Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki
November 1st, 2024
Tutaj prezentujemy protokół, który łączy elektroporację in vivo i denerwację mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL). Zabieg ten umożliwia badanie potencjalnej roli białek pochodzenia mięśniowego w regeneracji synapsy nerwowo-mięśniowej.
Nasze badania mają na celu zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw powtarzania synapsy nerwowo-mięśniowej oraz ocenę wpływu hamowania lub nadekspresji określonych białek pochodzących z mięśni na ten proces regeneracyjny. Poprzez elektroporację mięśni in vivo zaobserwowaliśmy wpływ białek pochodzących z mięśni na organizację postsynaptycznych receptorów acetylocholiny. Ponadto nasz protokół denerwacji umożliwił nam zidentyfikowanie różnych morfologii domen postsynaptycznych i skorelowanie ich z ich stabilnością.
Technika ta służy jako wstępne podejście eksperymentalne do oceny wpływu określonych białek mięśniowych na regenerację NMD, torując drogę dla bardziej skomplikowanych technik edycji genów. Co więcej, protokoły są minimalnie inwazyjne. Ta kombinacja metod eksperymentalnych została wykorzystana do zbadania roli sygnalizacji wiatru w regeneracji NMD.
Poprzez ekspresję agonisty lub antagonisty szlaku wiatrowego, przeanalizowaliśmy uszkodzenie nerwów i następujące po nim procesy regeneracji. Nasze przyszłe badania będą dotyczyły wpływu białek pochodzących z mięśni na funkcjonalność organizacyjną synapsy nerwowo-mięśniowej w różnych kontekstach, w tym starzenia się i niektórych patologii, takich jak ALS. Na początek upewnij się, że wszystkie narzędzia do preparowania i przestrzeń robocza zostały autoklawowane i są czyste.
Umieść znieczuloną mysz CF-1 na stole operacyjnym. Użyj strzykawki Hamiltona, aby wstrzyknąć podskórnie 20 mikrolitrów 2 miligramów na mililitr hialuronidazy w PBS. Zważ mysz, aby określić przybliżoną dawkę meloksykamu i umieść zwierzę w pustej klatce na 30 minut rekonwalescencji.
Po ponownym znieczuleniu myszy wykonaj 8-milimetrowe nacięcie nad szwem strzałkowym czaszki. Za pomocą nożyczek i kleszczy delikatnie usuń tłuszcz i tkankę łączną pod skórą, aby odsłonić mięsień dźwigacza długiego lub LAL. Za pomocą strzykawki Hamilton wstrzyknij 10 mikrolitrów komercyjnie pozyskiwanego DNA do powięzi mięśniowej.
Umieść dwie złote elektrody igłowe w odległości pięciu milimetrów od siebie w równoległym ustawieniu nad włóknami mięśniowymi pokrywającymi całą długość mięśnia LAL. Teraz użyj elektroporatora, aby zastosować pięć impulsów elektrycznych o napięciu 100 woltów centymetrów przez 20 milisekund każdy z częstotliwością 1 herca. Badanie mikroskopowe wykazało, że duża część włókien mięśniowych z rostralnej części LAL była dodatnia dla ekspresji tandemowego dimeru pomidora, potwierdzając skuteczny transfer genów mięśni LAL za pośrednictwem elektroporacji in vivo.
Na początek ustaw znieczuloną mysz po lewej stronie, aby oderwić prawe mięśnie dźwigacza długiego lub LAL. Przymocuj prawe ucho w kierunku nosa, aby odsłonić tylną część małżowiny usznej. Po ogoleniu skóry i zlokalizowaniu tylnej żyły usznej wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie w skórze, dwa milimetry doogonowo od niej.
Za pomocą kleszczy i nożyczek usuń tłuszcz i tkankę łączną, aby odsłonić nerw dodatkowy rdzeniowy, mięsień dwubrzuścowy i chrzęstny kanał słuchowy. Delikatnie usuń otaczającą tkankę łączną, aby odsłonić tylną gałąź uszną nerwu powięziowego. Używając kleszczy z końcówką pod kątem 45 stopni, przyłóż 32. zgniatanie do nerwu ze stałym naciskiem.
Na koniec, używając rozmiaru szczepu 5-0 i igły HR-15, zamknij nacięcie szwami z wchłanialnego kwasu poliglikolowego. Po rekonwalescencji i leczeniu meloksykamem należy zbadać mikroskopowo LAL myszy pod kątem odnerwienia. Obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej mięśni LAL wykazało całkowite odnerwienie połączenia nerwowo-mięśniowego pięć dni po uszkodzeniu nerwu.
