Name: Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę długoterminowej hodowli organotypowych plasterków rdzenia kręgowego myszy do walidacji przeszczepu komórek macierzystych. To podejście wspiera badania nad terapiami komórkowymi urazów rdzenia kręgowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez Fundację Wings for Life (WFL-IT- 20/21), Narodowy Plan Odbudowy i Odporności Unii Europejskiej (NRRP)-misja 4 komponent 2, inwestycję nr 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Toskański Ekosystem Zdrowia-THE, Spoke 8) oraz Marina Romoli Onlus. Niniejszy manuskrypt odzwierciedla jedynie poglądy i opinie autorów, ani Unia Europejska, ani Komisja Europejska nie mogą być za nie odpowiedzialne. Dane i metadane są dostępne w Zenodo 10.5281/zenodo.10433147. Obrazy zostały wygenerowane za pomocą programu Biorender https://www.biorender.com/.

Long-Term Engraftment of h-SC-NES Cells in Spinal Cord Organotypic Cultures

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Nadal nie ma skutecznego leczenia dla pacjentów z SCI. Przetestowano różne podejścia, a jedno z najbardziej obiecujących opiera się na strategii regeneracyjnej polegającej na wymianie komórek. Obecnie postępy w dziedzinie medycyny regeneracyjnej wymagają opracowania nowatorskich platform do testowania skuteczności i bezpieczeństwa przeszczepów komórek, samodzielnie lub w połączeniu z innymi podejściami. Ich walidacja przedkliniczna jest niezbędna do prowadzenia dalszych badań klinicznych. Hodowle organotypowe SC są użyteczną platformą do badania różnych aspektów neurodegeneracji, regeneracji neuronów i rozwoju neurologicznego oraz do badania skuteczności nowych podejść terapeutycznych23. W szczególności specyficzne cechy kultur organotypowych, takie jak utrzymanie pierwotnej histoarchitektury oraz składu komórki i mikrośrodowiska, są korzystne dla rozwikłania dynamiki przeszczepów, takich jak wszczepianie komórek, integracja, różnicowanie i dojrzewanie.
Zgodnie z opublikowanymi protokołami, plastry organotypowe SC mogą być utrzymywane w hodowli przez około 2-3 tygodnie w zdrowych warunkach, co ogranicza ich wykorzystanie do długoterminowych badań i funkcjonalnych badań przesiewowych wymaganych do testowania schematów terapii komórkowej. Badanie ważnych procesów, takich jak różnicowanie i dojrzewanie w kierunku prawidłowego losu przeszczepionych komórek w tkance SC, wymaga długoterminowego monitorowania. Te procesy komórkowe mają kluczowe znaczenie podczas typowych przeszczepów w modelach zwierzęcych. Dostępność systemu ex vivo , który naśladuje wiele cech obecnych in vivo , byłaby pomocna w przedklinicznej fazie badań przesiewowych.
Z tego powodu w niniejszej pracy proponujemy optymalną długoterminową (≥30 dni) metodę hodowli organotypowej SC, która pozwala na utrzymanie żywotnych plastrów SC przez okres do 90 dni, trzykrotnie zwiększając ich zwykłe ramy czasowe. Ponadto wykazujemy stabilne wszczepienie komórek h-SC-NES wewnątrz plastrów SC i utrzymanie kultury przeszczepionej przez okres do 30 dni. Monitorowaliśmy wszczepianie komórek w czasie, obserwując ekspresję GFP w celu zweryfikowania przeżycia komórek do DPT 30. Po 30 DPT oceniliśmy szybkość apoptozy komórek. W piśmiennictwie opisano ocenę apoptozy przeszczepionych komórek h-SC-NES w plastrach SC w temperaturze 7 DPT40. Tutaj rozszerzyliśmy analizę apoptozy komórek w DPT 30, aby porównać szybkość apoptozy w odniesieniu do wcześniejszego punktu czasowego (DPT 7). Okazało się, że nasze dane są zgodne z literaturą, co sugeruje, że przeszczepione komórki h-SC-NES przeżywają również w późniejszym czasie, jeśli są utrzymywane w warunkach hodowli zoptymalizowanych w naszej pracy. Ta ulepszona, długoterminowa platforma ex vivo , dostępna samodzielnie i w konfiguracji do przeszczepów, pomoże naukowcom w przedklinicznych badaniach przesiewowych w kierunku przeszczepów komórek macierzystych w kierunku SCI. Pozwoli im to zidentyfikować najlepszego kandydata na komórkę do dalszych badań in vivo , które przyczynią się do powodzenia przeszczepów. Co więcej, po wstępnym badaniu przesiewowym, plastry organotypowe SC mogą być również stosowane równolegle z badaniami in vivo w celu potwierdzenia i potwierdzenia długoterminowej dynamiki i zachowań komórkowych obserwowanych w modelach zwierzęcych lub w celu wsparcia badań mechanistycznych.
Nasz protokół szczegółowo opisuje, jak wygenerować ten długoterminowy model organotypowy, ale należy również omówić kilka krytycznych kroków. Jeśli chodzi o tworzenie kultur organotypowych SC, istnieją pewne wyzwania podczas operacji i pierwszych etapów posiewu. Dobrze wykonany zabieg chirurgiczny jest niezbędny do wygenerowania wycinków, które zachowują oryginalną histoarchitekturę. Jeśli SC zostanie zniszczony podczas izolacji, plastry mogą stracić swoją typową strukturę anatomiczną, a uszkodzenie tkanek może wywołać nadmierną zniewagę prozapalną, prowadzącą do niezdrowych warunków i śmierci komórek. Najtrudniejszym etapem podczas operacji jest ekstrakcja SC ze szkieletu i usunięcie opon mózgowych z izolowanego SC. Powodzenie tych kroków zależy od doświadczenia operatora; Dlatego zaleca się okres szkolenia przed rozpoczęciem eksperymentów.
Przekrój koronalny SC przez śmigłowiec jest również trudnym etapem. Izolowany SC powinien być umieszczony na platformie tnącej dokładnie prostopadle do ostrza. Operator powinien również ustawić ostrze prostopadle do urządzenia tnącego. Te środki ostrożności są konieczne, aby zapewnić generowanie powtarzalnych wycinków między tymi samymi i różnymi doświadczeniami. Kolejną ważną kwestią jest to, że czas na zabieg jest ograniczony: cała procedura generowania plastrów musi trwać ~30 min. Jeśli operator poświęci więcej czasu na operację i cięcie, ucierpi na tym tkanka SC, co może negatywnie wpłynąć na powodzenie hodowli i kolejnych etapów eksperymentu.
