Kwantyfikacja śmierci komórek wywołanej cytokinami w ludzkich organoidach okrężnicy przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej na żywo

Cytokiny zapalne, interferon, gamma i TNF, alfa istnieją od setek milionów lat i mają kluczowe znaczenie dla skutecznej obrony gospodarza przed patogenami międzykomórkowymi. Nasza grupa badawcza stara się zrozumieć, w jaki sposób te cytokiny zabijają komórki, takie jak komórki nabłonkowe w jelitach i komórki rakowe. Powszechnie stosowane systemy do badania mechanizmów śmierci komórek nabłonka jelitowego obejmują modele mysie i unieśmiertelnione linie komórek nowotworowych.

Organoidy testowe u ludzi są korzystne, ponieważ są generowane bezpośrednio z biopsji pacjenta i zachowują wiele fizjologicznych i morfologicznych cech pary w tkance. Oznacza to, że mają zwiększoną wartość translacyjną. Badania nad narządami mają problemy z odtwarzalnością eksperymentów i wiążą się z kilkoma wyzwaniami technicznymi w porównaniu z tradycyjną hodowlą komórkową.

Obecne techniki pomiaru śmierci komórek organoidowych również mają ograniczenia. Niektóre są tylko częściowo ilościowe, nie mierzą bezpośrednio śmierci komórki, nie mogą mierzyć odpowiedzi pojedynczych organoidów lub wymagają drogiego sprzętu i złożonych protokołów. Nasz protokół analizy ilościowej śmierci komórek organoidowych jest prosty, solidny i niedrogi.

Użyliśmy naszego protokołu do pomiaru odpowiedzi pojedynczych organoidów na cytotoksyczne kombinacje cytokin, ale można go łatwo dostosować do badania dowolnego rodzaju zakłóceń. Metoda ta jest przydatna w badaniach nad śmiercią komórkową, funkcją bariery nabłonkowej lub immunologią błony śluzowej. Ostatnio informowaliśmy, że interferon gamma i TNF alfa działają synergicznie w celu wywołania śmierci komórek zapalnych w komórkach nabłonka jelitowego i komórkach raka jelita grubego.

Robią to za pośrednictwem szlaku sygnałowego JAK: jeden, dwa, stat, jeden. W przyszłych pracach chcemy zrozumieć, jaki to jest rodzaj śmierci komórki i w jaki sposób JAK jeden i JAK dwa zabijają komórki. Po rozszerzeniu koloidów pochodzących od pacjenta z chorobą Leśniowskiego-Crohna w płytce 48-dołkowej, delikatnie usuń pożywkę z krawędzi studzienki, nie uszkadzając kopuły kolonoidy.

Dodać 300 mikrolitrów enzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego uzupełnionego 10 mikromolowym ROCK1 i dwoma inhibitorami Y-27632 do każdej studzienki. Za pomocą końcówki do pipety P1000 zeskrob powierzchnię studzienki, aby rozbić kopułę kolonoidu i pipetować zawiesinę komórek w górę iw dół. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki.

Inkubuj zebrane kolonoidy w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Odwirować kolonoidy o stężeniu 400 G przez trzy minuty. I usuń supernatant, pozostawiając około 1,2 mililitra w probówce.

Następnie umieść końcówkę pipety P1000 w zawiesinie, trzymając ją tuż nad dnem probówki i szybko odpipetuj zawiesinę do i z końcówki, aby oddzielić okrężnicę. Obserwuj probówkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie pozostały całe kolonoidy, a fragmenty okrężnicy mają wielkość około 30 do 40 mikrometrów. Następnie dodaj 10 mililitrów lodowatego organoidowego środka do płukania do 15-mililitrowej probówki.

Odwirować probówkę o sile 400 G przez trzy minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze lodowatego organoidowego podłoża do mycia. Przenieś zawiesinę do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i oznacz ją jako probówkę z fragmentem kolonoidy.

Po wymieszaniu przenieś 50 mikrolitrów próbki do nowej probówki i oznacz ją jako probówkę do liczenia komórek. Odwirować probówkę o sile 400 G przez trzy minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach enzymatycznego odczynnika dysocjacyjnego uzupełnionego 10 mikromolowym Y-27632.

Inkubować probówkę do liczenia pojedynczych komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Używając pipety P1000 o pojemności 400 mikrolitrów, szybko odpipetuj próbkę. Następnie obserwuj próbkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że zawiesina pojedynczej komórki.

Dodaj jeden mililitr organoidowej pożywki do płukania do probówki z pojedynczymi komórkami. Następnie odwirować zawiesinę i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 50 mikrolitrach organoidowego podłoża do płukania. Dodaj 50 mikrolitrów błękitu trypanowego i policz komórki za pomocą hemocytometru.

