Name: Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Poznaj metody oceny wczesnego różnicowania komórek T FH specyficznych dla wirusa u myszy zakażonych ostrą LCMV. Wykorzystaj cytometrię przepływową i manipulację genową w badaniach immunologicznych nad projektowaniem szczepionek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 32300785 do X.C.), Chińskiego Narodowego Programu Podoktorskiego dla Innowacyjnych Talentów (No. BX20230449 do X.C.) oraz National Science and Technology Major Project (nr 2021YFC2300602 do L.Y.).

Deciphering Early Follicular Helper T-Cell Commitment in Acute LCMV Infection

<ol><li>O'shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+follicular+helper+cell+biology%3A+A+decade+of+discovery+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases.</a> Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).</li>
<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper t cells.</a> Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS+receptor+instructs+T+follicular+helper+cell+versus+effector+cell+differentiation+via+induction+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6.</a> Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+expressing+follicular+helper+CD4+T+cells+are+fate+committed+early+and+have+the+capacity+to+form+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory.</a> J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).</li>
<li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+BLIMP-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEF1+and+TCF1+orchestrate+T%28FH%29+differentiation+by+regulating+differentiation+circuits+upstream+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6.</a> Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF1+is+required+for+the+t+follicular+helper+cell+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection.</a> Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+TCF-1+initiates+the+differentiation+of+T%28FH%29+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection.</a> Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).</li>
<li>Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+control+the+expression+and+activity+of+bcl-6+in+th1+cells+to+regulate+flexibility+with+a+TFH-like+gene+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile.</a> Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).</li>
<li>Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+STAT1+is+required+for+IL-6-mediated+bcl6+induction+for+early+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation.</a> J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+ezh2+primes+the+early+differentiation+of+follicular+helper+T+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection.</a> Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+programs+T%28FH%29+differentiation+by+integrating+phosphorylation-dependent+activation+of+bcl6+and+polycomb-dependent+repression+of+p19ARF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF.</a> Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METTL3-dependent+m%286%29A+modification+programs+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).</li>
<li>Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+is+a+potent+negative+regulator+of+TFH+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation.</a> J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+KLF2+restrains+CD4%2B+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation.</a> Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+e3+ubiquitin+ligase+itch+is+required+for+the+differentiation+of+follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells.</a> Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).</li>
<li>Baumjohann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+cluster+mir-17%7E92+promotes+TFH+cell+differentiation+and+represses+subset-inappropriate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression.</a> Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+complex+mTORC2+promotes+the+longevity+of+virus-specific+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+by+preventing+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis.</a> Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).</li>
<li>Hale, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+memory+CD4%2B+T+cells+with+commitment+to+T+follicular+helper-+and+T+helper+1-cell+lineages+are+generated+after+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection.</a> Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenium-GPX4+axis+protects+follicular+helper+t+cells+from+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis.</a> Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).</li>
<li>Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+MHC-class+II-restricted+TCR-transgenic+mice%3A+Effects+on+humoral+and+cellular+immune+responses+after+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection.</a> Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).</li>
<li>Grosjean, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+mouse+splenic+t+cells+for+ex+vivo+and+in+vivo+T+cell+receptor+stimulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).</li>
<li>Dowling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+bottom-up+proteomic+analysis+of+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).</li>
<li>Choi, Y. S., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+expression+in+TCR+transgenic+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells.</a> Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+expansion+and+retroviral+transduction+of+mouse+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells.</a> J Immunol Methods. 488, 112931(2021).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+CXCR5-+expressing+CD8%28%2B%29+T+cells+curtail+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection.</a> Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+B+helper+T+cells+express+CXC+chemokine+receptor+5%2C+localize+to+B+cell+follicles%2C+and+support+immunoglobulin+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production.</a> J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+mTORC1+promotes+the+generation+and+suppressive+function+of+follicular+regulatory+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells.</a> Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatase+pten+links+platelets+with+immune+regulatory+functions+of+mouse+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+identification+of+T%28fh%2913+cells+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human.</a> J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Badania w dziedzinie limfocytów TFH zostały podkreślone od czasu odkrycia wyspecjalizowanej funkcji komórek TFH we wspomaganiu komórek B. Coraz więcej badań wykazało, że różnicowanie komórek TFH jest procesem wieloetapowym i wieloczynnikowym30, w którym zaangażowanie komórek TFH w los określa się we wczesnym stadium5. Dlatego lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw wcześnie różnicujących się limfocytów TFH ma kluczowe znaczenie dla biologii komórek TFH i racjonalnego projektowania szczepionek. W tym artykule przedstawiliśmy metody dostępu do wczesnego zaangażowania losu specyficznych dla wirusa komórekT FH oraz manipulowania ekspresją genów we wcześnie zróżnicowanych komórkach TFH poprzez wykorzystanie modelu infekcji wirusowej LCMV Armstronga, transgenicznej myszy SM TCR i transdukcji za pośrednictwem retrowirusa.
Receptor chemokiny CXCR5 jest ważnym markerem powierzchniowym, który odróżnia komórki TFH od innych podzbiorów komórek TH CD4 + 6,7,8,31, co wymaga metody barwienia CXCR5 o wysokiej specyficzności i czułości w badaniach nad komórkami T FH. W badaniu przedstawiono trzyetapową metodę barwienia CXCR5 streptawidyną-biotyną w celu identyfikacji podzbioru komórek TFH (Figura 1C). Chociaż utrata swoistości jest jednym z lepkich problemów dla podejść do barwienia przeciwciałami z dwoma lub trzema paciorkowcami o wysokiej czułości, stwierdzono, że sygnał fluorescencyjny przez trzyetapowe barwienie przeciwciałami CXCR5 prawie całkowicie pokrywał się z sygnałem GFP w CXCR5-GFP29 reporterowych limfocytach T SM CD4 + w 3 dniu po zakażeniu (Figura 1D), co sugeruje osiągnięcie zarówno swoistości, jak i czułości za pomocą trzyetapowej metody barwienia przeciwciałami CXCR5. Rzeczywiście, ta strategia barwienia CXCR5 trzema paciorkowcami jest wypróbowana i zaufana i pomogła naukowcom lepiej zbadać biologię komórek TFH 11,14,15,21, a także innych typów limfocytów T z ekspresją CXCR5 29,32.
Po zakażeniu i immunizacji zaangażowanie komórek TFH w los jest na ogół modelowane przez rozwidlone różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + na komórki TFH lub komórki TH bez efektoraFH 2,3,30. Badanie to wykazało zrównoważone rozwidlenie komórek TFH iT H1 w przeniesionych limfocytach T SM CD4 +. Co więcej, te przeniesione limfocyty T SM CD4 + mają odpowiednią ilość komórek we wczesnej fazie infekcji, działając w ten sposób jako odpowiedni model do badania różnicowania limfocytów TFH. Z pewnością ektopowa ekspresja Bcl-6 za pośrednictwem retrowirusa w przeniesionych komórkach T SM CD4 + była silnie ukierunkowana na różnicowanie komórek TFH w porównaniu z kontrolnymi komórkami T SM CD4 + (86,6% w porównaniu z 53,8%) (Figura 3C), co jest zgodne z poprzednim raportem6 i dodatkowo dowodzi dokładności protokołów opisanych w badaniu. Alternatywnie, wyżej wymienione protokoły można również zastosować do retrowirusowego knock-down zainteresowanych genów (np. bcl6, Tcf7) we wcześnie aktywowanych limfocytach T SM CD4 + 11 (dane nie pokazane).
Jednym z ograniczeń w protokole jest kwestia czasu (łącznie ponad 2 godziny) i wieloetapowy proces trzyetapowej metody barwienia CXCR5. Alternatywnie, jednoetapowe18,33 lub dwuetapowe 4,9,34 CXCR5 metody barwienia zastosowano również w badaniach nad komórkami TFH. Porównanie specyficzności/czułości tych metod barwienia CXCR5 jest uzasadnione.
Podsumowując, w ramach obecnego badania opracowano protokoły umożliwiające dostęp do wcześnie różnicujących się komórek TFH specyficznych dla wirusa oraz badanie zainteresowanych genów, które potencjalnie regulują różnicowanie komórek TFH . Protokoły te będą napędzać badania nad wczesnym zaangażowaniem komórekT FH w los.

