Transfekcja molekularnego klonu rDNA Naegleria gruberi do trofozoitów N. gruberi
21 czerwca 2024
Ten protokół opisuje metodologię transfekcji trofozoitów Naegleria gruberi za pomocą konstruktu, który jest utrzymywany przez cały okres pasowania trofozoitów in vitro, jak również poprzez torbienie i ekscystację.
Nasze badania stanowią pierwszy krok do zrozumienia, jakie sekwencje zawarte w zamkniętym kolistym pozachromosomalnym rybosomalnym DNA zawierającym element (CERE) mają kluczowe znaczenie dla umożliwienia replikacji CERE, a także zrozumienia maszynerii replikacji DNA CERE. Protokół ten wypełnia luki w zrozumieniu, w jaki sposób CERE rozmnaża się w Naegleria gruberi i jakie składniki CERE są niezbędne do skutecznego rozmnażania. Nasz protokół oferuje minimalistyczną metodę transfekcji naeglerii, mającą na celu ograniczenie procedur, które mogą zakłócić pracę komórki.
W ten sposób CERE rozmnaża się w Naegleria gruberi i jakie składniki CERE są niezbędne do skutecznego rozmnażania. Ustaliliśmy, że gatunki naegleria zawierają unikalne CERE, które różnią się zarówno długością sekwencji, jak i składem nukleotydów. Staramy się stworzyć podstawy do analizy dynamiki molekularnej CERE dla gatunków z rodzaju Naegleria.
Nasze wyniki utorowały drogę do pytań dotyczących tego, jakie składniki są niezbędne do replikacji CERE i czy ORI może być wykorzystany do rozmnażania obcych konstruktów w gatunkach Naegleria. Naszym celem jest dalszy postęp w naszych badaniach, rozszerzając się na inne gatunki z rodzaju Naegleria i dostarczając odpowiedzi na temat transfekcji CERE na poziomie wewnątrzgatunkowym. Na początek umieść zamrożone trofozoity naegleria gruberi w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty.
Hodowlę trofozoitów w pożywce PYNFH w temperaturze 25 stopni Celsjusza do około 80% zlewania się. Umieść kolbę zlewającą się na lodzie na 5 do 10 minut, aby uwolnić przylegające trofozoity z plastiku. Następnie delikatnie zamieszaj kolbę, aby usunąć wszelkie pozostałe przylegające komórki.
Zastąp pożywkę sterylną pożywką do torbienia, aby otorbić komórki naegleria gruberi. Po 48 godzinach usunąć torbiele z kolby. Odwiruj cysty w temperaturze 600G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza.
Po odwirowaniu ponownie zawieś torbiele w dwóch mililitrach pożywki PYNFH z 10% płodową surowicą cielęcą w celu usunięcia komórek. Inkubuj cysty w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 72 godziny, aż pojawią się trofozoity i osiągną 80% konfluencji. Aby przetransfekować trofozoity, najpierw umieść jeden mililitr trofozoitów na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej z płaskim dnem.
Następnie inkubować mieszaninę odczynnika do transfekcji plazmidu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odpipetować około 800 mikrolitrów pożywki z monowarstw trofozoitów tuż przed transfekcją. Następnie dodaj 200 mikrolitrów mieszaniny odczynników do transfekcji plazmidu do trofozoitów.
Delikatnie obracaj płytkę co 15 minut, aby zapobiec gromadzeniu się podłoża na krawędziach płytki i wysychaniu. Po godzinie dodaj 10 jednostek DNA do jednego mililitra buforu 10X DNA i dodaj do studzienek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby usunąć resztki plazmidowego DNA.
Teraz umyj płytkę raz jednym mililitrem pożywki wzrostowej. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki. Inkubować płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 do 36 godzin.
Po zakończeniu inkubacji podziel zawartość studzienki na nową płytkę w stosunku jeden do dwóch. Następnie zbierz trofozoity z pozostałych studni do dalszej analizy. Trofozoity Naegleria gruberi były ameboidalne i przylegały do kolb hodowlanych w standardowych warunkach hodowli.
Ich inkubacja na lodzie zaowocowała powstaniem okrągłych i nieprzylegających trofozoitów. Inkubacja trofozoitów w podłożach otorbień spowodowała ich otorbienie. Na początek dodaj 200 mikrolitrów 100-milimolowego chlorku sodu do probówki zawierającej transfekowane trofozoity naegleria gruberi.
Odwirować probówkę o sile 600 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 mikrolitrach 100 milimolowego EDTA. Umieść probówkę w bloku grzewczym na 15 minut w temperaturze 98 stopni Celsjusza, aby zlizować komórki.
Wiruj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut na najwyższych obrotach, aby rozdrobnić resztki. Przenieść supernatant do nowej probówki. Następnie dodaj 0,5 objętości octanu amonu, trzy objętości absolutnego etanolu i jeden mikrolitr glikogenu do supernatantu.
Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać przed inkubacją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 30 minut lub przez noc. Po inkubacji odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 16 000G. Usuń supernatant bez naruszania osadu i dodaj 200 mikrolitrów 70% etanolu, aby go umyć przed odwirowaniem.
Ponownie zawiesić wysuszone granulki w sterylnej wodzie dejonizowanej, aby uzyskać gęstość trofozoitów 10 000 trofozoitów na mikrolitr. Po PCR ze starterem specyficznym dla transfekowanego DNA i wykryciu przekształconych trofozoitów, dodaj dwa mikrolitry barwnika ładującego 6X do próbek CERE. Następnie załaduj barwione próbki na 0,8% żel agarozowy.
Po elektrofluorescencji żelu przez 1,5 do dwóch godzin, inkubuj go w barwniku DNA rozcieńczonym w 100 mililitrach wody dejonizowanej. Przenieś poplamiony żel do wody dejonizowanej na 20 minut, aby go odplamić. Wizualizuj żel w systemie światła ultrafioletowego, aby udokumentować wyniki.
Analiza PCR wykazała, że pGRUB wykryto w transfekowanych trofozoitach przez co najmniej siedem pasaży. pGEM został utracony po pierwszym pasażu, co wskazuje, że pusty plazmid nie został zatrzymany przez ameby.
Przegląd
To badanie bada metodologię transfekcji dla trofozoitów Naegleria gruberi, koncentrując się na replikacji zamkniętych kołowych pozachromosomalnych elementów DNA rybosomalnego (CERE). Protokół pozwala na stabilne utrzymanie transfekcji podczas przeszczepu in vitro i cykli encystacji-ekscystacji.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Genetyka
- Biologia molekularna
- Biologia komórki
Tło
- Potrzeba zrozumienia propagacji CERE w Naegleria gruberi.
- Unikalne sekwencje CERE i ich zmienność wśród gatunków Naegleria.
- Znaczenie skutecznych metod transfekcji do badania maszyny replikacyjnej DNA.
Zastosowane metody
- Protokoły transfekcji dla trofozoitów Naegleria.
- Wykorzystanie procesów encystacji i ekscystacji.
- Ocena zatrzymania DNA poprzez analizę PCR.
Główne wyniki
- Stabilna transfekcja pGRUB obserwowana przez wiele przeszczepów.
- Analiza PCR potwierdziła obecność transfekowanego DNA.
- Pusty plazmid pGEM został utracony po pierwszym przeszczepie.
Wnioski
- Badanie ustanawia protokół dla transfekcji opartej na CERE w Naegleria gruberi.
- To zapewnia podstawę dla dalszych badań nad dynamiką molekularną CERE w różnych gatunkach Naegleria.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Stable transfection of Naegleria gruberi trophozoites with a molecular clone of CERE enables precise interrogation of extrachromosomal DNA replication mechanisms. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for genetic manipulation platforms in non-traditional eukaryotic systems. The protocol establishes a foundation for developing novel vectors and expanding the toolkit for functional genomics in protists.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of replication origin sufficiency and regulatory sequence function in extrachromosomal DNA.
- Supports mechanistic de-risking by isolating minimal CERE sequences required for propagation.
- Facilitates functional validation of genetic constructs in a eukaryotic protist model.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible system for introducing and maintaining foreign DNA in Naegleria trophozoites.
- Enables quantitative PCR-based detection of transfected constructs across passages.
- Supports assay standardization for evaluating vector stability and replication efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Establishes a platform for future studies on regulatory elements and vector engineering in protist models.
- Enables continuity from molecular discovery to functional validation in non-traditional eukaryotes.
- Supports risk-adjusted advancement of genetic tools for broader eukaryotic applications.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions CERE-based transfection as a foundational tool from early discovery through lead identification in genetic engineering workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on DNA replication origins and regulatory sequence function.
- Screening: Provides a quantitative, PCR-based readout for construct retention and stability.
- Analytics: Enables comparative analysis of vector persistence and loss across experimental conditions.
- Translational Research: Lays groundwork for adapting vector systems to other Naegleria species and related protists.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol for repeated use in functional genomics and vector development studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vector design and replication mechanisms.
- Operational Value: Delivers a reproducible, scalable protocol for stable transfection in protist models.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in extrachromosomal DNA studies, supporting better go/no-go decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic engineering approaches in non-traditional systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protist culture, and PCR-based detection.
- Needs access to tissue culture, electrophoresis, and fluorescence imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in transfection and detection workflows.
- Adaptation to other Naegleria species may require sequence-specific optimization.
- Retention of constructs is dependent on inclusion of functional CERE elements, as non-replicating plasmids are rapidly lost.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:32
Culture and Transfection of Naegleria gruberi Trophozoites for Molecular Studies
4:27
Closed Circular Extrachromosomal Ribosomal DNA (rDNA) Containing Element (CERE) Isolation from Transfected Naegleria Gruberi Trophozoites and PCR Analysis
