Name: Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in vivo i unerwienia mięśnia dźwigacza bocznego zorza długiego u myszy CF-1. Technika ta pozwala badać wpływ białek mięśniowych na regenerację synaps nerwowo-mięśniowych i stabilność receptorów postsynaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wysoce współpracującemu i stymulującemu środowisku członków NeSt Lab za użyteczne dyskusje i komentarze na temat tej pracy. Prace w NeSt Lab są obecnie finansowane przez FONDECYT 1221213. Schemat w Rysunek 1A został stworzony za pomocą BioRender.com.

Wszystkie procedury eksperymentalne są zatwierdzone przez Komitet Bioetyczny na Universidad Austral de Chile, Chile (protokół nr 503/2023) i przestrzegają norm nałożonych przez Komitet Bioetyczny Narodowej Agencji Badań i Rozwoju Chile (ANID), a także wytycznych Dyrektywy Rady Europejskiej dotyczącej opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. W niniejszym badaniu wykorzystano dorosłe (3-6 miesięcy) myszy CF-1 obojga płci (30-45 g). Eutanazja była dokonywana przez przedawkowanie wziewnego środka znieczulającego, po którym następowała wykrwawienie. Odczynniki i sprzęt użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Elektroporacja mięśni LAL in vivo
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Delikatnie uspokaj mysz w akrylowej komorze indukcyjnej pod wpływem 2,5% izofluoranu z tlenem 0,8 l/min (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Następnie utrzymuj sedację myszy za pomocą maski z rurką na nos podłączonej do urządzenia do znieczulenia wziewnego pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym. 
		UWAGA: Upewnij się, że mysz jest w stanie uśpienia przed rozpoczęciem procedury; Przetestuj odruch dotyku myszy, delikatnie ściskając jedną stopę kleszczami (wykonuj ten krok za każdym razem po wywołaniu znieczulenia).</li>
		<li>Zdezynfekować obszar szyjki macicy na poziomie szwu strzałkowego czaszki za pomocą antyseptycznego glukonianu chlorheksydyny 2% i wstrzyknąć podskórnie 20 μl hialuronidazy 2 mg/ml w PBS za pomocą strzykawki Hamiltona, aby ułatwić dostęp plazmidu DNA do powierzchni mięśnia.</li>
		<li>Wyłącz przepływ izofluoranu i pozwól myszy oddychać czystym tlenem przez 1 minutę.</li>
		<li>Zważyć mysz, aby obliczyć odpowiednią dawkę meloksykamu (patrz krok 1.3.2).</li>
		<li>Umieść zwierzę w pustej klatce (bez ściółki), aby doszło do siebie po znieczuleniu.</li>
		<li>Umieść zwierzę w normalnym pomieszczeniu na 30 min16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przebieg zabiegu
	<ol>
		<li>Ponownie znieczulić mysz poprzez inhalację 2,5% izofluoranu z mieszaniną tlenu o stężeniu 0,8 l/min (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami) i utrzymywać ją w stanie sedacji przez cały zabieg chirurgiczny za pomocą wziewnego urządzenia do znieczulenia, pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym.</li>
		<li>Ogol okolicę szyjki macicy za pomocą obosiecznej żyletki i zdezynfekuj chlorheksydyną i 70% etanolem 3 razy.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie 8 mm nad szwem strzałkowym czaszki i odsłoń mięsień LAL, delikatnie usuwając tłuszcz i tkankę łączną znajdującą się tuż pod skórą za pomocą nożyczek/kleszczy. 
		UWAGA: Mięsień LAL jest najbardziej powierzchownym mięśniem w okolicy czaszki po nacięciu skóry. Można go łatwo rozpoznać po orientacji włókien mięśniowych, które biegną po przekątnej od środkowej czaszki w kierunku każdej klasy pinna8,16.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki Hamiltona wstrzyknij 10 μl komercyjnie uzyskanego DNA (0,8-1 μg/μL) w PBS do powięzi, która jest rozprowadzana po całym mięśniu, tworząc bańkę.</li>
		<li>Umieść dwie złote elektrody igłowe w odległości 5 mm od siebie, równolegle i nad włóknami mięśniowymi, zajmując całą długość mięśnia LAL (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Za pomocą elektroporatora wygeneruj pięć impulsów o napięciu 100 V/cm każdy, z których każdy trwa 20 ms, o częstotliwości 1 Hz.</li>
		<li>Powtórz procedurę w przeciwległym mięśniu LAL (powtarzając kroki 1.2.4-1.2.6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szycie i rekonwalescencja
	<ol>
		<li>Zszyj skórę (rozmiar szczepu 5/0, igła HR15) za pomocą wchłanialnej nici kwasu poliglikolowego.</li>
		<li>Wstrzykiwać podskórnie przeciwbólowy meloksykam w dawkach 1-2 mg/kg masy ciała w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego.</li>
		<li>Wyłącz przepływ izofluoranu i pozwól myszy oddychać czystym tlenem przez 1 minutę.</li>
		<li>Umieść zwierzę w pustej klatce (bez ściółki), aby doszło do siebie po znieczuleniu.</li>
		<li>Zwierzę należy umieścić w jego zwykłym pomieszczeniu i monitorować je przez 2 dni po operacji lub do czasu wyzdrowienia. Monitoruj objawy bólu lub stresu, przydzielając punkty dla każdego z różnych parametrów, biorąc pod uwagę wcześniej opisane kryteria humanitarnego punktu końcowego19. 
		UWAGA: Umieść mysz w podgrzewanej podkładce pokrytej podkładką chirurgiczną, aby zapobiec spadkowi temperatury ciała podczas operacji. Staraj się nie poświęcać więcej niż 30 minut na zabieg chirurgiczny, zapobiegając w ten sposób śmierci myszy z powodu nadmiernego znieczulenia. Jeśli ekspresja białka daje niski poziom fluorescencji, zaleca się koelektroporację ze znacznikiem (np. tdTomato lub GFP) w stosunku 1:5 (znacznik: DNA będące przedmiotem zainteresowania).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Odnerwienie wywołane uszkodzeniem nerwu
UWAGA: Ten protokół jest modyfikacją wcześniej opisanego protokołu17. Wykonaj tę procedurę z różnicą co najmniej 3 dni od elektroporacji. W zależności od pytań badawczych zabieg ten może być wykonywany przed lub po elektroporacji.
<ol>
	<li>Anestezjologia i ułożenie zwierząt
	<ol>
		<li>Przeprowadzić sedację zwierzęcia w akrylowej komorze indukcyjnej pod wpływem 2,5% izofluoranu z tlenem o stężeniu 0,8 l/min (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).</li>
		<li>Zważyć mysz, aby obliczyć dawkę meloksykamu (patrz krok 2.3.2.).</li>
		<li>Utrzymuj sedację myszy za pomocą maski z rurką na nos podłączonej do urządzenia do znieczulenia wziewnego pod mikroskopem stereoskopowym do preparacji.</li>
		<li>Ustaw mysz po jej lewej stronie (aby oderwić prawy mięsień LAL). Przyklej prawe ucho w kierunku nosa, aby odsłonić tylną część małżowiny usznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przebieg zabiegu
	<ol>
		<li>Ogol tylną część małżowiny usznej za pomocą obosiecznej żyletki i zdezynfekuj chlorheksydyną i 70% etanolem 3 razy.</li>
		<li>Zlokalizuj tylną żyłę uszną i wykonaj nacięcie w skórze, w odległości 2 mm doogonowo od niej, o długości około 5 mm za pomocą nożyczek sprężynowych. Unikaj cięcia naczyń krwionośnych i/lub tkanki mięśniowej.</li>
		<li>Przetnij tłuszcz i tkankę łączną za pomocą kleszczy i nożyczek. Znajdź nerw dodatkowy rdzeniowy; Kontynuuj, aż znajdziesz brzuch mięśnia dwubrzuścowego i chrzęstny kanał słuchowy (półprzezroczysta biaława tkanka) (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A).</li>
		<li>Zlokalizuj początek rozgałęzienia nerwu twarzowego tuż pod mięśniem dwubrzuścowym.</li>
		<li>Podążaj za tylną gałęzią uszną (najbardziej grzbietową gałęzią nerwu twarzowego) i delikatnie usuń otaczającą ją tkankę łączną, ostrożnie unikając bezpośredniej manipulacji nerwów.</li>
		<li>Zmiażdż tylną gałąź uszną nerwu twarzowego przez 30 s, wywierając stały nacisk na nerw za pomocą kleszczy z końcówką nachyloną pod kątem 45°.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szycie i rekonwalescencja
	<ol>
		<li>Zszyj skórę (rozmiar szczepu 5/0, igła HR15) za pomocą wchłanialnej nici kwasu poliglikolowego.</li>
		<li>Wstrzykiwać podskórnie przeciwbólowy meloksykam w dawkach 1-2 mg/kg masy ciała w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego.</li>
		<li>Zdejmij taśmę z ucha, wyłącz przepływ izofluoranu i pozwól myszy oddychać czystym tlenem przez 1 minutę.</li>
		<li>Umieść zwierzę w pustej klatce (bez ściółki), aby doszło do siebie po znieczuleniu.</li>
		<li>Przywróć mysz do jej zwykłej obudowy i monitoruj ją przez 2 dni po operacji lub do czasu wyzdrowienia.</li>
		<li>Po powrocie do zdrowia zbadaj mysz pod kątem błędów w ruchu chorego ucha jako oznaki skutecznego odnerwienia. 
		UWAGA: U zwierząt kontrolnych należy wykonać nacięcie w skórze, odsłonić nerw twarzowy bez bezpośredniego dotykania, a następnie zszyć.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Electroporation and Nerve Injury in Mouse Levator Auris Longus Muscle

