Name: Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj metodę izolacji mitochondriów do analizy superkompleksów oddechowych z małych próbek tkanek i kultur komórkowych. Technika ta umożliwia badanie organizacji systemu OXPHOS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant numer "PGC2018-095795-B-I00" od Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) oraz przez granty "Grupo de Referencia: E35_17R" i grant numer "LMP220_21" od Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) dla PF-S i RM-L.

Mitochondrial Fractionation in Small Tissue Samples for Supercomplex Analysis

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Adaptacje metodologiczne wprowadzone w opisanych tu protokołach mają na celu uniknięcie strat i zwiększenie wydajności przy jednoczesnym utrzymaniu aktywności kompleksu mitochondrialnego (co ma kluczowe znaczenie, gdy dostępność wystarczającej ilości próbek jest zagrożona) oraz odtworzenie oczekiwanego wzorca SC w tkance lub linii komórkowej (patrz rysunek 2C). W tym celu i z uwagi na fakt, że wysoka czystość mitochondriów nie jest wymagana do prawidłowego wykrycia SC, liczba kroków, czasów i objętości została zmniejszona, gdy tylko było to możliwe.
Tak więc, po homogenizacji i usunięciu jąder i nieuszkodzonych komórek przez wirowanie z niską prędkością, supernatanty zawierające mitochondria są przenoszone do probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml, a kolejne wirowanie w celu uzyskania surowych frakcji mitochondrialnych odbywa się w mikrodymie poprzez zwiększenie prędkości oraz skrócenie czasu i objętości w stosunku do konwencjonalnych protokołów. Pozwala to na przetworzenie kilku próbek w stosunkowo krótkim czasie: dokładne oszacowanie mówi, że 10 próbek można przetworzyć w ciągu ~2-2,5 godziny (od rozpoczęcia homogenizacji (krok protokołu 1.6. lub równoważny dla tkanek) do uzyskania frakcji SCs gotowej do załadowania w żelu (krok protokołu 3.7) i minimalizuje straty przy zachowaniu aktywności. Kolejną zmianą w stosunku do oryginalnych protokołów grupy Schäggera jest zastąpienie, po solubilizacji membranowej ekstrakcji frakcji SCs, etapu ultrawirowania prostym wirowaniem mikrofuge (krok protokołu 3.4).
W procedurze jest kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, skuteczność pękania komórek, szczególnie w przypadku komórek hodowanych (patrz uwaga po kroku 1.8 protokołu), a w szczególności w przypadku małych komórek. Tkanki i linie komórkowe mają zmienny stopień trudności w pękaniu komórek: na przykład w sercu i mięśniach ten etap jest zwykle mniej wydajny niż w wątrobie lub śledzionie, ale jest kompensowany pod względem wydajności, ponieważ te pierwsze mają wyższą zawartość mitochondriów. Jedną z alternatyw dla poprawy wydajności mitochondriów po wyizolowaniu z mięśni lub serca byłoby traktowanie próbek trypsyną przed homogenizacją. Mózg jest kolejną tkanką, która wykazuje niską skuteczność w rozbijaniu komórek z powodu ręcznej homogenizacji, która jest łagodniejsza i mniej wydajna, a prawdopodobnie także z powodu większej zmienności typów komórek w tej tkance, jak to zostało zgłoszone wcześniej . Można to częściowo skompensować za pomocą drugiego etapu homogenizacji, zgodnie z sugestią zawartą w naszym protokole (krok 2.7.4). Z drugiej strony, jeśli pęknięcie komórki jest nadmierne, końcowa próbka zawierająca SC może być zanieczyszczona fragmentami jądrowego DNA, które mogą zakłócać przebieg elektroforetyczny. Problem ten objawia się wzrostem lepkości próbki po dodaniu digitoniny w celu rozpuszczenia błon mitochondrialnych i można go rozwiązać przez traktowanie DNAzą I.
Po drugie, jeśli stosunek detergentu do białka jest zbyt niski, skutkowałoby to mniej efektywną rozpuszczalnością błony i możliwością tworzenia się agregatów. Może to objawiać się w żelach jako słaba rozdzielczość w SC o dużej masie cząsteczkowej (patrz ryc. 4) lub jako CIV dający wiele prążków odpowiadających oligomerom43. Jeśli współczynnik jest zbyt wysoki, może to prowadzić do dezagregacji SC (głównie CI-SC). Po trzecie, ważne jest, aby unikać podgrzewania próbek podczas całej procedury (zob . rysunek 4) i unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ mogą one wpływać na stan zespołu SC.
W tabeli 2 przedstawiono podsumowanie oczekiwanych plonów dla kilku typów komórek i próbek tkanek. Wartości są przybliżone i będą zależeć od skuteczności pękania ogniw i charakteru źródła. W przypadku tkanek, jeżeli materiał wyjściowy jest zamrożony, daje on zwykle wyższą wydajność niż w przypadku świeżych próbek. Przedstawiono szacunkową liczbę torów (przy uwzględnieniu obciążenia od 50 do 60 μg białka mitochondrialnego na pas), które można obciążyć.
Przedstawione tutaj protokoły obejmują różne tkanki i typy komórek z niewielkimi zmianami, mogą być stosowane ze świeżymi lub mrożonymi próbkami i wymagają prostego sprzętu oraz stosunkowo niskich kosztów, nie wymagających stosowania drogich zestawów do oczyszczania lub gradientów. Mogą jednak wymagać pewnych adaptacji, aby można je było stosować z określonymi typami komórek lub próbkami, a także gdy przedmiotem analizy są określone populacje mitochondriów, takie jak na przykład mitochondria synaptyczne mózgu lub mitochondria mięśniowe subsarkolemmalne.
Ponieważ dokładne role fizjologiczne, a także potencjalny udział SC w sytuacjach patologicznych nie zostały jeszcze zdefiniowane, konieczna jest analiza ich dynamiki i czynników wpływających na ich składanie, stabilność i funkcję. Nasze protokoły mogą stanowić cenne narzędzia, które pozwalają uzyskać powtarzalne wyniki na wzorcach SC przy małych rozmiarach próbek i z różnych typów komórek i tkanek, szczególnie gdy trzeba porównać wiele warunków eksperymentalnych29.