Napotykając różne patogeny lub zagrożenia, naiwne limfocyty T CD4+ dostosowują swoje odpowiedzi immunologiczne poprzez różnicowanie się w różne podzbiory komórek pomocniczych T (TH) o wyspecjalizowanych funkcjach1. W scenariuszu ostrej infekcji wirusowej duża część naiwnych limfocytów T CD4 + różnicuje się w pęcherzykowe komórki pomocnicze T (TFH), które zapewniają pomoc limfocytom B2,3. W odróżnieniu od innych podzbiorów komórek TH CD4 + (np. Komórek TH1,T H2, TH9 i TH17), komórki TFH wyrażają znaczny poziom CXCR5, który jest receptorem chemokiny dla chemokiny naprowadzającej komórki B CXCL13, umożliwiając komórkom TFH migrację do pęcherzyków komórek B. W pęcherzykach limfocytów B limfocyty TFH pomagają pokrewnym limfocytom B w inicjowaniu i utrzymywaniu reakcji centrum rozrodczego, umożliwiając w ten sposób szybką produkcję przeciwciał o wysokim powinowactwie i długotrwałą pamięć humoralną2,3.
Po ostrym zakażeniu wirusowym, wczesne zaangażowanie w los specyficznych dla wirusa komórek TFH występuje w ciągu 72 h4,5i jest kontrolowane przez chłoniaka z komórek B represora transkrypcji-6 (Bcl-6)5,6,7,8, który działa jako "główny regulator" zarządzający TFH decyzje dotyczące losu komórki. Niedobór Bcl-6 poważnie stępia różnicowanie komórek TFH, podczas gdy ektopowa ekspresja Bcl-6 znacznie sprzyja zaangażowaniu komórek TFH w los. Oprócz Bcl-6 wiele cząsteczek bierze udział w instruowaniu wczesnego zaangażowania komórekT FH w los. Czynniki transkrypcyjne TCF-1 i LEF-1 inicjują różnicowanie komórek TFH poprzez indukcję Bcl-69,10,11. Hamowanie Blimp1, zarówno przez Bcl-6, jak i TCF-1, jest wymagane do wczesnego zaangażowania losu komórekT FH11,12. STAT1 i STAT3 są również wymagane do wczesnego różnicowania komórek TFH13. Poza tym modyfikacje epigenetyczne przez metylotransferazę histonową EZH214,15i metylotransferazę m6A METTL316 pomagają ustabilizować programy transkrypcyjne komórekT FH (zwłaszcza Bcl6 i Tcf7), a tym samym przygotować wczesne zaangażowanie losu komórekT FH. Podczas gdy postępy, w tym wyżej wymienione cząsteczki i inne, podsumowane w innym miejscu3, zostały poczynione w celu zrozumienia transkrypcyjnych i epigenetycznych regulacji zaangażowania wczesnych komórekT FH w los, wcześniej nieznane cząsteczki pozostają do poznania.
W mysim modelu zakażenia wirusem ostrego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV), adoptyjnie przenoszone kongeniczne TCR-transgeniczne limfocyty T CD4+ SMARTA (SM), które specyficznie rozpoznają epitop glikoproteiny LCMVI-A bGP66-77, ulegają różnicowaniu komórek TFH lub TH1 podczas infekcji wirusowej. Ten wzorzec różnicowania bifurkacji TFH/T H1 wspiera postęp modelu zakażenia SM / ostrego LCMV w badaniu biologii komórek TFH specyficznych dla wirusa. Rzeczywiście, model ostrego zakażenia SM/LCMV jest szeroko stosowany w dziedzinie badań nad komórkami TFH i odegrał kluczową rolę w przełomowych odkryciach w biologii komórek TFH. Obejmuje to identyfikację wspomnianego wcześniej Bcl-6 jako czynnika transkrypcyjnego definiującego linię komórek TFH5,6, a także inne ważne czynniki transkrypcyjne (np. Blimp-16, TCF-1/LEF9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218, oraz Itch19) kierujące różnicowaniem komórekT FH, regulacjami potranskrypcyjnymi (np. METTL316 i miR-17~9220) różnicowania komórek TFH, pamięci i plastyczności komórek TFH21,22 oraz racjonalnych strategii szczepień ukierunkowanych na komórkiT FH (np. selenium23).
Obecne badanie opisuje powtarzalne metody dostępu do wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH, w tym (1) stworzenie ostrego modelu myszy SM chimery zakażonego LCMV, odpowiedniego do uzyskania dostępu do wcześnie zróżnicowanych komórek TFH, (2) przeprowadzanie barwienia cytometrią przepływową cząsteczek związanych z wcześnie różnicowanymi komórkami TFH, oraz (3) przeprowadzanie manipulacji genami w SM CD4+ opartej na wektorach retrowirusowych. Limfocyty T. Metody te będą przydatne w badaniach nad wczesnym zaangażowaniem komórekT FH specyficznych dla wirusa we wczesnym losie.