Po umieszczeniu plastrów na błonie hodowlanej ważne jest, aby je prawidłowo karmić. GDNF jest niezbędny do podtrzymania regeneracji tkanek i przeżycia. Cięcie rozdrabniaczem jest traumatyczne dla tkanki i z tego powodu plastry są umieszczane wkrótce po pokrojeniu w lodowatym podłożu preparacyjnym, aby usunąć nadmiar cząsteczek prozapalnych i sprzyjających śmierci. Następnie plastry umieszcza się na błonach hodowlanych (wkładki do hodowli komórkowych) ze świeżą pożywką zmodyfikowaną GDNF, aby przyspieszyć regenerację i przyleganie plastrów do błony. GDNF powinien być dodawany do pożywki codziennie przez pierwszy tydzień w hodowli ze względu na jego krótki okres półtrwania50,51. Zaobserwowaliśmy, że plastry wymagają ciągłej obecności GDNF w pierwszych dniach hodowli, aby wspomóc regenerację i żywotność tkanek. W każdym razie, ponieważ obecność GDNF jest ważna przez cały okres hodowli, zdecydowanie odradza się przerywanie podawania GDNF w dalszych punktach czasowych.
W pierwszym tygodniu hodowli ważne jest również, aby sprawdzić plastry makroskopowo na oko i pod mikroskopem. Przezroczysta tkanka i przezroczystość granic są oznakami prawidłowego przylegania plastrów do błony i żywotnej tkanki. Tkanka martwicza będzie wydawała się niezwykle biała na pierwszy rzut oka, a obszary martwicze będą ciemnoszare pod mikroskopem. Po kilku tygodniach w hodowli morfologia tkanki może się zmienić: ruchy komórek i przyleganie tkanek do błony mogą wpływać na ten proces. Zaobserwowaliśmy na przykład utratę światła centralnego w niektórych wycinkach wypełnionych komórkami oraz utratę morfologii rogu grzbietowego i brzusznego. Dzieje się tak głównie w przypadku mniejszych plastrów, podczas gdy większość z nich zachowa strukturę anatomiczną zbliżoną do oryginalnej. Plastry są zwykle generowane z odcinka lędźwiowego lub piersiowego, ponieważ w ten sposób mogą mieć odpowiedni rozmiar, aby zachować swoją pierwotną histoarchitekturę w czasie: jeśli są zbyt małe, tracą swoją architekturę, a jeśli są zbyt duże, obszar centralny może ulec martwicy. W związku z tym wykorzystaliśmy odcinek lędźwiowy szczeniąt myszy do wygenerowania plastrów o odpowiedniej wielkości dla optymalnej długoterminowej hodowli, ale w zasadzie można wziąć pod uwagę inne segmenty. Co więcej, zdecydowaliśmy się na użycie odcinka lędźwiowego, ponieważ obszary brzuszne i grzbietowe są bardziej odróżnialne od siebie. Ponadto region ten przedstawia obszary tkanek o wyższym odsetku neuronów ruchowych i istoty szarej, które są miejscami zainteresowania dla terapii wymiany komórek w SCI. Jeśli chodzi o przeszczepianie komórek do plastrów, główny problem jest związany z pęknięciem szklanej końcówki mikroigłowej. Jeśli otwór do przejścia komórek jest zbyt duży, może to spowodować uszkodzenie tkanki SC podczas mikroiniekcji. Jeśli jest zbyt mały, układanie komórek może zatkać igłę, utrudniając proces przeszczepu. Procedura przeszczepu powinna zostać zakończona w ciągu 1 godziny, aby zminimalizować cierpienie i śmierć komórek.
Proponowany protokół stanowi optymalne i wszechstronne narzędzie dla różnych rodzajów dochodzeń. W tym przypadku stosujemy naszą długoterminową platformę do walidacji przeszczepu komórek h-SC-NES na pierwszych etapach różnicowania w tkance SC myszy przez 30 dni. Główną nowością proponowanego podejścia jest optymalizacja protokołu kokultury. Składniki GM utrzymują długoterminową przeżycie neuronalną plastrów SC i przeszczepionych komórek h-SC-NES. Rzeczywiście, GMO, będąc pożywką wolną od surowicy, podtrzymuje różnicowanie przeszczepionych komórek w kierunku losu neuronalnego w odniesieniu do pożywki wcześniej używanej do organotypowej hodowli plastrów47.
Jeśli chodzi o proponowane modele SCI, eksperymenty są zwykle przeprowadzane na dorosłych myszach. Jak dotąd, najważniejsze różnice między noworodkowym a dorosłym SC są związane z wyższym potencjałem regeneracyjnym stwierdzonym u noworodków w stosunku do dorosłych myszy52. Jednak takie różnice nie mają wpływu na rodzaj protokołu, który proponujemy, ponieważ tutaj skupiamy się na odpowiedzi przeszczepionych komórek na środowisko tkanki gospodarza, a nie na zdolnościach regeneracyjnych neuronów rezydentnych. Inna różnica między noworodkami a dorosłymi myszami po SCI jest związana z powstawaniem blizny glejowej, która występuje u dorosłych. Aspekt ten nie jest uwzględniany w proponowanym modelu, który nie uwzględnia złożonych procesów fizjopatologicznych wynikających z urazów pierwotnych i wtórnych.
Jeśli chodzi o zastosowania, platforma może być również wykorzystana do zbadania integracji między przeszczepionymi komórkami z obwodami rezydentnymi obecnymi w modelu organotypowym SC. Narzędzia inżynierii genetycznej były już wykorzystywane w OUN do oceny połączeń synaptycznych i mogą być wykorzystane w tym zakresie 53,54,55. W szczególności integracja może zostać zbadana i zwalidowana poprzez ocenę tworzenia się synaps między przeszczepionymi komórkami a tkanką SC ex vivo. Te długoterminowe hodowle organotypowe mogą być również wykorzystywane do testowania środków neuroprotekcyjnych i neuroregeneracyjnych lub nowych cząsteczek/materiałów lub do badania zaburzeń neurodegeneracyjnych, które obejmują SC. Aby zbadać specyficzne zaburzenia neurodegeneracyjne, protokół musi zostać dostosowany do hodowli plastrów SC wygenerowanych z odpowiednich modeli, takich jak myszy transgeniczne noszące określone mutacje związane z patologią, na odpowiednim etapie patologii (tj. noworodek, młodociany, dorosły). Podsumowując, nasz protokół i ogólnie hodowle organotypowe, będące eksplantatami konkretnego narządu, wykazują cechy, które wypełniają lukę między hodowlami komórkowymi 2D a modelami in vivo, potwierdzając, że są one nieocenionym narzędziem zarówno do badań podstawowych, jak i badań przedklinicznych.

Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego (SCI) ma druzgocące konsekwencje fizyczne, psychologiczne i ekonomiczne dla pacjentów i opiekunów1. Podjęto wiele prób promowania regeneracji aksonów w SCI przy użyciu różnych podejść2,3,4 i wykazano pewne korzystne efekty poprzez tworzenie przekaźników neuronalnych między neuronami proksymalnymi i dystalnymi w miejscu uszkodzenia za pomocą terapii wymiany komórek. Zainteresowanie terapiami komórkowymi wciąż rośnie5, ponieważ przeszczepione komórki mogą odgrywać wiele ról, w tym zapewniać wsparcie troficzne, modulację immunologiczną, regenerację utraconych obwodów nerwowych poprzez indukcję plastyczności, wymianę komórek i remielinizację aksonów6.
Ostatnio, główny wysiłek w tej dziedzinie skupił się na ludzkich nerwowych komórkach macierzystych/progenitorowych (NSC/NPC)7. Kilka badań sugeruje, że NSC/NPC modulują odpowiedź astrocytów8, promują wydzielanie czynników proregeneracyjnych9,10 i zastępują brakujące komórki neuronalne w SCI11,12. Jednak badania, które wspierają różnicowanie przeszczepionych komórek w funkcjonalne neurony, są nadal słabe. Co więcej, przeżywalność i różnicowanie przeszczepionych komórek w uszkodzonym rdzeniu kręgowym (SC) jest niskie13, prawdopodobnie dlatego, że przeszczepione komórki potrzebują kilku tygodni, a nawet miesięcy, aby różnicować się in vivo. Ponadto obecne badania nie wyjaśniły w pełni wielu biochemicznych, molekularnych, komórkowych i funkcjonalnych aspektów terapii zastępowania komórek. W tym kontekście potrzebne są proste, szybkie i opłacalne modele do badania mechanizmów wszczepiania komórek, zdolności przeszczepionych komórek do proliferacji, różnicowania się w określone typy lub subpopulacje komórek oraz tworzenia synaps z neuronami rezydentnymi.
Integracja badań histologicznych z zapisem elektrofizjologicznym oraz profilowaniem transkryptomu i proteomu jest niezbędna do pełnego zrozumienia kaskady molekularnej zachodzącej po przeszczepie komórki. Z pewnością przyspieszy to projektowanie i walidację nowych terapii zastępczych komórek w modelach przedklinicznych i badaniach klinicznych. Rzeczywiście, do tej pory wykorzystanie gryzoni, dużych zwierząt i naczelnych było warte zachodu w celu wyjaśnienia wielu procesów komórkowych po przeszczepie14. Jednak ze względu na wysokie koszty, duży wpływ etyczny, a także złożoność organizmu, ich zastosowanie często nie jest proste lub niewystarczające do rozwikłania procesów biochemicznych i molekularnych. Ponadto mogą mieć wiele wad skorelowanych z różnicami biologicznymi, zarówno międzygatunkowymi (metabolizm), jak i zmiennością wewnątrzgatunkową (płeć, wiek). Czynniki te, wraz z czynnikami zewnętrznymi, takimi jak sytuacje stresowe, mogą zmienić wynik eksperymentu i ich przewidywalność pod względem translacji terapeutycznej na ludzi15,16,17.
Dlatego wiele grup stosuje hodowle komórkowe 2D in vitro i organiczne plastry ex vivo (hodowle ex vivo) oprócz modeli zwierzęcych. Hodowla komórkowa 2D jest najczęściej używanym systemem do badania określonych procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki i/lub populacji komórek. Niemniej jednak jednowarstwowe hodowle komórkowe nie odzwierciedlają złożoności występującej w całym organizmie. Brak struktur tkankowych i środowiska fizjologicznego nie pozwala systemom hodowli 2D na pełną emulację kluczowych aspektów strukturalnych, morfologicznych i funkcjonalnych badanej tkanki18,19,20. Hodowle organotypowe mogą przezwyciężyć niektóre z tych problemów. Modele organotypowe opierają się na eksplantacji fragmentu tkanki lub narządu i utrzymywaniu go ex vivo przez ograniczony czas21,22. W szczególności generowane są plastry eksplantowanej tkanki o precyzyjnej grubości, która umożliwia składnikom odżywczym łatwe dotarcie do prawie wszystkich komórek w plasterkach. Mogą być generowane z różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego, takich jak hipokamp, podwzgórze, móżdżek, wzgórze, kora mózgowa, istota i prążkowie oraz rdzeń kręgowy23. Kultury organotypowe zachowują architekturę tkankową, rozmieszczenie przestrzenne komórek, różnorodność komórkową i środowisko (tj. skład macierzy zewnątrzkomórkowej) narządu pochodzenia. Ponadto zachowują pierwotną aktywność neuronalną, połączenia między komórkami, a w szczególności krótkie obwody po eksplantacji.
Te aspekty zapewniają pewne korzyści dla kultur ex vivo zarówno w odniesieniu do kultur jednowarstwowych, jak i modeli zwierzęcych. Zachowują kluczowe cechy tkanek znalezione in vivo, ale z redukcją kosztów i możliwością wykonywania różnych typów eksperymentów molekularnych, komórkowych i funkcjonalnych z dokładną regulacją parametrów środowiskowych hodowli24,25,26,27,28,29. Wycinki organotypowe mogą być również wykorzystywane do opracowywania modeli różnych zaburzeń neurologicznych poprzez upodabnianie kluczowych cech histopatologicznych określonych schorzeń30. Co więcej, zachowanie pierwotnego środowiska tkanek wielokomórkowych sprawia, że są one odpowiednimi platformami do badań przesiewowych leków oraz do testowania cząsteczek i materiałów neuroprotekcyjnych i neuroregeneracyjnych.
W tej pracy proponujemy użycie kultur organotypowych SC jako modelu do optymalizacji przeszczepów NSC. Nie jest to trywialne, ponieważ wymagane są optymalne warunki hodowli, aby zagwarantować przeżycie zarówno gospodarza (tkanka SC), jak i przeszczepu (NSC) przez tygodnie. Różne grupy badawcze wszczepione w kultury organotypowe, pochodzące z mózgu i pochodzące z SC, różne typy komórek. Większość prac dotyczyła przeszczepu mezenchymalnych komórek macierzystych31,32,33, węchowe komórki osłonowe34, lub NSCs35,36,37,38,39,40 i oceniono interakcje przeszczepionych komórek z komórkami gospodarza, przeżywalność całego systemu oraz to, czy przeszczepione komórki różnicowały się w neurony, czy komórki podobne do neuronów w środowisku tkankowym ex vivo32,33,41. Niektórzy z nich oceniali potencjał regeneracyjny komórek po przeszczepie, obserwując ich aksonalny wzrost wewnątrz tkanki37,40,41, zdolność mielinizacyjna wszczepionych prekursorów oligodendrocytów42, migracja przeszczepionych komórek do tkanki gospodarza43oraz czy przeszczepione komórki uwalniały czynniki popychające w kierunku środowiska proregeneracyjnego31. Jednym z ograniczeń obecnych badań jest to, że nie badają one wszczepienia przez długi czas.
Biorąc pod uwagę, że NSC wydają się potrzebować kilku tygodni na rozróżnienie in vivo44,45, to badanie skupia się na tym, jak generować i utrzymywać długoterminowe (≥30 dni) mysie wycinki SC przez okres do 90 dni. Stwierdzono, że plastry zachowują swoją pierwotną strukturę anatomiczną i utrzymują niską i stabilną szybkość apoptozy w czasie oraz wysoką żywotność komórek. Zaobserwowaliśmy rozproszoną ekspresję markerów neuronalnych RNA wiążącego homolog 3 fox-1 (RBFOX3) i łańcucha lekkiego neurofilamentu (NFL), przy czym ten ostatni wykazuje z czasem rosnący trend kiełkowania aksonów wokół plasterków, co świadczy o ich zdrowym stanie. Co więcej, udało nam się przeszczepić do plastrów SC ludzkie neuroepitelialne komórki macierzyste pochodzące z ekspresji GFP (h-SC-NES) na pierwszych etapach różnicowania neuronów. Przeszczep NSC utrzymywano przez 30 dni po przeszczepie, a komórki wykazywały ekspresję GFP przez cały okres hodowli. Stwierdzono również, że szybkość apoptozy komórek w dniu po przeszczepie (DPT) 30 jest zgodna z wartością szybkości apoptozy obserwowaną przy DPT 7 w tych samych komórkach40. Komórki wydawały się wszczepiać w środowisko tkankowe i przeżywały do kilku tygodni.
Podsumowując, nasze dane pokazują, że możliwe jest utrzymanie w kulturze wycinków organotypowych SC przez 3 miesiące bez uszczerbku dla ich pierwotnej cytoarchitektury i środowiska tkankowego. Co najważniejsze, można je wykorzystać do testowania terapii komórkowych przed przystąpieniem do eksperymentu in vivo, zmniejszając w ten sposób koszty i czas eksperymentu. Tutaj szczegółowo ilustrujemy wszystkie fragmenty do generowania mysich plasterków organotypowych SC i jak je utrzymywać przez długi czas (≥30 dni). Ponadto szczegółowo wyjaśniamy, jak przeprowadzić przeszczep NPC do wycinków i jak zachować je do dalszej analizy.