Superkompleksy (SCs) są supramolekularnymi powiązaniami pomiędzy poszczególnymi kompleksami łańcuchów oddechowych1,2. Od czasu wstępnej identyfikacji SC i opisu ich składu przez grupę Schägger2,3, potwierdzonej później przez inne grupy, ustalono, że zawierają one kompleksy oddechowe I, III i IV (odpowiednio CI, CIII i CIV) w różnych stechiometriach. Można zdefiniować dwie główne populacje SC, te zawierające CI (i albo sam CIII, albo CIII i CIV) i o bardzo wysokiej masie cząsteczkowej (MW, zaczynające się ~1,5 MDa dla mniejszego SC: CI + CIII2) oraz te zawierające CIII i CIV, ale nie CI, o znacznie mniejszym rozmiarze (takie jak CIII2 + CIV o ~680 kDa). Te SC współistnieją w wewnętrznej błonie mitochondrialnej z wolnymi kompleksami, również w różnych proporcjach. Tak więc, podczas gdy CI występuje głównie w powiązanych formach (tj. w SC: ~80% w sercu bydlęcym i ponad 90% w wielu typach komórek ludzkich)3, CIV występuje bardzo obficie w swojej wolnej postaci (ponad 80% w sercu bydlęcym), przy czym CIII wykazuje bardziej zrównoważoną dystrybucję (~40% w bardziej obfitej wolnej formie, jako dimer w sercu bydlęcym).
Chociaż ich istnienie jest obecnie powszechnie akceptowane, ich dokładna rola jest nadal przedmiotem dyskusji4,5,6,7,8,9,10. Zgodnie z modelem plastyczności, mogą istnieć różne proporcje SC i poszczególnych kompleksów w zależności od typu komórki lub statusu metabolicznego1,7,11. Ta dynamiczna natura zespołu pozwoliłaby komórkom regulować wykorzystanie dostępnych paliw i wydajność systemu fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w odpowiedzi na zmiany środowiskowe4,5,7. SC mogą również przyczyniać się do kontrolowania tempa wytwarzania reaktywnych form tlenu oraz uczestniczyć w stabilizacji i obrocie poszczególnych kompleksów4,12,13,14. Modyfikacje statusu zespołu SC zostały opisane w związku z różnymi sytuacjami fizjologicznymi i patologicznymi15,16 oraz procesem starzenia17.
Tak więc, zmiany we wzorcach SC zostały opisane u drożdży w zależności od źródła węgla użytego do wzrostu2 oraz w hodowanych komórkach ssaków, gdy glukoza jest podstawiona przez galaktozę4. Modyfikacje odnotowano również w wątrobie myszy po poście8 oraz w astrocytach, gdy utlenianie mitochondrialnych kwasów tłuszczowych jest zablokowane18. Ponadto stwierdzono spadek lub zmiany w SC i OXPHOS w zespole Bartha19, niewydolność serca20, kilka metabolic21 i neurological22,23,24 zaburzenia i różne nowotwory25,26,27,28. Czy te zmiany w montażu i poziomach SC są główną przyczyną, czy reprezentują wtórne skutki w tych patologicznych sytuacjach, jest nadal badane15,16. Różne metodologie mogą dostarczyć informacji na temat tworzenia i funkcjonowania SC; Należą do nich pomiary aktywności8,29, ultrastructural analysis30,31, oraz proteomics32,33. Użyteczną alternatywą, która jest coraz częściej stosowana i stanowi punkt wyjścia dla niektórych z wcześniej wymienionych metodologii, jest bezpośrednie określenie stanu montażu SC za pomocą elektroforezy Blue native (BN) opracowanej w tym celu przez grupę Schäggera 34,35.
To podejście wymaga powtarzalnych i wydajnych procedur do uzyskania i rozpuszczania błon mitochondrialnych i może być uzupełnione innymi technikami, takimi jak analiza aktywności w żelu (IGA), elektroforeza drugiego wymiaru i western blot (WB). Ograniczeniem w badaniach nad dynamiką SC za pomocą elektroforezy BN może być ilość komórek wyjściowych lub próbek tkanek. Przedstawiamy serię protokołów do analizy składania i funkcji SC, zaadaptowanych z metod grupy Schäggera, które można zastosować do świeżych lub mrożonych próbek komórek lub tkanek już od 20 mg tkanki.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>Kwas aminokapronowy</td><td>Fluka Analytical</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Bis Tris</td><td>Acrons Organics</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>Test Bradforda</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Diamin&nbsp; benzydyna (DAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Bez kwasów tłuszczowych BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Tłuczek teflonowy</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini komórka trans-blot</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 Przeciwciało monoklonalne</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3 do 12% Mini żele białkowe</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Dodatek buforowy katodowy (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Bufor do biegania (20x)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 Przeciwciało monoklonalne</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>Sól tetrazolowa nitroniebieskiego (NBT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>PDVF Membrana</td><td>Amersham</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>metasiarczan fenazyny (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA Przeciwciało monoklonalne</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna/penicylina</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 Przeciwciało monoklonalne</td><td>Invitrogen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; Numer EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

