Name: Transfekcja molekularnego klonu rDNA Naegleria gruberi do trofozoitów N. gruberi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Poznaj metodę transfekcji trofozoitów Naegleria gruberi przy użyciu elementu CERE. Protokół umożliwia stabilne utrzymanie DNA przez wiele podań, co pozwala badać replikację DNA i otwiera drogę do manipulacji genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były częściowo finansowane z grantu z Funduszu George'a F. Haddixa Uniwersytetu Creighton (KMD). Rysunek 1 jest generowany w biorender.com, a rysunek 3 jest generowany w benchling.com.

Szczegóły dotyczące gatunków, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów. Sekwencja konstrukcji pGRUB 17 004 par zasad znajduje się w pliku uzupełniającym 1.
1. Hodowla trofozoitów
<ol>
	<li>Rozmrażać zamrożone trofozoity N. gruberi w temperaturze 37 °C przez 3 min.</li>
	<li>Zaszczepić trofozoity w kolbach T25 w zmodyfikowanym peptonie/ekstrakcie drożdżowym/kwasie nukleinowym/kwasie foliowym/heminie 10% pożywką dla płodowej surowicy cielęcej (PYNFH) plus 2% buforem (fosforan disodowy, diwodorofosforan potasu).</li>
	<li>Hoduj trofozoity w temperaturze 25 °C aż do ~80% zlewania się, gdzie wykazują morfologię ameboidalną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: Podczas początkowego ożywiania kultury trofozoitów ze stanu zamrożenia, może minąć do 5-7 dni, zanim T25 stanie się zlewny. Dekantuj pożywkę co 3-4 dni i zastąp ją nową.</li>
	<li>Umieść kolby zlewające się na lodzie na 5-10 minut, aby uwolnić przylegające trofozoity z plastiku. Delikatnie zamieszać kolbę, aby usunąć wszelkie pozostałe przylegające komórki. Trofozoity mają teraz "zaokrągloną w górę" morfologię (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</li>
	<li>Podzielić kultury w stosunku 1:2 do 1:4 do nowych kolb do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Usuń PYNFH i zastąp go sterylnymi środkami do torbowania (120 mM chlorek sodu, 0,03 mM chlorek magnezu, 1 mM fosforan disodowy, 1 mM diwodorofosforan potasu, 0,03 mM chlorek wapnia, 0,02 mM chlorek żelaza, pH 6,8)22 do encyst N. gruberi. 
	UWAGA: Większość trofozoitów otorbia się po 72 godzinach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Opróżnianie powinno nastąpić w ciągu 72 godzin.</li>
	<li>Usunąć torbiele z kolb, odwirować przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C i ponownie zawiesić torbiele w pożywce PYNFH z 10% płodową surowicą cielęcą w celu wygładzenia komórek. Inkubować w temperaturze 25 °C przez 24 godziny, aż trofozoity zaczną się pojawiać.</li>
</ol>
2. Transfekcja trofozoitów
<ol>
	<li>Umieścić trofozoity na 6-dołkowej płaskodennej płytce do hodowli tkankowej (1 ml 1 x 106 trofozoitów/ml) i wyhodować w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Transfekuj komórki, gdy osiągną 70%-80% zlewania (~10,4 x 104 komórki/cm2 w 6-dołkowych klastrach). Przed użyciem podgrzej odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę odczynnika plazmid-transfekcja w następujący sposób: 75 ng plazmidowego DNA i 0,225 μl odczynnika do transfekcji w 200 μl pożywki PYNFH bez FBS. Przygotować wystarczającą ilość mieszaniny odczynnika do transfekcji plazmidu i transfekcji, aby wykonać transfekcję w dwóch egzemplarzach. 
	UWAGA: W tym badaniu użyto plazmidu bakteryjnego zawierającego pełnowymiarowy klon N. gruberi CERE (pGRUB). Pusty plazmid (pGEM) został użyty jako kontrola negatywna (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Mieszaninę odczynnika do transfekcji plazmidu inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Usuń ~800 μL pożywki z monowarstw trofozoitu tuż przed transfekcją.</li>
	<li>Umieść mieszaninę odczynnika plazmid-transfekcja na trofozoitach.</li>
	<li>Delikatnie obracaj płytkę co 15 minut, aby zapobiec agregacji nośnika na krawędziach płytki.</li>
	<li>Przemyć monowarstwy raz 2 ml pożywki wzrostowej po 1 godzinie inkubacji w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Potraktować monowarstwy 10 M DNazą w 1 ml 10x buforu DNazy przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu usunięcia resztkowego plazmidowego DNA, przemyć raz pożywką wzrostową, dodać 2 ml świeżej pożywki i umieścić w temperaturze 25 °C. Inkubować płytkę przez 24-36 godzin.</li>
