Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych
3 maja 2024
Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.
Nasze badania koncentrują się na lepszym zrozumieniu biogenezy mitochondriów, a w szczególności organizacji i regulacji systemu OXPHOS. A także na określeniu roli, jaką mitochondria odgrywają w chorobach, od raka po zaburzenia neurodegeneracyjne. Mitochondria pełnią wiele istotnych ról w komórce, warunkując cały jej metabolizm i przetrwanie.
Powoli zwiększamy naszą wiedzę na temat złożoności mitochondriów i ich wkładu w mechanizmy adaptacji komórek w zdrowiu i chorobie. Przyczyniliśmy się do ustanowienia nowego modelu organizacji systemu OXPHOS, modelu plastyczności. Integruje to poprzednie propozycje i zakłada współistnienie super kompleksów i wolnych kompleksów w różnych proporcjach, aby zoptymalizować jego funkcję i umożliwić adaptacje komórkowe.
Nasz protokół pozwala, począwszy od małych tkanek lub próbek hodowli komórkowych, uzyskać wystarczającą ilość białka mitochondrialnego, aby przeanalizować składanie, stan i funkcję super kompleksów za pomocą niebieskiej natywnej elektroforezy lub innych technik. Możemy to zrobić w sposób powtarzalny w krótkim czasie za pomocą prostego sprzętu i przy stosunkowo niskich kosztach. Na początek ponownie zawiesić upakowane podniebienie komórkowe w objętości buforu hipotonicznego równej siedmiokrotności objętości osadu komórkowego.
Przenieś zawiesinę komórkową do homogenizatora Potter Dounce i inkubuj na lodzie przez dwie minuty, pozwalając komórkom pęcznieć. Przerwij błony komórkowe, wykonując od ośmiu do dziesięciu pociągnięć w homogenizatorze, sprzężonym z napędzanym silnikiem tłuczkiem teflonowym obracającym się z prędkością 600 obr./min. Dodaj równą objętość buforu hipertonicznego do zawiesiny komórki, aby wytworzyć środowisko izotoniczne.
Przenieś homogenat do probówki o pojemności od 10 do 15 mililitrów. Wirować przy 1 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant do 1,5 mililitrowej probówki polipropylenowej. Aby zebrać surową frakcję mitochondrialną, odwirować w mikrodymie o stężeniu 16 000 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad wzbogacony w mitochondria z 0,5 mililitra buforu A. Połączyć zawartość dwóch probówek w jedną i odwirować, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach buforu A. Określić ilościowo stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradforda. Za pomocą nożyczek odetnij od 20 do 30 miligramów tkanki zwierzęcej.
Umyj tkankę trzy do czterech razy w buforze homogenizacyjnym za pomocą sitka, uważając, aby nie stracić mniejszych kawałków. Przenieść kawałki tkanki z buforem do homogenizatora. W przypadku tkanek wątroby, śledziony i nerek wykonaj od czterech do sześciu ruchów w górę iw dół w LVEM Potter za pomocą napędzanego silnikiem tłuczka teflonowego z prędkością 600 obr./min.
Rozpocznij od ponownego zawieszenia frakcji mitochondrialnych uzyskanych z hodowli komórek lub tkanek ssaków w niebieskim natywnym buforze próbki, aby uzyskać stężenie białka około 10 miligramów na mililitr. Aby rozpuścić błony mitochondrialne, dodaj digitoninę, aby uzyskać stosunek czterech gramów digitoniny na gram białka mitochondrialnego. Wymieszać delikatnie pipetując i inkubować na lodzie przez pięć minut.
Odwirować zawiesinę w mikrodymie o stężeniu 20 000 G przez 25 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Zebrać supernatant do świeżej probówki, następnie dodać 5% Coomassie blue G-250, co odpowiada jednej trzeciej początkowej objętości zawiesiny, i wymieszać pipetując. Dodać bufor zimnej katody A do górnej komory aparatu do elektroforezy i bufor anodowy do dolnej komory.
Załaduj od 30 do 100 mikrogramów białka mitochondrialnego do studzienek na żelu poliakrylamidowym. Po elektroforezie umieść żel w plastikowym pudełku. Dodać wystarczającą objętość odpowiedniego roztworu do oznaczania aktywności w żelu, aby pokryć żel i inkubować w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając, chroniąc przed światłem.