<ol><li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of motor nerve terminals.</a> Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).</li>
<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+Coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Zelada, D., Bermedo-Garcia, F., Collao, N., Henriquez, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+function+recovery%3A+Deciphering+a+regenerative+niche+at+the+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">Motor function recovery: Deciphering a regenerative niche at the neuromuscular synapse.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 96 (2), 752-766 (2021).</li>
<li>Kobayashi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+duration+of+muscle+denervation+on+functional+recovery+in+the+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model.</a> Muscle Nerve. 20 (7), 858-866 (1997).</li>
<li>Bermedo-Garcia, F., Zelada, D., Martinez, E., Tabares, L., Henriquez, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+the+murine+neuromuscular+synapse+relies+on+long-lasting+morphological+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of the murine neuromuscular synapse relies on long-lasting morphological adaptations.</a> BMC Biol. 20 (1), 158(2022).</li>
<li>Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+the+mouse+levator+auris+longus+muscle%3A+A+convenient+preparation+to+study+muscle+and+nerve+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: A convenient preparation to study muscle and nerve plasticity.</a> J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20 (11), 740-743 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease%3A+Amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 36 (2), 133-156 (2010).</li>
<li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-and+postsynaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and postsynaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).</li>
<li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J Vis Exp. (55), e3124(2011).</li>
<li>Zelada, D., Barrantes, F. J., Henríquez, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+causes+differential+effects+on+postsynaptic+stability+in+normal+and+denervated+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Lithium causes differential effects on postsynaptic stability in normal and denervated neuromuscular synapses.</a> Sci Rep. 11 (1), 17285(2021).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, Pt 4 1081-1101 (2012).</li>
<li>Mcmahon, J. M., Signori, E., Wells, K. E., Fazio, V. M., Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+electrotransfer+of+plasmid+into+skeletal+muscle+by+pretreatment+with+hyaluronidase%3A+Increased+expression+with+reduced+muscle+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: Increased expression with reduced muscle damage.</a> Gene Ther. 8 (16), 1264-1270 (2001).</li>
<li>Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transfection+of+mammalian+skeletal+muscles+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation.</a> J Vis Exp. (32), e1520(2009).</li>
<li>Ojeda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+levator+auris+longus+muscle%3A+An+amenable+model+system+to+study+the+role+of+postsynaptic+proteins+to+the+maintenance+and+regeneration+of+the+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mouse levator auris longus muscle: An amenable model system to study the role of postsynaptic proteins to the maintenance and regeneration of the neuromuscular synapse.</a> Front Cell Neurosci. 14, 225(2020).</li>
<li>Olmstead, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facial+nerve+axotomy+in+mice%3A+A+model+to+study+motoneuron+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury.</a> J Vis Exp. (96), e52382(2015).</li>
<li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury%3A+A+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Exp Neurol. 207 (1), 64-74 (2007).</li>
<li>Lloyd, M., Wolfensohn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+use+of+distress+scoring+systems+in+the+application+of+humane+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Humane+Endpoints+in+Animal+Experiments+for+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Practical use of distress scoring systems in the application of humane endpoints.</a> Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. , 48-53 (1999).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+Red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. Red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Perez, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p75%28ntr%29+neurotrophin+receptor+is+required+to+organize+the+mature+neuromuscular+synapse+by+regulating+synaptic+vesicle+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">The p75(ntr) neurotrophin receptor is required to organize the mature neuromuscular synapse by regulating synaptic vesicle availability.</a> Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 147(2019).</li>
<li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> J Anat. 237 (5), 827-836 (2020).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+anatomy+of+the+human+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction.</a> Cell Rep. 21 (9), 2348-2356 (2017).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biol. 6 (12), 160240(2016).</li>
<li>Ma, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerating+axonal+growth+promotes+motor+recovery+after+peripheral+nerve+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice.</a> J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).</li>
<li>Sakuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+motor+recovery+after+prolonged+denervation+of+the+neuromuscular+junction+is+not+due+to+regenerative+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lack of motor recovery after prolonged denervation of the neuromuscular junction is not due to regenerative failure.</a> Eur J Neurosci. 43 (3), 451-462 (2016).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li>
<li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry A. 93 (5), 556-562 (2018).</li>
<li>Morris, L. M., Klanke, C. A., Lang, S. A., Lim, F. Y., Crombleholme, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tdtomato+and+EGFP+identification+in+histological+sections%3A+Insight+and+alternatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Tdtomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives.</a> Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).</li>
<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse%3A+A+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).</li>
<li>Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+electroporation+as+a+plasmid+delivery+system+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle.</a> Int J Mol Sci. 20 (11), 2776(2019).</li>
<li>Pérez-García, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+musk+activity+delays+denervation+and+improves+motor+function+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Increasing musk activity delays denervation and improves motor function in ALS mice.</a> Cell Rep. 2 (3), 497-502 (2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Połączenie elektroporacji mięśni in vivo i denerwacji jest cennym eksperymentalnym podejściem do badania niszy regeneracyjnej w NMJ4. Ponieważ mięsień LAL jest powierzchownie odsłonięty, te połączone procedury można łatwo uzupełnić o dostarczenie sond lub leków, które mogą wpływać na ekspresję lub aktywność białka12. Ponadto elektroporacja genów reporterowych w mięśniu LAL może stanowić cenne narzędzie do śledzenia aktywacji lub hamowania szlaków sygnałowych w kontekście uszkodzenia nerwów i/lub regeneracji NMJ. 
Obie procedury są szybkie, wysoce powtarzalne i łatwe do rozpoznania za pomocą możliwych do zidentyfikowania markerów, zwłaszcza jeśli niektóre szczegóły eksperymentalne są starannie replikowane. Na przykład prawidłowe uszkodzenie nerwu specyficznej tylnej gałęzi usznej nerwu twarzowego polega na zidentyfikowaniu wspomnianych anatomicznych punktów orientacyjnych. Odkryliśmy również, że powtarzalność uszkodzenia zmiażdżenia nerwu zależy od dokładnego czasu zmiażdżenia, przy czym protokół ten wynosi 30 sekund, ponieważ niewielkie zmiany w czasie zmiażdżenia nerwu mogą zmienić profil reinerwacji i powrót do funkcji. Podobnie, dla efektywnej elektroporacji mięśnia LAL niezbędna jest obserwacja pęcherzyka roztworu plazmidu utworzonego pod powięzią mięśniową LAL i prawidłowe ustawienie elektrod pod przejściową przepuszczalnością błon komórkowych i migracją DNA wewnątrz włókien mięśniowych. Co ciekawe, sukces odnerwienia NMJ może być łatwo śledzony przez brak ruchu małżowiny usznej, podczas gdy wydajność elektroporacji można zaobserwować in vivo przy użyciu lunety fluorescencyjnej. Obie metody są minimalnie inwazyjne, wywierając minimalny wpływ na ważne funkcje myszy, łagodząc w ten sposób niepotrzebny stres zwierząt i eliminując potrzebę intensywnej opieki pooperacyjnej.
Integracja różnych paradygmatów uszkodzenia nerwów z elektroporacją mięśni in vivo w różnym czasie może umożliwić ocenę funkcji białek w odniesieniu do różnych wyników funkcjonalnych. Na przykład, wraz z obecnym protokołem krótkotrwałego unerwienia NMJ, resekcja odcinka nerwowego dostarcza informacji na temat przebiegu zwyrodnienia NMJ, podczas gdy wielokrotne uszkodzenia nerwu lub przecięcie nerwu, po którym następuje ponowne zszycie, reprezentują paradygmaty opóźnionej reinerwacji NMJ, przy czym ta ostatnia jest dobrym modelem tego, co dzieje się u ludzi25,26. W tym samym kontekście, czas elektroporacji można regulować, aby badać różne etapy procesu regeneracji NMJ, w celu opóźnienia lub odwrócenia uszkodzenia NMJ, szczególnie biorąc pod uwagę, że elektroporowane plazmidowe DNA w mięśniach dają ekspresję białka przez okres do 4 miesięcy po elektroporacji27.
Procedura elektroporacji opisana w tym protokole osiąga wysoki poziom transgenezy i jest wysoce odtwarzalna, zarówno jako samodzielna metoda, jak i, co ważniejsze, gdy jest stosowana wraz z uszkodzeniem nerwów. Jedną z głównych zalet stosowania znacznika fluorescencyjnego jest to, że pozwala on na identyfikację NMJ z włókien elektroporowanych w celu bardziej precyzyjnej analizy. Obecne eksperymenty zostały przeprowadzone przy użyciu białka fluorescencyjnego tdTomato, ponieważ jest to bardzo jasne białko w porównaniu z innymi czerwonymi, pomarańczowymi i żółtymi białkami fluorescencyjnymi20, wykazuje podwyższoną czułość wykrywania28 i utrzymuje sygnał fluorescencyjny po cyklach zamrażania i rozmrażania29, ale mieliśmy również czułe wykrywanie i powtarzalne wyniki przy użyciu kilku innych białek fluorescencyjnych jako kontroli. Co więcej, dla badań NMJ kluczowe jest, aby metoda stosowana do transgenezy nie zmieniała NMJ ani włókna mięśniowego, co kontrolujemy poprzez ilościowe określenie proporcji jąder centralnych i integralności mięśni16. 
Obecny protokół uszkodzenia zmiażdżenia nerwu powoduje odnerwienie postsynaptyczne NMJ 5 dni po uszkodzeniu, podczas gdy po 10 dniach większość NMJ ulega reinerwacji, co stanowi szybki protokół denerwacji-reinerwacji, w porównaniu z bardziej klasycznym paradygmatem uszkodzenia nerwu kulszowego18. W związku z tym czas powstania tego modelu pozwala na badanie wpływu białek pochodzących z mięśni w procesie reinerwacji, ponieważ można wybrać różne okna czasowe do oceny denerwacji lub reinerwacji NMJ. Co więcej, anatomia mięśnia LAL, jego grubość i zachowany wzór unerwienia pozwalają na wizualizację płytek końcowych i nerwów za pomocą optyki Nomarskiego, wymaganej do testów elektrofizjologicznych z wykorzystaniem zapisów wewnątrzkomórkowych w celu określenia wpływu nadekspresji białka na regenerację funkcjonalną motoryczną30.
Chociaż procedury te są wydajne i solidne, wymagają pewnego poziomu wyszkolenia i wiedzy specjalistycznej oraz mają pewne ograniczenia. Na przykład transgeneza poprzez elektroporację in vivo może być osiągnięta tylko w jednym lub małym zestawie mięśni, więc wydajność elektroporowanych próbek jest ograniczona i ma wpływ lokalny, upośledzając w ten sposób analizy ogólnoustrojowe (behawioralne) w porównaniu z myszami transgenicznymi16,31. Ponadto uszkodzenie nerwów stanowi drastyczny paradygmat odnerwienia mięśni szkieletowych, który nie przypomina modeli przewlekłego odnerwienia, takich jak neurodegeneracja lub starzenie się 6,32,33. W związku z tym, obecny połączony protokół powinien być traktowany jako ważne pierwsze eksperymentalne podejście do analizy potencjalnej roli określonych białek pochodzących z mięśni w utrzymaniu lub przywróceniu synaps nerwowo-mięśniowych, zanim będzie można osiągnąć bardziej czasochłonne i wymagające eksperymenty, takie jak te z udziałem myszy transgenicznych lub transgenezy za pośrednictwem wirusa.
Obecne odkrycia łączące obie metody pokazują, że wydajność elektroporacji ani reinerwacja domen postsynaptycznych są znacząco zmienione, udowadniając w ten sposób zgodność tych procedur w badaniu wpływu białek pochodzących z mięśni na dynamikę NMJ, obejmującą krótko- i długoterminowe skutki po uszkodzeniu nerwów, procesie reinerwacji i późniejszym powrocie do sprawności.