<table><tbody><tr><td>przeciw rozszczepieniu Kaspaza-3,&nbsp; (Asp175) (5A1E) (Królik)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9661S</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anty-GFP (mysz) - monoklonalna</td><td>Sigma/Merck</td><td>G6539</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anty-ludzkie jądra (mysz) - monoklonalna, klon 235-1&nbsp;</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1281</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anty-ludzkie jądra (królik)</td><td>NeoBiotechnologie</td><td>RBM5-346-P1</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anty-NeuN (RBFOX3) (Królik) - poliklonalny</td><td>Sigma/Merck</td><td>ABN78</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anty-NFL (Mysz)</td><td>Sigma/Merck</td><td>MAB1615</td><td>1:400</td></tr><tr><td>anty-NFL H-Phospho (Królik) -poliklonalny</td><td>Biologend</td><td>840801</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Aqua Polymount</td><td>Poly-sciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Gibco</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>Blades</td><td>Leica</td><td>118364227</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa z klasyfikowaną wodą</td><td>Sigma/Merck</td><td>W3500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen z ogona szczura</td><td>Sigma/Merck</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny - Mikroskop konfokalny A1 (Eclipse Ti)</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma/Merck</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330</td> DPBS Sigma/Merck D8537 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma/Merck</td><td>gf144</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Sigma/Merck</td><td>SRP3200</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane, 3.5"&nbsp;</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Kozio-anty mysz IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Kozioł anty mysz IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A21236</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozio-anty królik IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A11011</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Kozioł-anty królik IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21244</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Wykres Pad-Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Koń Surowica</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma/Merck</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma/Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral prep</td><td>Addgene</td><td>17446-LV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Zestaw do oznaczania żywotności/cytotoksyczności</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32250</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>do ładowania komórek w igle do przeszczepu</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Membrana do hodowli komórek milikomórkowych</td><td>Sigma/Merck</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe miskroskopowe</td><td>VWR&nbsp;</td><td>ECN 631-1572</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (35mm)</td><td>VWR</td><td>734-2317</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma/Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta pasteura</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Mikrowtryskiwacz do przeszczepów</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma/Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela nr 10 Sterylna stal nierdzewna</td><td>VWR International</td><td>SWAN3001</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Wiosna Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501235</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop do obrazowania i akwizycji</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy do chirurgii</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta-Dumont #5-inox</td><td>World Precision Instruments</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki, 8,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do mikropipet</td><td>Przyrząd migawkowy</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>R& Systemy D</td><td>1254/50</td><td></td></tr></tbody></table>

długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

Wciąż brakuje leków na urazy rdzenia kręgowego (SCI) ze względu na skomplikowaną patofizjologię. Jedno z najbardziej obiecujących podejść regeneracyjnych opiera się na przeszczepie komórek macierzystych w celu zastąpienia utraconej tkanki i wspomagania powrotu do sprawności. Podejście to powinno być dalej badane pod kątem bezpieczeństwa i skuteczności in vitro i ex vivo przed przystąpieniem do droższych i bardziej czasochłonnych testów na zwierzętach. W niniejszej pracy pokazujemy stworzenie długoterminowej platformy opartej na organotypowych wycinkach mysiego rdzenia kręgowego (SC) przeszczepionych ludzkimi nerwowymi komórkami macierzystymi w celu przetestowania komórkowych terapii zastępczych w przypadku SCI.
Standardowe kultury organotypowe SC są utrzymywane przez około 2 lub 3 tygodnie in vitro. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół długotrwałej konserwacji (≥30 dni) przez okres do 90 dni. Pożywka stosowana do długoterminowej hodowli plastrów SC została również zoptymalizowana pod kątem przeszczepiania nerwowych komórek macierzystych do modelu organotypowego. Ludzkie neuroepitelialne komórki macierzyste pochodzące z SC (H-SC-NES) niosące reporter z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) przeszczepiono do mysich plastrów SC. Trzydzieści dni po przeszczepie komórki nadal wykazują ekspresję GFP i niski wskaźnik apoptozy, co sugeruje, że zoptymalizowane środowisko utrzymało ich przetrwanie i integrację w tkance. Protokół ten stanowi solidny punkt odniesienia dla skutecznego testowania terapii wymiany komórek w tkance SC. Platforma ta umożliwi naukowcom przeprowadzanie wstępnych badań przesiewowych ex vivo różnych terapii przeszczepiania komórek, pomagając im wybrać najbardziej odpowiednią strategię przed przystąpieniem do eksperymentów in vivo.