Przegląd
Niniejsze badanie prezentuje protokół wykorzystujący elektroporację in vivo i denerwację mięśnia czworobocznego ucha (LAL) w celu zbadania ról białek pochodzących z mięśni w regeneracji synaps nerwowo-mięśniowych. Badając wpływ określonych białek, protokół ten ma na celu wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw stabilizacji postsynaptycznych receptorów acetylocholinowymi oraz zbadanie implikacji dla procesów regeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia regeneracyjna
- Mechanizmy molekularne
Tło
- Węzeł nerwowo-mięśniowy jest kluczowy dla skurczu mięśni i jest wpływany na przez różne zdarzenia sygnalizacji komórkowej.
- Zrozumienie regeneracji synaps nerwowo-mięśniowych może dostarczyć wglądu w powrót do zdrowia po urazach nerwów.
- Białka pochodzące z mięśni mogą wpływać na organizację i stabilność synaps w tym procesie.
- Poprzednie badania nie w pełni opisywały rolę określonych białek mięśniowych w regeneracji synaptycznej.
Cel badania
- Ocenić wpływ inhibicji lub nadmiernego ekspresjonowania określonych białek pochodzących z mięśni na regenerację węzła nerwowo-mięśniowego.
- Ustanowić minimalnie inwazyjny protokół do badania procesu regeneracji.
- Analizować zmiany morfologiczne w domenach postsynaptycznych po denerwacji.
Stosowane metody
- Badanie wykorzystuje elektroporację in vivo do transferu genów w mięśniu LAL u znieczulonych myszy CF-1.
- Denerwacja mięśnia LAL jest przeprowadzana w celu zbadania wpływu na organizację receptorów postsynaptycznych.
- Protokół obejmuje stosowanie impulsów elektrycznych do skutecznego transferu genów, z odzyskiem i monitorowaniem po zabiegu.
- Przeprowadza się badania mikroskopowe i konfokalne w celu analizy denerwacji węzła nerwowo-mięśniowego.
Główne wyniki
- Technika elektroporacji osiągnęła wysokie współczynniki ekspresji oznaczonego białka w włóknach mięśniowych.
- Denerwacja doprowadziła do identyfikowalnych zmian morfologicznych w domenach postsynaptycznych, korelowanych z wynikami stabilności.
- Przyszłe badania zajmą się starzeniem się i chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak ALS, poprzez ocenę białek pochodzących z mięśni.
Konkluzje
- To badanie demonstruje nowatorskie podejście do zrozumienia wpływu białek pochodzących z mięśni na stabilność synaps i regenerację.
- Opisane metody mogą służyć jako podstawowe kroki w kierunku bardziej złożonych przedsięwzięć genetycznych i terapeutycznych.
- Zdobyte wglądy mogą znacząco wpłynąć na zrozumienie dynamiki węzła nerwowo-mięśniowego w kontekście zdrowia i choroby.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding the molecular mechanisms of neuromuscular junction (NMJ) regeneration is critical for de-risking early-stage neuromuscular target validation and informing translational strategies for diseases such as ALS. The combined in vivo electroporation and short-term reinnervation protocol enables precise interrogation of muscle-derived protein function in NMJ maintenance and repair, supporting predictive confidence in target selection and mechanistic hypotheses. This approach positions R&D teams to make informed go/no-go decisions at key inflection points in neuromuscular discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of muscle protein overexpression or silencing on NMJ regeneration.
- Supports mechanistic de-risking by correlating protein function with postsynaptic domain stability.
- Facilitates hypothesis-driven evaluation of candidate targets in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo platform for quantifying postsynaptic acetylcholine receptor organization.
- Enables reproducible assessment of NMJ morphology following genetic manipulation.
- Supports standardization of readouts for downstream screening of modulators affecting NMJ repair.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by modeling NMJ regeneration in contexts relevant to aging and neuromuscular disease.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation of muscle-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative, disease-relevant outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional validation of muscle-derived targets and supporting quantitative analysis of NMJ regeneration.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on the role of specific proteins in NMJ repair and maintenance.
- Screening: Provides reproducible, quantitative endpoints for evaluating genetic or pharmacological interventions.
- Analytics: Delivers confocal imaging and morphological data to compare experimental conditions and inform target prioritization.
- Translational Research: Models regenerative processes relevant to neuromuscular disease and aging, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable in vivo platform adaptable to diverse muscle proteins and signaling pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in NMJ biology.
- Operational Value: Standardizes in vivo gene transfer and denervation workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuromuscular targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in vivo electroporation, microsurgery, and confocal imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for gene transfer and high-resolution microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of surgical and analytical protocols for reproducibility.
- Adaptable to other muscle groups or animal models with protocol optimization.
- Potential variability in animal responses and technical execution must be managed through rigorous controls.
