Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV
26 kwietnia 2024
Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.
Nasze badania opisują powtarzalne metody oceny zaangażowania we wczesnej fazie komórek TFH specyficznych dla wirusa, w tym ustalenie ostrego testu zakaźnego, wielonasobnego modelu myszy, przeprowadzanie barwienia cytometrią przepływową i przeprowadzanie manipulacji genami opartej na wektorach retrowirusowych. W porównaniu ze stymulacją limfocytów T in vitro, stymulacja in vivo może aktywować limfocyty T szybciej nawet w ciągu 12 godzin i jest w pełni aktywowana do następnej transdukcji retrowirusa. Nasze odkrycia pomogły w badaniach nad mechanizmami leżącymi u podstaw wczesnego zaangażowania różnych specyficznych komórek TFH.
Co więcej, nasze badania przyczynią się do zrozumienia humoru zależnego od limfocytów T, pokory i optymalizacji projektowania szczepionek. Na początek zdobądź sześcio- do ośmiotygodniową inteligentniejszą mysz z dodatnim CD45.1 i wstrzyknij jej 200 mikrogramów peptydu LCMV GP61-77 w 100 mikrolitrach pożywki RPMI. Po pobraniu splenocytów od myszy zawieś je w 2% RPMI, aby osiągnąć gęstość komórek od jednego razy 10 do ośmiu komórek na mililitr i umieść probówkę z komórkami na lodzie.
Dozować 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej wraz ze 150 mikrolitrami buforu barwiącego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem. Odwirować 96-dołkową płytkę o temperaturze 800 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I ostrożnie zdekantować supernatant.
Zwiruj płytkę i dodaj 200 mikrolitrów buforu barwiącego do każdej studzienki. Po ogranulowaniu komórki ponownie zawieś i inkubuj je z powierzchniowym koktajlem przeciwciał na lodzie przez 30 minut w ciemności. Po dwukrotnym umyciu ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach stałego buforu i przenieść je do probówki do cytometrii przepływowej.
Wykonaj analizę cytometrii przepływowej, aby sprawdzić stan aktywacji inteligentnych limfocytów T CD4 dodatnich. Następnie zasiej jeden razy 10, sześć inteligentnych limfocytów T CD4 dodatnich na studzienkę do płytki 24-dołkowej. Wirować komórki w temperaturze 800 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem.
Następnie dodaj jeden mililitr pożywki retrowirusowej i osiem mikrogramów polibrenu do każdej studzienki. Wirowanie transdukuje komórki w temperaturze 800 G przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odrzuceniu pożywki retrowirusowej inkubuj komórki z jednym mililitrem wstępnie podgrzanego 10% RPMI uzupełnionego interleukiną drugą.
Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić ogniwa za pomocą 2% RPMI, aby uzyskać gęstość komórek od jednego razy 10 do ośmiu komórek na mililitr. Aby ocenić wydajność transdukcji, podamy 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.
Inkubuj je na lodzie z powierzchniowym koktajlem przeciwciał, w tym CD4, V, alfa dwa i przeciwciałem związanym ze znacznikiem wektorowym. Umyj komórki i wykonaj cytometrię przepływową, jak pokazano wcześniej. Następnie wstrzyknąć jeden raz 10 do sześciu limfocytów T CD4 dodatnich w inteligentnym teście CD4 CD4 do myszy biorcy C57 BL6 dożylnie, a następnie jeden razy 10 do sześciu jednostek tworzących płytkę LCMV Armstrong następnego dnia.
Po pozyskaniu śledzionitów od myszy wybarwij je, aby sprawdzić pożądane markery. Aby wykryć czynniki transkrypcyjne, inkubuj komórki z 200 mikrolitrami 2% aldehydu paraform w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Na koniec wykonaj cytometrię przepływową, aby wykryć czynniki we wczesnym stadium ostrego zakażenia LCMV.
W trzeciej dobie po zakażeniu stwierdzono zrównoważone rozwidlenie pęcherzykowych limfocytów T pomocniczych i komórek T pomocniczych jeden wśród MIGR one SMART dwóch limfocytów T CD4-dodatnich. W komórkach T MigR1 BCL6 Smart CD4 dodatnich zaobserwowano dominujące różnicowanie komórek T T MigR1 BCL6 Smart CD4 i zwiększone poziomy ekspresji.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokoły służące do oceny wczesnego różnicowania komórek T FH specyficznych dla wirusa oraz manipulowania ekspresją genów w tych komórkach. Opisane metody mają na celu pogłębienie wiedzy na temat aktywacji limfocytów T i jej znaczenia dla projektowania szczepionek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Opracowywanie szczepionek
Wstęp
- Wirusowo-specyficzne komórki T FH odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach immunologicznych.
- Zrozumienie ich wczesnego różnicowania może pomóc w opracowywaniu strategii szczepionkowych.