Opisane metody pozwalają na przygotowanie organotypowych skrawków SC z myszy w stadium P3 oraz ich utrzymywanie w kulturze przez dłuższy czas w dobrym stanie. Ponadto przedstawiamy protokół transplantacji komórek do skrawków i ich współhodowli przez okres do 30 dni (Rysunek 1). W pierwszej kolejności prezentujemy optymalizację warunków hodowli oraz protokół odpowiedni do długotrwałego hodowania skrawków SC z transplantowanymi komórkami (Rysunek 2A). Skrawki są generowane i utrzymywane od DEV 0 do DEV 2 w pożywce OM, która została pierwotnie zaproponowana jako optymalne medium do utrzymania skrawków SC47. Jednakże ze względu na obecność białek surowicy, pożywka ta mogła być suboptymalna dla podtrzymania różnicowania i dojrzewania neuronów z transplantowanych komórek prekursorowych linii neuronalnej. W związku z tym w dniu DEV 3 przetestowaliśmy zmianę z pożywki OM na GM — formulację zawierającą Neurobasal oraz B27, która wspiera przeżycie neuronów i nie zawiera surowicy, która hamuje prawidłowe różnicowanie neuronów, promując w zamian los glialny48,49.
Rysunek 2B przedstawia wyniki uzyskane po zmianie medium w DEV 3 z OM na GM, w porównaniu do plastrów SC, w których nie dokonano tej zmiany (plastry kontrolne hodowano w OM). Jako marker integralności neuronalnej wykorzystaliśmy rozkład sygnału NFL wewnątrz plastrów (Rysunek 2B,C). Plastry w DEV 7 były zdrowe w obu warunkach hodowli, wykazując rozproszony rozkład neurofilamentów (NFL, kolor zielony). W DEV 10 plastry hodowane w GM wydawały się być zdrowsze w stosunku do plastrów kontrolnych hodowanych w OM, co potwierdzono rozmieszczeniem barwienia NFL. Oszacowano również obszar NFL+ (% obszaru NFL+/obszaru DAPI+) plastrów przedstawionych na reprezentatywnych obrazach na Rysunku 2B. Oszacowany obszar NFL+ przedstawiono na histogramach na Rysunku 2C, co potwierdza, że sygnał NFL jest rozproszony w plastrach w DEV 7 w obu warunkach. Jednak w DEV 10 oszacowany obszar pokryty barwieniem NFL ulega zmniejszeniu w przypadku warunków hodowli w OM.
Dane te sugerują, że przejście na pożywkę GM w DEV 3 jest dobrze tolerowane podczas przedłużonej hodowli skrawków SC (DEV 10). W następnym kroku przetestowano pożywkę GM w późniejszych punktach czasowych: DEV 30, DEV 60 i DEV 90. Jak pokazano w Rysunek 3A,Bprzekroje zachowywały żywotność w hodowli aż do 90. dnia rozwoju embrionalnego (DEV 90). Stwierdzono szeroką obecność barwienia NFL w przekrojach w każdym punkcie czasowym, z rozproszonymy rozrostem neurytów wychodzących z regionu centralnego wokół przekrojów. Rzeczywiście, oszacowano NFL+ pole powierzchni przekrojów przedstawionych w Rycina 3A i zwiększało się w czasie, co przedstawiono na histogramach Rycina 3BZaobserwowaliśmy również pozytywny wynik w kierunku markera neuronalnego RBFOX3, co stanowiło kolejny dowód na różnicowanie neuronalne skrawków. W każdym punkcie czasowym sprawdzaliśmy również stopień apoptozy, oceniając w różnych skrawkach liczbę komórek pozytywnych pod kątem aCASP3 (Rysunek 4A,B). Analizę przeprowadzono zgodnie z opisem w sekcji 10.2 protokołu. Odsetek apoptozy (% aCASP3+ komórki/całkowita liczba DAPI+ komórek) okazał się bardzo niski w każdym punkcie czasowym (odpowiednio 0,85 ± 0,52%, 0,71 ± 0,27% i 0,66 ± 0,45% dla DEV 30, 60 i 90), bez istotnych różnic między trzema rozważanymi punktami czasowymi (wartość p &gt; 0.05, Rysunek 4B). Dane te sugerują, że tempo apoptozy związane z aCASP3 pozostaje stabilne w czasie i, wraz z szerokim rozkładem NFL w skrawkach (Rycina 4A), potwierdź przeżywalność skrawków w każdym punkcie czasowym.
W celu potwierdzenia poprzednich danych przeprowadziliśmy również test żywotności (live/dead assay), aby ocenić przeżywalność skrawków w trzech różnych punktach czasowych. Do znakowania komórek żywych i metabolicznie aktywnych wykorzystaliśmy kalceinę (barwienie zielone), a do oceny śmierci komórkowej Sytox (barwienie cyjanowe). Jak pokazują histogramy na Rysunku 4C, odsetek komórek metabolicznie aktywnych nieznacznie wzrasta od DEV 30 do DEV 90 (odpowiednio 93,17 ± 5,21%, 96,43 ± 3,02% i 96,33 ± 3,10% dla DEV 30, 60 i 90), stabilizując się między dwoma ostatnimi punktami czasowymi (DEV 30 vs DEV 60 p-value = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 p-value = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 p-value = 0,99). Odnotowano niski poziom śmierci komórkowej, który zmniejszał się w czasie (odpowiednio 6,83 ± 5,21%, 3,57 ± 3,02% i 3,66 ± 3,10% dla DEV 30, 60 i 90), przy czym stwierdzono istotną różnicę między DEV 30 a późniejszymi punktami czasowymi, DEV 60 i DEV 90 (DEV 30 vs DEV 60 p-value = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 p-value = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 p-value = 0,99). Dane te, w połączeniu ze wskaźnikiem apoptozy, potwierdzają przeżywalność skrawków w czasie i dowodzą skuteczności zastosowanego protokołu długoterminnej hodowli.
Po potwierdzeniu możliwości długotrwałej hodowli skrawków rdzenia kręgowego (SC), poddano system próbie poprzez transplantację komórek h-SC-NES na wczesnych etapach różnicowania neuronalnego. Przetestowano komórki h-SC-NES, ponieważ wykazały one obiecujące wyniki w leczeniu urazów rdzenia kręgowego (SCI)12. Procedura transplantacji komórek h-SC-NES do mysich skrawków SC opisana jest w sekcji 6 protokołu. Skrawki SC oraz transplantowane komórki h-SC-NES utrzymywano do 30. dnia po transplantacji (DPT 30). Komórki przeszczepiono w 10. dniu in vitro (DIV 10) różnicowania (etap prekursorów neuronalnych) do organotypowych skrawków w 4. dniu rozwoju embrionalnego (DEV 4), zgodnie ze schematem protokołu na Rysunku 5A. Ekspresję GFP w transplantowanych komórkach monitorowano w hodowli przez okres do 30 dni. Rysunek 5B przedstawia reprezentatywne obrazy żywych komórek skrawka SC z transplantowanymi komórkami GFP+ w różnych punktach DPT. Stabilna ekspresja GFP w czasie (Rysunek 5B i Rysunek 6A) sugeruje, że komórki przetrwały w tkance SC w wcześniej zoptymalizowanych warunkach hodowli. Sprawdzono również odsetek apoptozy transplantowanych komórek, zgodnie z opisem w sekcji 10.2 protokołu. Odsetek apoptozy (% komórek aCASP3+/całkowita liczba komórek Hu-Nu+) po 30 DPT okazał się bardzo niski (0,44 ± 0,34%) (Rysunek 6B). Ponadto stwierdzono, że odsetek apoptozy w DPT 30 był zgodny z wynikami uzyskanymi dla tego samego typu komórek w DPT 7, co zgłoszono we wcześniejszych doniesieniach40, co dokumentuje stabilizację hodowli w czasie.