	<li>Umieść płytkę na lodzie na 10 minut, aby uwolnić komórki.</li>
	<li>Podziel jedną studnię (1:2) na dwie nowe.</li>
	<li>Zbierz trofozoity z pozostałych studni do celów eksperymentalnych. 
	UWAGA: Wszystkie kultury są wykonywane w dwóch egzemplarzach. Dla każdego warunku 1 studzienka jest używana do przejścia, a 1 służy do izolacji CERE.</li>
</ol>
3. Izolacja CERE od Naeglerii
<ol>
	<li>Oblicz liczbę trofozoitów w każdym studzience użytej do izolacji CERE za pomocą barwienia wykluczającego błękitem trypanowym i hemocytometru23.</li>
	<li>Umieść trofozoity w probówce o pojemności 2,0 ml.</li>
	<li>Przemyt trofozoity raz na 100 mM chlorku sodu (pH 7,5) przez odwirowanie (600 x g, 10 min, 4 °C). 
	UWAGA: Chlorek sodu zapobiega przywieraniu trofozoitów do boków rurki.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osady komórek w 100 μl 100 mM EDTA (pH 7,5).</li>
	<li>Umieścić probówkę w bloku grzewczym na 15 minut w temperaturze 98 °C w celu lizy komórek i dezaktywacji enzymów w trofozoitach. 
	UWAGA: Ten krok dezaktywuje DNazy, które są obfite w trofozoity Naegleria. DNazy mogą zakłócać zdolność wykrywania natywnego CERE i klonu molekularnego w kroku 4. Wydajność DNA zmniejsza się, gdy w kroku 3.4 używa się ponad ~3 x 106 komórek.</li>
	<li>Odwirować probówki z maksymalną prędkością (16 000 x g) w temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby osadzać resztki.</li>
	<li>Przenieść supernatanty do nowej probówki.</li>
	<li>Etanol wytrącić supernatanty z 0,5 objętości 7,5 M octanu amonu (pH 7,5), 3 objętościami bezwzględnego etanolu i 1 μl 10 mg/ml glikogenu jako nośnika.</li>
	<li>Odwróć probówkę kilka razy i umieść probówkę w temperaturze -80 °C na co najmniej 1 godzinę lub na noc.</li>
	<li>Ogrzać próbki do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 16 000 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć osad 70% etanolem przez odwirowanie przez 5 minut przy 16 000 x g (w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Usuń etanol i susz granulat na powietrzu przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić wysuszone granulki w sterylnej wodzie dejonizowanej (DI). Normalizuj objętość do 10 000 trofozoitów na μl.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia w PCR.</li>
</ol>
4. Wykrywanie metodą PCR przekształconych trofozoitów
<ol>
	<li>Użyj 20 000 odpowiedników komórkowych DNA, starterów 600 nM (Tabela 1) i polimerazy Taq i wykonaj PCR24. 
	UWAGA: Startery, które odróżniają natywne CERE od sklonowanego CERE, są wymienione w Tabeli 1, podobnie jak warunki PCR. Rysunek 3 pokazuje położenie podkładów na konstrukcjach. PCR będzie wymagał optymalizacji w zależności od użytych starterów, a także zastosowanej konkretnej mieszanki PCR.</li>
	<li>Mikrofale 0,8% agarozy w 1x bazie Tris, kwasie octowym i buforze EDTA (TAE) aż agaroza się rozpuści.</li>
	<li>Schłodzić agarozę do temperatury ~50 °C w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wlej roztwór do tacki do odlewania żelu zawierającej grzebień do tworzenia studzienek.</li>
	<li>Pozostaw żel w temperaturze pokojowej do zestalenia.</li>
	<li>Umieść żel w aparacie do elektroforezy.</li>
	<li>Zdekantować 1x TAE do komory elektroforetycznej, aż żel zostanie pokryty.</li>
	<li>Wyjmij grzebień.</li>
	<li>Dodaj 6x barwnik ładujący (0,25% błękitu bromfenolowego, 0,25% cyjanolu ksylenowego, 30% glicerolu) do próbek i załaduj żel. Użyj drabinki DNA, aby określić rozmiar produktu PCR.</li>
	<li>Podłącz elektrodę, włącz zasilanie i uruchom żel pod napięciem 80 V przez ~1,5-2 godziny.</li>
	<li>Wyłącz zasilanie i usuń żel.</li>
	<li>Wybarwić żel barwnikiem DNA (np. 10 μl 10 mg/ml bromku etydyny) w 100 ml wody demineralizowanej przez 10 minut.</li>
	<li>Odplamić żel przez 20 minut w wodzie DI.</li>
	<li>Wizualizuj żel na systemie światła ultrafioletowego (UV) i udokumentuj wyniki.</li>
</ol>