Na tej podstawie oblicz stężenie komórek w probówce z fragmentem okrężnicy. Odwiruj wymaganą objętość w nowej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki. Następnie usunąć supernatant.

Zawiesić osad w ekstrakcie z błony podstawnej lub BME. Teraz, we wstępnie inkubowanej 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania, odwróć pipetą 10 mikrolitrów roztworu kolonoidu BME na dołek i ostrożnie mieszaj roztwór regularnie, aby zapobiec nierównomiernemu wysiewowi. Odwróć płytkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po 20 minutach pokryj kopuły 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanej pożywki do proliferacji organoidów i kontynuuj inkubację przez trzy dni. Po inkubacji koloidów pochodzących od pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna przez trzy dni, przechyl płytkę i usuń pożywkę z krawędzi studzienek. Dodaj 200 mikrolitrów na studzienkę pożywki do leczenia cytokinami zawierającej 2,5 mikromolowy barwnik fluorescencyjny śmierci komórek.

Inkubować koloidy w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez wymagany czas leczenia. Po inkubacji przenieść płytkę do etapu cyfrowego mikroskopu odwróconej epifluorescencji i potwierdzić, że kolonoidy o maksymalnej toksyczności są w pełni licowane. Korzystając z kanału transmisyjnego, skup się na okronoidzie z komórkami SYTOX dodatnimi.

Następnie przełącz się na kanał GFP. Dostosuj natężenie światła i czas ekspozycji, aby zmaksymalizować sygnał fluorescencyjny, jednocześnie minimalizując tło. Korzystając ze zoptymalizowanych ustawień obrazu, obserwuj warunki braku barwnika i maksymalnej toksyczności, aby upewnić się, że próbki nie są prześwietlone lub niedoświetlone.

Uzyskaj obrazy transmisyjne i GFP kolonoidów przy użyciu metody losowego próbkowania, wybierając pola widzenia, które są zgodne ze stałym wzorem siatki pokrywającym kopułę okrężnicy. Zapisuj obrazy w przenośnym sieciowym formacie graficznym i eksportuj je. Przeciągnij i upuść pliki zestawu danych obrazów na pasek narzędzi ImageJ, a następnie kolejno kliknij pozycję Obraz, stosy i obrazy do stosu, aby połączyć pliki.

Następnie kliknij Obraz, a następnie Typ i 8-bitowy, aby przekonwertować stos obrazów na plik 8-bitowy. Kliknij narzędzie do zaznaczania odręcznego i ręcznie wybierz obszar zainteresowania na obrazie transmisji. Następnie przełącz się między stosem obrazów na odpowiedni obraz kanału GFP.

Na pasku narzędzi kliknij przycisk Analizuj i ustaw pomiary. W oknie dialogowym Ustawianie miar zaznacz średnią wartość szarości i pozostaw inne pola niezaznaczone. Po wybraniu obrazu GFP kliknij przycisk Analizuj i mierz.

Po przeanalizowaniu zestawu danych skopiuj wszystkie dane w oknie wyników i wklej je do arkusza kalkulacyjnego. Należy obliczyć średnią średnich wartości szarości z repliki technicznej dla każdego warunku. Odejmij średnią nieleczonego schorzenia od każdego stanu poddanego zabiegowi.

Następnie należy podzielić każdy warunek poddania działaniu substancji przez odjętą w tle średnią stanu maksymalnej toksyczności. Aby obliczyć żywotność komórek po leczeniu, odejmij znormalizowane wartości od jednego. Korzystając z podanego równania, oblicz współczynnik interakcji perturnanta.

Transmisyjne obrazy fluorescencyjne kolonoidów po ośmiu godzinach wykazały, że tylko interferon gamma plus kolonoidy traktowane TNF alfa były dodatnie dla sygnału fluorescencyjnego. Po 24 godzinach kolonoidy leczone interferonem gamma i TNF alfa wykazywały duże obszary dodatnie dla sygnału fluorescencyjnego z wyraźnym podziałem morfologii okrężnicy. Poziomy śmierci komórek po ośmiu godzinach były niskie dla kolonoidów kontrolnych BSA z niewielkim wzrostem w stanach leczonych TNF alfa.

Po 24 godzinach interferon gamma w połączeniu z kolonoidami traktowanymi TNF alfa wykazywał najwyższe poziomy śmierci komórek. Wartości CPI wskazywały na niewielki synergizm po ośmiu godzinach i znaczny synergizm po 24 godzinach. Potwierdziło to zależne od czasu synergiczne oddziaływanie między interferonem gamma a TNF alfa.