Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Wścieklizna jest w stu procentach śmiertelna i potrzebna jest szybka, precyzyjna diagnoza, aby zapewnić ratujące życie leczenie tym, którzy najbardziej tego potrzebują. Niezawodne badania laboratoryjne są naprawdę kluczowe dla kontroli wścieklizny. CDC opracowało krok po kroku protokół testów na wściekliznę za pomocą ilościowego transkryptazy odwrotnej PCR lub RT-PCR, wykorzystując zweryfikowany test na wirusa Alisa w czasie rzeczywistym o nazwie LN34, co umożliwia laboratoriom poprawę dokładności diagnostycznej i wsparcie działań zapobiegających wściekliźnie.

Przez dziesięciolecia testy na wściekliznę opierały się na bezpośrednich testach przeciwciał fluorescencyjnych zwanych DFA lub FAT. Jednak wiele międzynarodowych laboratoriów stosuje RT-PCR do testów na wściekliznę ze względu na jego doskonałą czułość i dokładność. Test DFA na wściekliznę wymaga specjalistycznych mikroskopów, przechowywania w łańcuchu chłodniczym, specjalistycznego szkolenia personelu oraz odczynników, które w ostatnich latach doświadczyły niedoborów, a PCR i RT-PCR są obecnie szeroko stosowane do testów patogenów.

Wiele laboratoriów posiada już sprzęt i wiedzę PCR oraz RT-PCR, a potrzebne odczynniki są dostępne u komercyjnych dostawców. Koszty są główną przeszkodą w testowaniu na wściekliznę w obszarach z największą liczbą przypadków wścieklizny u ludzi. CDC opracowało multipleksową wersję testu LN34, która poprawia kontrolę jakości i obniża koszt na badaną próbkę.

RT-PCR jest coraz częściej wdrażany do diagnostyki wścieklizny, ponieważ jest szeroko stosowany do testowania innych patogenów, a wyniki są łatwe do interpretacji. Jednak użycie zwalidowanego testu jest niezwykle ważne, a równie istotne jest, by test działał zgodnie z oczekiwaniami. Nasz krok po kroku protokół obejmuje kontrole jakości, kwestie bezpieczeństwa oraz najlepsze praktyki PCR, aby pomóc laboratoriom rozpocząć pracę.

Na początek załóż środki ochronne, w tym okulary ochronne, zakrytą fartuchową i dwie pary rękawiczek. Oczyść i zdezynfekować powierzchnię roboczą związkiem amonu czwartorzędowego lub innym odpowiednim środkiem dezynfekującym do dezaktywacji wirusa wścieklizny. Rozłóż plastikową podkładkę chłonną na powierzchni roboczej, używając czystej jednorazowej tkanki skalpelowej do zbierania obrazków, reprezentującej pełny przekrój pnia mózgu i móżdżku.

Aby ujednolicić i ekstrakcję RNA, ostatecznie podrobnić potrzebne tkanki skalpelem jednorazowego użytku. Rozmazuj tkankę mieloną wymazem i przełóż wymaz do probówki wypełnionej buforem homogenizacyjnym i kulkami. Po wyrzuceniu zewnętrznej rękawicy za pomocą środka dezynfekującego QAC rozcieńczonego w skali 1:256, oczyść i zdezynfekować stanowisko pracy, sprzęt oraz zewnątrz probówek.

Homogenizuj próbki za pomocą mini bijaka do koralików przez 60 sekund. I wizualnie obejrzeć rurki. Pozostawić próbki na pięć minut w temperaturze pokojowej.

Na koniec oczyść i zdezynfekować stanowisko pracy, sprzęt oraz zewnątrz probówek środkiem dezynfekującym QAC przed przystąpieniem do ekstrakcji RNA. Na początek wykonaj dekontaminację powierzchniową szafy bezpieczeństwa biologicznego za pomocą QAC rozcieńczonego do 1:256. Wykonaj dodatkowe czyszczenie, aby usunąć kurz lub inne zanieczyszczenia środowiskowe.

Rozłóż na platformie roboczej podkładkę chłonną wyścieloną plastikiem. Następnie ułóż odczynniki i próbki w szafce na zabezpieczenia biologiczne. Rozłóż wszystkie probówki zbiorcze w czystej stojaku na rurki mikrowirówki.