Using a CERE-Based Vector for Transfection of Naegleria gruberi Trophozoites

<ol><li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+we+know+by+now+about+the+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">What do we know by now about the genus Naegleria.</a> Exp Parasitol. 145, Suppl S2-S9 (2014).</li>
<li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+research+on+the+Amoeboflagellate+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Protozool%22%5BJournal%5D)">A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria.</a> Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).</li>
<li>Fulton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+in+Naegleria+gruberi%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation in Naegleria gruberi.</a> Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).</li>
<li>Grace, E., Asbill, S., Virga, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naegleria+fowleri%3A+Pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22AAC%22%5BJournal%5D)">Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options.</a> AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).</li>
<li>Moseman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Battling+brain-eating+amoeba%3A+enigmas+surrounding+immunity+to+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri.</a> PLOS Pathog. 16 (4), e1008406(2020).</li>
<li>Marciano-Cabral, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Naegleria+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of Naegleria spp.</a> Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).</li>
<li>Piñero, J. E., Omaña-Molina, M., Chávez-Munguía, B., Lorenzo-Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Naegleria fowleri.</a> Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).</li>
<li>Zysset-Burri, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+pathogenicity+factors+of+the+free-living+amoeba+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri.</a> BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).</li>
<li>Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Naegleria+lovaniensis%2C+the+basis+for+a+comparative+approach+to+unravel+pathogenicity+factors+of+the+human+pathogenic+amoeba+N.+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">The genome of Naegleria lovaniensis, the basis for a comparative approach to unravel pathogenicity factors of the human pathogenic amoeba N. fowleri.</a> BMC Genom. 19, 654-665 (2018).</li>
<li>Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sequencing+improves+the+draft+genome+of+the+human+pathogenic+amoeba+Naegleria+fowleri%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri.</a> Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).</li>
<li>Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Naegleria+genome%3A+A+free-living+microbial+eukaryote+lends+unique+insights+into+core+eukaryotic+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology.</a> Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).</li>
<li>Clark, C. G., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+genes+of+Naegleria+gruberi+are+carried+exclusively+on+a+14-kilobase-pair+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">rRNA genes of Naegleria gruberi are carried exclusively on a 14-kilobase-pair plasmid.</a> Mol Cell Biol. 7 (9), 3027-3031 (1987).</li>
<li>Clark, C. G., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+ribosomal+RNA+genes+are+a+general+feature+of+schizopyrenid+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Protozool%22%5BJournal%5D)">Circular ribosomal RNA genes are a general feature of schizopyrenid amoebae.</a> J Protozool. 35 (2), 326-329 (1988).</li>
<li>Dao, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identify+origin+of+replication+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+two-step+feature+selection+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two-step feature selection technique.</a> Bioinformatics. 35 (12), 2075-2083 (2019).</li>
<li>Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+circular+extrachromosomal+element+of+Naegleria+gruberi+strain+EGB+ribosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the circular extrachromosomal element of Naegleria gruberi strain EGB ribosomal DNA.</a> Genome Announc. 6 (6), e00020-e00021 (2018).</li>
<li>Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+the+Naegleria+fowleri+%28strain+LEE%29+closed+circular+extrachromosomal+ribosomal+DNA+element%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element.</a> Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055(2020).</li>
<li>Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extrachromosomal+elements+of+the+Naegleria+amoebae%3A+How+little+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know.</a> Plasmid. 115, 102567(2021).</li>
<li>Nguyen, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+%28CERE%29+of+Naegleria+australiensis+De+Jonckheere+%28strain+PP+397%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397).</a> Microbiol Resource Announce. 12, e0032123(2023).</li>
<li>Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+of+Naegleria+jadini+Willaert+and+Ray+%28Strain+ITMAP400%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400).</a> Microbiol Resource Announce. 12 (4), 0006123(2023).</li>
<li>Nguyen, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+%28CERE%29+of+Naegleria+pringsheimi+De+Jonckheere+%28strain+Singh%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh).</a> Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).</li>
<li>Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+single+origin+of+replication+in+the+Naegleria+gruberi+extrachromosomal+DNA+element%5BTitle%5D)+AND+%22Protist%22%5BJournal%5D)">Mapping the single origin of replication in the Naegleria gruberi extrachromosomal DNA element.</a> Protist. 170, 141-152 (2019).</li>
<li>Sohn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+liquid+media+for+encystation+of+pathogenic+free-living+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Efficient liquid media for encystation of pathogenic free-living amoebae.</a> Korean J Parasitol. 55 (3), 233-238 (2017).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2001).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Jeong, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+nfa1+gene+cloned+from+pathogenic+Naegleria+fowleri+in+non-pathogenic+N.+gruberi+enhances+cytotoxicity+against+CHO+target+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Expression of the nfa1 gene cloned from pathogenic Naegleria fowleri in non-pathogenic N. gruberi enhances cytotoxicity against CHO target cells in vitro.</a> Infect Immun. 73 (7), 4098-4105 (2005).</li>
<li>Clark, C. G., Cross, G. A. M., De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+evolutionary+divergence+in+the+genus+Naegleria+by+analysis+of+ribosomal+DNA+plasmid+restriction+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of evolutionary divergence in the genus Naegleria by analysis of ribosomal DNA plasmid restriction patterns.</a> Mol Biochem Parasitol. 34 (3), 281-296 (1989).</li>
<li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variation+in+the+ribosomal+internal+transcribed+spacers%2C+including+the+5.8S+rDNA%2C+of+Naegleria+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Protist%22%5BJournal%5D)">Sequence variation in the ribosomal internal transcribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp.</a> Protist. 149 (3), 221-228 (1998).</li>
<li>Rawal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+prediction+of+G4+DNA+as+regulatory+motifs%3A+Role+in+Escherichia+coli+global+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: Role in Escherichia coli global regulation.</a> Genome Res. 16 (5), 644-655 (2006).</li>
<li>Yadav, V. K., Abraham, J. K., Mani, P., Kulshrestha, R., Chowdhury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuadBase%3A+Genome-wide+database+of+G4+DNA+-+occurrence+and+conservation+in+human%2C+chimpanzee%2C+mouse+and+rat+promoters+and+146+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">QuadBase: Genome-wide database of G4 DNA - occurrence and conservation in human, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes.</a> Nucleic Acids Res. 36, D381-D385 (2007).</li>
</ol>

Nie stwierdzono żadnych finansowych konfliktów interesów.