W ciągu ostatnich dziesięcioleci zgromadzone dowody na istnienie superkompleksów oddechowych (SC) zmieniły nasze rozumienie organizacji mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów, dając początek propozycji "modelu plastyczności." Model ten postuluje współistnienie różnych proporcji SC i kompleksów w zależności od tkanki lub stanu metabolicznego komórki. Dynamiczny charakter montażu w SC pozwoliłby komórkom zoptymalizować wykorzystanie dostępnych paliw i wydajność transferu elektronów, minimalizując wytwarzanie reaktywnych form tlenu i sprzyjając zdolności komórek do przystosowania się do zmian środowiskowych. 
Ostatnio nieprawidłowości w montażu SC zostały zgłoszone w różnych chorobach, takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne (choroba Alzheimera i Parkinsona), zespół Bartha, zespół Leigha lub rak. Rola zmian w składaniu SC w postępie choroby nadal wymaga potwierdzenia. Niemniej jednak dostępność wystarczającej ilości próbek, aby określić status montażu SC, jest często wyzwaniem. Dzieje się tak w przypadku biopsji lub próbek tkanek, które są małe lub muszą zostać podzielone w celu przeprowadzenia wielu analiz, w przypadku kultur komórkowych, które rosną wolno lub pochodzą z urządzeń mikroprzepływowych, z niektórymi hodowlami pierwotnymi lub rzadkimi komórkami, lub gdy trzeba przeanalizować efekt określonych kosztownych zabiegów (w przypadku nanocząstek, bardzo drogich związków itp.). W takich przypadkach wymagana jest wydajna i łatwa w zastosowaniu metoda. W pracy przedstawiono metodę przystosowaną do otrzymywania wzbogaconych frakcji mitochondrialnych z niewielkich ilości komórek lub tkanek w celu analizy struktury i funkcji mitochondrialnych SC za pomocą elektroforezy natywnej, a następnie testów aktywności w żelu lub western blot.