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4% roztwór utrwalający paraformaldehyd, 4% PFA</td><td>Beyotime</td><td>P0099-500mL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m sitko komórkowe</td><td>Merck</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anty-mysie TCR V&alpha; 2 (klon B20.1)</td><td>Biolegend</td><td>127812</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anty-mysie CD45.1 (klon A20)</td><td>Biolegend</td><td>110724</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>APC anty-mysie CD25 (klon PC61)</td><td>Biolegend</td><td>101910</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mysz</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BeaverBeads Streptavidin</td><td>Beaver</td><td>22321-10</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna anty-mysie przeciwciało F4/80 (klon BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Biotyna Szczur anty-mysz CD11c (klon N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Biotyna Szczur anty-mysz CD19 (klon 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Biotyna Szczur anty-mysi CD8a (klon 53-6,7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Biotyna Szczur anty-mysz NK-1.1 (klon PK136)</td><td>Biolegend</td><td>108704</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Biotyna Szczur anty-mysie TER-119 / Komórki erytroidalne (klon TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej, BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-T-bet (klon 4B10)</td><td>Biolegend</td><td>644816</td><td>rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anty-mysz CD279 (PD-1) (klon 29F.1A12)</td><td>Mysz Biolegend</td><td>135220</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>C57BL/6J (B6)</td><td></td><td></td> Mysz reporterowa Jackson Laboratory 000664 <td></td></tr><tr><td>CXCR5-GFP</td><td></td><td></td><td>W domu; linia myszy knock-in CXCR5-GFP została wygenerowana przez wstawienie konstrukcji IRES-GFP po otwartej ramce odczytu Cxcr5.</td></tr><tr><td>DMEM 10% pożywka</td><td></td><td></td><td>DMEM zawierająca 10%</td></tr><tr><td>pożywki FBS Pożywka DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>FACSFortesa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu, FBS</td><td>Sigma</td><td>F8318</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo (wersja 10.4.0)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foxp3/Zestaw do barwienia czynnika transkrypcyjnego</td><td>Invitrogen</td><td>00-5523-00</td><td>Zestaw zawiera trzy odczynniki: a. Koncentrat utrwalający/przepuszczalny (4X); b. Rozcieńczalnik utrwalający / przepuszczalny; c. Bufor do przepuszczalności.</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H+L), biotynylowane</td><td>laboratoria wektorowe</td><td>BA-9400-1.5</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>System automatycznego obrazowania komórek Invitrogen EVOS FL</td><td>Bufor</td> izolacyjny ThermoFisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor izolacyjny FACS zawierający 0,5% peptydu BSA i 2mM EDTA</td><td></td> LCMV GP61-77 (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Chińska firma peptydowa <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 633 lub 635 nm</td><td>Life Technologies</td><td>L10199</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>MigR1</td><td>addgene</td><td>#27490</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>addgene</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-mysz CD69 (klon H1.2F3)</td><td>Biolegend</td><td>104508</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>PE Mysz anty-Bcl-6 (klon K112-91)</td><td>BD Biosciences</td><td>561522</td><td>rozcieńczenie 1:50</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Solarbio</td><td>H8761</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony szczur Anti-Mouse CXCR5 (klon 2G8)</td><td>BD Biosciences</td><td>551961</td><td>1:50 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Szczur monoklonalny PerCP anty-mysz CD4 (klon RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100538</td><td>1:200 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>rekombinowana mysia IL-2</td><td>Gibco</td><td>212-12-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Beyotime</td><td>C3702-500mL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 2%</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 zawierający 2% FBS</td></tr><tr><td>SMARTA (SM) Transgeniczna mysz TCR</td><td></td><td></td><td>Linia transgeniczna SM TCR w naszym laboratorium to prezent od dr Rafi Ahmeda (Emory University). Dodatkowo, tę linię myszy można również uzyskać z The Jackson Laboratory (plama #: 030450).</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> barwiący <td>PBS zawierający 2% FBS i 0,01% NaN3</td></tr><tr><td>Streptawidyna PE-cyjanina7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td>Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>TCF1/TCF7 (C63D9) MAb królika (koniugat Alexa Fluor 488)&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>6444S</td><td>Rozcieńczenie 1:400</td></tr><tr><td>Bufor do barwienia komórek TFH,</td><td></td><td></td><td>Bufor FACS zawierający 1% BSA i 2%</td></tr><tr><td>odczynnik TransIT-293</td> w surowicy myszy <td>Mirus Bio</td><td>MIRUMIR2700</td><td></td></tr></tbody></table>

dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek t pomocniczych cd4 + u myszy zakażonych ostrą lcmv

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Komórki T (TFH) są postrzegane jako niezależna linia limfocytów T CD4+, która pomaga pokrewnym limfocytom B w wytwarzaniu przeciwciał o wysokim powinowactwie, tworząc w ten sposób długotrwałą odporność humoralną. Podczas ostrej infekcji wirusowej zaangażowanie w los specyficznych dla wirusa limfocytów TFH jest określane we wczesnej fazie infekcji, a badania wcześnie zróżnicowanych limfocytów TFH mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia zależnej od limfocytów T odporności humoralnej i optymalizacji projektu szczepionki. W badaniu, wykorzystując mysi model zakażenia wirusem ostrego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (LCMV) i transgenicznej myszy TCR-SMARTA (SM) z limfocytami T CD4 + specyficznie rozpoznającymi epitop glikoproteiny LCMV I-ABGP66-77, opisaliśmy procedury uzyskiwania dostępu do wczesnego zaangażowania losu specyficznych dla wirusa komórekT FH na podstawie barwień cytometrii przepływowej. Ponadto, wykorzystując transdukcję retrowirusową limfocytów T SM CD4+, opracowano również metody manipulowania ekspresją genów w wcześnie zróżnicowanych komórkach TFH specyficznych dla wirusa. W związku z tym metody te pomogą w badaniach nad mechanizmem (mechanizmami) leżącym u podstaw wczesnego zaangażowania limfocytówT FH specyficznych dla wirusa.