Wstępnie napełnij jedną mikrowirówkę o pojemności 1,5 mililitra 300 mikrolitrów 100% etanolu na każdą próbkę mózgu. Wiruj zhomogenizowane próbki mózgu w warstwie 10 000 do 16 000 G przez dwie minuty w mikrowirówce stołowej. Przelej przezroczysty różowy supernatant do nowej sterylnej probówki zawierającej 100% etanolu, podaj pipetę w górę i w dół, aby wymieszać i przenieść 600 mikrolitrów mieszaniny supernatantu etanolu do kolumny spinowej w probówce zbiorczej.

Wiruj przez minutę, aż ciecz przejdzie przez kolumnę, odrzuć przepływ i przelej każdą kolumnę do nowej probówki zbiorczej. Do każdej kolumny dodaj 400 mikrolitrów buforu prepłuczkiego RNA. Wiruj mieszankę w stężeniu 10 000 do 16 000 G przez 30 sekund i wyrzuć przepływ.

Każdą kolumnę zwróć do tej samej probówki i powtórz krok przed przemywaniem po raz drugi. Następnie do każdej kolumny dodaj 700 mikrolitrów buforu RNA. Wirówka na 10 000 do 16 000 G przez dwie minuty.

I ostrożnie przenieś je do rurki wolnej od RNazy. Usuń przepływ i probówkę, a następnie zdejmij i wyrzuć zewnętrzne rękawice. Następnie dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od DNaz i RNaz bezpośrednio do matrycy kolumny i inkubuj przez 30 sekund.

Następnie wiruj w temperaturze od 10 000 do 16 000 G przez minutę. Ostrożnie przełóż RNA do nowej śrubowej góry, płaskiego dna z oznaką mikro rurki do testu RT-PCR. Na początek rozmroz bufor RT-PCR w jednym stopniu, bez kontroli szablonów, woda wolna od nukleazy, spłonniki i sondy na lodzie, w przestrzeni przygotowania mieszanki głównej.

Umieść jeden krok enzymu RT-PCR na lodzie. Oblicz objętość każdego odczynnika dla mieszanek LN34 multipleksowanych i beta-A Master Mixes. Dla multipleksowanego testu LN34 wyznacz studnie dla każdej próbki w trójkątach, używając mapy płyt 96 dołków.

Po wirowaniu i obracaniu należy podać 23 mikrolitry LN34 multiplex Master Mix do każdego przypisanego LN34 do odpowiedniego dołu. Aby przygotować reakcje kontroli z ujemnym wzorcem, należy dodać dwa mikrolitry wody o jakości PCR do każdego dołka kontrolnego z ujemnym szablonem. Połóż płytę 96 dołków na lodzie.

Wyczyść stanowisko pracy 70% etanolem. Obecnie w workspace edycji szablonowej rozmrażaj próbki RNA i pozytywnie kontroluj jednorazowe aliquoty sztucznego RNA na lodzie. Po wirowaniu krótko wiruj probówki z próbkami RNA, pipetuj dwa mikrolitry próbki lub dodatniej kontroli RNA do odpowiadającej jamki.

Po dodaniu wszystkich próbek nałóż na otwory klejącą osłonę optyczną, aby całkowicie je uszczelnić. Wiruj płytę w 500 G przez minutę w temperaturze pokojowej, a następnie umieść szczelną płytkę w przyrządzie PCR w czasie rzeczywistym lub ilościowym skalibrowanym dla matryc fam i VIC Hex reporter. Ustaw przyrząd na odpowiednie parametry cykliczne.

Po zakończeniu uruchomienia ustaw wartości progowe na 0,2 dla LN34 i 0,05 dla beta aktyny. Sprawdź krzywe próbek kontrolnych pod kątem problemów z jakością. Test LN34 wykazał udane krzywe amplifikacyjne z dodatnimi wynikami przekraczającymi próg przy różnych wartościach progowych cyklu w skali logarytmicznej.

Oraz krzywe wzmacniania sigmoidalnego w skali liniowej zarówno dla LN34, jak i beta aktyny. Negatywne wyniki wykazały płaskie linie bez wzmocnienia. Zidentyfikowano nieprawidłowe krzywe amplifikacyjne, z których niektóre wykazywały liniowe, a nie sigmoidalne wzrosty fluorescencji, co wskazuje na nietypowe wyniki.

Odpowiadające wykresy wieloskładnikowe wykazywały nieregularne, faliste sygnały fluorescencyjne zamiast oczekiwanych gładkich krzywych. Podkreślając potrzebę analizy wykresów amplifikacji zamiast polegać wyłącznie na wartościach progowych cykli.