Dysocjacja próbek tkanek nowotworowych ludzi i myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek
16 sierpnia 2024
Ten protokół opisuje procedurę szybkiej dysocjacji próbek ludzkich i mysich guzów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
Zakres naszych badań polega na poznaniu mechanizmów odpowiedzi lub oporności na standardowe immunoterapie. Nasze laboratorium stara się zrozumieć, co napędza skuteczną odpowiedź immunologiczną przeciwko nowotworom i czy możemy zidentyfikować te predyktory terapii, aby znaleźć cele, które mogą przezwyciężyć oporność. Największym postępem w ostatnich latach jest opracowanie i integracja technik sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
Umożliwiają nam one w czasie rzeczywistym systematyczne badanie cech molekularnych w poszczególnych komórkach w bezstronny sposób, co jest pomocne w analizie tych złożonych i ewoluujących ekosystemów nowotworowych. Chociaż wiele modeli przedklinicznych jest wykorzystywanych do badania mechanizmów odpowiedzi na immunoterapię, nadal nie znamy uwarunkowań immunologicznych, które są ważne dla odporności człowieka. Przetwarzanie i analizowanie próbek od pacjentów w czasie rzeczywistym ma kluczowe znaczenie dla naszej zdolności do badania wszystkich przedziałów komórkowych w danym guzie.
Korzystając z bezstronnych technik genomicznych i transkryptomicznych, nasze laboratorium odkryło, że defekty w maszynerii prezentacji antygenu są związane z opornością na immunoterapię w czerniaku. Niedawno, stosując podejścia jednokomórkowe, odkryliśmy unikalne stany limfocytów T i polaryzację komórek szpikowych związane z wynikami pacjentów odpowiednio w czerniaku oraz raku głowy i szyi. Największą zaletą naszego protokołu jest jego prostota.
Jest to uniwersalny protokół przystosowany do dysocjacji małych i dużych próbek guzów od wielu typów nowotworów w krótkim czasie, kończący się wytworzeniem wysoce żywotnych zawiesin jednokomórkowych. Aby rozpocząć trawienie guza, wlej próbkę do 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej umieszczonego na lodzie. Odpipetować 420 mikrolitrów pożywki z naczynia do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.
Za pomocą pęsety przenieś tkankę próbki do probówki zawierającej podłoże. Pokrój próbkę czystymi nożyczkami na kawałki o średnicy od dwóch do trzech milimetrów. Dodać do próbki odpowiednie ilości enzymów i pożywek do wytrawiania.
Wiruj probówkę przez pięć sekund i inkubuj w mieszalniku termicznym umieszczonym pionowo na boku. Umieść filtr komórkowy o średnicy 50 mikrometrów na nowej stożkowej rurce o pojemności 15 mililitrów i zalej filtr jednym mililitrem świeżej pożywki RPMI. Używając białej końcówki do pipet o pojemności 1 000 mikrolitrów o niskiej retencji, załaduj próbkę do filtra i dodaj pożywkę.
Następnie grzbietem tłoka strzykawki zmielić i wepchnąć próbkę na filtr ruchem skręcającym. Umyj filtr pięcioma mililitrami pożywki i wszelkimi pozostałymi mediami z naczynia zawierającego próbkę. Na początek uzyskaj przefiltrowaną i strawioną próbkę guza.
Odwirować próbkę o masie 450 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odessać pożywkę bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w buforze do lizy ACK w celu usunięcia czerwonych krwinek i zapisania użytej objętości. Powtarzać etapy wirowania i lizy, aż osad próbki nie będzie miał widocznego czerwonego koloru po odwirowaniu.
Następnie ponownie zawiesić osad próbki w świeżym podłożu. Wymieszaj po 10 mikrolitrów błękitu trypanowego i zdysocjowanych komórek w 1,5 mililitrowej probówce. Załaduj 10 mikrolitrów z każdej strony hemocytometru, aby policzyć komórki.
Zapisz stężenie komórek, całkowitą liczbę żywych komórek, procent żywotności i końcową objętość nośnika po zliczeniu. Na początek uzyskaj strawioną próbkę tkanki nowotworowej i zmiel czerwone krwinki. Odwirować próbkę o masie 450 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po usunięciu pożywki ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze podłoża izolacyjnego. Po powtórzeniu wirowania ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach pożywki izolacyjnej. Przenieś 100 mikrolitrów próbki do dołka z 0,2 mililitra probówki paskowej do PCR.
W kapturze bezpieczeństwa biologicznego dodać do próbki po 10 mikrolitrów koktajlu Annexin V i koktajlu selekcyjnego biotyny. Odpipetować roztwór i inkubować w temperaturze pokojowej przez cztery minuty. Następnie wiruj cząstki magnetyczne pokryte dekstryną przez 30 sekund.
Zmieszać 20 mikrolitrów kulek i 60 mikrolitrów pożywki izolacyjnej z próbką. Po trzech minutach umieść probówkę z paskiem na 10-krotnym separatorze magnetycznym Genomics na wysokim ustawieniu na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś płyn z probówki paskowej bez naruszania kulek do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej do mikrowirówek o niskim poziomie wiązania.
Odwirować probówkę, jak pokazano wcześniej, i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki RPMI w zależności od wielkości granulki. Na koniec policz komórki w hemocytometrze. Po usunięciu martwych komórek liczba żywych komórek wynosiła 4,9 razy 10 do potęgi pięciu na mililitr przy żywotności powyżej 90%
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje procedurę szybkiej dysocjacji próbek guzów ludzkich i mysich do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Technika ta ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia odpowiedzi immunologicznej przeciwko guzbom oraz identyfikacji predyktorów oporności na terapię.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Analiza pojedynczych komórek
Wstęp
- Zrozumienie mechanizmów odpowiedzi lub oporności na immunoterapie.