<img alt="Schemat przygotowania skrawka rdzenia kręgowego myszy i transplantacji komórek NES; metoda oceny żywotności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat procedury. Reprezentacyjny schemat przedstawiający ogólny przebieg wykonanego protokołu. (A) Po lewej stronie schemat podsumowujący generowanie skrawków rdzenia kręgowego (SC) myszy z wyizolowanego rdzenia kręgowego młodych myszy w dniu P3 oraz długoterminową hodowlę organotypowych skrawków rdzenia kręgowego. (B) Po prawej stronie schemat podsumowujący transplantację ludzkich komórek NES pochodzących z rdzenia kręgowego (h-SC-NES) wykazujących ekspresję GFP do organotypowych skrawków rdzenia kręgowego myszy. Przeszczepione komórki utrzymywano przez 30 dni po transplantacji. Skróty: h-SC-NES = ludzkie neuroepitelialne komórki macierzyste pochodzące z rdzenia kręgowego; GFP = zielone białko fluorescencyjne; DEV = dzień ex vivo; DPT = dzień po transplantacji; NFL = lekki łańcuch neurofilamentu; RBFOX3 = homolog 3 białka wiążącego RNA fox-1; aCASP3 = aktywna kaspaza-3; SC = rdzeń kręgowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces rozwoju neurytów, obrazy mikroskopowe, wykresy; efekty medium organotypowego i przeszczepowego, DEV 7, 10." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Optymalizacja warunków długoterminowej hodowli. (A) Reprezentatywny schemat protokołu testowania OM i GM. W grupie kontrolnej OM jest utrzymywane do DEV 7-10. W przypadku opracowanych skrawków medium zmieniono na GM w DEV 3; następnie utrwalono je w DEV 7-10 w celu porównania z grupą kontrolną. (B) Reprezentatywne obrazy porównujące organotypowe skrawki rdzenia kręgowego myszy (SC) w DEV 7 i 10 hodowane w różnych warunkach. Skrawki wybarwiono na marker cytoszkieletowy neurofilament (NFL, zielony). Szeroki rozkład barwienia NFL w skrawkach hodowanych w GM sugeruje ogólne przeżycie i różnicowanie. Jądra komórkowe wybarwiono DAPI. Pasek skali = 500 µm. (C) Reprezentatywne histogramy szacunkowej powierzchni zajmowanej przez NFL w skrawkach pokazanych na Rycina 1B. W DEV 10 powierzchnia NFL zmniejsza się w warunkach hodowli w OM. Skróty: DEV = dzień ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; NFL = lekki łańcuch neurofilamentu; OM = medium organotypowe; GM = medium przeszczepowe; SC = rdzeń kręgowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Etapy rozwoju neuronalnego z markerami NFL, RBFOX3; obrazy mikroskopowe, wykresy danych, wzrost neurytów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Długotrwale hodowane organotypowe skrawki rdzenia kręgowego myszy. (A) Skrawki są utrzymywane w kulturze do 90. dnia DEV. Analiza immunofluorescencyjna wykazuje szeroki rozkład markeru cytoszkieletowego neurofilamentu (NFL, zielony) oraz jądrowego markeru neuronalnego RBFOX3 (czerwony), co świadczy o ich dobrym stanie i tożsamości neuronalnej po długoterminowej hodowli. Warto zauważyć, że aksony NFL+ rozrastają się rozproszone wokół skrawków w czasie. Jądra są przeciwbarwione DAPI. Pasek skali = 500 µm. (B) Reprezentatywne histogramy szacowanej powierzchni NFL+ w czasie oraz powierzchni RBFOX3+ skrawków przedstawionych na panelu A. Powierzchnia neurytów NFL+ zwiększa się w czasie. Skróty: DEV = dzień ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; NFL = lekki łańcuch neurofilamentów; SC = rdzeń kręgowy; RBFOX3 = białko RBFOX3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza apoptozy; barwienie aCASP3 i DAPI; obrazy mikroskopowe; komórki neuronalne; kwantyfikacja apoptozy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Ocena żywotności komórek w plastrach rdzenia kręgowego (SC) w czasie. (A) Reprezentatywne obrazy organotypowych plastrów w dniu DEV 60 barwionych na aCASP3 (czerwony) i NFL (zielony). Pasek skali = 100 µm. NFL wykazuje wzorzec rozproszony. Nieliczne komórki są dodatnie pod kątem markera apoptozy aCASP3 (Wstawki: 1-2-3). (B) Analiza poziomu apoptozy w plastrach w różnych punktach czasowych. Średnia ± SD, N (powtórzenia) = 6 plastrów, n (całkowita liczba komórek) &gt; 1 000 dla każdego plastra, test Kruskala-Wallisa, porównania wielokrotne, wartość p &gt; 0,05. Poziom apoptozy pozostaje stabilny w czasie. Na wstawkach 1-2-3 panelu A można zaobserwować szczegóły komórek dodatnich dla aCASP3 (barwienie czerwone, białe strzałki). Małe czerwone kropki oznaczają szczątki komórkowe i jądra pyknotyczne. Pasek skali = 50 µm. (C) Reprezentatywne obrazy testu żywotności (live/dead) wykonanego na plastrach SC w dniu DEV 90: komórki metabolicznie aktywne są znakowane na zielono Kalceiną, natomiast komórki martwe i uszkodzone są znakowane na jasnoniebiesko (cyjanowo) Sytoxem. Dwa histogramy przedstawiają % komórek dodatnich dla Kalceiny (po lewej) i Sytoxu (po prawej) w stosunku do całkowitej liczby komórek. Dla obu: średnia ± SD, N (powtórzenia) = 6 plastrów, n (całkowita liczba komórek) &gt; 1 000 dla każdego plastra, test Kruskala-Wallisa, porównania wielokrotne, DEV 30 vs DEV 60 wartość p = 0,018; DEV 30 vs DEV 90 wartość p = 0,027; DEV 60 vs DEV 90 wartość p &gt; 0,99. Skróty: DEV = dzień ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; NFL = lekki łańcuch neurofilamentowy; SC = spinal cord (rdzeń kręgowy); aCASP3 = aktywna kaspaza-3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu różnicowania neuronalnego z transdukcją lentiwirusową GFP i wynikami obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Transplantacja komórek h-SC-NES do organotypowych skrawków mysich. (A) Reprezentacyjny schemat protokołu transplantacji. Komórki są transplantowane jako prekursory neuronalne w 10. dniu (DIV 10) różnicowania do organotypowych skrawków w 4. dniu (DEV 4). (B) Reprezentacyjne obrazy organotypowych skrawków mysich po transplantacji komórek h-SC-NES wykazujących ekspresję GFP w czasie do 30. dnia po transplantacji (DPT 30). Komórki zostały poddane transdukcji wektorem lentiwirusowym niosącym gen GFP. Ekspresja GFP w czasie potwierdza ich żywotność i adaptację do środowiska skrawka. Pasek skali = 500 µm. Skróty: DIV = dzień przed różnicowaniem; h-SC-NES = ludzkie macierzyste komórki neuroepithelialne pochodzące z rdzenia kręgowego; GFP = zielone białko fluorescencyjne; DEV = dzień ex vivo; OM = pożywka organotypowa; GM = pożywka do przeszczepu; DPT = dni po transplantacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Barwienie fluorescencyjne aCASP3, Hu-Nu w neuronach; wykres kołowy procenta komórek aCASP3+." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Ocena wskaźnika apoptozy przeszczepionych komórek h-SC-NES 30 dni po transplantacji. (A) Reprezentatywny obraz mysiego skrawka organotypowego z przeszczepionymi komórkami h-SC-NES wykazującymi ekspresję GFP. Komórki zostały przetransdukowane wektorem lentiwirusowym niosącym gen GFP w celu monitorowania ich w skrawkach po transplantacji. Ekspresja GFP w czasie potwierdza ich żywotność i adaptację do środowiska skrawka. Przedstawiony punkt czasowy to 30. dzień po transplantacji (DPT 30); komórki są barwione na jądra ludzkie (cyjan) oraz aCASP3 (czerwony). Pasek skali = 150 µm. (B) Po lewej reprezentatywny wykres kołowy z analizy apoptozy komórek przeszczepionych do skrawków w DPT 30 (N (powtórzenia) = 5 skrawków, n (komórki) = 5 000), a po prawej wstawka z komórkami Hu-Nu+ oraz szczegół komórki pozytywnej pod kątem aCASP3 (biała strzałka). Pasek skali = 75 µm. Małe czerwone kropki oznaczają szczątki komórkowe i jądra pikonotyczne. Skróty: h-SC-NES = ludzkie neuroepitelialne komórki macierzyste pochodzące z rdzenia kręgowego; GFP = zielone białko fluorescencyjne; DPT = dzień po transplantacji; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; NFL = lekki łańcuch neurofilamentowy; aCASP3 = aktywna kaspaza-3; Hu-Nu = jądra ludzkie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Skład roztworów użytych w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