Wydajność izolacji mitochondriów uzyskanych zgodnie z powyższymi protokołami różni się w zależności od kilku czynników, takich jak linia komórkowa lub rodzaj tkanki, charakter próbek (tj. czy zastosowano tkanki świeże czy zamrożone) lub efektywność procesu homogenizacji. Przewidywane wydajności uzyskania mitochondriów z różnych linii komórkowych i tkanek zestawiono w Tabeli 2. Po otrzymaniu frakcji mitochondrialnych kolejnym krokiem jest analiza wzorca oddechowych SC, którą przeprowadza się po solubilizacji surowej próbki mitochondrialnej i rozdziale elektroforetycznym metodą BN-PAGE, a następnie analizie IGA lub immunodetekcji WB. Rysunek 1 przedstawia wygląd niebarwionych ścieżek żelu bezpośrednio po elektroforezie oraz wzorzec prążków po standardowym barwieniu Coomassie próbek mitochondrialnych z hodowanej linii komórkowej oraz wątroby myszy.
Na Rysunku 2A,B można zauważyć wyraźne różnice w wzorcach składania SC w komórkach ludzkich i mysich po zastosowaniu testów IGA. Zauważono zatem obecność wolnego kompleksu I w komórkach mysich, podczas gdy w mitochondriach ludzkich nie jest on wykrywalny. Wzorzec kompleksu IV-IGA jest bardzo podobny w obu liniach komórkowych człowieka (Rysunek 2B), natomiast wykazuje różnice między dwiema analizowanymi liniami komórkowymi myszy na Rysunku 2A. Różnice te wynikają z faktu, że komórki BL6 wykazują ekspresję wariantu zmutowanego SCAF18.
Wzorce SC, uzyskane przy użyciu opisanego tutaj protokołu izolacji mitochondriów przeznaczonego do małych próbek, są zachowane w odniesieniu do protokołów „konwencjonalnych” stosowanych dla większych próbek. Można to zaobserwować na Rysunku 2C, porównując ścieżki 1 i 6 (uzyskane po izolacji mitochondriów za pomocą konwencjonalnego protokołu z 3 g wątroby i 1,1 g BAT) z odpowiednio ścieżkami 2 i 5 (uzyskane przy użyciu przedstawionych tutaj protokołów z około 0,1 g obu tkanek). Zgodnie z zaproponowanym modelem plastyczności, względna proporcja kompleksów oddechowych i SC zmienia się w zależności od typu komórki i stanu metabolicznego. Jak pokazano na Rysunku 2C,D, różne tkanki wykazują odmienne wzorce montażu SC. Zatem mitochondria mózgu wykazują bardzo niskie poziomy wolnego kompleksu I i wyższą proporcję SC w porównaniu z innymi tkankami, a BAT charakteryzuje się niskimi poziomami CV (Rysunek 2A) i wysoką ilością SC III + IV (Rysunek 2D). Mitochondria serca wykazują wysokie poziomy SC i CV. Wzorce montażu CV są bardzo podobne pomiędzy hodowaną linią komórkową a próbką mitochondriów z wątroby myszy (Rysunek 2E).
Składanie kompleksów SC można również analizować za pomocą WB, co przedstawiono na Rysunku 3 dla dwóch próbek pobranych z kontrolnej śledziony oraz komórek nowotworowych. W tym przypadku 30-50 µg białka mitochondrialnego jest zazwyczaj wystarczające do wykrycia różnych kompleksów i SC za pomocą specyficznych przeciwciał. Rysunek 4 przedstawia niektóre z głównych błędów, które mogą wystąpić podczas stosowania tych protokołów. Niewłaściwe gradienty żelu mogą prowadzić do anormalnych i niepożądanych wzorów migracji, jak na Rysunku 4A, ścieżka 1, gdzie kompleksy SC pozostają blisko studzienki w górnej części ścieżki z powodu wyższego niż normalnie stężenia akrylamidu w żelu. Inkubacja próbek, nawet przez stosunkowo krótki czas, w wysokich temperaturach (tutaj 37 °C i 40 °C przez 10 min) powoduje degradację SC i CI (Rysunek 4A, ścieżki 2-4). Podobnie, stosunek detergentu do białka jest krytyczny dla uzyskania dobrych wyników i odpowiedniej rozdzielczości żelu. Poniżej stosunku 2 g digitoniny/g białka rozdzielczość prążków ulega stopniowemu zmniejszeniu, a przy niższym stężeniu (0,5 g/g) widoczny jest jedynie rozmaz w obszarze odpowiadającym SC (Rysunek 4B).