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to synapsa obwodowa, która kontroluje skurcze mięśni i, pośrednio, skoordynowany ruch organizmów1. Jest tworzony przez presynaptyczne zakończenie aksonu ruchowego, postsynaptyczną domenę mięśniową wzbogaconą w receptory acetylocholiny (AChR) i niemielinowe końcowe komórki Schwanna pokrywające zakończenie aksonu2,3,4. Po odnerwieniu NMJ z powodu urazowego uszkodzenia nerwów obwodowych, choroby lub interwencji farmakologicznej, aktywność mięśni kurczliwych zostaje utracona5,6. Ponieważ pewne permisywne mikrośrodowiska umożliwiają szybką i skuteczną regenerację funkcjonalną, poszukiwanie białek, które mogłyby pomóc w procesie regeneracji, jest stałą koniecznością. W tym przypadku połączono dwie procedury, aby konkretnie ocenić potencjalną rolę manipulowania ekspresją białek mięśniowych w krótkoterminowej regeneracji NMJ po uszkodzeniu nerwu.
Mięsień dźwigacza długiego (LAL), znajdujący się na grzbietowej powierzchni czaszki, jest cienkim i płaskim mięśniem, który kontroluje ruch małżowiny usznej. Mięsień LAL składa się z pasm rostralnych i ogonowych, z których każdy zawiera dwie lub trzy warstwy włókien mięśniowych7,8. Tylna gałąź uszna nerwu twarzowego unerwia mięsień LAL, generując dobrze opisany wzór unerwienia składający się z pięciu regionów unerwienia rostralnego (R1-R5) i dwóch ogonowych (C1-C2)8,9,10. LAL jest mięśniem powierzchownie wyeksponowanym i łatwo dostępnym, dlatego jego stosowanie wymaga mało inwazyjnych zabiegów. Pozwala to na wizualizację NMJ za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym, dostarczanie leków, a także interwencję w kompletne preparaty mięśniowe zarówno in vivo, jak i ex vivo11,12. Wszystkie te cechy sprawiają, że mięsień LAL jest doskonałym modelem do badania zachowania i funkcji NMJ10,13.
Elektroporacja in vivo to technika transferu genów, która pozwala na inkorporację egzogennego DNA do tkanki poprzez przejściową przenikanie błon komórkowych i ruchliwość DNA wewnątrz komórek, oba generowane po wywołaniu pola elektrycznego14,15. Zabieg ten jest miejscowy i można go wykonać na każdym etapie rozwoju zwierzęcia. Biorąc pod uwagę unikalne cechy mięśnia LAL, jego elektroporacja in vivo stanowi minimalnie inwazyjną, wysoce wydajną i szybką procedurę16, co umożliwia zaobserwowanie silnej ekspresji białka dwa lub trzy dni po elektroporacji.
Procedura miażdżenia nerwu twarzowego jest szeroko stosowana w badaniach, ponieważ oferuje kilka zalet5,17,18. Protokół ten został wcześniej zmodyfikowany, aby celować w tylną gałąź uszną nerwu twarzowego, który unerwia mięśnie czaszki, w tym mięsień LAL, aby uniknąć paraliżu twarzy; W związku z tym myszy nie wymagają specjalnej opieki po operacji (np. smarującej maści do oczu na utratę odruchu mrugania). Ponieważ unerwienie NMJ w mięśniu LAL rozpoczyna się między 7-9 dniami po urazie6, jest to dobry krótkoterminowy model reinerwacji w porównaniu z powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia nerwu kulszowego w celu odnerwienia mięśni kończyn tylnych, gdzie reinerwacja następuje około trzech tygodni po urazie nerwu18.
Połączenie elektroporacji in vivo i uszkodzenia nerwu twarzowego w mięśniu LAL umożliwi badaczom ocenę zachowania komponentów synaptycznych przeciwko modulacji białek pochodzących z mięśni w różnych okresach regeneracji NMJ, w tym krótko- i długoterminowych efektów morfologicznych6,16, za pomocą szerokiej gamy technik, w tym testów immunohistochemicznych, histologicznych i funkcjonalnych.