Protokół opisany tutaj jest bardzo prosty, chociaż każdy konstrukt będzie prawdopodobnie wymagał pewnego stopnia optymalizacji, szczególnie stosunku odczynnika do transfekcji DNA, w zależności od charakteru konstruktu i gatunku użytego Naegleria . Przetestowaliśmy tylko jeden dostępny na rynku odczynnik do transfekcji przy użyciu tego protokołu, ale jest prawdopodobne, że kilka innych może być skutecznych. Biorąc pod uwagę, że używany jest pełnowymiarowy klon CERE, zawierający funkcjonalny początek replikacji, a tym samym replikujący się autonomicznie, konstrukt posiada wszystkie niezbędne eukariotyczne mechanizmy replikacji. Gdyby częściowy klon został wstawiony do wektora pGEM, przewiduje się, że transfekowany klon zostanie utracony bardzo szybko po transfekcji, jeśli nie zawiera funkcjonalnego eukariotycznego pochodzenia replikacji, podobnie jak pusty wektor pGEM (Rysunek 2B). Co więcej, dane te pokazują, że obecność prokariotycznego DNA nie zakłóca zdolności klonu molekularnego do zatrzymywania przez trofozoit.
Chociaż odnotowano jeden przypadek transfekcji trofozoitów N. gruberi 25, wkładka użyta w niniejszym badaniu jest znacznie większa (~17 kbp) niż ta, która została transfekowana w poprzednim badaniu (<1 kbp). Chociaż nie wiadomo, jaki maksymalny rozmiar plazmidu może być tolerowany przez Naegleria, niepublikowane dane z naszego laboratorium ustaliły, że ameby z innego rodzaju (Willaertia) zawierają CERE o wielkości około 24 kpz.
Kluczowym krokiem w zapewnieniu, że protokół ten wykrywa DNA w trofozoicie, jest etap leczenia DNazą (krok 2.9), który zapewnia, że resztkowe DNA (tj. DNA, które nie zostało transfekowane) jest eliminowane z kultur. Przeprowadzono kilka procedur kontroli jakości, aby zapewnić integralność protokołu. Najpierw konstrukty zostały zsekwencjonowane. Po drugie, produkty PCR zostały również zsekwencjonowane w celu potwierdzenia ich tożsamości i upewnienia się, że nie doszło do zanieczyszczenia testu oraz potwierdzenia, że produkty PCR nie były wynikiem błędnego przygotowania.
Podczas gdy wykazano udaną transfekcję plazmidu o eukariotycznym pochodzeniu replikacji, z ryc. 4 jasno wynika, że po pierwszym przejściu trofozoitów następuje zmniejszenie sygnału PCR. qPCR przeprowadzono na transfekowanych trofozoitach w czasie i stwierdzono, że poziom pGRUB spada z około 1600 kopii w pasażu 1 do 35 w pasażu 7 (dane nie pokazane), co wskazuje, że transfekowany plazmid prawdopodobnie zostanie utracony w ciągu kilku następnych pasaży. Nie jest to zaskakujące, ponieważ transfekowany plazmid jest obcy trofozoitom i byłby postrzegany jako niepotrzebny lub szkodliwy dla przetrwania ameby.
Istnieje zasadniczy brak wiedzy na temat CERE w Naeglerii. Większość sekwencji CERE w GenBank to sekwencje częściowe, przy czym główny nacisk kładziony jest na rDNA i regiony wewnętrznej transkrybowanej przestrzeni dystansowej (ITS), które są używane do identyfikacji rodzaju (ITS1) i gatunku (ITS2)1,26,27. Podczas gdy sekwencja podjednostek rDNA jest wysoce konserwatywna między Naegleria sp., NRS Naegleria sp. różni się znacznie, zarówno pod względem rozmiaru, jak i kolejności, od około 5,5 kb do 10 kbp 1,15,16,17,18,19,20. Funkcja NRS w Naegleria jest w dużej mierze niezbadanym terytorium, ale zakłada się, że zawiera elementy regulacyjne, w tym między innymi pochodzenie replikacji, promotor i sekwencję zakończenia17. Opierając się na kompletnych sekwencjach CERE w GenBank, wspólną cechą Naegleria CERE jest obecność powtarzających się regionów w NRS, które są bogate w A-T. Funkcja tych regionów jest obecnie nieznana.
Zdolność do transfekcji trofozoitów Naegleria pozwala na badanie kilku aspektów biologii CERE NRS, w szczególności dynamiki i wymagań replikacji CERE. U Escherichia coli G-kwadrupleksy zostały zidentyfikowane w regionach promotorowych niektórych genów28. Struktury G-kwadrupleksu zostały również zidentyfikowane u promotorów szerokiej gamy eukariontów, w tym myszy, szczurów, ludzi i naczelnych innych niż ludzie29. Analiza in silico kilku różnych pełnowymiarowych sekwencji CERE pokazuje, że przewiduje się, że wiele obszarów NRS będzie tworzyć struktury G-kwadrupleksowe. Jeden obszar przewidywanych struktur kwadrupleksu G w NRS kilku Naegleria sp. znajduje się przed początkiem genu 18S. Zdolność do transfekcji trofozoitów pozwoliłaby na eksplorację identyfikacji regionu promotorowego rDNA w CERE w Naegleria poprzez usuwanie/mutowanie sekwencji przed rDNA. Podobnie, podobne badania można przeprowadzić w celu zidentyfikowania sekwencji, które kończą transkrypcję rDNA.
Zachowanie pełnej długości CERE w trofozoitach przez pewien czas pozwoli na przeprowadzenie badań, które skupią się na identyfikacji minimalnego obszaru NRS potrzebnego do replikacji CERE. Chociaż region CERE został zidentyfikowany jako przypuszczalne pochodzenie replikacji20, nie wiadomo, czy do replikacji CERE wymagane są struktury drugorzędowe poza tym regionem, czy też region ten może zostać znacznie skrócony, a ori nadal funkcjonować. Powtarzające się elementy w NRS znajdują się we wszystkich Naegleria sp. zsekwencjonowanych do tej pory 15,16,17,18,19,20. Cel tych sekwencji jest obecnie nieznany. Nie wiadomo jeszcze, czy istnieją one jako element regulatorowy, czy też zostaną usunięte, czy CERE replikuje się w trofozoitach. Powtarzające się sekwencje są specyficzne dla gatunku w Naegleria, ale nie wiadomo, czy sekwencje jednego gatunku mogą funkcjonować u innego. Krótko mówiąc, istnieje niezliczona ilość pytań dotyczących biologii CERE, na które można teraz odpowiedzieć za pomocą techniki opisanej w niniejszym dokumencie.