<img alt="Wyniki elektroforezy; rozdział białek z barwieniem Coomassie; analiza komórek i wątroby, marker CV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wzór kompleksów i superkompleksów mitochondrialnych po rozdziele BNGE mitochondriów permeabilizowanych digitoniną z linii komórkowej (L929Balbc) oraz wątroby myszy. Ścieżki po lewej stronie (1 i 2) przedstawiają wygląd niebarwionego żelu bezpośrednio po elektroforezie, gdzie wykrywalny jest tylko CV, natomiast ścieżki po prawej stronie (3 i 4) pokazują wzór prążków po barwieniu Coomassie. Skróty: BNGE = elektroforeza w natywnych białkach (Blue Native gel electrophoresis); CV = kompleks V; SCs = superkompleksy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat elektroforezy żelowej białek; wzorce prążków CI, CIV, CV; analizowane tkanki wątroby, mózgu i serca." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza IGA mitochondriów wyizolowanych z różnych linii komórkowych i tkanek mysich. (A,B) Aktywność w żelu (in-gel activity) wskazanych kompleksów w mitochondriach wyizolowanych z (A) mysich lub (B) ludzkich linii komórkowych. L929Balbc to transmitochondrialna linia komórkowa wytworzona w naszym laboratorium poprzez transfer mitochondriów z płytek krwi myszy Balb/cJ do komórek ρ°L929neo, zgodnie z wcześniejszym opisem40,41. Fibroblasty BL6 to unieśmiertelniona linia komórkowa wytworzona w naszym laboratorium z biopsji ucha myszy BL6. (C) Wzorce CI-IGA z mitochondriów mysich wyizolowanych albo metodą konwencjonalną, zaczynając od 3 g wątroby (ścieżka 1) i 1,1 g BAT (ścieżka 6), albo według przedstawionego tutaj protokołu, zaczynając w każdym przypadku od około 0,1 g tkanki (ścieżka 2, wątroba; ścieżka 3, serce; ścieżka 4, mózg i ścieżka 5, BAT). (D) Wzorce CIV-IGA (wykonane po CI-IGA pokazanym na panelu 2C, ścieżki 2-5) w mitochondriach z wątroby, serca, mózgu i BAT myszy. (E) Aktywność CV-IGA analizowana w hodowlach komórkowych i wątrobie myszy. Na każdą ścieżkę nałożono około 60-75 µg białka mitochondrialnego. Skróty: IGA = aktywność w żelu (in-gel activity); SCs = superkompleksy; CI = kompleks I; BAT = brunatna tkanka tłuszczowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy białek mitochondrialnych z użyciem przeciwciał α-NDUFA9, α-Uqcrc1, α-Co1, α-SDHA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Immunodetekcja WB różnych kompleksów i superkompleksów mitochondrialnych w próbkach śledziony. Po rozdziale kompleksów mitochondrialnych i SC metodą Blue Native PAGE, uzyskanych z próbek kontrolnych śledziony (Spleen M9) i guza (Tumor M9), przeniesiono je na membranę PVDF i sekwencyjnie hybrydyzowano z przeciwciałami rozpoznającymi wskazane podjednostki CI, CIII, CIV i CII (odpowiednio panele A-D). Na każdą ścieżkę naniesiono około 50 µg białka mitochondrialnego. Gwiazdki oznaczają sygnał pozostały z poprzedniego western blotu. Skróty: SC = superkompleks; CI = kompleks I; CIII = kompleks III; CIV = kompleks IV; CII = kompleks II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy; wpływ temperatury i stosunku digitonininy/białka na superkompleksy; ścieżki 1-4." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Pułapki w analizie SC metodą Blue-Native PAGE. Analiza IGA dla CI mitochondriów wyizolowanych z (A>) świeżej wątroby myszy i (B>) zamrożonej wątroby szczura w różnych warunkach solubilizacji. (A>) Ścieżka 1, błędne stężenie gradientu żelu (8-13% zamiast standardowych 3-13%). Ścieżki 2-4, próbki inkubowane przez 10 min odpowiednio na lodzie, w 37 °C oraz 40 °C przed nałożeniem. (B>) Wzór po IGA dla CI mitochondriów uzyskanych z zamrożonej wątroby szczura przy zastosowaniu różnych stosunków digitonininy/białka do solubilizacji. Skróty: SC = superkompleks; PAGE = elektroforeza w żelu poliakrylamidowym; CI = kompleks I; IGA = aktywność w żelu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pożywka</td>
			<td colspan="3">Skład</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor hipotoniczny</td>
			<td colspan="3">10 mM MOPS, 83 mM sacharozy, pH 7,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor hipertoniczny</td>
			<td colspan="3">30 mM MOPS, 250 mM sacharozy, pH 7,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do homogenizacji A</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sacharozy, pH 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do homogenizacji AT</td>
			<td colspan="3">225 mM mannitolu, 1 mM EGTA, 75 mM sacharozy, 0,01% BSA pH 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do homogenizacji AT2</td>
			<td colspan="3">225 mM mannitolu, 1 mM EGTA, 75 mM sacharozy, 0,02% BSA pH 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor do próbek BN</td>