<table><tbody><tr><td>#5/45 Kleszcze Dumonta&nbsp;</td><td>Narzędzia naukowe&nbsp;</td><td>11251-35</td><td>Sterylizuj przed użyciem</td></tr><tr><td>anty 2H3</td><td>DSHB</td><td></td><td>Rozcieńczony 1 : 300</td></tr><tr><td>anty S100 Gotowy do użycia</td><td>Dako</td><td>IR504</td><td>Rozcieńczony 1 : 5</td></tr><tr><td>anty SV2</td><td>DSHB</td><td></td><td>Rozcieńczony 1 : 50</td></tr><tr><td>Glukonian chlorheksydyny 2%</td> <td>DifenPharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy do analizy zimnego światła</td><td>Motic</td><td>Model SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Rozcieńczony 1 : 100</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp;</td><td>11252-00</td><td>Sterylizuj przed użyciem</td></tr><tr><td>Dumont Mini Kleszcze &ndash; Styl 5</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp;</td><td>11200-14</td><td>Sterylizuj przed użyciem</td></tr><tr><td>Elektroporator ECM 830</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Złote elektrody igłowe&nbsp;</td><td>Genetrody, BTX</td><td>45-0114</td> Strzykawka <td>Hamilton prosta 10 mm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do znieczulenia wziewnego</td><td>SciVerma Scientific</td><td>M3000 Stół</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>218-082</td><td></td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Instituto de Salud Publica - Chile</td><td></td><td>Dorosłe (3-6 miesięcy) myszy CF-1 obojga płci (30-45 g)&nbsp;</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Schick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture Glicosorb 5/0</td><td>TAGUM</td><td>GS0812. J</td><td>Wchłanialna nić kwasu poliglikolowego&nbsp;</td></tr><tr><td>tdPlazmid pomidorowy</td><td>Addgene</td><td>54642</td><td>plazmid pomidorowy pod kontrolą promotora CMV</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tramadolu 5% (Triamcol)</td><td>Drag Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki pięknej&nbsp;</td><td>91500-09</td><td>Sterylizować przed użyciem</td></tr><tr><td>WGA Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>W7024</td><td>Rozcieńczony</td></tr> <tr><td>&alpha;-BTX Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>B13422</td><td>Rozcieńczyć 1 : 500</td></tr></tbody></table>

połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

Combined In Vivo Electroporation and Short&#45;Term Reinnervation of the Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to synapsa obwodowa kontrolująca skurcz włókien mięśni szkieletowych, aby umożliwić skoordynowany ruch wielu organizmów. W NMJ presynaptyczny koniec aksonu ruchowego styka się z postsynaptyczną domeną mięśniową i jest pokryty końcowymi komórkami Schwanna. Integralność i funkcja NMJ jest zagrożona w kilku warunkach, w tym starzeniu się, chorobach nerwowo-mięśniowych i urazach. Aby przeanalizować potencjalny wkład białek pochodzących z mięśni w utrzymanie i regenerację NMJ, połączono strategię transferu genów in vivo z denerwacją mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL) po mechanicznym uszkodzeniu nerwów. Wcześniejsze odkrycia wykazały, że wymuszona ekspresja kontrolnych białek fluorescencyjnych nie zmienia organizacji NMJ ani neurotransmisji. Procedura ta ma na celu opisanie szczegółowej metody elektroporacji in vivo mięśnia LAL, po której następuje przecięcie lub zmiażdżenie określonej gałęzi nerwu twarzowego unerwiającego mięśnie czaszki, co prowadzi odpowiednio do odnerwienia i reinerwacji NMJ. Połączenie tych eksperymentalnych strategii w wygodnym mięśniu LAL stanowi skuteczną metodę badania potencjalnego udziału nadekspresji lub wyciszenia białek mięśniowych w kontekście krótkotrwałego unerwienia NMJ.