Rodzaj Naegleria obejmuje ponad 45 gatunków, chociaż jest mało prawdopodobne, że wszyscy członkowie gatunku zostali zidentyfikowani1. Naegleria mogą występować w różnych formach: jako trofozoity (ameby), jako wiciowce lub, gdy zasoby są poważnie ograniczone, jako cysty1,2,3,4. Rodzaj Naegleria jest znany ze swojego jednego szczególnie niebezpiecznego gatunku, Naegleria fowleri, znanego jako 'ameba zjadająca mózg' (recenzja w1,2,3,4,5,6,7), które jest przyczyną prawie zawsze śmiertelnego pierwotnego amebowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych.
Naegleria kodują swoje rDNA na CERE znajdującym się w jąderku. Pełne sekwencjonowanie genomów trzech gatunków Naegleria potwierdza brak rDNA w genomie jądrowym8,9,10,11. Opierając się na ograniczonych sekwencjach CERE o pełnej długości, CERE waha się od około 10 kbp do 18 kbp długości. CERE każdego gatunku Naegleria zawierają pojedynczy cystron rDNA (zawierający rybosomalne DNA 5,8, 18 i 28S) na każdej z około 4 000 CERE na komórkę12,13,14. Oprócz rDNA, każda CERE ma dużą sekwencję nie-rDNA (NRS). Rozmiary CERE różnią się w zależności od gatunku; różnice wynikają głównie z różnej długości NRS, ponieważ sekwencje rDNA są wysoce konserwatywne w całym rodzaju1,15,16,17,18,19,20. Mapowanie pojedynczego początku replikacji DNA w obrębie N. gruberi CERE NRS21 stanowi silne wsparcie dla hipotezy, że Naegleria CERE replikuje się niezależnie od genomu jądrowego.
N. gruberi to niepatogenna ameba często używana do badania biologii Naegleria. Opracowaliśmy metodologię przekształcania trofozoitów N. gruberi za pomocą klonu CERE z tego samego gatunku, aby przetestować hipotezę, że ameby Naegleria tolerują i niezależnie replikują CERE w trofozoitach. Osiągnięto to poprzez przekształcenie N. gruberi z pełnowymiarowym klonem N. gruberi CERE w trofozoity i śledzenie losów klonu dawcy CERE za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Ogólny przegląd protokołu jest opisany w Rysunek 1. Przedstawione w niniejszym dokumencie dane pokazują, że klon dawcy może być wykryty przez co najmniej siedem pasaży w hodowli tkankowej, a także może być utrzymany poprzez torbienie i ekscystację. Badania te stanowią podstawę do analizy replikacji CERE, a także do zbadania jej zastosowania jako wektora transfekcji Naeglerii.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Bio Rad</td><td>161-3102</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7330</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli</td><td></td> kruszonego lodu<td></td>, T-75 Thermo Scientific 130190 <td></td></tr><tr><td></td> Płytka hodowlana, 6-dołkowa Corning 3506 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-4527</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M</td><td>Affymetrix</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>Aparat żelowy do elektroferezy</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6052-45</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa, 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf, 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-8751</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Kwas foliowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876-25G</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Drabinka</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Thermo Scientific</td><td>88871001</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek żelaza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>372870-256</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Magneisum Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>MySpin 12</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><<tr><td>em>N. gruberi</td><td>ATCC</td><td>30224</td><td></td></tr><tr><td>Kwas nukleinowy</td><td>Chem Impex Int' l</td><td>#01625</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>pGEM</td><td>Promega</td><td>P2251</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz elektrofazowy PowerPac HC Odczynniki</td><td>do</td><td></td> chlorku sodu 1645052 <td></td></tr><tr><td></td><td>MCB</td><td>SX0420</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dwuzasadowy</td> Wirówka stołowa <td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td></td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Tris, podstawa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ViaFect Waga</td><td>Promega</td><td>E4981</td><td></td></tr> Denver <tr><td></td><td>Instruments</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