Charakterystyka wcześnie zróżnicowanych wirusowo-specyficznych komórek TFH podczas ostrej infekcji LCMV 
Aby zbadać wczesne determinowanie losów wirusowo-specyficznych komórek TFH, naiwne kongeniczne komórki T SM CD4+, które specyficznie rozpoznają epitop LCMV GP I-AbGP66-77, przeniesiono adoptywnie do biorców C57BL/6 CD45.2+. Następnego dnia biorcy ci zostali zainfekowani dożylnie wysoką dawką wirusa LCMV Armstrong w modelu ostrej infekcji (Rysunek 1A). W 3. dniu po infekcji przeanalizowano splenocyty biorców C57BL/6 metodą cytometrii przepływowej; wyniki wskazały na obecność dużej ilości przeniesionych komórek T SM CD4+ CD45.1+ (~10% wszystkich komórek T CD4+) (Rysunek 1B), co zapewniło wystarczającą liczbę wirusowo-specyficznych komórek T CD4+ do dalszych badań. Dalsze analizy przeniesionych komórek T SM CD4+ wykazały koekspresję CXCR5 i Bcl-6/TCF-1 oraz wzajemne wykluczanie się ekspresji CXCR5 i CD25/T-bet, co pozwoliło zdefiniować linie TFH (CXCR5+Bcl-6+ lub CXCR5+TCF-1+) oraz TH1 (CXCR5-CD25+ lub CXCR5-T-bet+) (Rysunek 1C). Aby ocenić specyficzność i czułość barwienia przeciwciałem przeciwko CXCR5 zaprezentowanego w badaniu, skrzyżowano wspomnianą linię myszy SM CD45.1+ z linią myszy knock-in CXCR5-GFP, wytworzoną poprzez insercję konstruktu IRES-GFP po otwartej ramce odczytu genu Cxcr529. Następnie komórki SM reporterowe CD45.1+ CXCR5-GFP przeniesiono do biorców C57BL/6. Biorców tych zainfekowano wirusem LCMV Armstrong, a ich splenocyty przeanalizowano w 3. dniu po infekcji. Rzeczywiście, sygnał fluorescencji uzyskany metodą barwienia przeciwciałem CXCR5 w badaniu precyzyjnie pokrywał się z sygnałem GFP w przeniesionych komórkach T SM CD4+ reporterowych CXCR5-GFP29 w 3. dniu po infekcji (Rysunek 1D), co wskazuje na wysoką specyficzność trzystopniowej metody barwienia przeciwciałem CXCR5.
Retrowirusowa nadekspresja Bcl-6 w limfocytach T CD4+ z SM 
Bcl-6 jest jedną z najważniejszych cząsteczek sprzyjających różnicowaniu limfocytów TFH6,7,8. Aby potwierdzić niezawodność obecnego protokołu w uzyskiwaniu wcześnie zróżnicowanych limfocytów TFH, limfocyty T CD4+ SM CD45.1+ aktywowano in vivo i transdukowano supernatantem retrowirusowym z komórek 293T przetransfekowanych plazmidem MigR1 lub plazmidem do nadekspresji MigR1-Bcl6 (Rysunek 2 i Rysunek 3A). Następnie transdukowane retrowirusem limfocyty T CD4+ SM przeniesiono adoptywnie do biorców C57BL/6, które następnie zainfekowano szczepem LCMV Armstrong (Rysunek 3B). W 3. dniu po infekcji stwierdzono zrównoważoną bifurkację limfocytów TFH i TH1 w komórkach MigR1-SM CD4+ T, natomiast w komórkach MigR1-Bcl6-SM CD4+ T zaobserwowano przewagę różnicowania w kierunku limfocytów TFH (Rysunek 3C). Zgodnie z tym, poziom ekspresji Bcl-6 był podwyższony w limfocytach MigR1-Bcl6-SM CD4+ T w porównaniu do limfocytów MigR1-SM CD4+ T (Rysunek 3D). Zatem fenotyp różnicowania limfocytów TFH napędzanego przez ektopową ekspresję Bcl-66 został precyzyjnie odtworzony zgodnie z obecnym protokołem.
<img alt="Proces różnicowania limfocytów T$_{FH}$ specyficznych dla wirusa, cytometria przepływowa, strategia bramkowania, analiza podwójnego barwienia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Analizy cytometrii przepływowej wczesnego determinizmu losu komórek SM TFH podczas zakażenia LCMV Armstrong. (A) Schemat doświadczenia. Limfocyty T CD4+ z śledziony pobrano od myszy SM CD45.1+, a następnie przeniesiono adoptywnie do biorców C57BL/6 (CD45.2+). Następnego dnia biorców tych zakażono LCMV Armstrong. W 3. dniu po zakażeniu przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej przeniesione komórki SM CD45.1+ z śledziony biorców. (B) Reprezentatywne dane z cytometrii przepływowej przedstawiające strategię bramkowania przeniesionych limfocytów T CD4+ SM CD45.1+ z śledziony biorców w 3. dniu po zakażeniu LCMV Armstrong. (C) Reprezentatywne dane z cytometrii przepływowej przedstawiające podwójne barwienia na CXCR5 oraz inne cząsteczki związane z limfocytami TFH (Bcl-6, TCF-1, CD25 i T-bet) w przeniesionych komórkach SM CD45.1+ z śledziony biorców w 3. dniu po zakażeniu LCMV Armstrong. (D) Reprezentatywne dane z cytometrii przepływowej przedstawiające podwójne barwienia z użyciem koniugowanego z fluorescencją przeciwciała przeciwko CXCR5 oraz sygnału GFP w przeniesionych komórkach SM reporterowych CXCR5-GFP CD45.1+ z śledziony biorców w 3. dniu po zakażeniu LCMV Armstrong. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Transdukcja retrowirusowa w komórkach T CD4+ SM; schemat, sygnał GFP, analiza cytometrii przepływowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Transdukcja retrowirusowa w komórkach T CD4+ SM. (A) Schemat produkcji retrowirusów i transdukcji retrowirusowej w komórkach T CD4+ SM. W celu produkcji retrowirusów komórki 293T wysiane na płytce 6-dołkowej transfekowano plazmidami docelowego DNA, gdy gęstość komórek osiągnęła ≥80% konfluencji. Następnie supernatant hodowli komórkowej zawierający retrowirusy zebrano 72 h po transfekcji i natychmiast wykorzystano lub przechowywano w temperaturze -80 °C. W celu transdukcji retrowirusowej w komórkach T CD4+ SM myszy CD45.1+ SM wstrzyknięto dożylnie 200 µg peptydu LCMV GP61-77. Następnie, 16-18 h po wstrzyknięciu peptydu, pobrano śledzionę z myszy SM i określono stan aktywacji śledzionowych komórek T CD4+. Aktywowane komórki T CD4+ SM poddano transdukcji supernatantem hodowli zawierającym retrowirusy i hodowano in vitro przez 48 h przed oceną wydajności transdukcji. (B) Obrazowanie mikroskopowe fluorescencyjne GFP w komórkach 293T transfekowanych plazmidowym DNA. Pasek skali: 400 µm. (C) Analiza cytometrii przepływowej poziomów ekspresji CD25 i CD69 w naiwnych śledzionowych komórkach T CD4+ z myszy naiwnej (naiwne, lewo) lub śledzionowych komórkach T CD4+ SM z myszy SM po wstrzyknięciu peptydu LCMV GP61-77 (aktywowane, prawo). (D) Analiza cytometrii przepływowej ekspresji GFP w komórkach T CD4+ SM poddanych transdukcji retrowirusowej (transdukowane, lewo) lub komórkach T CD4+ SM niepoddanych transdukcji retrowirusowej (nietransdukowane, prawo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat plazmidów MigR1 i MigR1-Bcl6, cytometria przepływowa, analiza różnicowania limfocytów T." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wpływ nadekspresji Bcl-6 na determinację losów limfocytów TFH z SM. (A) Mapy liniowe szkieletów retrowirusowych MigR1 (panel górny) oraz zmodyfikowanego wektora MigR1 z regionem CDS Bcl6 powyżej IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (panel dolny). (B) Schemat eksperymentalny. Limfocyty T SM CD4+ transdukowane MigR1 lub MigR1-Bcl6 zostały adoptywnie przeniesione do biorców C57BL/6 (CD45.2+) na jeden dzień przed zakażeniem LCMV Armstrong. W 3. dniu po zakażeniu przeniesione limfocyty T SM CD4+ CD45.1+ z śledzion odbiorców zostały poddane analizie cytometrią przepływową. (C) Analiza cytometrii przepływowej CXCR5 i CD25 w limfocytach T SM CD4+ GFP+ transdukowanych MigR1 lub MigR1-Bcl6. Liczby obok bramki wskazują częstość występowania limfocytów TFH w limfocytach T SM CD4+. (D) Analiza cytometrii przepływowej poziomu ekspresji Bcl-6 w limfocytach T SM CD4+ transdukowanych MigR1 lub MigR1-Bcl6. MFI, średnia intensywność fluorescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

Nasze badania opisują powtarzalne metody oceny zaangażowania we wczesnej fazie komórek TFH specyficznych dla wirusa, w tym ustalenie ostrego testu zakaźnego, wielonasobnego modelu myszy, przeprowadzanie barwienia cytometrią przepływową i przeprowadzanie manipulacji genami opartej na wektorach retrowirusowych. W porównaniu ze stymulacją limfocytów T in vitro, stymulacja in vivo może aktywować limfocyty T szybciej nawet w ciągu 12 godzin i jest w pełni aktywowana do następnej transdukcji retrowirusa. Nasze odkrycia pomogły w badaniach nad mechanizmami leżącymi u podstaw wczesnego zaangażowania różnych specyficznych komórek TFH.Co więcej, nasze badania przyczynią się do zrozumienia humoru zależnego od limfocytów T, pokory i optymalizacji projektowania szczepionek. Na początek zdobądź sześcio- do ośmiotygodniową inteligentniejszą mysz z dodatnim CD45.1 i wstrzyknij jej 200 mikrogramów peptydu LCMV GP61-77 w 100 mikrolitrach pożywki RPMI. Po pobraniu splenocytów od myszy zawieś je w 2% RPMI, aby osiągnąć gęstość komórek od jednego razy 10 do ośmiu komórek na mililitr i umieść probówkę z komórkami na lodzie.Dozować 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej wraz ze 150 mikrolitrami buforu barwiącego do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem. Odwirować 96-dołkową płytkę o temperaturze 800 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I ostrożnie zdekantować supernatant.Zwiruj płytkę i dodaj 200 mikrolitrów buforu barwiącego do każdej studzienki. Po ogranulowaniu komórki ponownie zawieś i inkubuj je z powierzchniowym koktajlem przeciwciał na lodzie przez 30 minut w ciemności. Po dwukrotnym umyciu ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach stałego buforu i przenieść je do probówki do cytometrii przepływowej.Wykonaj analizę cytometrii przepływowej, aby sprawdzić stan aktywacji inteligentnych limfocytów T CD4 dodatnich. Następnie zasiej jeden razy 10, sześć inteligentnych limfocytów T CD4 dodatnich na studzienkę do płytki 24-dołkowej. Wirować komórki w temperaturze 800 G przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć pożywkę sklarowaną nad osadem.Następnie dodaj jeden mililitr pożywki retrowirusowej i osiem mikrogramów polibrenu do każdej studzienki. Wirowanie transdukuje komórki w temperaturze 800 G przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odrzuceniu pożywki retrowirusowej inkubuj komórki z jednym mililitrem wstępnie podgrzanego 10% RPMI uzupełnionego interleukiną drugą.Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić ogniwa za pomocą 2% RPMI, aby uzyskać gęstość komórek od jednego razy 10 do ośmiu komórek na mililitr. Aby ocenić wydajność transdukcji, podamy 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem.Inkubuj je na lodzie z powierzchniowym koktajlem przeciwciał, w tym CD4, V, alfa dwa i przeciwciałem związanym ze znacznikiem wektorowym. Umyj komórki i wykonaj cytometrię przepływową, jak pokazano wcześniej. Następnie wstrzyknąć jeden raz 10 do sześciu limfocytów T CD4 dodatnich w inteligentnym teście CD4 CD4 do myszy biorcy C57 BL6 dożylnie, a następnie jeden razy 10 do sześciu jednostek tworzących płytkę LCMV Armstrong następnego dnia.Po pozyskaniu śledzionitów od myszy wybarwij je, aby sprawdzić pożądane markery. Aby wykryć czynniki transkrypcyjne, inkubuj komórki z 200 mikrolitrami 2% aldehydu paraform w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Na koniec wykonaj cytometrię przepływową, aby wykryć czynniki we wczesnym stadium ostrego zakażenia LCMV.W trzeciej dobie po zakażeniu stwierdzono zrównoważone rozwidlenie pęcherzykowych limfocytów T pomocniczych i komórek T pomocniczych jeden wśród MIGR one SMART dwóch limfocytów T CD4-dodatnich. W komórkach T MigR1 BCL6 Smart CD4 dodatnich zaobserwowano dominujące różnicowanie komórek T T MigR1 BCL6 Smart CD4 i zwiększone poziomy ekspresji.