Wysoka kwantowa wydajność fluorescencji białka tdTomato20 sprawia, że jest ono odpowiednim znacznikiem do oceny wydajności elektroporacji. W związku z tym oceniono ekspresję białka tdTomato w mięśniach LAL za pomocą elektroporacji in vivo (Rysunek 1). Mięśnie LAL wypreparowano 21 dni po elektroporacji. Preparaty całego narządu ukazują cienki pasy caudalny (cLAL, niebieski wielokąt) mięśnia LAL z dwoma obszarami unerwienia oraz gruby pas rostralny (rLAL, żółty wielokąt) z pięcioma obszarami unerwienia8,10 (Rysunek 1B). W zależności od miejsca iniekcji DNA oraz rozmieszczenia elektrod, wysoki odsetek włókien mięśniowych, szczególnie z części rLAL, wykazał pozytywną ekspresję tdTomato (Rysunek 1B). W celu oceny wydajności procedury wykonano poprzeczne krioprzekroje zgodnie z opisaną metodą16 (Rysunek 1C). Ilościowa analiza wykazała, że 66,70% ± 5,95% włókien było pozytywnych pod kątem ekspresji tdTomato (Rysunek 1D). Następnie, aby ocenić uszkodzenia włókien mięśniowych, błony mięśniowe znakowano WGA, a jądra DAPI (Rysunek 1C), w celu zidentyfikowania obecności jąder centralnych (groty strzałek) jako oznaki cykli uszkodzenia i regeneracji. Nie stwierdzono istotnych różnic w odsetku włókien z jądrami centralnymi pomiędzy kontrolnymi a elektroporowanymi mięśniami LAL (Rysunek 1E).
Zmiażdżenie tylnej gałęzi usznej nerwu twarzowego prowadzi do denerwacji mięśnia LAL6 (Rysunek 2A). Mięśnie LAL od myszy kontrolnych oraz od myszy 5, 10 i 60 dni po uszkodzeniu nerwu zostały wypreparowane, utrwalone i zabarwione zgodnie z wcześniej opisanymi metodami16,21. W skrócie, przeciwciało SV2 znakuje pęcherzyki synaptyczne i jest stosowane wraz z przeciwciałem 2H3 przeciwko neurofilamentom w celu uwidocznienia całej domeny presynaptycznej6,16,22,23,24. Przeciwciało S100B zastosowano do barwienia komórek Schwanna, natomiast α-BTX służyło do detekcji postsynaptycznych AChR. Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej wykazało całkowitą denerwację NMJ 5 dni po uszkodzeniu nerwu (Rysunek 2B). Domeny postsynaptyczne wydają się być ponownie unerwione 10 dni po uszkodzeniu nerwu (Rysunek 2B). Po 60 dniach (Rysunek 2B) zregenerowane NMJ wykazywały fenotyp podobny do grupy kontrolnej.
W końcu przetestowano połączone zastosowanie elektroporacji in vivo oraz protokołu zmiażdżenia nerwu twarzowego. W tym celu mięśnie LAL poddano elektroporacji wektorem wykazującym ekspresję białka tdTomato, a po 3 dniach wykonano uszkodzenie nerwu. Po 9 dniach mięsień LAL został wypreparowany, utrwalony i zabarwiony w celu uwidocznienia domen presynaptycznych i postsynaptycznych NMJ (Rysunek 3A). Można zaobserwować ekspresję białka tdTomato w włóknach mięśniowych, wraz z odnerwionymi (zielony grot strzałki) i ponownie unerwionymi NMJ (żółte strzałki) (Rysunek 3B). Ilościowa analiza wykazała, że 58,37% ± 4,63% włókien wykazuje pozytywną ekspresję tdTomato (Rysunek 3C, lewy słupek), natomiast 47,00% ± 10,69% domen postsynaptycznych zostało ponownie unerwionych (Rysunek 3C, prawy słupek).
<img alt="Konfiguracja elektromiografii u myszy; mikroskopia fluorescencyjna; analiza włókien tdTomato; wykres statystyczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Wydajny in vivo transfer genów do mięśni LAL za pomocą elektroporacji. Plazmid kodujący białko tdTomato wykazano w mięśniach LAL poprzez in vivo elektroporacja u dorosłych myszy. Roztwór DNA wstrzyknięto pod powięź mięśnia rLAL, a nad mięśniem umieszczono elektrody igłowe wykonane ze złota w celu podania pięciu impulsów o natężeniu 100 V/cm2 o czasie trwania 20 ms i częstotliwości 1 Hz (A). Mięśnie w całości wypreparowano 21 dni po elektroporacji i barwiono pod kątem obecności AChR z użyciem α-BTX (kolor biały). W mięśniu rLAL zaobserwowano elektroporowane włókna wykazujące ekspresję tdTomato (kolor czerwony) (B). Mięsień rLAL został przekrojony w przekroju poprzecznym i zabarwiony WGA (żółty) oraz DAPI (cyjan) (C) do wykrywania odpowiednio błony mięśniowej i jąder komórkowych. Efektywność procedury określono jako procent włókien wykazujących ekspresję tdTomato (czerwone w C) z całkowitej liczby włókien poprzez barwienie WGA (D). Odsetek jąder centralnych (groty strzałek) określono jako parametr uszkodzenia/regeneracji włókien mięśniowych (E). Statystyki przedstawiają średnią ± SEM dla N: trzech zwierząt na grupę (kontrolną i elektroporowaną). Pasek skali = 1 mm (B), 50 µm (C). ns = nieistotne statystycznie; test t-Studenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat anatomii ucha królika przedstawiający nerw twarzowy; mikroskopia regeneracji nerwu w czasie (Ctrl, 5d, 10d, 60d)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Krótkoterminowa regeneracja NMJ z wykorzystaniem protokołu zmiażdżenia nerwu. Aby precyzyjnie zmiażdżyć nerw, gałąź zalustną nerwu twarzowego (cyjan) można skutecznie odsłonić, identyfikując wskaźniki anatomiczne: żyłę zalustną, brzusiec mięśnia dwbrzuchszczeka oraz chrzestną część kanału słuchowego (A). Reprezentatywne obrazy z mikroskopii konfokalnej NMJ mięśnia LAL uzyskane z grupy kontrolnej lub od myszy dorosłych po 5 dniach, 10 dniach i 60 dniach od zmiażdżenia nerwu. NMJ zidentyfikowano poprzez znakowanie aksonów ruchowych i zakończeń (SV2 dla pęcherzyków synaptycznych oraz 2H3 dla neurofilamentów; cyjan), komórek Schwanna (anty-S100 B; żółty) oraz AChRs (α-BTX; magenta) (B). Dolne panele przedstawiają oddzielnie kanały aksonów ruchowych (panele lewe) i AChR (panele prawe). Szare kształty wyrysowano w celu wyznaczenia pozycji domen postsynaptycznych i oceny stanu unerwienia. Paski skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat elektroporacji i urazu nerwu; obrazy mikroskopowe włókien, SV2/2H3, α-BTX; wyniki na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Połączone protokoły elektroporacji in vivo oraz zmiażdżenia nerwu. Mięsień LAL został poddany elektroporacji plazmidem kodującym białko tdTomato (czerwony). Gałąź uszna tylna nerwu twarzowego została zmiażdżona 3 dni po elektroporacji. Po 9 dniach wypreparowano mięsień LAL (A), a komponenty presynaptyczne i postsynaptyczne zidentyfikowano poprzez znakowanie aksonów ruchowych i zakończeń (przeciwciała SV2 oraz 2H3, cyjan) oraz AChR (α-BTX; magenta) (B). Wskazano odnerwioną (zielona grot strzałki) oraz reinerwowaną płytkę motoryczną NMJ (żółta strzałka). Ilościowe oznaczenie proporcji włókien wykazujących ekspresję białka tdTomato (lewy słupek) oraz proporcji domen postsynaptycznych w kontakcie z regenerującym się aksonem ruchowym (prawy słupek) (C). Wyniki przedstawiają średnią ± SEM dla N: 3 myszy na grupę. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół, który łączy elektroporację in vivo i denerwację mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL). Zabieg ten umożliwia badanie potencjalnej roli białek pochodzenia mięśniowego w regeneracji synapsy nerwowo-mięśniowej.

Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many ...

Nasze badania mają na celu zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw powtarzania synapsy nerwowo-mięśniowej oraz ocenę wpływu hamowania lub nadekspresji określonych białek pochodzących z mięśni na ten proces regeneracyjny. Poprzez elektroporację mięśni in vivo zaobserwowaliśmy wpływ białek pochodzących z mięśni na organizację postsynaptycznych receptorów acetylocholiny. Ponadto nasz protokół denerwacji umożliwił nam zidentyfikowanie różnych morfologii domen postsynaptycznych i skorelowanie ich z ich stabilnością.Technika ta służy jako wstępne podejście eksperymentalne do oceny wpływu określonych białek mięśniowych na regenerację NMD, torując drogę dla bardziej skomplikowanych technik edycji genów. Co więcej, protokoły są minimalnie inwazyjne. Ta kombinacja metod eksperymentalnych została wykorzystana do zbadania roli sygnalizacji wiatru w regeneracji NMD.Poprzez ekspresję agonisty lub antagonisty szlaku wiatrowego, przeanalizowaliśmy uszkodzenie nerwów i następujące po nim procesy regeneracji. Nasze przyszłe badania będą dotyczyły wpływu białek pochodzących z mięśni na funkcjonalność organizacyjną synapsy nerwowo-mięśniowej w różnych kontekstach, w tym starzenia się i niektórych patologii, takich jak ALS. Na początek upewnij się, że wszystkie narzędzia do preparowania i przestrzeń robocza zostały autoklawowane i są czyste.Umieść znieczuloną mysz CF-1 na stole operacyjnym. Użyj strzykawki Hamiltona, aby wstrzyknąć podskórnie 20 mikrolitrów 2 miligramów na mililitr hialuronidazy w PBS. Zważ mysz, aby określić przybliżoną dawkę meloksykamu i umieść zwierzę w pustej klatce na 30 minut rekonwalescencji.Po ponownym znieczuleniu myszy wykonaj 8-milimetrowe nacięcie nad szwem strzałkowym czaszki. Za pomocą nożyczek i kleszczy delikatnie usuń tłuszcz i tkankę łączną pod skórą, aby odsłonić mięsień dźwigacza długiego lub LAL. Za pomocą strzykawki Hamilton wstrzyknij 10 mikrolitrów komercyjnie pozyskiwanego DNA do powięzi mięśniowej.Umieść dwie złote elektrody igłowe w odległości pięciu milimetrów od siebie w równoległym ustawieniu nad włóknami mięśniowymi pokrywającymi całą długość mięśnia LAL. Teraz użyj elektroporatora, aby zastosować pięć impulsów elektrycznych o napięciu 100 woltów centymetrów przez 20 milisekund każdy z częstotliwością 1 herca. Badanie mikroskopowe wykazało, że duża część włókien mięśniowych z rostralnej części LAL była dodatnia dla ekspresji tandemowego dimeru pomidora, potwierdzając skuteczny transfer genów mięśni LAL za pośrednictwem elektroporacji in vivo.Na początek ustaw znieczuloną mysz po lewej stronie, aby oderwić prawe mięśnie dźwigacza długiego lub LAL. Przymocuj prawe ucho w kierunku nosa, aby odsłonić tylną część małżowiny usznej. Po ogoleniu skóry i zlokalizowaniu tylnej żyły usznej wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie w skórze, dwa milimetry doogonowo od niej.Za pomocą kleszczy i nożyczek usuń tłuszcz i tkankę łączną, aby odsłonić nerw dodatkowy rdzeniowy, mięsień dwubrzuścowy i chrzęstny kanał słuchowy. Delikatnie usuń otaczającą tkankę łączną, aby odsłonić tylną gałąź uszną nerwu powięziowego. Używając kleszczy z końcówką pod kątem 45 stopni, przyłóż 32. zgniatanie do nerwu ze stałym naciskiem.Na koniec, używając rozmiaru szczepu 5-0 i igły HR-15, zamknij nacięcie szwami z wchłanialnego kwasu poliglikolowego. Po rekonwalescencji i leczeniu meloksykamem należy zbadać mikroskopowo LAL myszy pod kątem odnerwienia. Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej mięśni LAL wykazało całkowite odnerwienie połączenia nerwowo-mięśniowego pięć dni po uszkodzeniu nerwu.