- Obecne metody badania tych komórek mogą zostać ulepszone.
- Stymulacja in vivo może aktywować komórki T skuteczniej niż metody in vitro.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnych metod oceny różnicowania komórek T FH.
- Zbadanie mechanizmów aktywacji limfocytów T.
- Optymalizacja technik manipulacji genetycznych w komórkach T FH.
Zastosowane metody
- Ustanowienie ostrego modelu mysiego zakażenia wielokrotnego w ramach testu analitycznego.
- Barwienie metodą cytometrii przepływowej do analizy komórkowej.
- Manipulacja genami z wykorzystaniem wektorów retrowirusowych.
- Stymulacja limfocytów T in vivo przy użyciu peptydów LCMV GP61-77.
Główne wyniki
- Stymulacja in vivo aktywuje limfocyty T szybciej niż metody in vitro.
- Opracowane metody są powtarzalne i skuteczne w badaniu komórek T FH.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia odporności zależnej od limfocytów T.
- Badania pomagają w optymalizacji strategii projektowania szczepionek.
Wnioski
- Badanie dostarcza cennych protokołów do badań nad komórkami T FH.
- Zdobyta wiedza może wesprzeć działania w zakresie opracowywania szczepionek.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach w celu dalszego zgłębiania dynamiki limfocytów T.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wczesne różnicowanie wirusowo-specyficznych limfocytów T pomocniczych dla limfocytów B (Tfh) CD4+ stanowi krytyczny punkt zwrotny w zrozumieniu humorowej odporności zależnej od limfocytów T oraz optymalizacji projektowania szczepionek. Niniejszy schemat postępowania umożliwia precyzyjne badanie determinacji losów limfocytów T i funkcji genów podczas ostrej infekcji wirusowej, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów immunologicznych. Podejście to bezpośrednio wspiera strategie translacyjne w procesach opracowywania szczepionek i immunoterapii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczne ograniczenie ryzyka w badaniach nad różnicowaniem linii komórek T podczas ostrej infekcji.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez kwantyfikację wczesnego różnicowania komórek TFH.
- Ułatwia badanie funkcji genów w decyzjach dotyczących losów komórek odpornościowych w oparciu o postawione hipotezy.
- Zapewnia platformę do analizy szlaków istotnych dla odporności humoralnej.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy in vivo i ex vivo do fenotypowania komórek odpornościowych.
- Zapewnia powtarzalne ilościowe wyniki oparte na cytometrii przepływowej w ocenie stanu aktywacji limfocytów T.
- Umożliwia standaryzowaną manipulację genetyczną poprzez transdukcję retrowirusową w celu przeprowadzenia dalszych badań przesiewowych.
- Przygotowuje stabilne modele biologiczne do badań nad wpływem związków chemicznych lub perturbacji genetycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wczesnego mapowania losów limfocytów T z oceną kandydatów na szczepionki.
- Wspiera ciągłość procesu od odkryć mechanistycznych do przedklinicznej oceny immunogenności.
- Umożliwia dostosowanie strategii immunomodulujących do poziomu ryzyka w oparciu o wczesne odczyty biomarkerów.
- Zapewnia wgląd translacyjny w mechanizmy odpornościowe leżące u podstaw trwałych odpowiedzi przeciwciał.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje etapy od wczesnych odkryć, poprzez identyfikację wiodących kandydatów, aż po immunologię przedkliniczną, łącząc badania mechanistyczne z translacyjnymi badaniami nad szczepionkami.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących różnicowania limfocytów T oraz funkcji genów in vivo.
- Przesiewy: Dostarcza ilościowe, powtarzalne dane z cytometrii przepływowej do fenotypowania komórek układu odpornościowego.
- Analityka: Zapewnia wyniki statystyczne do porównywania stanów aktywacji i różnicowania w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne decyzje o losach komórek odpornościowych z przedklinicznymi modelami skuteczności szczepionek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do manipulacji i fenotypowania komórek odpornościowych w wielu programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów immunologicznych oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje fenotypowanie komórek odpornościowych oraz przepływy pracy w manipulacjach genetycznych w celu zapewnienia skalowalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go dla celów immunologicznych i kandydatów na szczepionki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów immunomodulujących z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o wczesne spostrzeżenia mechanistyczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu modeli mysich in vivo oraz analizy cytometrii przepływowej.
- Konieczny jest dostęp do infrastruktury transdukcji retrowirusowej i immunofenotypowania.
- W celu zapewnienia powtarzalności niezbędna jest standaryzacja strategii barwienia i bramkowania pomiędzy zespołami.
- Możliwa może być konieczność adaptacji metody dla różnych modeli wirusowych lub swoistości TCR.
- Przepustowość i skalowalność są ograniczone przez model zwierzęcy oraz wydajność przetwarzania komórek.