transfekcja molekularnego klonu rdna naegleria gruberi do trofozoitów n. gruberi

Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites

Wszystkie geny rybosomalne trofozoitów Naegleria są utrzymywane w zamkniętym kolistym pozachromosomalnym rybosomalnym DNA (rDNA) zawierającym element (CERE). Chociaż niewiele wiadomo na temat CERE, pełna analiza sekwencji genomu trzech gatunków Naegleria wyraźnie pokazuje, że w genomie jądrowym nie ma cystron rDNA. Co więcej, w N. gruberi CERE zmapowano pojedynczy początek replikacji DNA, co potwierdza hipotezę, że CERE replikuje się niezależnie od genomu jądrowego. Ta cecha CERE sugeruje, że możliwe jest wykorzystanie zmodyfikowanego CERE do wprowadzenia obcych białek do trofozoitów Naegleria. Pierwszym krokiem w badaniu wykorzystania CERE jako wektora w Naegleria było opracowanie protokołu transfekcji N. gruberi za pomocą molekularnego klonu N. gruberi CERE sklonowanego do pGEM7zf+ (pGRUB). Po transfekcji pGRUB był łatwo wykrywany w trofozoitach N. gruberi przez co najmniej siedem pasaży, a także przez torbienie i ekscystację. Jako kontrolę, trofozoity transfekowano wektorem szkieletowym, pGEM7zf+, bez sekwencji N. gruberi (pGEM). pGEM nie został wykryty po pierwszym pasażu po transfekcji do N. gruberi, co wskazuje na jego niezdolność do replikacji w organizmie eukariotycznym. Badania te opisują protokół transfekcji trofozoitów Naegleria i wykazują, że sekwencja plazmidu bakteryjnego w pGRUB nie hamuje udanej transfekcji i replikacji transfekowanego klonu CERE. Co więcej, ten protokół transfekcji będzie miał kluczowe znaczenie dla zrozumienia minimalnej sekwencji CERE, która napędza jego replikację w trofozoitach, a także identyfikacji regionów regulatorowych w sekwencji nierybosomalnej (NRS).

Analiza PCR trofozoitów transfekowanych plazmidem pGRUB wykazuje, że transfekowany CERE jest wykrywalny przez co najmniej siedem pasaży trofozoitów, a także podczas enkystacji i ekskystacji (Rycina 4). Primery użyte w reakcji PCR wiążą się zarówno z wektorem pGEM, jak i z sekwencją CERE, co zapewnia, że PCR nie wykrywa natywnego CERE. Analiza PCR przeprowadzona po transfekcji trofozoitów plazmidem pGEM wykazała wynik negatywny (Rycina 4), co wskazuje, że pusty plazmid nie został utrzymany przez ameby. Rycina 4 pokazuje, że pGEM został utracony już przy pierwszym pasażu – kolejne pasaże, enkystacja oraz ekskystacja dały wyniki negatywne.
<img alt="Schemat hodowli trofozoitów, transfekcji, izolacji i procesu PCR; metoda mikrobiologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig01v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat procedury transfekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy komórek ameboidalnych i sferycznych; porównanie morfologii komórek w skali 10 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Trofozoity N. gruberi (szczep NEG-M) w hodowli. (A) W standardowych warunkach hodowli w temperaturze 25 °C trofozoity N. gruberi wykazują morfologię ameboidalną i przylegają do kolb/płytek hodowlanych. Strzałka wskazuje pseudopodium, które służy do kierunkowego poruszania się trofozoitu. (B) Po inkubacji hodowli N. gruberi na lodzie trofozoity przyjmują okrągłą morfologię i przestają przylegać. (C) Po inkubacji w medium do encystowania przez 24-48 h trofozoity N. gruberi ulegają encystowaniu. Paski skali: 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mapy plazmidów pGEM-7Zf(+) i pGRUB, wskazujący promotory, geny, sekwencje." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Konstrukt pGRUB użyty do transfekcji N. gruberi (NEG-M). Pełnowymiarowy CERE N. gruberi (szczep EBM, 14 007 bp; czerwony) został sklonowany do pGEM7Zf(+) (2 997 bp; zielony), co dało konstrukt o długości 17 004 bp. Strzałki na każdym plazmidzie wskazują położenie starterów PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej, rozdział DNA, analiza wzoru prążków, porównanie pGRUB i pGEM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Wyniki PCR wykrywające pGRUB i pGEM przetransformowane do trofozoitów N. gruberi. PCR wykazuje, że pGRUB jest wykrywany w przetransformowanych trofozoitach przez co najmniej siedem pasaży, cystowanie (En) oraz wycystowanie (Ex). pGEM jest tracone po pierwszym pasażu trofozoitów. P1 = pasaż 1, P7 = pasaż 7. Kontrole negatywne (neg) nie otrzymały DNA w reakcji PCR, natomiast kontrole pozytywne (pos) to DNA pGRUB lub pGEM wprowadzone do PCR. Oczekiwane rozmiary produktów to 656 bp (pGRUB) i 337 bp (pGEM). Cyfry po lewej stronie panelu A wskazują rozmiar najjaśniejszych prążków drabinki DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Nazwa startera</td>
			<td colspan="2" >Sekwencja - 5'-&gt;3'</td>
			<td >Tm</td>
			<td >Wielkość produktu</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pGEM-forward</td >
			<td colspan="2" >CTCTTCGCTATTACGCCAGC</td >
			<td >54</td >
			<td >337 bp</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >pGEM-reverse</td >
			<td colspan="2" >TTGTGTGGAATTGTGAGCGG</td >
			<td ></td >
			<td >337 bp</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >pGRUB-forward</td >
			<td colspan="2" >AGCCCCCGATTTAGAGCTTG</td >
			<td >60.5</td >
			<td >656 bp</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >pGRUB-reverse</td >
			<td colspan="2" >TCGGCTAGAAATGAAGTGAGGAC</td >
			<td ></td >
			<td >656 bp</td >
		</tr>
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Primery PCR i warunki zastosowane w tych badaniach.
Plik uzupełniający 1: Sekwencja konstruktu pGRUB o długości 17 004 par zasad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Ten protokół opisuje metodologię transfekcji trofozoitów Naegleria gruberi za pomocą konstruktu, który jest utrzymywany przez cały okres pasowania trofozoitów in vitro, jak również poprzez torbienie i ekscystację.