combined-vivo-electroporation-short-term-reinnervation-cranial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy procedury powtarzalnego podawania inhibitorów sygnalizacji muskarynowej do mięśnia dźwigacza małżowiny usznej (LAL) u młodych dorosłych myszy oraz późniejszego barwienia immunocytochemicznego jego złącz neuromięśniowych (NMJs) w preparatach całych organów. Mięsień LAL posiada wyjątkowe zalety w kontekście ujawniania farmakologicznych efektów in vivo w złączach NMJs.

Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych oraz potrójne barwienie immunocytochemiczne mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy

Chrząstki kraniofacjalne rozwijają się w bliskim kontakcie z innymi tkankami i są trudne do manipulacji u żywych zwierząt. Wykorzystujemy elektroporację do dostarczania narzędzi molekularnych podczas wzrostu szkieletu kraniofacjalnego, z pominięciem wczesnych efektów embrionalnych. Podejście to pozwoli nam na efektywne testowanie cząsteczek kandydackich in vivo.

Elektroporacja mezenchymy kraniofacialnej

Komórki otoczki węchowej (OEC) to komórki grzebienia nerwowego, które umożliwiają wzrost pierwotnych neuronów węchowych. Ta specyficzna właściwość może być wykorzystana do przeszczepu komórkowego. Przedstawiamy w niniejszej pracy model transplantacji komórkowej oparty na zastosowaniu OEC w modelu uszkodzenia nerwu krtaniowego.

Przeszczep komórek osłonki węchowej w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów obwodowych

Użycie nerwu żwacza jako nerwu dawczego stanowi jednoetapową alternatywę dla kryterium, standardowej dwuetapowej procedury przeszczepu nerwu poprzeczno-twarzowego i swobodnego transferu mięśni w paraliżu twarzy. Przedstawiamy szczegółowy opis, jak bezpiecznie wykonać tę technikę z transferem mięśni gracilis oraz omawiamy wskazania i ograniczenia.

Jednoetapowa dynamiczna reanimacja uśmiechu w nieodwracalnym porażeniu twarzy poprzez swobodny funkcjonalny transfer mięśni

Protokół opisany w tym artykule wykorzystuje mięsień levator auris longus (LAL) myszy do rejestrowania spontanicznych i wywołanych przez nerwy potencjałów postsynaptycznych (zacisk prądowy) i prądów (zacisk napięcia) w złączu nerwowo-mięśniowym. Zastosowanie tej techniki może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów transmisji synaptycznej w warunkach normalnych i chorobowych.

Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego

Zwierzęce modele implantów ślimakowych mogą poszerzyć wiedzę na temat technologicznych podstaw leczenia trwałego odbiorczego ubytku słuchu za pomocą stymulacji elektrycznej. W badaniu przedstawiono protokół chirurgiczny ogłuszenia i implantacji ślimakowej zestawu elektrod u myszy, a także ocenę funkcjonalną z odpowiedzią słuchową pnia mózgu.

Operacja wszczepienia implantu ślimakowego i elektrycznie wywołane nagrania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u myszy C57BL/6

Elektroporacja to skuteczne podejście do dostarczania interesujących genów do komórek. Stosując to podejście in vivo na neuronach zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy (DRG), opisujemy model do badania regeneracji aksonów in vivo.

Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

Ten protokół opisuje powtarzalne podejście do chirurgii nerwu twarzowego w modelu szczurzym, w tym opisy różnych indukowalnych wzorców urazów.

Chirurgia nerwu twarzowego w modelu szczurzym w celu zbadania hamowania i regeneracji aksonów

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji wszczepialnego systemu do chronologicznego zapisu in vivo wywołanych i spontanicznych potencjałów elektromiograficznych. System jest stosowany do badania unerwienia mięśni krtani po uszkodzeniu nerwów.

Wszczepialny system do przewlekłej elektromiografii in vivo

Urazy objętościowe utraty mięśni (VML) przekraczają endogenne zdolności regeneracyjne, skutkując trwałymi deficytami funkcjonalnymi. Obecne badania nad VML koncentrują się głównie na mięśniach kończyn i tułowia. Aby rozszerzyć badania mechanistyczne VML na mięśnie czaszkowo-twarzowe, niniejszy artykuł opisuje metodę in vivo do podłużnej oceny funkcji mięśni żwaczowych przed i po urazie VML.

Funkcjonalna ocena in vivo mięśnia masetera szczura po chirurgicznym utworzeniu urazu objętościowego (VML)

Poznaj metodę elektroporacji in vivo i unerwienia mięśnia dźwigacza bocznego zorza długiego u myszy CF-1. Technika ta pozwala badać wpływ białek mięśniowych na regenerację synaps nerwowo-mięśniowych i stabilność receptorów postsynaptycznych.

Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

Przeglądaj więcej filmów