W tym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę generowania i utrzymywania długoterminowych wycinków organotypowych rdzenia kręgowego przeszczepionych z nerwowymi komórkami macierzystymi jako model ex vivo do testowania komórkowych terapii zastępczych.

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

Jesteśmy zainteresowani opracowaniem obiecującego podejścia regeneracyjnego do leczenia urazów rdzenia kręgowego. W tym artykule walidujemy model organotypowy rdzenia kręgowego do testowania komórkowych terapii zastępczych w badaniach nad rdzeniem kręgowym. Do tej pory modele organotypowe rdzenia kręgowego są utrzymywane w hodowli przez dwa lub trzy tygodnie in vitro.A pożywki subkulturowe są nieoptymalne do wszczepiania, różnicowania i dojrzewania nerwowych komórek macierzystych. Terapie wymiany komórek nadal wymagają poprawy, aby ogłosić zdolność przeszczepionych komórek do odtworzenia utraconych obwodów. Dzięki temu protokołowi zapewniamy nowatorską, długoterminową platformę ex vivo, która rozwiązuje problemy związane z przeszczepami komórek, takie jak przeżycie, integracja i tempo dojrzewania wszczepionych nerwowych komórek macierzystych.Platforma ta będzie pomocna dla naukowców w znalezieniu najlepszej strategii przeszczepu komórek, zmniejszając liczbę zwierząt potrzebnych do walidacji in vivo. Nasz protokół jest prosty, szybki i opłacalny, aby przeprowadzić badania potwierdzające słuszność koncepcji i optymalizacyjne.

long-term-mouse-spinal-cord-organotypic-slice-culture-as-platform-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Transplantacja prekursorów neuronalnych jest obiecującą strategią ochrony i/lub zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych szyjnych neuronów ruchowych nerwu przeponowego w przypadku urazów rdzenia kręgowego (SCI) oraz w przebiegu stwardnienia bocznego zanikowego (ALS), będącego chorobą neuronów ruchowych. Przedstawiamy protokół dostarczania komórek do przedniego rogu szyjnego rdzenia kręgowego w gryzoniach w modelach ALS i SCI.

Wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Źródło: Palma-Tortosa, S., et.al. Hodowle organotypowe dorosłej ludzkiej kory mózgowej jako model ex vivo do przeszczepiania i walidacji ludzkich komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje przeszczep neuronalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych do wycinków ludzkiej tkanki korowej. Procedura polega na wyizolowaniu i ponownym zawieszeniu komórek progenitorowych w macierzy błony podstawnej, a następnie wstrzyknięciu ich do wycinka korowego...

Przeszczepianie progenitorów neuronalnych pochodzących z komórek macierzystych do ludzkich wycinków korowych

Kultury Slice ułatwiają manipulowanie rozwojem zarodka za pomocą zaburzeń genowych i farmakologicznych. Jednakże warunki hodowli muszą zapewniać, że normalny rozwój może przebiegać w ograniczonym środowisku wycinka. Ilustrujemy protokół, który ułatwia prawidłowy rozwój rdzenia kręgowego, aby przebiegał przez co najmniej 24 godziny.

Protokół hodowli plastrów rdzenia kręgowego zarodków kurczaka

Matryce fibrynowe zawierające czynniki wzrostu zostały użyte do zatrzymania przeszczepionych nerwowych komórek macierzystych w miejscach całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego. Przeszczepione komórki całkowicie wypełniły jamę chorobową i zróżnicowały się w wiele typów komórek nerwowych, w tym neurony, które rozciągały aksony do rdzenia kręgowego gospodarza na duże odległości.

Promowanie przeżycia i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z koktajlami fibryny i czynnika wzrostu po ciężkim urazie rdzenia kręgowego

Opisano technikę badania komórek NG2 i oligodendrocytów za pomocą systemu hodowli plasterkowej w przodomózgowiu i móżdżku.  Metoda ta pozwala na badanie dynamiki proliferacji i różnicowania komórek w obrębie linii oligodendrocytów, w której można łatwo manipulować środowiskiem zewnątrzkomórkowym przy zachowaniu cytoarchitektury tkanek.

Organotypowe kultury warstwowe do badania dynamiki oligodendrocytów i mielinizacji

Uraz rdzenia kręgowego to traumatyczny stan, który powoduje ciężką zachorowalność i wysoką śmiertelność. W niniejszej pracy szczegółowo opisano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy, po którym następuje przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych.

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

To badanie przedstawia technikę izolacji neuronów od noworodków myszy WT. Wymaga starannego wypreparowania rdzenia kręgowego od noworodka myszy, a następnie oddzielenia neuronów od tkanki rdzenia kręgowego poprzez mechaniczne i enzymatyczne rozszczepienie.

Izolacja i hodowla neuronów rdzenia kręgowego od nowonarodzonych myszy

Ten artykuł opisuje technikę wprowadzania pustego przewodu między kikuty rdzenia kręgowego po całkowitym przecięciu i wypełnieniu komórkami Schwanna (SC) oraz wstrzykiwalną macierzą błony podstawnej w celu wypełnienia i wspomagania regeneracji aksonów w poprzek szczeliny.

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

Ten protokół opisuje długoterminowe hodowle organotypowe dorosłej ludzkiej kory mózgowej w połączeniu z dokorowym przeszczepem ex vivo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z komórek macierzystych, które prezentują nowatorską metodologię do dalszego testowania terapii opartych na komórkach macierzystych dla ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Hodowle organotypowe kory mózgowej dorosłego człowieka jako model ex vivo do przeszczepiania i walidacji ludzkich komórek macierzystych

Poznaj metodę długoterminowej hodowli organotypowych plasterków rdzenia kręgowego myszy do walidacji przeszczepu komórek macierzystych. To podejście wspiera badania nad terapiami komórkowymi urazów rdzenia kręgowego.

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego (Wideo) | JoVE Journal

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów