Name: Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów śmierci komórek nabłonkowych w warunkach zapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować pacjentom za ich świadomą zgodę i udział w badaniu naukowym, a personelowi klinicznemu za doskonałą pomoc. Rysunek 1A został stworzony z BioRender.com. Ta praca była wspierana przez granty od Science Foundation Ireland - a mianowicie nagrodę za rozwój kariery (CDA) dla K.N. (SFI-13/CDA/2171), grant centrum badawczego (SFI-12/RC/2273) oraz nagrodę dla centrum badawczego (SFI-14/SP/2710) dla APC Microbiome Ireland. P.F. otrzymał również dofinansowanie z SFI/20/RP/9007.

Quantifying Cell Death in Human Colonoids in Response to Cytotoxic Perturbagens

<ol><li>Patankar, J. V., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+the+gut+epithelium+and+implications+for+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Cell death in the gut epithelium and implications for chronic inflammation.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (9), 543-556 (2020).</li>
<li>Zeissig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+epithelial+apoptosis+and+barrier+repair+in+active+Crohn%27s+disease+by+tumour+necrosis+factor+alpha+antibody+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Downregulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn's disease by tumour necrosis factor alpha antibody treatment.</a> Gut. 53 (9), 1295-1302 (2004).</li>
<li>Bartee, E., Mcfadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+synergy%3A+An+underappreciated+contributor+to+innate+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Cytokine synergy: An underappreciated contributor to innate anti-viral immunity.</a> Cytokine. 63 (3), 237-240 (2013).</li>
<li>Fish, S. M., Proujansky, R., Reenstra, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effects+of+interferon+%CE%B3+and+tumour+necrosis+factor+%CE%B1+on+T84+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Synergistic effects of interferon γ and tumour necrosis factor α on T84 cell function.</a> Gut. 45 (2), 191-198 (1999).</li>
<li>Wakisaka, Y., Sugimoto, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+medicine+for+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Organoid medicine for Inflammatory Bowel Disease.</a> Stem Cells. 40 (2), 123-132 (2022).</li>
<li>Flood, P., Hanrahan, N., Nally, K., Melgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids%3A+Modeling+gastrointestinal+physiology+and+immunopathology+-+current+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids: Modeling gastrointestinal physiology and immunopathology - current applications and limitations.</a> Eur J Immunol. 54 (2), e2250248(2024).</li>
<li>Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intestinal+organoid-based+platform+that+recreates+susceptibility+to+t-cell-mediated+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to t-cell-mediated tissue injury.</a> Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+responses+to+IL-17+in+adult+stem+cell-derived+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crohns+Colitis%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids.</a> J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+synergises+with+IFN-%CE%B3+to+induce+caspase-8-JAK1%2F2-STAT1-dependent+death+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">TNF-α synergises with IFN-γ to induce caspase-8-JAK1/2-STAT1-dependent death of intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 864(2021).</li>
<li>Flood, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sensor-associated+type+I+interferon+signaling+is+increased+in+ulcerative+colitis+and+induces+jak-dependent+inflammatory+cell+death+in+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5 (5), e1228(2014).</li>
<li>Bode, K. J., Mueller, S., Schweinlin, M., Metzger, M., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+simple+fluorometric+method+to+detect+cell+death+in+3D+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A fast and simple fluorometric method to detect cell death in 3D intestinal organoids.</a> Biotechniques. 67 (1), 23-28 (2019).</li>
<li>Mertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-repurposing+screen+on+patient-derived+organoids+identifies+therapy-induced+vulnerability+in+KRAS-mutant+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Drug-repurposing screen on patient-derived organoids identifies therapy-induced vulnerability in KRAS-mutant colon cancer.</a> Cell Rep. 42 (4), 112324(2023).</li>
<li>Vandussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+BCL-G+regulates+secretion+of+inflammatory+chemokines+but+is+dispensable+for+induction+of+apoptosis+by+IFN-%CE%B3+and+TNF-%CE%B1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-γ and TNF-α in intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 11 (1), 68(2020).</li>
<li>Edgar, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-associated+DNA+methylation+changes+impact+on+cellular+function+of+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Culture-associated DNA methylation changes impact on cellular function of human intestinal organoids.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (6), 1295-1310 (2022).</li>
<li>Mubaid, F., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+is+more%3A+Longer+exposure+times+with+low+light+intensity+is+less+photo-toxic%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Less is more: Longer exposure times with low light intensity is less photo-toxic.</a> Microscopy Today. 25 (6), 26-35 (2017).</li>
<li>Ziegler, U., Groscurth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+features+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological features of cell death.</a> News Physiol Sci. 19 (3), 124-128 (2004).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Res. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Tamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+anticancer+agents+using+patient-derived+tumor+organoids+characteristically+similar+to+source+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues.</a> Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).</li>
<li>Karki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+TNF-%CE%B1+IFN-%CE%B3+triggers+inflammatory+cell+death%2C+tissue+damage%2C+and+mortality+in+SARS-CoV-2+infection+and+cytokine+shock+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synergism of TNF-α IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes.</a> Cell. 184 (1), 149-168 (2021).</li>
<li>Geary, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+synergy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding synergy.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (3), E237-E253 (2013).</li>
<li>Duarte, D., Vale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+synergism+in+drug+combinations+and+reference+models+for+future+orientations+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Res+Pharmacol+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Evaluation of synergism in drug combinations and reference models for future orientations in oncology.</a> Curr Res Pharmacol Drug Discov. 3, 100110(2022).</li>
<li>Wong, F. C., Woo, C. C., Hsu, A., Tan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-cancer+activities+of+Vernonia+amygdalina+extract+in+human+breast+cancer+cell+lines+are+mediated+through+caspase-dependent+and+p53-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The anti-cancer activities of Vernonia amygdalina extract in human breast cancer cell lines are mediated through caspase-dependent and p53-independent pathways.</a> PLoS One. 8 (10), e78021(2013).</li>
<li>Ryall, K. A., Tan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+approaches+for+advancing+the+discovery+of+effective+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cheminform%22%5BJournal%5D)">Systems biology approaches for advancing the discovery of effective drug combinations.</a> J Cheminform. 7, 7(2015).</li>
<li>Sukho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+density+and+inflammatory+cytokines+on+adipose+tissue-derived+stem+cells%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding density and inflammatory cytokines on adipose tissue-derived stem cells: An in vitro study.</a> Stem Cell Rev Rep. 13 (2), 267-277 (2017).</li>
<li>Vaughan-Jackson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+dependent+regulation+of+inflammatory+responses+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Density dependent regulation of inflammatory responses in macrophages.</a> Front Immunol. 13, 895488(2022).</li>
<li>Lumibao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+extracellular+matrix+on+the+precision+medicine+utility+of+pancreatic+cancer+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The impact of extracellular matrix on the precision medicine utility of pancreatic cancer patient-derived organoids.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.01.26.525757 (2023).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+induces+LGR5%2B+stem+cell+dysfunction+in+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">TNF-α induces LGR5+ stem cell dysfunction in patients with Crohn's disease.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (3), 789-808 (2022).</li>
</ol>

W czasie zakończenia prac firma K.N. otrzymywała fundusze na badania od firmy AbbVie Inc. Finansowanie to zostało przyznane w ramach nagrody centrum badawczego (SFI-14/SP/2710) dla APC Microbiome Ireland.

Opracowano kilka metod analiz ilościowych śmierci komórek w organoidach jelitowych. Badanie zaburzeń morfologii organoidów jelitowych za pomocą mikroskopii świetlnej jest prostym podejściem do ilościowego określania skutków substancji cytotoksycznych11. Jednak zmiany morfologiczne nie są bezpośrednim pomiarem śmierci komórki, a metoda jest tylko półilościowa. Inną metodą jest ocena aktywności metabolicznej organoidów za pomocą testu MTT lub ATP10,11. Ważne jest, aby pamiętać, że testy te mogą jedynie określać zmiany w żywotności komórek i muszą być zatwierdzone za pomocą testu śmierci komórki. Inne fluorometryczne testy śmierci komórki przy użyciu barwników wiążących DNA zostały zgłoszone12,13. Możliwe jest podejście bez obrazowania z wykorzystaniem fluorescencyjnego czytnika mikropłytek, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości12. Jednak ta metoda mierzy średni sygnał całej studni, co czyni ją nieodpowiednią dla heterogenicznych populacji. Wymaga również użycia czytnika mikropłytek z regulacją wysokości Z. Techniki obrazowania fluorescencyjnego mogą być wykorzystywane do analizy pojedynczych organoidów i przechwytywania danych komórkowych/subkomórkowych i morfologicznych. Zautomatyzowane systemy obrazowania konfokalnego o wysokiej zawartości (HCI) mogą generować duże ilości danych przy dużej przepustowości13. Niestety, konfokalna HCI wymaga specjalistycznego sprzętu, wykorzystuje złożone protokoły, zazwyczaj wymaga komercyjnego oprogramowania do analizy obrazu i jest droga.
Nasz protokół analizy ilościowej śmierci komórki okrężnicy w wielu punktach czasowych jest prosty, prosty i niedrogi. Jednak w porównaniu ze zautomatyzowanymi systemami HCI i czytnikami płyt jest to czasochłonne i ma zmniejszoną przepustowość. Kolejnym ograniczeniem naszej metody jest zastosowanie mikroskopii szerokokątnej, w przeciwieństwie do mikroskopii konfokalnej. Mikroskopia konfokalna jest bardziej odpowiednia do obrazowania grubych próbek 3D, takich jak organoidy, ponieważ redukuje nieostry sygnał i może rejestrować szeregowe sekcje optyczne (stosy Z). Jednak obrazowanie konfokalne zazwyczaj wymaga dłuższego czasu akwizycji i laserów o wysokiej intensywności, które zwiększają fototoksyczność/fotowybielanie. Bardzo ważne jest, aby pamiętać, że fluorescencyjne barwniki śmierci komórek, takie jak SYTOX Green, nadają się tylko do pomiaru form śmierci komórki, w których dochodzi do utraty integralności błony komórkowej, takich jak martwica, wtórna martwica związana z późną apoptozą, nekroptoza i pyroptoza21. Istnieją pewne formy regulowanej śmierci komórki, w których błona komórkowa pozostaje nieprzepuszczalna przynajmniej we wczesnych fazach śmierci komórki, takie jak apoptoza zależna od kaspazy. Jednak protokół ten można łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić również obrazowanie fluorescencyjnego reportera o aktywności kaspazy 3/722. Dostarczyłoby to dodatkowych danych, które pomogłyby scharakteryzować specyficzną modalność śmierci komórki.
Użyliśmy naszego protokołu, aby zademonstrować cytotoksyczne synergiczne oddziaływanie między cytokinami IFN-γ i TNF-α (Figura 2C), które wcześniej opisaliśmy w organoidach pochodzących od pacjentów z CD 9,10. Fizjologiczne znaczenie tej formy synergizmu wykazano również w mysich modelach limfohistiocytozy hemofagocytarnej i sepsy23. Wdrożono kilka matematycznych modeli referencyjnych i podejść do ilościowego określania synergii między kombinacjami czynników biologicznych24,25. Różnią się one pod względem złożoności, liczby czynników, które biorą pod uwagę, oraz progu, od którego należy uznać interakcję za synergiczną24,25. Niektóre modele wymagają wcześniejszej wiedzy na temat badanych czynników biologicznych, przyjmują pewne założenia dotyczące aktywności czynników i mogą wymagać kompleksowych krzywych dawka-odpowiedź dla każdego leczenia pojedynczego i skojarzonego25. Metoda, którą wybraliśmy do pomiaru synergii, jest modyfikacją modelu współczynnika interakcji leków (CDI), który wcześniej był używany do pomiaru hamującego wpływu kombinacji leków stosowanych w chemioterapii na proliferację linii komórek nowotworowych26. CDI jest modelem niezależności Bliss; Obliczając przewidywany łączny efekt dwóch perturbagenów Bliss Independence zakłada, że są one ukierunkowane na odrębne szlaki i mają niezależne mechanizmy działania27. Aby interakcja między zaburzeniami była synergistyczna, rzeczywisty łączny efekt musi być większy niż przewidywany efekt. Ten model jest odpowiedni dla naszej konfiguracji eksperymentalnej, ponieważ wiadomo, że IFN-γ i TNF-α mają różne receptory i dalsze komponenty sygnalizacyjne. Co więcej, niezależność Bliss pozwala na obliczenie współczynnika interakcji w celu ilościowego określenia synergizmu i nie wymaga zestawów danych dawka-odpowiedź.
Istnieje kilka kluczowych czynników, które należy wziąć pod uwagę, aby zapewnić optymalne wyniki dla tego protokołu. Ważne jest, aby kolonoidy były rozmnażane do dużej gęstości (ryc. 1Bi), aby miały średnicę około 25-50 μm i aktywnie rozmnażały się przed próbą wysiewu komórek. Stosowanie nieoptymalnych kultur kolonoidów do testów może skutkować niewystarczającą liczbą komórek, niską regeneracją okrężnicy i niespójnymi eksperymentami. Aby uzyskać powtarzalne wyniki, ważne jest również, aby konsekwentnie zasiewać gęstość kolonoidów między eksperymentami. Wcześniej wykazano, że na odpowiedź in vitro na cytokiny zapalne może wpływać gęstość wysiewu komórek28,29. Innym częstym problemem jest tworzenie się pęcherzyków powietrza w kopule BME, co może wpływać na obrazowanie. Można temu zapobiec, stosując technikę odwróconego pipetowania. Ta technika zapewnia również bardziej konsekwentny siew.
Ponadto, jeśli obrazujesz wiele punktów czasowych, przygotuj warunek maksymalnej toksyczności dla każdego punktu czasowego. Triton-X 100, niejonowy środek powierzchniowo czynny, jest powszechnie stosowany jako kontrola pozytywna (warunek maksymalnej toksyczności) do testów cytotoksyczności. Dodatek Triton-X 100 powoduje lizę i zabijanie kolonoidów, umożliwiając fluorescencyjnemu barwnikowi śmierci komórki przedostanie się do komórek. Użycie warunku maksymalnej toksyczności z wcześniejszego punktu czasowego spowoduje niedokładną i niespójną normalizację danych z powodu zaniku sygnału fluorescencyjnego w czasie.
Ostatnią kwestią do rozważenia jest wybór BME stosowanego do hodowli okrężnicy. Istnieje kilku komercyjnych producentów BME; jednak w naszym protokole przetestowaliśmy tylko markę zawartą w Tabeli Materiałów. Niedawne badanie z wykorzystaniem organoidów raka trzustki pochodzących od pacjentów wykazało, że komercyjne źródło BME zmieniło tempo proliferacji komórek, ale nie miało znaczącego wpływu na odpowiedź na leki chemioterapeutyczne lub ekspresję genów30. Mając to na uwadze, spodziewamy się, że trend wyników będzie podobny między markami BME dla naszego protokołu, ale zalecamy konsekwentne używanie tej samej marki.
Pokazaliśmy, w jaki sposób ten protokół można wykorzystać do analizy śmierci komórek indukowanej przez IFN-γ i TNF-α przy użyciu kolonoidów pochodzących od pacjenta z CD. Organoidy jelitowe pochodzące od pacjentów są potężnym narzędziem do badania CD, ponieważ zachowują wiele cech choroby, w tym zwiększoną wrażliwość na cytotoksyczne działanie TNF-α31. Jednak protokół można łatwo zmodyfikować w celu zbadania cytotoksycznego wpływu zaburzeń innych niż cytokiny lub stanów chorobowych innych niż IBD, takich jak rak jelita grubego (z powodzeniem przetestowaliśmy protokół przy użyciu kolonoidów innych niż IBD). Uważamy, że ta metoda jest przydatna we wszystkich obszarach badawczych związanych z mechanizmami śmierci komórek, funkcją bariery nabłonkowej lub immunologią błony śluzowej jelit.

Nabłonek jelitowy tworzy fizyczną, półprzepuszczalną barierę między zawartością światła jelita a leżącymi pod nim tkankami. Aby skutecznie utrzymać tę barierę, komórki nabłonka jelitowego (IEC) przechodzą niezwykle wysoki obrót komórkowy, z ciągłym cyklem śmierci i regeneracji komórek. Jednak podczas zaburzeń zapalnych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD), występuje wyższy poziom nieprawidłowej śmierci komórek1. Może to sprzyjać załamaniu funkcji bariery i aktywacji układu odpornościowego, wywołując dalszy stan zapalny. W chorobie Leśniowskiego-Crohna (CD), formie IBD, wykazano, że sygnalizacja cytokin przyczynia się do zwiększonego poziomu śmiertelności IEC2. Badając, w jaki sposób sygnalizacja cytokin indukuje śmierć komórek IEC, można mieć nadzieję, że uda się opracować lepsze metody leczenia dla pacjentów z IBD i innymi zaburzeniami zapalnymi jelit1.
W badaniach nad biologią i odkrywaniem celów leków, synergia jest ogólnie rozumiana jako występująca, gdy system biologiczny traktowany kombinacjami indywidualnych bodźców wykazuje reakcję na kombinację, która jest większa niż połączone efekty addytywne samych pojedynczych bodźców. Synergiczne interakcje między cytokinami zostały dobrze udokumentowane w stymulowaniu wrodzonych odpowiedzi przeciwwirusowych3. Wiadomo również, że cytokiny indukują śmierć komórki synergistycznie, w tym w IECs4. Jednak rola, jaką synergiczna sygnalizacja cytokin cytotoksycznych odgrywa w zaburzeniach zapalnych jelit, takich jak IBD, jest niedostatecznie zbadana.
Organoidy jelitowe człowieka to mikrotkanki 3D produkowane in vitro, które są generowane z komórek macierzystych nabłonka jelitowego. Organoidy jelitowe mogą być hodowane z biopsji błony śluzowej jelita uzyskanej od pacjentów z IBD i zachowują wiele cech choroby5,6. Organoidy okazały się idealnym systemem modelowym do badania cytotoksyczności cytokin w kontekście zapalenia jelit7,8. Wcześniej nasza grupa scharakteryzowała synergistyczne efekty zabijania cytokin IFN-γ i TNF-α istotnych dla IBD w organoidach okrężnicy (kolonoidach) pochodzących od pacjenta z CD9,10. Jednak dokładne mechanizmy zaangażowane w pośredniczenie w tej formie synergistycznej śmierci komórki pozostają nieuchwytne. Istnieje również potencjalnie wiele innych niescharakteryzowanych interakcji cytokin cytotoksycznych, które są istotne dla zaburzeń zapalnych jelit.
Dostępnych jest kilka protokołów do badania śmierci komórek w organoidach jelitowych10,11,12,13; jednak każdy z nich ma wady. Niektóre z tych technik mierzą jedynie żywotność komórek i nie mierzą bezpośrednio śmierci komórki, nie są w stanie ocenić odpowiedzi pojedynczych organoidów lub wymagają drogiego sprzętu i złożonych protokołów. Potrzebne są solidne i proste metodologie do ilościowego określenia śmierci komórek organoidów i interakcji perturbagenów w organoidach jelitowych. Przedstawiony przez nas protokół jest prostym i niedrogim podejściem do pomiaru odpowiedzi pojedynczych organoidów na cytotoksyczne cytokiny, ale może być stosowany do każdego rodzaju bodźca lub perturbagenu. Pokazujemy również, jak wykorzystać model synergii niezależności Bliss do obliczenia współczynnika interakcji perturbagenu (CPI), który opisuje interakcje cytokin cytotoksycznych.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowane rozwiązanie DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td>Science Suite Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>oprogramowania do ilustracji naukowych</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2058</td><td>Zasadniczo wolny od IgG, niski poziom endotoksyny</td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC, indywidualnie pakowane, sterylne</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej Cultrex, typ 2, Pathclear</td><td>R& D Systems</td><td>3532-010-02</td><td>Ekstrakt z błony podstawnej</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Merck</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Cyfrowy mikroskop fluorescencji odwróconej</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td>Cyfrowy mikroskop odwróconej epifluorescencji</td></tr><tr><td>EVOS 40x Obiektyw, fluoryt, LWD, kontrast fazowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4683</td><td>Duża odległość robocza 40-krotny obiektyw fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Fidżi/ImageJ (wersja Windows)</td><td>Oprogramowanie typu open source</td><td>Nie dotyczy</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Sigma-Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór gentamycyny</td><td>Sigma-Merck</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do delikatnej dysocjacji komórek</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td>Bezenzymatyczny odczynnik do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Suplement dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 (wersja Windows)</td><td>Dotmatics</td><td>N/A Oprogramowanie</td> do <td>grafiki danych i statystyk</td></tr><tr><td>Greiner 15 ml Polipropylenowa probówka wirówkowa, sterylna ze stożkowym dnem i Zakrętka</td><td>Cruinn</td><td>188261CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF (bez zwierząt)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Merck</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ANT-NR-05</td><td>Szeroki zakres odczynnik przeciwbakteryjny</td></tr><tr><td>Nunc Edge 96-Well, Nunclon traktowany Delta, płaskodenna mikropłytka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15543115</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko IFN-gamma</td><td>R& Systemy D</td><td>285-IF</td><td>Zawiesić w sterylnym, przefiltrowanym 0,1% PBS/BSA</td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko TNF-alfa</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA</td><td>Zawiesić w sterylnym, przefiltrowanym 0,1% PBS/BSA</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Merck</td><td>S7067</td><td></td></tr><tr><td>Snap Cap Probówki do mikrowirówek o niskiej retencji</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Zielone barwienie kwasami nukleinowymi - 5 mM Roztwór w DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Barwnik śmierci komórek fluorescencyjnych, chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Merck</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma-Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>Odczynnik dysocjacji enzymatycznej</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10071</td><td>Inhibitor ROCK-I i ROCK-II</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo

Quantification of Cytokine-Induced Cell Death in Human Colonic Organoids Using Live Fluorescence Microscopy

Śmierć komórek nabłonka jelitowego (IEC) jest zwiększona u pacjentów z chorobami zapalnymi jelit (IBD), takimi jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) i choroba Leśniowskiego-Crohna (CD). Może to przyczyniać się do zaburzeń funkcji bariery jelitowej, zaostrzenia stanu zapalnego i immunopatogenezy choroby. Cytokiny i ligandy receptora śmierci są częściowo odpowiedzialne za ten wzrost śmiertelności IEC. Cytokiny istotne dla IBD, takie jak TNF-α i IFN-γ, są cytotoksyczne dla IEC zarówno niezależnie, jak i w połączeniu. Protokół ten opisuje prosty i praktyczny test do ilościowego określania cytotoksyczności indukowanej cytokinami w organoidach okrężnicy pochodzących od pacjenta z CD przy użyciu fluorescencyjnego barwnika śmierci komórki (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), mikroskopii fluorescencyjnej na żywo i oprogramowania do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym. Pokazujemy również, jak wykorzystać model matematyczny niezależności Bliss do obliczenia współczynnika interakcji perturbagenu (CPI) na podstawie cytotoksyczności organoidów. CPI można wykorzystać do określenia, czy interakcje między kombinacjami cytokin lub innymi typami zaburzeń są antagonistyczne, addytywne czy synergistyczne. Protokół ten można wdrożyć do badania cytotoksycznej aktywności cytokin i innych zaburzeń przy użyciu organoidów okrężnicy pochodzących od pacjenta.

Korzystając z niniejszego protokołu, zademonstrowaliśmy, w jaki sposób kolonoidy jelita grubego pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna (CD) mogą być wykorzystywane do badania cytotoksycznych efektów cytokin IFN-γ i TNF-α, istotnych w przebiegu nieswoistych zapaleń jelit (IBD), na pierwotny nabłonek. Użyliśmy dostępnego komercyjnie fluorescencyjnego barwnika śmierci komórkowej (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), który może przenikać jedynie do komórek o uszkodzonej błonie komórkowej, gdzie ulega aktywacji poprzez wiązanie z kwasami nukleinowymi. Kolonoidy poddano jednoczesnej inkubacji z cytokinami oraz fluorescencyjnym barwnikiem śmierci komórkowej, a następnie wykonano obrazowanie żywych komórek po 8 h i 24 h za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. Reprezentatywne nałożone obrazy transmisyjne/fluorescencyjne po 8 h wskazują, że jedynie kolonoidy traktowane IFN-γ + TNF-α wykazują dodatni sygnał fluorescencyjny; jednak liczba fluorescencyjnych komórek jest niewielka (Rycyna 2A). W warunkach zastosowania IFN-γ + TNF-α można również zaobserwować pęcherzykowanie błony komórkowej (blebbing), będące morfologicznym wskaźnikiem śmierci komórki20. Po 24 h kolonoidy traktowane IFN-γ + TNF-α wykazują rozległe obszary z dodatnim sygnałem fluorescencyjnym (Rycyna 2A). Widoczny jest również wyraźny rozpad morfologii kolonoidu – światło centralne nie jest już widoczne, a bariera nabłonkowa została całkowicie zniszczona.
Aby ilościowo określić sygnał barwnika śmierci komórkowej, wykorzystaliśmy otwartoźródłowe oprogramowanie do analizy obrazu w celu obliczenia intensywności fluorescencji każdego kolonoidu. Następnie znormalizowano dane, wyrażając średnią dla każdego warunku jako procent traktowania Max Toxicity. Po 8 h homeostatyczna lub tła śmierć komórek w kolonoidach kontrolnych BSA była stosunkowo niska (7,7% Max Toxicity) (Rycina 2B). W tym punkcie czasowym nie odnotowano statystycznie istotnych zmian w poziomie śmierci komórek; jednak w warunkach traktowanych TNF-α zaobserwowano niewielki wzrost cytotoksyczności (Rycina 2B). Po 24 h poziomy śmierci komórek wzrosły we wszystkich warunkach traktowanych cytokinami. Niemniej jednak, w przypadku warunku kontrolnego BSA, zmiana poziomu śmierci komórek między punktami czasowymi była minimalna (7,5% Max Toxicity po 24 h). Kolonoidy traktowane IFN-γ + TNF-α wykazały największy wzrost poziomu śmierci komórek w porównaniu do kontroli BSA (29,4% Max Toxicity). Różnica w poziomach śmierci komórek między traktowaniem łączonym a traktowaniem pojedynczymi cytokinami (IFN-γ, TNF-α) była wysoce istotna. Wyniki te sugerują możliwość cytotoksycznej interakcji synergistycznej między IFN-γ a TNF-α po 24 h.
W celu ilościowego określenia interakcji cytotoksycznych między stosowanymi cytokinami oraz ustalenia, czy wykazują one działanie synergistyczne, wykorzystaliśmy wskaźnik CPI. Interakcje między cytokinami uznaje się za synergistyczne, gdy wartość CPI jest &lt;1, addytywne, gdy =1, lub antagonistyczne, gdy &gt;1. Wartości CPI obliczono dla poszczególnych punktów czasowych (Rysunek 2C). Po 8 h wartość CPI wskazywała na niewielki synergizm (0,99), natomiast po 24 h wartość CPI uległa znacznemu obniżeniu (0,83). Analiza ta potwierdziła, że interakcja między IFN-γ a TNF-α po 24 h miała charakter synergistyczny. Co więcej, ilustruje ona, że w tym kontekście synergizm między IFN-γ a TNF-α jest zależny od czasu.
<img alt="Schemat hodowli kolonoidów, traktowanie cytokinami, proces obrazowania żywych komórek, wyniki mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przebiegu eksperymentu i rozwiązywania problemów. (A) Schematyczny przegląd protokołu. (B) Reprezentatywne obrazy. (Bi) Obraz mikroskopii świetlnej ilustrujący optymalną gęstość hodowli i optymalny rozmiar kolonoidów przed pasażowaniem do analizy. Pasek skali = 500 µm. (Bii) Obraz mikroskopii świetlnej ilustrujący optymalny rozmiar fragmentów kolonoidów po dysocjacji; fragmenty zaznaczone na czerwono. Pasek skali = 100 µm. (Biii) Obraz mikroskopii świetlnej morfologii martwiczej kolonoidów po traktowaniu MT (z Triton X-100). Pasek skali = 25 µm. (Biv) Obraz mikroskopii świetlnej dwóch kolonoidów nakładających się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Pasek skali = 25 µm. (Bv) Obraz mikroskopii świetlnej detrytusu komórkowego kolonoidów obecnego po pasażowaniu; detrytus zaznaczony na czerwono. Pasek skali = 25 µm. Skróty: ROI = obszar zainteresowania; MFI = średnia intensywność fluorescencji; MT = maksymalna toksyczność. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza toksyczności komórkowej przedstawiająca mikroskopię i wykresy słupkowe; efekty IFN-γ po 8 h/24 h z BSA, TNF-α." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza ilościowa indukowanej cytokinami śmierci komórek w ludzkich kolonoidach CD. (A) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii żywych komórek kolonoidów CD traktowanych barwnikiem SYTOX Green Nucleic Acid Stain (fluorescencyjny barwnik śmierci komórkowej) oraz cytokinami po 8 h i 24 h; nałożone kanały transmisji i GFP (kolor zielony). Kolonoidy traktowano w następujący sposób: 1) PBS/BSA, 2) 10 ng/mL IFN-γ, 3) 10 ng/mL TNF-α, 4) 10 ng/mL IFN-γ + 10 ng/mL TNF-α. Paski skali = 25 µm. (B) Analiza ilościowa kolonoidów CD traktowanych fluorescencyjnym barwnikiem śmierci komórkowej i cytokinami po 8 i 24 h; dane wyrażone jako % warunku MT. N = 2 linie kolonoidów CD, obrazowano 11-16 kolonoidów na warunek. (C) CPI obliczony dla każdego punktu czasowego przy użyciu zestawu danych z B, N = 2 linie kolonoidów CD. Dane wyrażone jako średnie ± SE. W B przeprowadzono analizę dwuczynnikową ANOVA, a następnie testy post-hoc Bonferroniego, *P &lt; 0.05, ***P &lt; 0.001 zgodnie z oznaczeniem. Skróty: CD = choroba Leśniowskiego-Crohna; GFP = zielone białko fluorescencyjne; CPI = współczynnik interakcji perturbagenu; PBS = roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanowo; BSA = albuminy surowicy bydlęcej; TNF-α = czynnik martwicy nowotworu alfa; IFN-γ = interferon gamma; MT = maksymalna toksyczność. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig02largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Skład pożywek hodowlanych dla protokołu. Aby przygotować pożywkę do proliferacji organoidów (Organoid Proliferation Media), należy połączyć pożywkę kondycjonowaną L-WRN oraz pożywkę bezsurowiczą (Serum-free Media) w stosunku 1:1, a następnie dodać suplementy. Pożywka do proliferacji organoidów powinna zostać zużyta w ciągu 2 tygodni od przygotowania. Należy pamiętać, że wszystkie gotowe pożywki powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Układ eksperymentalnej płytki 96-dołkowej oraz traktowanie cytokinami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%202%20(1).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół opisuje prostą i opłacalną metodę badania i ilościowego określania śmierci komórek w organoidach ludzkiego jelita grubego w odpowiedzi na cytotoksyczne zaburzenia, takie jak cytokiny. Podejście to wykorzystuje fluorescencyjny barwnik śmierci komórki (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), mikroskopię fluorescencyjną na żywo i oprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym w celu ilościowego określenia odpowiedzi pojedynczych organoidów na bodźce cytotoksyczne.

Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo

Intestinal epithelial cell (IEC) death is increased in patients with inflammatory bowel diseases (IBD) such as ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease ...

Cytokiny zapalne, interferon, gamma i TNF, alfa istnieją od setek milionów lat i mają kluczowe znaczenie dla skutecznej obrony gospodarza przed patogenami międzykomórkowymi. Nasza grupa badawcza stara się zrozumieć, w jaki sposób te cytokiny zabijają komórki, takie jak komórki nabłonkowe w jelitach i komórki rakowe. Powszechnie stosowane systemy do badania mechanizmów śmierci komórek nabłonka jelitowego obejmują modele mysie i unieśmiertelnione linie komórek nowotworowych.Organoidy testowe u ludzi są korzystne, ponieważ są generowane bezpośrednio z biopsji pacjenta i zachowują wiele fizjologicznych i morfologicznych cech pary w tkance. Oznacza to, że mają zwiększoną wartość translacyjną. Badania nad narządami mają problemy z odtwarzalnością eksperymentów i wiążą się z kilkoma wyzwaniami technicznymi w porównaniu z tradycyjną hodowlą komórkową.Obecne techniki pomiaru śmierci komórek organoidowych również mają ograniczenia. Niektóre są tylko częściowo ilościowe, nie mierzą bezpośrednio śmierci komórki, nie mogą mierzyć odpowiedzi pojedynczych organoidów lub wymagają drogiego sprzętu i złożonych protokołów. Nasz protokół analizy ilościowej śmierci komórek organoidowych jest prosty, solidny i niedrogi.Użyliśmy naszego protokołu do pomiaru odpowiedzi pojedynczych organoidów na cytotoksyczne kombinacje cytokin, ale można go łatwo dostosować do badania dowolnego rodzaju zakłóceń. Metoda ta jest przydatna w badaniach nad śmiercią komórkową, funkcją bariery nabłonkowej lub immunologią błony śluzowej. Ostatnio informowaliśmy, że interferon gamma i TNF alfa działają synergicznie w celu wywołania śmierci komórek zapalnych w komórkach nabłonka jelitowego i komórkach raka jelita grubego.Robią to za pośrednictwem szlaku sygnałowego JAK: jeden, dwa, stat, jeden. W przyszłych pracach chcemy zrozumieć, jaki to jest rodzaj śmierci komórki i w jaki sposób JAK jeden i JAK dwa zabijają komórki. Po rozszerzeniu koloidów pochodzących od pacjenta z chorobą Leśniowskiego-Crohna w płytce 48-dołkowej, delikatnie usuń pożywkę z krawędzi studzienki, nie uszkadzając kopuły kolonoidy.Dodać 300 mikrolitrów enzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego uzupełnionego 10 mikromolowym ROCK1 i dwoma inhibitorami Y-27632 do każdej studzienki. Za pomocą końcówki do pipety P1000 zeskrob powierzchnię studzienki, aby rozbić kopułę kolonoidu i pipetować zawiesinę komórek w górę iw dół. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki.Inkubuj zebrane kolonoidy w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Odwirować kolonoidy o stężeniu 400 G przez trzy minuty. I usuń supernatant, pozostawiając około 1,2 mililitra w probówce.Następnie umieść końcówkę pipety P1000 w zawiesinie, trzymając ją tuż nad dnem probówki i szybko odpipetuj zawiesinę do i z końcówki, aby oddzielić okrężnicę. Obserwuj probówkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie pozostały całe kolonoidy, a fragmenty okrężnicy mają wielkość około 30 do 40 mikrometrów. Następnie dodaj 10 mililitrów lodowatego organoidowego środka do płukania do 15-mililitrowej probówki.Odwirować probówkę o sile 400 G przez trzy minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego organoidowego podłoża do mycia. Przenieś zawiesinę do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i oznacz ją jako probówkę z fragmentem kolonoidy.Po wymieszaniu przenieś 50 mikrolitrów próbki do nowej probówki i oznacz ją jako probówkę do liczenia komórek. Odwirować probówkę o sile 400 G przez trzy minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach enzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego uzupełnionego 10 mikromolowym Y-27632.Inkubować probówkę do liczenia pojedynczych komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Używając pipety P1000 o pojemności 400 mikrolitrów, szybko odpipetuj próbkę. Następnie obserwuj próbkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że zawiesina pojedynczej komórki.Dodaj jeden mililitr organoidowej pożywki do płukania do probówki z pojedynczymi komórkami. Następnie odwirować zawiesinę i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 50 mikrolitrach organoidowego podłoża do płukania. Dodaj 50 mikrolitrów błękitu trypanowego i policz komórki za pomocą hemocytometru.Na tej podstawie oblicz stężenie komórek w probówce z fragmentem okrężnicy. Odwiruj wymaganą objętość w nowej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Następnie usunąć supernatant.Zawiesić osad w ekstrakcie z błony podstawnej lub BME. Teraz, we wstępnie inkubowanej 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania, odwróć pipetą 10 mikrolitrów roztworu kolonoidu BME na dołek i ostrożnie mieszaj roztwór regularnie, aby zapobiec nierównomiernemu wysiewowi. Odwróć płytkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po 20 minutach pokryj kopuły 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanej pożywki do proliferacji organoidów i kontynuuj inkubację przez trzy dni. Po inkubacji koloidów pochodzących od pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna przez trzy dni, przechyl płytkę i usuń pożywkę z krawędzi studzienek. Dodaj 200 mikrolitrów na studzienkę pożywki do leczenia cytokinami zawierającej 2,5 mikromolowy barwnik fluorescencyjny śmierci komórek.Inkubować koloidy w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez wymagany czas leczenia. Po inkubacji przenieść płytkę do etapu cyfrowego mikroskopu odwróconej epifluorescencji i potwierdzić, że kolonoidy o maksymalnej toksyczności są w pełni licowane. Korzystając z kanału transmisyjnego, skup się na okronoidzie z komórkami SYTOX dodatnimi.Następnie przełącz się na kanał GFP. Dostosuj natężenie światła i czas ekspozycji, aby zmaksymalizować sygnał fluorescencyjny, jednocześnie minimalizując tło. Korzystając ze zoptymalizowanych ustawień obrazu, obserwuj warunki braku barwnika i maksymalnej toksyczności, aby upewnić się, że próbki nie są prześwietlone lub niedoświetlone.Uzyskaj obrazy transmisyjne i GFP kolonoidów przy użyciu metody losowego próbkowania, wybierając pola widzenia, które są zgodne ze stałym wzorem siatki pokrywającym kopułę okrężnicy. Zapisuj obrazy w przenośnym sieciowym formacie graficznym i eksportuj je. Przeciągnij i upuść pliki zestawu danych obrazów na pasek narzędzi ImageJ, a następnie kolejno kliknij pozycję Obraz, stosy i obrazy do stosu, aby połączyć pliki.Następnie kliknij Obraz, a następnie Typ i 8-bitowy, aby przekonwertować stos obrazów na plik 8-bitowy. Kliknij narzędzie do zaznaczania odręcznego i ręcznie wybierz obszar zainteresowania na obrazie transmisji. Następnie przełącz się między stosem obrazów na odpowiedni obraz kanału GFP.Na pasku narzędzi kliknij przycisk Analizuj i ustaw pomiary. W oknie dialogowym Ustawianie miar zaznacz średnią wartość szarości i pozostaw inne pola niezaznaczone. Po wybraniu obrazu GFP kliknij przycisk Analizuj i mierz.Po przeanalizowaniu zestawu danych skopiuj wszystkie dane w oknie wyników i wklej je do arkusza kalkulacyjnego. Należy obliczyć średnią średnich wartości szarości z repliki technicznej dla każdego warunku. Odejmij średnią nieleczonego schorzenia od każdego stanu poddanego zabiegowi.Następnie należy podzielić każdy warunek poddania działaniu substancji przez odjętą w tle średnią stanu maksymalnej toksyczności. Aby obliczyć żywotność komórek po leczeniu, odejmij znormalizowane wartości od jednego. Korzystając z podanego równania, oblicz współczynnik interakcji perturnanta.Transmisyjne obrazy fluorescencyjne kolonoidów po ośmiu godzinach wykazały, że tylko interferon gamma plus kolonoidy traktowane TNF alfa były dodatnie dla sygnału fluorescencyjnego. Po 24 godzinach kolonoidy leczone interferonem gamma i TNF alfa wykazywały duże obszary dodatnie dla sygnału fluorescencyjnego z wyraźnym podziałem morfologii okrężnicy. Poziomy śmierci komórek po ośmiu godzinach były niskie dla kolonoidów kontrolnych BSA z niewielkim wzrostem w stanach leczonych TNF alfa.Po 24 godzinach interferon gamma w połączeniu z kolonoidami traktowanymi TNF alfa wykazywał najwyższe poziomy śmierci komórek. Wartości CPI wskazywały na niewielki synergizm po ośmiu godzinach i znaczny synergizm po 24 godzinach. Potwierdziło to zależne od czasu synergiczne oddziaływanie między interferonem gamma a TNF alfa.

quantification-cytokine-induced-cell-death-human-colonic-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test cytometrii przepływowej do ilościowego określenia poziomów ROS w organoidach jelitowych 3D uzyskanych od transgenicznych myszy wykazujących ekspresję GFP. Metoda ta zapewnia eksperymentalny model in vitro do zbadania skuteczności badanych związków w produkcji ROS.

Test cytometrii przepływowej do ilościowego określania stresu oksydacyjnego: Test do ilościowego określania reaktywnych form tlenu w organoidach jelitowych za pomocą sond fluorogennych

Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Ten protokół opisuje test do charakterystyki tworzenia się kropelek lipidowych (LD) w organoidach jelitowych człowieka po stymulacji kwasami tłuszczowymi. Omówiliśmy, w jaki sposób ten test jest używany do ilościowego oznaczania powstawania LD i jak można go wykorzystać do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które wpływają na tworzenie LD.

Test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka

Prezentowany protokół wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego określenia liczby proliferujących i martwych komórek w hodowanych enteroidach myszy. Metoda ta jest pomocna w ocenie wpływu leczenia farmakologicznego na proliferację organoidów i przeżycie.

Kwantyfikacja komórek proliferacyjnych i martwych w enteroidach

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół generowania dojrzałych ludzkich organoidów siatkówki i wykorzystywania ich w teście toksyczności fotoreceptorów do identyfikacji kandydatów farmaceutycznych na chorobę zwyrodnieniową siatkówki związaną z wiekiem teleangiektazję plamki żółtej typu 2 (MacTel).

Badania przesiewowe toksyczności w ludzkich organoidach siatkówki do odkryć farmaceutycznych

Organoidy jelitowe pochodzące z biopsji oraz technologie organ-on-a-chips są połączone w platformę mikrofizjologiczną, aby podsumować funkcjonalność jelit specyficzną dla regionu.

Połączenie ludzkich organoidów i technologii Organ-on-A-Chip w celu modelowania funkcjonalności specyficznej dla regionu jelitowego

Tutaj prezentujemy metodę identyfikacji związków, które modulują mechanizm ADCC, ważny mechanizm zabijania komórek nowotworowych przez przeciwciała przeciwnowotworowe. Działanie cytotoksyczne komórek NK mierzy się w sferoidach komórek raka piersi w obecności trastuzumabu. Analiza obrazu identyfikuje żywe i martwe komórki zabójcze i docelowe w sferoidach.

Kwantyfikacja cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał w modelu sferoidalnym guza: zastosowanie do odkrywania leków

Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów są wyrafinowanym systemem modelowym do badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł dotyczący metod szczegółowo opisuje zastosowanie multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do jednoczesnej oceny kinetycznej różnych fenotypów organoidów.

Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta

To badanie wykorzystuje wielobarwne markery fluorescencji śmierci komórki i apoptozy w połączeniu z mikroskopią konfokalną do oceny apoptozy wywołanej cytokinami i śmierci specyficznej dla komórek β w wyspach trzustkowych. Ujawnia przestrzenne i czasowe zmiany w śmierci komórki i apoptozie w odpowiedzi na bodźce zewnątrzkomórkowe.

Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

Poznaj metodę kwantyfikacji śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów śmierci komórek nabłonkowych w warunkach zapalnych.

Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo

Przeglądaj więcej filmów