- Znaczenie przetwarzania i analizy próbek pacjentów w czasie rzeczywistym.
- Rozwój technik sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
- Konieczność badania przedziałów komórkowych w obrębie guzów.
Cel badania
- W celu zbadania odpowiedzi immunologicznej przeciwko nowotworom.
- W celu zidentyfikowania czynników prognostycznych sukcesu terapeutycznego.
- W celu przełamania oporności na standardowe immunoterapie.
Zastosowane metody
- Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek
- Szybka dysocjacja próbek nowotworowych
- Analiza cech molekularnych w czasie rzeczywistym
- Badanie ekosystemów nowotworowych
Główne wyniki
- Wgląd w mechanizmy odpowiedzi odpornościowej.
- Identyfikacja kluczowych determinant immunologicznych.
- Głębsze zrozumienie mikrośrodowiska nowotworowego.
- Potencjalne cele w celu przełamania oporności na terapię.
Wnioski
- Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek jest kluczowe dla analizy guzów nowotworowych.
- Przetwarzanie danych w czasie rzeczywistym pomaga w zrozumieniu złożonych nowotworów.
- Przyszłe badania mogą skupić się na zidentyfikowanych predyktorach terapii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka i uniwersalna dysocjacja tkanek nowotworowych ludzi i myszy jest kluczowym elementem umożliwiającym realizację procedur sekwencjonowania RNA z pojedynczych komórek (scRNAseq) w badaniach nad immunoonkologią. Zawiesiny pojedynczych komórek o wysokiej żywotności bezpośrednio wpływają na wierność późniejszego profilowania molekularnego, co wspiera rzetelną walidację celów terapeutycznych oraz minimalizację ryzyka w badaniach mechanistycznych. Niniejszy protokół odnosi się do kluczowego etapu w badaniach translacyjnych, zapewniając jakość próbek niezbędną do wysokorozdzielczej analizy komórkowej oraz repertuaru immunologicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie heterogeniczności mikrośrodowiska guza w rozdzielczości pojedynczych komórek.
- Wspiera identyfikację stanów komórek odpornościowych i nowotworowych powiązanych z odpowiedzią na terapię lub opornością na nią.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez zachowanie wrażliwych populacji komórkowych i minimalizowanie artefaktów indukowanych stresem.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu dzięki wysokiej jakości odczytom komórkowym.
Przesiewy i rozwój testów analitycznych
- Zapewnia zwalidowane, żywotne zawiesiny pojedynczych komórek do analiz scRNAseq i multiomicznych.
- Standaryzuje przygotowanie próbek dla różnych typów nowotworów i rozmiarów materiału, w tym biopsji o niskiej zawartości materiału wejściowego.
- Ogranicza kontaminację krzyżową i artefakty RNA z otoczenia, zwiększając powtarzalność analiz.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie próbek do wysokoprzepustowego przesiewu fenotypów komórek nowotworowych i immunologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników dysocjacji z odkrywaniem biomarkerów translacyjnych oraz profilowaniem repertuaru immunologicznego.
- Zapewnia ciągłość od próbek pochodzących od pacjentów po walidację w modelach przedklinicznych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp badań poprzez dostarczanie wysokiej jakości danych do porównań międzygatunkowych.
- Umożliwia identyfikację istotnych klinicznie programów komórkowych oraz mechanizmów oporności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół dysocjacji znajduje się na styku pozyskiwania tkanek i molekularnego profilowania pojedynczych komórek, łącząc wczesne etapy odkryć z przepływami pracy w badaniach translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia wysokiej jakości materiały do testowania hipotez i analizy szlaków w immunologii nowotworów.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe zawiesiny pojedynczych komórek do późniejszych analiz scRNAseq i CITEseq.
- Analityka: Dostarcza wiarygodnych wskaźników żywotności i stężenia komórek w celu wsparcia analiz porównawczych między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Umożliwia bezpośrednie powiązanie danych pochodzących od pacjentów z systemami modeli przedklinicznych w celu walidacji biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w instytucjach: Oferuje uniwersalny, adaptowalny protokół odpowiedni dla różnych typów nowotworów i środowisk badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad immunoonkologią.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przygotowanie próbek dzięki ustandaryzowanym, szybkim przepływom pracy i wysokiej żywotności uzyskiwanych komórek.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie niezawodnego generowania danych na poziomie pojedynczych komórek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój celów immunoterapii i biomarkerów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie manipulacji tkankami, trawienia enzymatycznego oraz przygotowania testów jednokomórkowych.
- Wymagany jest dostęp do liczników komórek, separatorów magnetycznych oraz infrastruktury bezpieczeństwa biologicznego.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności wyników dla różnych typów guzów i wielkości materiału wyjściowego.
- Metoda jest dostosowana zarówno do próbek ludzkich, jak i mysich, w tym do małych biopsji i dużych resekcji.
- Należy monitorować żywotność próbek oraz odpowiedź stresową, aby zapewnić jakość danych.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:40
Rapid Dissociation of Tumor Tissue to Gain Enhanced Single‐Cell Tumor Insights
2:59
Red Blood Cell Lysis in Digested Tumor Samples for Single‐Cell RNA Sequencing
4:03
Dead Cell Removal from Dissociated Tumor for Single‐Cell Sequencing