			<td colspan="3">50 mM NaCl, 50 mM imidazol, 2 mM kwas aminokapronowy, 1 mM EDTA pH 7,0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór digitoniny</td>
			<td colspan="3">10% digitonina w 50 mM NaCl, 50 mM imidazolu, 5 mM kwasu aminokapronowego, 4 mM PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor do nakładania próbek w BN-PAGE</td>
			<td colspan="3">5% błękit Coomassie G w 0,75 M kwasie aminokapronowym</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor katodowy A do BN</td>
			<td colspan="3">50 mM trycyny, 15 mM Bis-Tris pH = 7,0 (4 °C), 0,02% G-250 (błękit Coomassie G-250)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor katodowy B do BN-PAGE</td>
			<td colspan="3">50 mM tricyny, 15 mM Bis-Tris pH=7,0 (4 °C), 0,002% G-250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bufor anodowy do BN-PAGE</td>
			<td colspan="3">50 mM Bis-Tris, pH=7,0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>podłoże do kompleksu I IGA</td>
			<td colspan="3">5 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/mL NADH, 2,5 mg/mL nitroblue tetrazolium (NBT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podłoże dla kompleksu II IGA</td>
			<td colspan="3">Bufor fosforan potasu 50 mM o pH 7,4, 20 mM bursztynian sodu, 0,2 mM fenazyny metosiarczanu (PMS), 2,5 mg/ml NBT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>podłoże IGA dla kompleksu III</td>
			<td colspan="3">Bufor fosforan potasu 50 mM pH 7,2, 0,05% diaminobenzydyny (DAB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrat IGA dla kompleksu IV</td>
			<td colspan="3">Taki sam roztwór jak w CIII, plus 50 μM cytochrom c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podłoże IGA dla kompleksu V</td>
			<td colspan="3">35 mM Tris, 270 mM glicyna pH 8,3, 14 mM MgSO44, 0,2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór barwiący</td>
			<td colspan="3">Barwnik Coomassie R-250 w stężeniu 0,25% w 40% metanolu i 10% kwasu octowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do odbarwiania/utrwalania</td>
			<td colspan="3">40% metanol, 10% kwas octowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do transferu</td>
			<td colspan="3">48 mM Tris, 39 mM glicyny, 20% metanolu</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład buforów i pożywek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Typ komórek/tkanka</td >
			<td >Ilość początkowa</td >
			<td >Przewidywana wydajność (µg białka mitochondrialnego)</td >
			<td >Liczba linii (50-60 µg/linia)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Komórki hodowane</td >
			<td ></td >
			<td ></td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >MDA-MB-468</td >
			<td >100 µL vpc</td >
			<td >300-400 µg</td >
			<td >6-9</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >pochodne 143B</td >
			<td >100 µL vpc</td >
			<td >200-350 µg</td >
			<td >4-7</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Fibroblasty mysie</td >
			<td >100 µL vpc</td >
			<td >150-200 µg</td >
			<td >3-5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Serce</td >
			<td >100 mg</td >
			<td >400-500 µg</td >
			<td >10-12*</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Mięśnie szkieletowe</td >
			<td >100 mg</td >
			<td >300-400 µg</td >
			<td >8-10*</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Wątroba</td >
			<td >100 mg</td >
			<td >400-500 µg</td >
			<td >8-10</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Śledziona</td >
			<td >50 mg</td >
			<td >150-250 µg</td >
			<td >3-5</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >BAT</td >
			<td >100 mg</td >
			<td >200-300 µg</td >
			<td >4-6</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Mózg</td >
			<td >100 mg</td >
			<td >250-300 µg</td >
			<td >5-8</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Przewidywane wydajności izolacji mitochondriów z różnych typów komórek i tkanek mysich. Frakcje mitochondrialne uzyskane z serca lub mięśni szkieletowych są czystsze niż te otrzymane z innych tkanek. W związku z tym na żele można nanosić mniejsze ilości materiału (*).

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

Nasze badania koncentrują się na lepszym zrozumieniu biogenezy mitochondriów, a w szczególności organizacji i regulacji systemu OXPHOS. A także na określeniu roli, jaką mitochondria odgrywają w chorobach, od raka po zaburzenia neurodegeneracyjne. Mitochondria pełnią wiele istotnych ról w komórce, warunkując cały jej metabolizm i przetrwanie.Powoli zwiększamy naszą wiedzę na temat złożoności mitochondriów i ich wkładu w mechanizmy adaptacji komórek w zdrowiu i chorobie. Przyczyniliśmy się do ustanowienia nowego modelu organizacji systemu OXPHOS, modelu plastyczności. Integruje to poprzednie propozycje i zakłada współistnienie super kompleksów i wolnych kompleksów w różnych proporcjach, aby zoptymalizować jego funkcję i umożliwić adaptacje komórkowe.Nasz protokół pozwala, począwszy od małych tkanek lub próbek hodowli komórkowych, uzyskać wystarczającą ilość białka mitochondrialnego, aby przeanalizować składanie, stan i funkcję super kompleksów za pomocą niebieskiej natywnej elektroforezy lub innych technik. Możemy to zrobić w sposób powtarzalny w krótkim czasie za pomocą prostego sprzętu i przy stosunkowo niskich kosztach. Na początek ponownie zawiesić upakowane podniebienie komórkowe w objętości buforu hipotonicznego równej siedmiokrotności objętości osadu komórkowego.Przenieś zawiesinę komórkową do homogenizatora Potter Dounce i inkubuj na lodzie przez dwie minuty, pozwalając komórkom pęcznieć. Przerwij błony komórkowe, wykonując od ośmiu do dziesięciu pociągnięć w homogenizatorze, sprzężonym z napędzanym silnikiem tłuczkiem teflonowym obracającym się z prędkością 600 obr./min. Dodaj równą objętość buforu hipertonicznego do zawiesiny komórki, aby wytworzyć środowisko izotoniczne.Przenieś homogenat do probówki o pojemności od 10 do 15 mililitrów. Wirować przy 1 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant do 1,5 mililitrowej probówki polipropylenowej. Aby zebrać surową frakcję mitochondrialną, odwirować w mikrodymie o stężeniu 16 000 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad wzbogacony w mitochondria z 0,5 mililitra buforu A. Połączyć zawartość dwóch probówek w jedną i odwirować, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach buforu A. Określić ilościowo stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradforda. Za pomocą nożyczek odetnij od 20 do 30 miligramów tkanki zwierzęcej.Umyj tkankę trzy do czterech razy w buforze homogenizacyjnym za pomocą sitka, uważając, aby nie stracić mniejszych kawałków. Przenieść kawałki tkanki z buforem do homogenizatora. W przypadku tkanek wątroby, śledziony i nerek wykonaj od czterech do sześciu ruchów w górę iw dół w LVEM Potter za pomocą napędzanego silnikiem tłuczka teflonowego z prędkością 600 obr./min.Rozpocznij od ponownego zawieszenia frakcji mitochondrialnych uzyskanych z hodowli komórek lub tkanek ssaków w niebieskim natywnym buforze próbki, aby uzyskać stężenie białka około 10 miligramów na mililitr. Aby rozpuścić błony mitochondrialne, dodaj digitoninę, aby uzyskać stosunek czterech gramów digitoniny na gram białka mitochondrialnego. Wymieszać delikatnie pipetując i inkubować na lodzie przez pięć minut.Odwirować zawiesinę w mikrodymie o stężeniu 20 000 G przez 25 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Zebrać supernatant do świeżej probówki, następnie dodać 5% Coomassie blue G-250, co odpowiada jednej trzeciej początkowej objętości zawiesiny, i wymieszać pipetując. Dodać bufor zimnej katody A do górnej komory aparatu do elektroforezy i bufor anodowy do dolnej komory.Załaduj od 30 do 100 mikrogramów białka mitochondrialnego do studzienek na żelu poliakrylamidowym. Po elektroforezie umieść żel w plastikowym pudełku. Dodać wystarczającą objętość odpowiedniego roztworu do oznaczania aktywności w żelu, aby pokryć żel i inkubować w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając, chroniąc przed światłem.Gdy rozwiną się odpowiednie prążki, usuń roztwór testowy. Umyj żel dwukrotnie wodą destylowaną przed utrwaleniem go 40% metanolem i 10% kwasem octowym przez 30 minut. Analiza aktywności żelu ujawniła wyraźne wzorce składania superkompleksów w komórkach myszy i ludzi.Wolny kompleks jeden zaobserwowano w komórkach myszy, podczas gdy nie był on wykrywalny w ludzkich mitochondriach. Złożone cztery wzorce były podobne w ludzkich liniach komórkowych, ale różniły się w liniach komórkowych myszy z powodu zmutowanego wariantu SCAF1.