Gdy rozwiną się odpowiednie prążki, usuń roztwór testowy. Umyj żel dwukrotnie wodą destylowaną przed utrwaleniem go 40% metanolem i 10% kwasem octowym przez 30 minut. Analiza aktywności żelu ujawniła wyraźne wzorce składania superkompleksów w komórkach myszy i ludzi.
Wolny kompleks jeden zaobserwowano w komórkach myszy, podczas gdy nie był on wykrywalny w ludzkich mitochondriach. Złożone cztery wzorce były podobne w ludzkich liniach komórkowych, ale różniły się w liniach komórkowych myszy z powodu zmutowanego wariantu SCAF1.
Przegląd
Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko niewielkie ilości próbek. Badanie skupia się na zrozumieniu biogenezy mitochondrialnej i organizacji systemu OXPHOS.
Kluczowe Elementy Badań
Dziedzina Nauki
- Neurobiologia
- Biologia Komórkowa
- Badania Mitochondrialne
Wprowadzenie
- Mitochondria odgrywają niezbędne role w metabolizmie komórkowym i przetrwaniu.
- Zrozumienie złożoności mitochondrialnej ma kluczowe znaczenie dla wglądu w zdrowie i choroby.
- Organizacja systemu OXPHOS jest niezbędna dla adaptacji komórkowych.
- Poprzednie modele systemu OXPHOS zostały zintegrowane z nowym modelem plastyczności.
Cel Badania
- Analiza superkompleksów oddechowych przy ograniczonej dostępności próbek.
- Wzmocnienie zrozumienia roli mitochondriów w chorobach.
- Ustanowienie nowego modelu organizacji systemu OXPHOS.
Wykorzystane Metody
- Analiza superkompleksów oddechowych.
- Integracja istniejących modeli w ramy plastyczności.
- Wykorzystanie technik dla małych próbek.
- Skupienie się na biogenezie mitochondrialnej i regulacji.
Główne Wyniki
- Ustanowienie nowego modelu dla systemu OXPHOS.
- Wgląd we współistnienie superkompleksów i kompleksów wolnych.
- Zrozumienie wkładu mitochondriów w adaptacje komórkowe.
- Implikacje dla chorób, takich jak rak i choroby neurodegeneracyjne.
Wnioski
- Nowy model plastyczności zwiększa zrozumienie funkcji mitochondrialnej.
- Techniki dla małych próbek są skuteczne w analizie superkompleksów oddechowych.
- Konieczne są dalsze badania, aby zbadać rolę mitochondriów w różnych chorobach.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and analysis of mitochondrial supercomplexes from small tissue or cell culture samples addresses a critical bottleneck in early discovery and translational research, where sample availability is often limited. This capability enables mechanistic de-risking of mitochondrial function and supports predictive confidence in disease-relevant models, particularly for neurodegenerative and metabolic disorders. The method enhances portfolio decision-making by enabling robust target validation and functional assessment in resource-constrained settings.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial respiratory supercomplex assembly and function in limited or precious samples.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying OXPHOS system organization in disease-relevant models.
- Facilitates functional target validation for mitochondrial pathways implicated in neurodegeneration and cancer.
- Improves predictive confidence for early-stage portfolio triage by providing quantitative supercomplex status.
Screening & Assay Development
- Prepares validated mitochondrial fractions suitable for downstream blue native electrophoresis and in-gel activity assays.
- Enables reproducible and quantitative assessment of supercomplex assembly across multiple samples.
- Supports assay standardization and scalability for compound or genetic perturbation studies in small-scale systems.
- Facilitates reliable evaluation of mitochondrial-targeted interventions in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial supercomplex analysis with disease-relevant tissue and cell models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by linking mechanistic mitochondrial data to disease phenotypes.
- Supports biomarker development by quantifying supercomplex assembly patterns in preclinical models.
- Provides mechanistic insight into mitochondrial dysfunction in rare or limited-access clinical samples.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust mitochondrial analysis from early target validation through translational research, especially when sample input is limiting.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for mitochondrial function in health and disease.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for supercomplex assembly, enabling assay readiness.
- Analytics: Provides native electrophoresis and in-gel activity readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling analysis in disease-relevant and rare sample types.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable protocol for mitochondrial studies across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Standardizes mitochondrial isolation and analysis from small samples, improving reproducibility.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and advancement of mitochondrial targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial biology and native electrophoresis techniques.
- Needs access to centrifugation, homogenization, and electrophoresis instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and quantitative analysis.
- Adaptable to various tissue and cell culture models, including rare or slow-growing systems.
- Sample input limitations may affect throughput and require careful planning for parallel analyses.