Transfekcja molekularnego klonu rDNA Naegleria gruberi do trofozoitów N. gruberi

All ribosomal genes of Naegleria trophozoites are maintained in a closed circular extrachromosomal ribosomal DNA (rDNA) containing element (CERE). While ...

Nasze badania stanowią pierwszy krok do zrozumienia, jakie sekwencje zawarte w zamkniętym kolistym pozachromosomalnym rybosomalnym DNA zawierającym element (CERE) mają kluczowe znaczenie dla umożliwienia replikacji CERE, a także zrozumienia maszynerii replikacji DNA CERE. Protokół ten wypełnia luki w zrozumieniu, w jaki sposób CERE rozmnaża się w Naegleria gruberi i jakie składniki CERE są niezbędne do skutecznego rozmnażania. Nasz protokół oferuje minimalistyczną metodę transfekcji naeglerii, mającą na celu ograniczenie procedur, które mogą zakłócić pracę komórki.W ten sposób CERE rozmnaża się w Naegleria gruberi i jakie składniki CERE są niezbędne do skutecznego rozmnażania. Ustaliliśmy, że gatunki naegleria zawierają unikalne CERE, które różnią się zarówno długością sekwencji, jak i składem nukleotydów. Staramy się stworzyć podstawy do analizy dynamiki molekularnej CERE dla gatunków z rodzaju Naegleria.Nasze wyniki utorowały drogę do pytań dotyczących tego, jakie składniki są niezbędne do replikacji CERE i czy ORI może być wykorzystany do rozmnażania obcych konstruktów w gatunkach Naegleria. Naszym celem jest dalszy postęp w naszych badaniach, rozszerzając się na inne gatunki z rodzaju Naegleria i dostarczając odpowiedzi na temat transfekcji CERE na poziomie wewnątrzgatunkowym. Na początek umieść zamrożone trofozoity naegleria gruberi w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty.Hodowlę trofozoitów w pożywce PYNFH w temperaturze 25 stopni Celsjusza do około 80% zlewania się. Umieść kolbę zlewającą się na lodzie na 5 do 10 minut, aby uwolnić przylegające trofozoity z plastiku. Następnie delikatnie zamieszaj kolbę, aby usunąć wszelkie pozostałe przylegające komórki.Zastąp pożywkę sterylną pożywką do torbienia, aby otorbić komórki naegleria gruberi. Po 48 godzinach usunąć torbiele z kolby. Odwiruj cysty w temperaturze 600G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.Po odwirowaniu ponownie zawieś torbiele w dwóch mililitrach pożywki PYNFH z 10% płodową surowicą cielęcą w celu usunięcia komórek. Inkubuj cysty w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 72 godziny, aż pojawią się trofozoity i osiągną 80% konfluencji. Aby przetransfekować trofozoity, najpierw umieść jeden mililitr trofozoitów na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej z płaskim dnem.Następnie inkubować mieszaninę odczynnika do transfekcji plazmidu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odpipetować około 800 mikrolitrów pożywki z monowarstw trofozoitów tuż przed transfekcją. Następnie dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny odczynników do transfekcji plazmidu do trofozoitów.Delikatnie obracaj płytkę co 15 minut, aby zapobiec gromadzeniu się podłoża na krawędziach płytki i wysychaniu. Po godzinie dodaj 10 jednostek DNA do jednego mililitra buforu 10X DNA i dodaj do studzienek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby usunąć resztki plazmidowego DNA.Teraz umyj płytkę raz jednym mililitrem pożywki wzrostowej. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki. Inkubować płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 do 36 godzin.Po zakończeniu inkubacji podziel zawartość studzienki na nową płytkę w stosunku jeden do dwóch. Następnie zbierz trofozoity z pozostałych studni do dalszej analizy. Trofozoity Naegleria gruberi były ameboidalne i przylegały do kolb hodowlanych w standardowych warunkach hodowli.Ich inkubacja na lodzie zaowocowała powstaniem okrągłych i nieprzylegających trofozoitów. Inkubacja trofozoitów w podłożach otorbień spowodowała ich otorbienie. Na początek dodaj 200 mikrolitrów 100-milimolowego chlorku sodu do probówki zawierającej transfekowane trofozoity naegleria gruberi.Odwirować probówkę o sile 600 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 mikrolitrach 100 milimolowego EDTA. Umieść probówkę w bloku grzewczym na 15 minut w temperaturze 98 stopni Celsjusza, aby zlizować komórki.Wiruj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut na najwyższych obrotach, aby rozdrobnić resztki. Przenieść supernatant do nowej probówki. Następnie dodaj 0,5 objętości octanu amonu, trzy objętości absolutnego etanolu i jeden mikrolitr glikogenu do supernatantu.Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać przed inkubacją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 30 minut lub przez noc. Po inkubacji odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 16 000G. Usuń supernatant bez naruszania osadu i dodaj 200 mikrolitrów 70% etanolu, aby go umyć przed odwirowaniem.Ponownie zawiesić wysuszone granulki w sterylnej wodzie dejonizowanej, aby uzyskać gęstość trofozoitów 10 000 trofozoitów na mikrolitr. Po PCR ze starterem specyficznym dla transfekowanego DNA i wykryciu przekształconych trofozoitów, dodaj dwa mikrolitry barwnika ładującego 6X do próbek CERE. Następnie załaduj barwione próbki na 0,8% żel agarozowy.Po elektrofluorescencji żelu przez 1,5 do dwóch godzin, inkubuj go w barwniku DNA rozcieńczonym w 100 mililitrach wody dejonizowanej. Przenieś poplamiony żel do wody dejonizowanej na 20 minut, aby go odplamić. Wizualizuj żel w systemie światła ultrafioletowego, aby udokumentować wyniki.Analiza PCR wykazała, że pGRUB wykryto w transfekowanych trofozoitach przez co najmniej siedem pasaży. pGEM został utracony po pierwszym pasażu, co wskazuje, że pusty plazmid nie został zatrzymany przez ameby.

