Name: Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj zaktualizowany multipleksowy test LN34 RT-PCR do diagnostyki wścieklizny u zwierząt. Ta metoda poprawia dokładność wykrywania wirusa w tkankach mózgu i wspiera działania profilaktyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wysiłki i współpracę wielu laboratoriów diagnostycznych przeciw wściekliźnie, które przyczyniły się do wdrożenia, walidacji i optymalizacji testu LN34 poprzez otwartą dzielność danych i opinie. Używanie nazw handlowych i źródeł komercyjnych służy wyłącznie identyfikacji i nie oznacza poparcia przez Centers for Disease Control and Prevention, Departament Zdrowia i Opieki Społecznej USA ani instytucje powiązane z autorami. Wnioski, ustalenia i opinie wyrażone przez autorów niekoniecznie odzwierciedlają oficjalne stanowisko Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej USA, Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ani instytucji powiązanych z autorami.

<ol><li>Meechan, P. J., Potts, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMeechan%2C+PJ+%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2020).</li>
<li>Terrestrial Manual 2023. , World Organization for Animal Health. At
 <a target="_blank" href="https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals">https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals</a> (2023).</li>
<li>Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1, World Health Organization. At
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/handle/10665/310836">https://iris.who.int/handle/10665/310836</a> (2018).</li>
<li>Laboratory Techniques in Rabies. Volume 2, World Health Organization. At
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/310837/9789241515306-eng.pdf?ua=1">https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/310837/9789241515306-eng.pdf?ua=1</a> (2019).</li>
<li>Genevie, R., et al. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing: A minimum standard for rabies diagnosis in the United States. , At
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/RabiesDFASPv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/RabiesDFASPv2.pdf</a> (2003).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+Expert+Consultation+on+Rabies%3A+Third+Report%22">WHO Expert Consultation on Rabies: Third Report</a>. , World Health Organization. Geneva. (2018).</li>
<li>Gigante, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+evaluation+of+the+LN34+pan-lyssavirus+real-time+RT-PCR+assay+for+postmortem+rabies+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-site evaluation of the LN34 pan-lyssavirus real-time RT-PCR assay for postmortem rabies diagnostics.</a> PLoS One. 13 (5), e0197074(2018).</li>
<li>Wadhwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pan-Lyssavirus+Taqman+Real-Time+RT-PCR+assay+for+the+detection+of+highly+variable+rabies+virus+and+other+lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR assay for the detection of highly variable rabies virus and other lyssaviruses.</a> PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005258(2017).</li>
<li>Gigante, C. M., Wicker, V., Wilkins, K., Seiders, M., Zhao, H., Patel, P., Orciari, L., Condori, R. E., Dettinger, L., Yager, P., Xia, D., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+pan-lyssavirus+LN34+assay+for+streamlined+rabies+diagnostics+by+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of pan-lyssavirus LN34 assay for streamlined rabies diagnostics by real-time RT-PCR.</a> Journal Virological Methods. , In press (2024).</li>
<li>Rao, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+modified+preexposure+prophylaxis+vaccination+schedule+to+prevent+human+rabies%3A+recommendations+of+the+advisory+committee+on+immunization+practices-United+States%2C+2022%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">Use of a modified preexposure prophylaxis vaccination schedule to prevent human rabies: recommendations of the advisory committee on immunization practices-United States, 2022.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (18), 619(2022).</li>
<li>Condori, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+LN34+Pan-Lyssavirus+Real-Time+RT-PCR+assay+for+rabies+diagnosis+and+rapid+genetic+typing+from+formalin-fixed+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Using the LN34 Pan-Lyssavirus Real-Time RT-PCR assay for rabies diagnosis and rapid genetic typing from formalin-fixed human brain tissue.</a> Viruses. 12 (1), 120(2020).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia

Udane badanie LN34 wymaga dodatniej kontroli, kontroli ekstrakcji, a reakcje kontroli wzorcowej nie przebiegają zgodnie z oczekiwaniami w każdym testie, w przeciwnym razie cykl musi zostać unieważniony i powtórzony. Wszystkie trzy pozytywne reakcje replikacyjne LN34 powinny przekroczyć próg w określonym zakresie lub powtórzyć ten proces. Dodatnie RNA kontrolowane opisane w poprzednich publikacjach 7,8 nie amplifikuje się w teście βA. Reakcje kontrolne bez szablonu nie powinny wykazywać krzywych amplifikacji przekraczających linię progową ani dla testu LN34, ani βA. Kontrola ekstrakcji nie powinna wykazywać amplifikacji dla LN34. Jeśli zaobserwowane zostanie nieoczekiwane wzmocnienie w NTC lub kontroli ekstrakcji, może to wskazywać na skażenie i unieważnić przeprowadzenie testów powtórzonych dla wszystkich próbek (patrz Tabela 5). Użytkownicy mogą rozważyć dodanie dodatkowych kontroli, w tym kontroli bez procesu lub bez próbki, aby monitorować zanieczyszczenie odczynników ekstrakcyjnych βA przez gospodarza.
Gdy śmiertelność na wściekliznę zbliża się do 100%, zaleca się dalsze badanie wszelkich słabych lub nieprawidłowych amplifikacji, nawet jeśli nie daje wartości CT. Reakcje ujemne lub NTC nie powinny wykazywać żadnego wzmocnienia, a fluorescencja powinna pojawiać się jako linia płaska równoległa do fluorescencji ROX w widoku wieloskładnikowym. Obserwacje krzywych, zwłaszcza w wielu replikacjach, mogą wskazywać na zanieczyszczenie krzyżowe lub słaby wynik pozytywny. Wszystkie repliki dla próbki dodatniej powinny być amplifikowane, aby uzyskać ważny wynik pozytywny. Jeśli tylko podzbiór replikacji amplifikuje się w którymkolwiek z testów, próbka powinna zostać ponownie przebadana. Ponadto każda próba dająca wysoce zmienne wyniki (różnice wartości Ct > ±1,5 między replikacjami) powinna być uznana za nieważną i próbka powinna być ponownie przebadana. Jeśli problem się utrzymuje, próbkę należy ponownie pobrać.
Próbka pozytywna na wściekliznę, pobrana z prawidłowo zebranej i przechowywanej tkanki pnia mózgu i móżdżku, powinna mieć wartość Ct krótszą niż 35 cykli w badaniu LN34. Wszystkie niejednoznaczne próbki muszą być ponownie przebadane za pomocą LN34 RT-PCR w czasie rzeczywistym. Jeśli próbka jest niejednoznaczna po powtórzeniu testów i wszystkie kontrole przeprowadzone zgodnie z oczekiwaniami, zaleca się ponowne wyodrębnienie RNA. Próbki z niskim poziomem RNA wirusowego (LN34 Ct > 35) mogą wskazywać na potencjalne problemy, takie jak skażenie, niskie obciążenie wirusem, hamowanie PCR lub nieudana ekstrakcija. Pobierz świeże fragmenty mózgu z oryginalnej tkanki, wykonaj ekstrakcję RNA i ponownie przebadaj próbkę. Podobnie, wartości Ct > 33 (singleplex), 37 (LN34M) lub brak amplifikacji w badaniu βA mogą wskazywać na niepowodzenie ekstrakcji RNA. Powtórz ekstrakcję dla takich próbek, a następnie powtórz badania zarówno LN34, jak i aktyny. Jeśli próbka po wielokrotnych testach ponownie da niejednoznaczny wynik, należy użyć metody wtórnej, takiej jak test DFA (zwany też FAT), DRIT lub izolacja wirusa. Jeśli zaobserwowane są dalsze rozbieżności lub niejednoznaczne wyniki, prosimy o konsultację z laboratorium referencyjnym przeciw wściekliźnie w celu uzyskania potwierdzających testów.
Jeśli inhibitory występują w ekstrakcji RNA, testy PCR mogą dać fałszywie negatywny wynik. Jeśli podejrzewa się hamowanie lub hamowanie reakcji kontrolnych βA (takich jak wartość Ct > 33 lub wartość Ct > 37) dla konkretnej próbki, ekstrahowane RNA powinno być testowane w 2 lub więcej rozcieńczeniach (np. 1:10 i 1:100 w wodzie wolnej od nukleazy), aby rozcieńczyć ewentualne inhibitory PCR. Dla trudnych próbek zawartość RNA można zwiększyć do 8,5 μL w reakcji RT-PCR, nie dodając wody. Może to ujawniać zwiększoną inhibicję (późniejsza wartość Ct w porównaniu do 2 μL wejściowego RNA) lub niski poziom RNA w oryginalnej próbie (wcześniejsza wartość Ct przy użyciu 8,5 μL w porównaniu do 2 μL wejściowego RNA).
Test LN34 nie rozróżnia lizawirusów ani nie określa wariantów wirusa wścieklizny. Amplicon z testu LN34 może być sekwencjonowany pod kątem niskiej rozdzielczości typowania wariantu wirusa wścieklizny lub identyfikacji lizawirusatypu 11.

Protokół ten opisuje procedurę diagnostyki wścieklizny z wykorzystaniem testu reakcji łańcuchowej LN34 pan-lizawirusa w czasie rzeczywistym (RT-PCR) od pobrania próbki aż do interpretacji wyników. Procedura zostanie podzielona na trzy części: pobieranie próbek mózgu w związku z testem LN34 (Sekcja 1), ręczną ekstrakcję RNA opartą na kolumnie przy użyciu zestawu Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research R2051) (Sekcja 2) oraz LN34 RT-PCR w czasie rzeczywistym skonfigurowanego przy użyciu zestawu AgPath-ID One-Step RT-PCR (ThermoFisher Scientific AM1005) (Sekcja 3). Ekstrakcja RNA i RT-PCR mogą być wykonywane przy użyciu innych produktów, jednak zestawy należy zweryfikować przed użyciem, aby zapewnić odpowiednią ekstrakcję i amplifikację RNA lizawirusa.
Sekcja 1 opisuje zebranie odpowiednich tkanek mózgowych do wykorzystania w teście RT-PCR LN34 w czasie rzeczywistym. Opis sekcji zwłok zwierzęcia, dekapitacji i usunięcia mózgu nie jest uwzględniony. Próbki mogą zawierać czynniki zakaźne. Procedury bezpieczeństwa biologicznego opisane w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 6th Edition1 powinny być przestrzegane, aby ograniczyć ryzyko. Próbki powinny być uznane za zakaźne do czasu zakończenia inaktywacji. Inaktywacja wirusa i walidacja testów powinny być przeprowadzane w każdym laboratorium zgodnie ze standardami danej instytucji. Laboratoria powinny stosować standardowe procedury bezpieczeństwa i jakości określone przez ich instytucję podczas wdrażania nowego testu diagnostycznego.
Na podstawie tego, co wiadomo o rozprzestrzenianiu się wirusa wścieklizny podczas infekcji, pień mózgu i móżdżek są najlepszymi tkankami do diagnozowania wścieklizny, a te tkanki są zalecane do testów na wściekliznę przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt oraz Światową Organizację Zdrowia Zwierząt 2,3,4,5. Ponieważ rozprzestrzenianie się wirusa może być jednostronne (Rysunek 1), zwłaszcza u większych zwierząt, należy zbadać pełny przekrój poprzeczny pnia mózgu oraz trzech płatów móżdżku w celu wykluczenia wścieklizny. W przypadku próbek, które nie spełniają tych minimalnych kryteriów, laboratorium może odrzucić próbkę jako niewystarczającą do testów lub zdecydować się na testy w celach nadzoru lub regulacji. Jeśli nie otrzyma wymaganych tkanek, ale laboratorium zdecyduje się na badanie, negatywny wynik testu powinien być uznany za niejednoznaczny dla wścieklizny u danego zwierzęcia, ponieważ obecność RNA wirusa w innych tkankach może być opóźniona, niska, przerywana lub jej brakować. W takim przypadku konieczne jest zebranie wymaganych próbek lub dodatkowe badania, aby wykluczyć wściekliznę. Jednak identyfikacja RNA lizawirusa w jakiejkolwiek tkance jest diagnostyczna dla zakażenia wścieklizną 3,6. Przykładami próbek, które mogą być testowane na obecność RNA wirusa wścieklizny w celu regulacji lub monitorowania (ale nie wykluczenia) zakażenia wścieklizną, to kora, hipokamp, rdzeń kręgowy, próbki zdegradowane, skóra, ślina i rogówka. Po przybyciu do laboratorium należy dokonać jakościowej oceny stanu każdej próbki. Chłodzenie może zachować próbkę przez co najmniej 72 godziny, ale nie powinno być stosowane długoterminowo. Powtarzające się cykle zamrożenia i rozmrażania mogą zmniejszyć czułość testu, dlatego należy unikać więcej niż pięciu cykli zamrożenia i rozmrażania. Jeśli stan tkanki uniemożliwia pewną identyfikację struktur mózgowych, próbka powinna zostać uznana za niezadowalającą. W przypadku niezadowalającej próbki można nadal przeprowadzić testy, aby stwierdzić (ale nie wykluczyć) wściekliznę. Pozytywne wyniki testów są podawane w ten sposób. Negatywne lub niejednoznaczne wyniki dotyczące niezadowalających tkanek powinny być zgłaszane jako niejednoznaczne, aby zapobiec błędnej interpretacji jako negatywnej diagnozy.
Protokół ten został opracowany na podstawie opublikowanych procedur 7,8,9 i zawiera zaktualizowane startery skierowane do regionu lidera genomu lizawirusa oraz sekwencji kodującej nukleoproteinę. Sonda celuje w krótką, wysoce zachowaną sekwencję i wykorzystuje zablokowane nukleotydy, co umożliwia szerokie wykrywanie. Test wykrywa RNA z różnych lizawirusów o różnym stężeniu8. Protokół ten demonstruje procedury laboratoryjne do przeprowadzenia testu PCR w czasie rzeczywistym LN34, jednak dokładne i czułe wykrywanie RNA lizawirusa zależy od innych elementów, które nie są szeroko objęte protokołem, takich jak przechowywanie próbek, prowadzenie dokumentacji, szkolenie i kompetencje personelu, śledzenie wyników, interpretacja wyników, zapewnienie jakości, środki bezpieczeństwa laboratoryjnego oraz rozwiązywanie problemów. Testy oparte na PCR są podatne na zanieczyszczenia krzyżowe ze względu na wysoką czułość. Zanieczyszczenia krzyżowego można uniknąć, stosując dobre praktyki laboratoryjne, takie jak częsta zmiana rękawic, obsługa jednej próbki naraz, dezynfekcja powierzchni roboczych skutecznymi środkami dekontaminującymi między próbkami oraz trzymanie rurek zamkniętych i próbek oddzielnych od odczynników PCR. Odczynniki i próbki PCR można łatwo oddzielić, stosując jednostronny przepływ pracy i rozdzielając obszary pracy przed i po amplifikacji. Na przykład przygotowuj mastermiksy PCR w miejscu fizycznie oddzielonym od miejsca przetwarzania próbek. Często zmieniaj rękawice, aby uniknąć skażenia odczynników PCR próbkami, zanieczyszczeniami lub dodatnim RNA. Płytka PCR lub probówki powinny zostać przeniesione po dodaniu mieszanki głównej do drugiego miejsca, gdzie można dodać próbkę i RNA sterujące. Co ważne, produkty PCR nie powinny być manipulowane w miejscach, gdzie przygotowywane są próbki lub mastermixy.
Nie ma nic lepszego niż praktyczna praktyka i doświadczenie podczas wykonywania testów diagnostycznych. Wszyscy nowi pracownicy powinni być szkoleni, a personel testujący powinien być oceniany pod kątem kompetencji co najmniej raz w roku, zgodnie z wymaganiami odpowiedniego dyrektora laboratorium. Wszelkie obserwacje nietypowych wyników lub niepowodzenia testu powinny być natychmiast zanotowane, zbadane i skorygowane. Każda nowa partia odczynników powinna być walidowana przy użyciu próbek o znanych wartościach Ct (takich jak próbka z dodatnim kontrolą lub zarchiwizowana). Cały sprzęt powinien być rutynowo konserwowany, zgodnie z zaleceniami producenta, a skuteczność testu powinna być weryfikowana po każdej konserwacji lub naprawie. Poziomy temperatury powinny być monitorowane na odpowiednim sprzęcie, aby lodówki i zamrażarki mieszały się w kryteriach ustalonych dla akceptowalnego zakresu temperatur dla odczynników stosowanych w badaniach diagnostycznych.
Modyfikacje proceduralne mogą wpływać na wydajność testu i prowadzić do wyników fałszywie pozytywnych, fałszywie negatywnych lub nieinterpretowalnych. Zalecenia należy ściśle przestrzegać, aby zapewnić wysoką czułość i swoistość testu. Laboratorium chcące wprowadzić modyfikacje tego protokołu powinno zweryfikować i potwierdzić zmodyfikowane metody w konsultacji z CDC.

<table><tbody><tr><td>7500 Fast</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>Nie ma</td><td>Nie zastępuj bez weryfikacji</td></tr><tr><td>7500 Fast Dx&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>Nie ma</td><td>Nie zastępuj bez weryfikacji</td></tr><tr><td>ABI ViiA 7</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>Nie ma</td><td>Nie zastępuj bez weryfikacji</td></tr><tr><td>AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific &nbsp;</td><td>AM1005</td><td>Nie zastępuj bez weryfikacji</td></tr><tr><td>Beadbug6</td><td>Benchmark Scientific</td><td>D1036</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MiniPrep z RNA Direct-zol &nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyser zielone koraliki&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5425 R</td><td></td></tr><tr><td>Optyczne płytki reakcyjne 96-dołkowe</td><td>ThermoFisher Scientific &nbsp;</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Osłony z klejem optycznym</td><td>ThermoFisher Scientific &nbsp;</td><td>4311971</td><td>Alternatywa: czapki</td></tr><tr><td>Aplikatory z włóknem poliestrowym do stosowania wymazy&nbsp;</td><td>BD BBL Poliestrowy Włókno Aplikacyjny Opaska Aplikacyjny</td><td>220690</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6Flex</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4485691</td><td>Nie zastępuj bez weryfikacji</td></tr><tr><td>Czwartorzędowy środek dezynfekujący amonikiem (1:256)</td><td>LYSOL</td><td>WBB56939</td><td>Nie zastępuj bez weryfikacji</td></tr><tr><td>PROSZĘ DO WOLI</td><td>ThermoFisher Scientific &nbsp;</td><td>7002PK</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>ThermoFisher Scientific &nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowy, skalpel z mechanizmem bezpieczeństwa;</td><td>Integra Miltex&nbsp;</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne mikrowirówki poliproylenowe (1,5 mL), wolne od nukleazy</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.405</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówki sterylne poliproylenowe (2 mL), wolne od nukleazy</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.600</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific &nbsp;</td><td>15596026</td><td>Nie zastępuj bez weryfikacji</td></tr></tbody></table>

diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu ln34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by the Updated, Multiplexed LN34 Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay

Wścieklizna to śmiertelna choroba zoonotyczna wywołana przez wściekliznę wywołaną Lyssawirusem (RABV) oraz powiązane negatywne wirusy RNA z rodzaju Lyssavirus ( rodzina Rhabdoviridae). Test LN34 celuje w wysoce konserwowany region lidera i gen nukleoproteinowy genomu lizawirusa oraz wykorzystuje zdegradowane prymary oraz sondę TaqMan zawierającą zablokowane nukleotydy do wykrywania RNA w różnorodnym rodzaju lizawirusa . Negatywne wynik wścieklizny powinien być wykonany tylko po zbadaniu pełnego przekroju pnia mózgu i trzech płatów móżdżku; jednak identyfikacja RNA lizawirusa w jakiejkolwiek tkance jest diagnostyczna dla zakażenia wścieklizną. Tkanka jest zbierana i ujednoliczana w odczynniku TRIzolu, który również inaktywuje wirusa. Ekstrakcja RNA przeprowadza się za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji opartego na kolumnie spinowej. Mieszanki główne przygotowuje się w czystej przestrzeni i alicyta do płyty o pojemności 96 dołków przed dodaniem próbki RNA. W warunkach klinicznych każda próbka jest testowana RT-PCR w czasie rzeczywistym pod kątem obecności RNA lizawirusa w trzech egzemplarzach oraz pojedynczo na mRNA β -aktyny gospodarza. Dodatnia i ujemna kontrola są uwzględniane podczas ekstrakcji i kroków RT-PCR w czasie rzeczywistym protokołu. Analiza danych polega na ręcznej regulacji progów w celu standaryzacji wartości Ct w różnych przebiegach instrumentów. Pozytywne wyniki określa obecność typowego wzmocnienia w teście pan-lyssavirus (Ct ≤ 35). Wyniki negatywne wynikają z braku typowej amplifikacji w teście pan-lizawirusa oraz wykrycia mRNA β-aktyny gospodarza (Ct ≤ 33). Obserwacja wartości poza tymi zakresami lub niepowodzenie kontroli testu może unieważnić przeprowadzenie lub skutkować niejednoznacznymi wynikami dla próbki. Protokół należy ściśle przestrzegać, aby zapewnić wysoką czułość i swoistość testu. Modyfikacje proceduralne mogą wpływać na wydajność testu i prowadzić do wyników fałszywie pozytywnych, fałszywie negatywnych lub nieinterpretowalnych.

Reprezentatywne obrazy z udanego testu LN34 przeprowadzonego na przyrządzie ABI ViiA7 w czasie rzeczywistym przedstawiono na Rysunku 2. Wyniki oglądania przedstawione na skali logarytmicznej umożliwiają łatwe obserwowanie wartości Ct, punktu, w którym krzywa przecina linię progową (rysunek 2A,C). Na wykresie w skali liniowej udane wzmocnienie pojawi się jako krzywa sigmoidalna (lub w kształcie litery "S") (rysunek 2B,D), natomiast wyniki ujemne powinny być prostą, płaską linią. Zaleca się oglądanie wyników zarówno w skali liniowej, jak i logarytmicznej, aby zidentyfikować możliwe anomalie lub błędy. Typowe pozytywne i negatywne wyniki w widoku wieloskładnikowym można zobaczyć odpowiednio na rysunku 2E,F, gdzie poziom fluorescencji barwnika oznaczającego sondę (FAM dla LN34, VIC/HEX dla βA) można zaobserwować względem pasywnego barwnika w buforze reakcji (ROX).
Przykłady nieprawidłowych wyników pokazano na Rysunku 3. Porównania między wykresami udanych przejazdów (Rysunek 2) a wykresami nieprawidłowymi (Rysunek 3) mogą być wykorzystywane do izolowania nietypowych przejazdów i problemów z instrumentami. Rysunek 3A pokazuje sygnał przekraczający próg, co daje wartość Ct dla LN34, ale krzywa wzmocnienia jest bardzo nietypowa i rośnie liniowo. Wykres wieloskładnikowy (Rysunek 3B) pokazuje również falistą linię, która nie jest typowa dla próby dodatniej. Ten przykład podkreśla znaczenie przeglądania wykresów amplifikacji, a nie tylko kopiowania wartości Ct. Zawsze upewnij się, że krzywe amplifikacji wyglądają normalnie dla wszystkich próbek. Zaleca się również obejrzenie wykresu wieloskładnikowego, aby upewnić się, że nie występują nieprawidłowości. Czasami sygnały bazowe na nieprzejrzystych poziomach mogą generować wartości Ct w przypadkach, gdy nie nastąpiło wzmocnienie. Jeśli sygnały wzmacniające wydają się liniowe, zaleca się korektę linii bazowej, aby sprawdzić, czy krzywa znika. W przypadku nietypowego sygnału cały przebieg powinien być powtórzony. Zaleca się czyszczenie i uruchomienie płyty tła na urządzeniu PCR w czasie rzeczywistym, jeśli problemy się utrzymają. Jeśli są dostępne, produkty PCR można stosować na żelu agarozowym i/lub sekwencjonować, aby zdiagnozować nietypowe wyniki. Nie zaleca się stosowania wyników elektroforezy żelowej ani sekwencjonowania do określania wyników diagnostycznych.
Poprzednie badania wykazały niską zmienność między replikami, testem, operatorem i laboratorium w testie LN347. Jeśli zaobserwuje się wysoką zmienność (różnicę >±1,5 Ct) między replikacjami tej samej próbki, należy ponownie zbadać to RNA. Duża zmienność może być spowodowana problemami z pipetami, praktykami laboratoryjnymi, błędnym pipetowaniem lub maszynami PCR w czasie rzeczywistym. Powtarzające się obserwacje wysokiej zmienności w kilku próbkach lub w różnych testach mogą wskazywać na problemy systemowe. Próbki z niskim RNA, zbliżające się do progu testu dla próbki pozytywnej (Ct 35), mogą wykazywać większą zmienność wartości Ct między replikacjami. Może być konieczna konsultacja z CDC i rozwiązywanie problemów, aby wyjaśnić przyczynę utrzymującej się zmienności, niespójnych wyników lub niepowodzenia testu.
Wysoka czułość testów opartych na PCR sprawia, że są one z natury podatne na skażenie. Ścisłe przestrzeganie dobrych praktyk laboratoryjnych to najlepszy sposób na ograniczenie zanieczyszczenia krzyżowego. Umiejętność rozpoznawania potencjalnych zanieczyszczeń jest ważna. Należy podejrzewać zanieczyszczenie reagentami, jeśli nie ma kontroli szablonu i podejrzewane negatywne dołki próbki w testie dają podobne wartości Ct. Powtórz testy z nowymi alikwotami odczynników PCR (bufor, woda, startery i enzym) oraz tym samym RNA. Jeśli wszystkie próbki i kontrola ekstrakcji dają podobne wartości CT, ale NTC jest ujemne, należy zbadać zanieczyszczenie odczynników ekstrakcyjnych i powtórzyć ekstrakcję przy użyciu nowych. Dobrą praktyką jest wytwarzanie małych aliquotów odczynników, aby zmniejszyć ryzyko skażenia i uniknąć możliwości wyrzucenia dużych ilości drogich odczynników. Identyfikacja zanieczyszczenia krzyżowego próbki jest trudniejsza. Jeśli podejrzewa się skażenie próbki, powtórz pobieranie próbki, zaczynając od oryginalnych tkanek. W niektórych przypadkach sekwencjonowanie wirusowego RNA może potwierdzić zanieczyszczenie, zwłaszcza gdy zanieczyszczające RNA jest bardzo różne od oczekiwanego wariantu wirusa (takiego jak wirus kontrolny stosowany w laboratorium). Sekwencjonowanie dwóch próbek przetwarzanych jednocześnie może określić, czy sekwencje wirusowe są identyczne, ale może być nieinformacyjne, jeśli sekwencje mają być bardzo podobne (na przykład ten sam wariant zebrany w tym samym hrabstwie). Jeśli podejrzewa się zanieczyszczenie próbki dodatnim RNA, można przeprowadzić amplikony z testu LN34 na żelu agarozowym, aby odróżnić RNA lizawirusa (165 bp) od RNA z dodatnim kontrolem (99 bp). Sekwencja szablonu użytego do wygenerowania dodatniego RNA dostarczonego przez CDC8.
W przypadku innych patogenów laboratoriaki mogą być używane do ręcznego ustawienia progu, aby pozbyć się "szumu", takiego jak słabe wzmocnienie pokazane cyjanem na Rysunku 4. Ta praktyka NIE jest zalecana przy diagnozie wścieklizny, ponieważ może prowadzić do fałszywie negatywnych wyników z poważnymi konsekwencjami, gdyż wścieklizna jest niemal w 100% śmiertelna. NIE zmieniaj ręcznie progu, aby uzyskać negatywne wyniki dla próbek słabych lub późnych amplifikacji. Próbki te muszą zostać ponownie pobrane i/lub ponownie przetestowane, aby wykluczyć wściekliznę.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66761/66761fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Pole widokowe pokazujące jednostronne rozprzestrzenianie się antygenu wirusa wścieklizny u zakażonego osła za pomocą bezpośredniego testu fluorescencyjnych przeciwciał. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/66761fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66761/66761fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Wykresy amplifikacyjne i wieloskładnikowe z udanego testu LN34. Dane wyników (A-D) są przedstawione na skali logaritmowej (A,C) oraz (B,D) w skali liniowej dla testów LN34 i βA. Panele A i B przedstawiają wyniki LN34 z dwóch próbek (w kolorach różowych i cyjanowych) w porównaniu do kontroli pozytywnej (w żółtym). W panelu B jest płaska zielona linia, która przedstawia dodatkową próbkę negatywną w serii. W A zielone linie nie wykazują żadnego wzmocnienia i są przedstawione jako przerywane segmenty. Próg dla testu LN34 został ręcznie ustawiony na 0,2 i jest pokazany przez czerwoną linię poziomą. (C,D) Wyniki testu βA dla dwóch próbek (czerwonej i cyjanowej). Próg testu βA został ręcznie ustawiony na 0,05. (E,F) Wykresy wieloskładnikowe przedstawiają fluorescencję (RFU) w każdym cyklu dla FAM (LN34), VIC (βA) oraz ROX (pasywny barwnik obecny w buforze AgPath-ID). Poziom ROX powinien pozostać na stałym poziomie przez wszystkie cykle. Typowa próbka dodatnia jest pokazana na panelu E; Fluorescencja FAM rośnie jako krzywa sigmoidalna zaczynając od cyklu 18 dla tej próby. Typowa próbka ujemna jest pokazana na panelu F, gdzie poziom FAM pozostaje równoległy do poziomu ROX przez wszystkie cykle. Dane pochodzą z instrumentu PCR w czasie rzeczywistym ABI ViiA7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/66761fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66761/66761fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy rzadkiego, nietypowego sygnału obserwowanego w teście LN34 są wykonywane na przyrządzie PCR ViiA7 w czasie rzeczywistym. (A-F) Wykresy amplifikacyjne (A,C,E) oraz wieloskładnikowe (B,D,F) powstałe w wyniku zanieczyszczenia studni. Liniowy wzrost (A,C) i fluktuacje faliste (B,D) w fluorescencji FAM nie reprezentują prawdziwego wzmocnienia opartego na kształcie krzywych i wielkości zmiany fluorescencji. Panele A do D prawdopodobnie reprezentują próbki ujemne, mimo że dla repliki pokazanej w panelach A i B uzyskano wartość Ct. Panele E i F pokazują nieparzysty sygnał falujący, który łatwiej jest dostrzec na wykresie wieloskładnikowym. Ten typ sygnału powinien być zbadany i może wskazywać na problemy z instrumentami, mimo że wszystkie sterowanie przebiega zgodnie z oczekiwaniami podczas tej trasy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/66761fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66761/66761fig04.jpg" /> 
Rysunek 4: Krzywe RT-PCR LN34 w czasie rzeczywistym z 2 próbek podejrzanych na wściekliznę, pokazujące dwie metody ustalania wartości progowych. (A) Próg LN34 został ustawiony na 0,2 (zalecane dla wszystkich testów). (B) Ręczne określenie innego progu dla każdego przebiegu, aby zamaskować sygnał uznany za "szum" (sygnał opóźnionego wzmocnienia). Metoda stosowana w panelu B NIE jest zalecana w przypadku wścieklizny ze względu na poważne konsekwencje nieuznania prawdziwie pozytywnego wyniku. Późne amplifikowanie może wskazywać na słabą próbkę pozytywną, hamowanie PCR lub nieudaną ekstrakcję w przypadku pozytywnym. Może to również wskazywać na zanieczyszczenie krzyżowe. Złota próbka (oznaczona czarnymi strzałkami) daje wartość Ct na progu testu i nie powinna być uznawana za ujemną. Próbki z późną amplifikacją powinny być ponownie pobierane i testowane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/66761fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
Tabela 1: Sekwencje i stężenia primerów i sond stosowane w testach RT-PCR w czasie rzeczywistym LN34 (singleplex LN34), LN34M (multipleksowany LN34 i βA). Sondy LN34 są oznaczane fluorescencyjnym barwnikiem FAM na 5ʹend oraz czarnodziurowym gasnikiem (BHQ1) na 3ʹendzie. Sonda βA jest oznaczona fluorescencyjnym barwnikiem HEX na 5ʹend oraz czarnym odkrywcem (BHQ1) na 3ʹendzie. Zablokowane bazy zmodyfikowane nukleotydami są oznaczane plusem poprzedzającym zasadę w sekwencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/Table 1.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Przygotowanie testów do testów LN34lys, Actin3 i LN34M. Nazwy, sekwencje i stężenia starterów i sond można znaleźć w Tabeli 1. LN34_F1 odpowiada ACGCTTAACAACCAGATCAAGAA7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/Table 2.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Parametry cykliczne dla instrumentów ABI. WAŻNE: Upewnij się, że uruchamiasz w trybie STANDARD , a nie FAST . Jako pasywny barwnik referencyjny powinien być wybrany ROX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/Table 3.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Algorytm interpretacji wyników RT-PCR LN34 w czasie rzeczywistym dla formatów singleplex (górna, niebieska tabela) i multipleks (dolny, czerwony tabela). Wynik LN34 pozytywny należy uznać za dodatni, nawet jeśli wynik βA jest ujemny lub niejednoznaczny. Jeśli amplikon LN34 nie zostanie wykryty, βA Ct musi znajdować się ≤ wartości Ct określonej wartości progowej, aby uznać ją za ujemną. Wartości βA Ct wskazują na jakość badanej próbki i wskazują na możliwe hamowanie. Niskie stężenie w oryginalnym próbce klinicznej może wpływać na krzywe wzrostu βA, prowadząc do braku zauważalnego amplifikacji. Dodatkowe czynniki przyczyniające się do niewykrycia β-aktyny to słaba ekstrakcja RNA z powodu utraty RNA lub przeniesienia inhibitorów PCR, nieprawidłowy zestaw i technika testowania, niezadowalający typ lub jakość próbki oraz nieprawidłowości odczynników lub sprzętu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/Table 4.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 5: Działania i interpretacje wspólnych wyników dla kontroli testów LN34. Wszystkie trzy kontrolne (RNA z dodatnim testem na wściekliznę, kontrolę ekstrakcji negatywną na wściekliznę oraz brak kontroli szablonowej muszą dawać oczekiwane rezultaty, aby przebieg przeszedł. Niepowodzenie kontroli pozytywnej lub brak kontroli szablonowej może wskazywać na błędne piepowanie, odczynnik lub awarię sprzętu. Cały cykl, włącznie ze wszystkimi badanymi próbkami RNA, musi być powtórzony. Awaria kontroli ekstrakcji może wskazywać na problem podczas ekstrakcji akcji, taki jak awaria odczynników, błędne piftowanie lub zanieczyszczenie krzyżowe. Pobieranie wszystkich próbek musi być powtórzone. Awarie kontroli powinny być rzadkie wśród doświadczonego personelu laboratoryjnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/Table 5.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Rabies is a fatal zoonotic disease caused by Lyssavirus rabies (RABV) and related negative strand RNA viruses from the Lyssavirus genus (family ...

Wścieklizna jest w stu procentach śmiertelna i potrzebna jest szybka, precyzyjna diagnoza, aby zapewnić ratujące życie leczenie tym, którzy najbardziej tego potrzebują. Niezawodne badania laboratoryjne są naprawdę kluczowe dla kontroli wścieklizny. CDC opracowało krok po kroku protokół testów na wściekliznę za pomocą ilościowego transkryptazy odwrotnej PCR lub RT-PCR, wykorzystując zweryfikowany test na wirusa Alisa w czasie rzeczywistym o nazwie LN34, co umożliwia laboratoriom poprawę dokładności diagnostycznej i wsparcie działań zapobiegających wściekliźnie.Przez dziesięciolecia testy na wściekliznę opierały się na bezpośrednich testach przeciwciał fluorescencyjnych zwanych DFA lub FAT. Jednak wiele międzynarodowych laboratoriów stosuje RT-PCR do testów na wściekliznę ze względu na jego doskonałą czułość i dokładność. Test DFA na wściekliznę wymaga specjalistycznych mikroskopów, przechowywania w łańcuchu chłodniczym, specjalistycznego szkolenia personelu oraz odczynników, które w ostatnich latach doświadczyły niedoborów, a PCR i RT-PCR są obecnie szeroko stosowane do testów patogenów.Wiele laboratoriów posiada już sprzęt i wiedzę PCR oraz RT-PCR, a potrzebne odczynniki są dostępne u komercyjnych dostawców. Koszty są główną przeszkodą w testowaniu na wściekliznę w obszarach z największą liczbą przypadków wścieklizny u ludzi. CDC opracowało multipleksową wersję testu LN34, która poprawia kontrolę jakości i obniża koszt na badaną próbkę.RT-PCR jest coraz częściej wdrażany do diagnostyki wścieklizny, ponieważ jest szeroko stosowany do testowania innych patogenów, a wyniki są łatwe do interpretacji. Jednak użycie zwalidowanego testu jest niezwykle ważne, a równie istotne jest, by test działał zgodnie z oczekiwaniami. Nasz krok po kroku protokół obejmuje kontrole jakości, kwestie bezpieczeństwa oraz najlepsze praktyki PCR, aby pomóc laboratoriom rozpocząć pracę.Na początek załóż środki ochronne, w tym okulary ochronne, zakrytą fartuchową i dwie pary rękawiczek. Oczyść i zdezynfekować powierzchnię roboczą związkiem amonu czwartorzędowego lub innym odpowiednim środkiem dezynfekującym do dezaktywacji wirusa wścieklizny. Rozłóż plastikową podkładkę chłonną na powierzchni roboczej, używając czystej jednorazowej tkanki skalpelowej do zbierania obrazków, reprezentującej pełny przekrój pnia mózgu i móżdżku.Aby ujednolicić i ekstrakcję RNA, ostatecznie podrobnić potrzebne tkanki skalpelem jednorazowego użytku. Rozmazuj tkankę mieloną wymazem i przełóż wymaz do probówki wypełnionej buforem homogenizacyjnym i kulkami. Po wyrzuceniu zewnętrznej rękawicy za pomocą środka dezynfekującego QAC rozcieńczonego w skali 1:256, oczyść i zdezynfekować stanowisko pracy, sprzęt oraz zewnątrz probówek.Homogenizuj próbki za pomocą mini bijaka do koralików przez 60 sekund. I wizualnie obejrzeć rurki. Pozostawić próbki na pięć minut w temperaturze pokojowej.Na koniec oczyść i zdezynfekować stanowisko pracy, sprzęt oraz zewnątrz probówek środkiem dezynfekującym QAC przed przystąpieniem do ekstrakcji RNA. Na początek wykonaj dekontaminację powierzchniową szafy bezpieczeństwa biologicznego za pomocą QAC rozcieńczonego do 1:256. Wykonaj dodatkowe czyszczenie, aby usunąć kurz lub inne zanieczyszczenia środowiskowe.Rozłóż na platformie roboczej podkładkę chłonną wyścieloną plastikiem. Następnie ułóż odczynniki i próbki w szafce na zabezpieczenia biologiczne. Rozłóż wszystkie probówki zbiorcze w czystej stojaku na rurki mikrowirówki.Wstępnie napełnij jedną mikrowirówkę o pojemności 1,5 mililitra 300 mikrolitrów 100% etanolu na każdą próbkę mózgu. Wiruj zhomogenizowane próbki mózgu w warstwie 10 000 do 16 000 G przez dwie minuty w mikrowirówce stołowej. Przelej przezroczysty różowy supernatant do nowej sterylnej probówki zawierającej 100% etanolu, podaj pipetę w górę i w dół, aby wymieszać i przenieść 600 mikrolitrów mieszaniny supernatantu etanolu do kolumny spinowej w probówce zbiorczej.Wiruj przez minutę, aż ciecz przejdzie przez kolumnę, odrzuć przepływ i przelej każdą kolumnę do nowej probówki zbiorczej. Do każdej kolumny dodaj 400 mikrolitrów buforu prepłuczkiego RNA. Wiruj mieszankę w stężeniu 10 000 do 16 000 G przez 30 sekund i wyrzuć przepływ.Każdą kolumnę zwróć do tej samej probówki i powtórz krok przed przemywaniem po raz drugi. Następnie do każdej kolumny dodaj 700 mikrolitrów buforu RNA. Wirówka na 10 000 do 16 000 G przez dwie minuty.I ostrożnie przenieś je do rurki wolnej od RNazy. Usuń przepływ i probówkę, a następnie zdejmij i wyrzuć zewnętrzne rękawice. Następnie dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od DNaz i RNaz bezpośrednio do matrycy kolumny i inkubuj przez 30 sekund.Następnie wiruj w temperaturze od 10 000 do 16 000 G przez minutę. Ostrożnie przełóż RNA do nowej śrubowej góry, płaskiego dna z oznaką mikro rurki do testu RT-PCR. Na początek rozmroz bufor RT-PCR w jednym stopniu, bez kontroli szablonów, woda wolna od nukleazy, spłonniki i sondy na lodzie, w przestrzeni przygotowania mieszanki głównej.Umieść jeden krok enzymu RT-PCR na lodzie. Oblicz objętość każdego odczynnika dla mieszanek LN34 multipleksowanych i beta-A Master Mixes. Dla multipleksowanego testu LN34 wyznacz studnie dla każdej próbki w trójkątach, używając mapy płyt 96 dołków.Po wirowaniu i obracaniu należy podać 23 mikrolitry LN34 multiplex Master Mix do każdego przypisanego LN34 do odpowiedniego dołu. Aby przygotować reakcje kontroli z ujemnym wzorcem, należy dodać dwa mikrolitry wody o jakości PCR do każdego dołka kontrolnego z ujemnym szablonem. Połóż płytę 96 dołków na lodzie.Wyczyść stanowisko pracy 70% etanolem. Obecnie w workspace edycji szablonowej rozmrażaj próbki RNA i pozytywnie kontroluj jednorazowe aliquoty sztucznego RNA na lodzie. Po wirowaniu krótko wiruj probówki z próbkami RNA, pipetuj dwa mikrolitry próbki lub dodatniej kontroli RNA do odpowiadającej jamki.Po dodaniu wszystkich próbek nałóż na otwory klejącą osłonę optyczną, aby całkowicie je uszczelnić. Wiruj płytę w 500 G przez minutę w temperaturze pokojowej, a następnie umieść szczelną płytkę w przyrządzie PCR w czasie rzeczywistym lub ilościowym skalibrowanym dla matryc fam i VIC Hex reporter. Ustaw przyrząd na odpowiednie parametry cykliczne.Po zakończeniu uruchomienia ustaw wartości progowe na 0,2 dla LN34 i 0,05 dla beta aktyny. Sprawdź krzywe próbek kontrolnych pod kątem problemów z jakością. Test LN34 wykazał udane krzywe amplifikacyjne z dodatnimi wynikami przekraczającymi próg przy różnych wartościach progowych cyklu w skali logarytmicznej.Oraz krzywe wzmacniania sigmoidalnego w skali liniowej zarówno dla LN34, jak i beta aktyny. Negatywne wyniki wykazały płaskie linie bez wzmocnienia. Zidentyfikowano nieprawidłowe krzywe amplifikacyjne, z których niektóre wykazywały liniowe, a nie sigmoidalne wzrosty fluorescencji, co wskazuje na nietypowe wyniki.Odpowiadające wykresy wieloskładnikowe wykazywały nieregularne, faliste sygnały fluorescencyjne zamiast oczekiwanych gładkich krzywych. Podkreślając potrzebę analizy wykresów amplifikacji zamiast polegać wyłącznie na wartościach progowych cykli.