accessing-early-differentiation-virus-specific-follicular-helper-cd4

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

γ-herpeswirusy (γ-HVs) ustanawiają dożywotnią persistencję w organizmie gospodarza. Zakażenie myszy wirusem γ-HV68 zapewnia genetycznie dostępny model in vivo do charakteryzacji cyklu życiowego i patogenezy γ-HVs. Niniejszy protokół opisuje wykrywanie i oznaczanie ilościowe zakażenia γHV68 w fazie ostrej i latentnej po zakażeniu, z wykorzystaniem metody tworzenia blaszek, metody ognisk zakaźnych oraz analizy qPCR.

Pomiar zakażenia $\gamma$HV68 u myszy

Tutaj opisujemy protokół analizy fenotypu limfocytów regulatorowych T (T reg) wyizolowanych od naiwnych i przewlekłych myszy zakażonych wirusem limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Ponadto zapewniamy proces oceny aktywności supresyjnej limfocytówT reg.

Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Ten protokół zapewnia metodę tworzenia humanizowanych myszy (hu-NSG) poprzez dowątrobowe wstrzykiwanie ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych do kondycjonowanych promieniowaniem noworodków NSG. Mysz hu-NSG jest podatna na zakażenie wirusem HIV i skojarzoną terapię antyretrowirusową (cART) i służy jako odpowiedni model patofizjologiczny do badań replikacji i latencji HIV.

Humanizowany mysi modelNOD/SCID/IL2rγ null (hu-NSG) do badań replikacji i latencji HIV

Tutaj prezentujemy protokół jakościowego wykrywania ex vivo specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+. Analiza jest możliwa w przypadku zawiesin pojedynczych komórek z narządów lub z niewielkich ilości krwi. Szeroki zakres badań wymaga analizy odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (badania nad szczepieniami i immunoterapią nowotworów).

Jednoczesna kwantyfikacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla antywektorów i anty-transgenów za pomocą barwienia tetramerem MHC I po szczepieniu wektorem wirusowym

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Opisane tutaj są trzy eksperymentalne podejścia do badania dynamiki infekcji HIV u humanizowanych myszy. Pierwsza z nich pozwala na badanie przewlekłych zdarzeń infekcyjnych, podczas gdy dwie ostatnie pozwalają na badanie ostrych zdarzeń po pierwotnym zakażeniu lub reaktywacji wirusa.

Przewlekłe, ostre i reaktywowane zakażenie wirusem HIV w humanizowanych modelach myszy z niedoborem odporności

Ten artykuł opisuje protokoły oceny odpowiedzi Tfh i GC B w mysim modelu infekcji wirusem grypy.

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

Opracowaliśmy protokół do generowania i oceny humanizowanego i ludzkiego modelu myszy NOG zakażonego wirusem niedoboru odporności na podstawie przeszczepu komórek macierzystych, dopochwowej ekspozycji na ludzkiego wirusa niedoboru odporności i kropelkowej cyfrowej kwantyfikacji RNA PCR.

Humanizowane myszy NOG do dopochwowej ekspozycji na HIV i leczenia zakażenia HIV

Aby badać różnicowanie i funkcjonowanie komórek T CD8 in vitro, komórki T CD8 można wyizolować z myszy i długoterminowo współhodować z wcześniej zakażonymi nabłonkami nabłonka pochwy myszy. Tutaj opisujemy ten proces i oceniamy nabycie rezydentnych markerów komórek T pamięci podczas współhodowli.

In vitro Dyferencjacja komórek T CD8 w pamięci rezydentnej za pomocą systemu współhodowli komórek T nabłonkowych

Poznaj metody oceny wczesnego różnicowania komórek T FH specyficznych dla wirusa u myszy zakażonych ostrą LCMV. Wykorzystaj cytometrię przepływową i manipulację genową w badaniach immunologicznych nad projektowaniem szczepionek.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV (Wideo) | JoVE Journal

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 ⁺ u myszy zakażonych ostrą LCMV

Przeglądaj więcej filmów