transfection-molecular-clone-naegleria-gruberi-rdna-into-n-gruberi

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejsza technika przedstawia efektywny sposób przygotowania defekcyjnych replikacyjnie zapasów retrowirusów kodujących ludzki onkogen, które następnie wykorzystano do indukowania choroby mieloproliferacyjnej w modelu mysim.

Produkcja retrowirusa z defektem replikacyjnym poprzez przejściową transfekcję komórek 293T

Niezawodna metoda wysokowydajnej ekspresji in vitro i następującego po niej zapisu elektrofizjologicznego rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w hodowlach ludzkich komórek embrionalnej nerki (HEK-293T).

Zoptymalizowana strategia transfekcji dla ekspresji i rejestracji elektrofizjologicznej rekombinowanych napięciowo zależnych kanałów jonowych w komórkach HEK-293T

Przedstawiamy nasz zoptymalizowany protokół wysokoprzepustowej nukleofekcji jako wydajny sposób transfekcji pierwotnych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA, bez wywoływania dojrzewania komórek. Dostarczamy ponadto dowodów na skuteczne wyciszenie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Opisujemy klon molekularny wirusa maedi-visna, który wykazuje ekspresję GFP i jest w pełni zakaźny. Replikację tego wirusa można wykryć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Propagowanie i wykrywanie zakaźnego klonu molekularnego wirusa maedi-visna wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Migracja neuroblastów jest kluczowym krokiem w neurogenezie poporodowej. Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania roli kandydatów na regulatory migracji neuroblastów poprzez zastosowanie nukleofekcji DNA/małego RNA spinki do włosów (shRNA) oraz testu migracji 3D z neuroblastami wyizolowanymi z pourodzeniowego strumienia migracyjnego rostralnego gryzoni.

Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Tutaj dostarczyliśmy metodę osiągnięcia stabilnej transfekcji pasożytów Eimeria kurczaka poprzez nukleofektyczne sporozoity lub merozoity drugiej generacji. Genetycznie zmodyfikowane pasożyty eimeriańskie wykazujące ekspresję heterologicznych genów antygenowych mogą być wykorzystywane jako nośniki szczepionek.

Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka

Malaria jest przenoszona przez inokulację stadium sporozoitu Plasmodium przez zakażone komary. Transgeniczne zarodźce pozwoliły nam lepiej zrozumieć biologię malarii i bezpośrednio przyczyniły się do opracowania szczepionki przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodologię generowania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Poznaj metodę transfekcji trofozoitów Naegleria gruberi przy użyciu elementu CERE. Protokół umożliwia stabilne utrzymanie DNA przez wiele podań, co pozwala badać replikację DNA i otwiera drogę do manipulacji genetycznych.

Transfekcja molekularnego klonu rDNA Naegleria gruberi do trofozoitów N. gruberi

Przeglądaj więcej filmów