postmortem-diagnosis-rabies-animals-updated-multiplexed-ln34-real

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) stanowi uznaną przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt i Światową Organizację Zdrowia (OIE/WHO) alternatywę dla testu na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) do diagnozowania wścieklizny. Test ten pozwala na zastosowania w terenie, które można wykonać w ciągu około 1 godziny po pobraniu wycisków mózgu za pomocą mikroskopii świetlnej.

Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w pan-lyssavirus została opracowana w celu wykrywania wszystkich znanych lyssawirusów. Walidacja z wykorzystaniem próbek mózgu różnych gatunków zwierząt pod kątem wścieklizny wykazała, że metoda ta ma czułość i swoistość równoważną złotemu standardowi testu na przeciwciała fluorescencyjne i może być stosowana do rutynowej diagnostyki wścieklizny.

Ocena uniwersalnej zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w celu wykrycia lyssawirusów

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie bezpiecznych technik sekcji zwłok na małych i dużych zwierzętach, aby uzyskać zadowalające próbki tkanek do badania wścieklizny.

Techniki sekcji zwłok wścieklizny u dużych i małych zwierząt

Ten RT-PCR w czasie rzeczywistym wykorzystujący barwnik interkalacyjny dsDNA jest odpowiedni do diagnozowania infekcji wirusem lyssa. Metoda rozpoczyna się od ekstrakcji RNA z próbek przedubojowych lub pośmiertnych z podejrzeniem wścieklizny, szczegółowo opisując przygotowanie mieszanki wzorcowej, dodanie RNA, ustawienie maszyny w czasie rzeczywistym i prawidłową interpretację wyników.

Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Tutaj prezentujemy protokół testu immunohistochemicznego do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie.

Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

Ten protokół przedstawia oparte na qRT-PCR podejście do określania liczby kopii genu nukleoproteiny (N) wirusa wścieklizny w różnych strukturach anatomicznych mózgu bydlęcego za pomocą transkrypcji in vitro.

Kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła

Zestawy do analizy ekspresji genów Solaris qPCR to nowoczesne, gotowe kombinacje starterów i sond qPCR, opracowane w celu uproszczenia procesu qPCR bez utraty specyficzności i odporności analizy.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem zestawu Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

PCR stał się powszechną techniką w wielu laboratoriach biologii molekularnej. Niniejszym przedstawiamy krótki przewodnik po kilku konwencjonalnych protokołach PCR. Ponieważ każda reakcja jest unikalnym eksperymentem, optymalne warunki niezbędne do otrzymania produktu są zmienne. Zrozumienie zmiennych w reakcji znacznie zwiększy efektywność rozwiązywania problemów, zwiększając tym samym szansę na uzyskanie pożądanego wyniku.

Reakcja łańcuchowa polimerazy: podstawowy protokół oraz strategie rozwiązywania problemów i optymalizacji

Poznaj zaktualizowany multipleksowy test LN34 RT-PCR do diagnostyki wścieklizny u zwierząt. Ta metoda poprawia dokładność wykrywania wirusa w tkankach mózgu i wspiera działania profilaktyczne.

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (Wideo) | JoVE Journal

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Przeglądaj więcej filmów