isolation-mitochondria-for-mitochondrial-supercomplex-analysis-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje procedurę izolacji mitochondriów z tkanek ludzkiego raka jajnika za pomocą wirowania o różnej prędkości w połączeniu z wirowaniem w gradiacji gęstości. Wyizolowane mitochondria można wykorzystać do analizy proteomicznej proteomu mitochondrialnego ludzkiego raka jajnika.

Izolacja mitochondriów: technika izolowania mitochondriów od próbki tkanki ludzkiego raka jajnika

Opisano metodę szybkiej izolacji mitochondriów z biopsji tkanek ssaków. Preparaty wątroby szczura lub mięśni szkieletowych homogenizowano za pomocą komercyjnego dysocjatora tkanek, a mitochondria izolowano przez filtrację różnicową przez filtry z siatki nylonowej. Czas izolacji mitochondriów wynosi &lt;30 min w porównaniu do 60 - 100 min przy użyciu metod alternatywnych.

Szybka izolacja i oczyszczanie mitochondriów do przeszczepu przez dysocjację tkanek i filtrację różnicową

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Ponieważ mitochondria stanowią tylko niewielki procent komórki roślinnej, muszą zostać oczyszczone do szeregu badań. Mitochondria można wyizolować z różnych organów roślinnych poprzez homogenizację, a następnie wirowanie w gradiacji różnicowej i gęstości w celu uzyskania wysoce oczyszczonej frakcji mitochondrialnej.

Izolacja i pomiary oddechowe mitochondriów Arabidopsis thaliana

Mitochondria mają wyspecjalizowane rybosomy, które różnią się od swoich bakteryjnych i cytoplazmatycznych odpowiedników. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób mitoribosomy można uzyskać z ich natywnego przedziału w komórkach HEK. Metoda polega na izolacji mitochondriów z komórek zawiesinowych, a następnie oczyszczeniu mitoribosomów.

Szybka izolacja mitoribosomu z komórek HEK

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Poznaj metodę izolacji mitochondriów do analizy superkompleksów oddechowych z małych próbek tkanek i kultur komórkowych. Technika ta umożliwia badanie organizacji systemu OXPHOS.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Przeglądaj więcej filmów