Opracowanie małoinwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi
25 października 2024
Opisano szczegółową metodologię tworzenia minimalnie inwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Podano również dodatkowe metody ilościowego określania obszaru zawału i wizualizacji drzewa tętnicy płucnej.
Zakres naszych badań ma na celu poprawę wiarygodności i odtwarzalności modeli zatorowości płucnej u gryzoni, które naśladują patofizjologię człowieka. Naszym celem jest znalezienie odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób techniki małoinwazyjne są wykorzystywane do indukowania modeli PE, mając nadzieję, że ułatwią one opracowanie nowych strategii terapeutycznych. Nasze protokoły generują autologiczne skrzepy krwi w standardowy sposób i indukują chirurgiczne modele PE gryzoni przy minimalnej inwazyjności, poprawiając w ten sposób wiarygodność i odtwarzalność eksperymentów na PE. Ujawniliśmy, że usuwanie skrzepów jest szybkie u gryzoni. To wyjaśnia, dlaczego model przewlekłego zakrzepowo-zatorowego nadciśnienia płucnego jest trudny do ustalenia. Techniki wizualizacji skrzepów pomogą w opracowaniu niezawodnego modelu zwierzęcego PTAP. Jesteśmy wspólnym laboratorium zarówno inżynierii biomedycznej, jak i klinicznych zespołów sercowo-naczyniowych. Dzięki temu modelowi nasze laboratorium skupi się na opracowywaniu nowatorskich strategii zapobiegania zakrzepowo-zatorowym i powikłaniom PE w oparciu o zaawansowane rozwiązania biomateriałowe.
[Narrator] Na początek ułóż znieczulone zwierzę na platformie operacyjnej w pozycji leżącej. Wyciągnij obie cztery kończyny poziomo od ciała i wyprostuj kończyny tylne, aby odpowiednio odsłonić obszar pachwiny. Za pomocą taśmy medycznej zabezpiecz zwierzę w tej pozycji. Użyj golarki elektrycznej, aby ogolić włosy wokół mostka i pachwiny. Następnie rozsmaruj krem do depilacji na resztkach włosów i trzykrotnie zdezynfekuj skórę jodowidonem. Włóż igłę o rozmiarze 27 przymocowaną do jednomililitrowej strzykawki pionowo na głębokość ośmiu milimetrów, aby nakłuć lewą lub prawą żyłę główną czaszki. Następnie przytrzymaj strzykawkę i delikatnie odciągnij tłok, aby wytworzyć podciśnienie w cylindrze. Stopniowo wyjmować igłę, aż zacznie napływać krew. Następnie utrzymuj tę pozycję, aż do pobrania 0,3 mililitra krwi. W celu przygotowania skrzepu krwi wepchnij zebraną krew do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Następnie wciągnij krew do silikonowej rurki samodzielnie wykonanego generatora skrzepliny, aż kolumna krwi osiągnie 10 centymetrów długości. Odczekaj 30 minut, aby krew mogła się skrzepnąć. Następnie przepłukać kolumnę krwi skrzepliny na szalkę Petriego zawierającą sól fizjologiczną. Następnie za pomocą cienkich nożyczek pokrój kolumnę skrzepliny na jednolite skrzepliny krwi, każdy o długości czterech milimetrów. Narysuj od 15 do 25 skrzepów do samodzielnie wykonanego wtryskiwacza wstępnie napełnionego dwoma mililitrami normalnej soli fizjologicznej. Po zdezynfekowaniu obszaru operacyjnego znieczulonego szczura należy wykonać pięciomilimetrowe nacięcie skóry powyżej początku powierzchownych naczyń nadbrzusza w okolicy pachwiny. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego z 10-krotnym powiększeniem oddziel cienką warstwę podskórnej tkanki tłuszczowej, aby odsłonić powierzchowne naczynia nadbrzusza. Ostrożnie odizoluj powierzchowną żyłę nadbrzusza od tętnicy, nerwu i tkanki tłuszczowej. Następnie kontroluj dystalną stronę za pomocą 8-0 Sterylny szew i zacisnąć szew za pomocą mikrozacisku. Kontroluj bliższą stronę za pomocą 8-0 sterylna pętla do szwów przymocowana do innego mikrozacisku. Zawiąż dystalną pętlę i przeciąć żyłę za pomocą kauteryzatora. Następnie wykonaj małe poprzeczne nacięcie po dystalnej stronie izolowanej żyły i przepłucz pozostałą krew w świetle żyły zwykłą solą fizjologiczną. Gdy żyła jest oczyszczona, użyj mikropęsety, aby powiększyć nacięcie żylne. W celu embolizacji delikatnie włóż igłę samodzielnie wykonanego wstrzykiwacza do żyły przez nacięcie żyły. Zabezpiecz igłę trzecim zaciskiem, aby zapobiec jej wysunięciu się z żyły. Następnie powoli naciskaj tłok, aby podać niewielką ilość soli fizjologicznej. Kontynuować naciskanie tłoka, aby podać skrzepy do żyły udowej przez powierzchowny dostęp do żyły w nadbrzuszu. Podwiązać żyłę za pomocą szwu proksymalnego. Na koniec zszyj nacięcie. Po eutanazji szczura z przedawkowaniem izofluranu, odetnij żebra dużymi nożycami i otwórz klatkę piersiową, unikając uszkodzenia płuc i dużych naczyń. Teraz włóż igłę urządzenia infuzyjnego do lewej komory. Otworzyć zawór urządzenia infuzyjnego, aby umożliwić infuzję soli fizjologicznej w postaci heparyny. Za pomocą nożyczek odetnij żyłę główną dolną i lewy wyrostek, aby umożliwić drenaż. Kontroluj prędkość perfuzji na poziomie 50 mililitrów na minutę. Po perfuzji, za pomocą 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej czteroprocentowym roztworem paraformaldehydu, nakłuj pień tętnicy płucnej przez prawą komorę. Napraw tkankę płucną, wykonując czteroprocentową obfitość paraformaldehydu przez płuca do całkowitej objętości 30 mililitrów. W celu wizualizacji drzewa tętniczego płuc dodaj równą ilość rozcieńczalnika do silikonowej masy odlewniczej. Po wymieszaniu mieszaniny dodaj pięć procent utwardzacza i ponownie wymieszaj mieszaninę. Następnie pobrać jeden mililitr mieszaniny do jednomililitrowej strzykawki. Wydmuchnąć powietrze i wprowadzić igłę do pnia tętnicy płucnej przez prawą komorę. Delikatnie nacisnąć tłok, aby mieszanina odlewu silikonowego wypełniła drzewo tętnicy płucnej. Umieść całą masę na szalce Petriego przed przechowywaniem jej przez noc w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić krystalizację mieszaniny odlewniczej. Zanurz płuca kolejno w roztworach alkoholu etylowego 25%, 50%, 75%, 95% i 100% każdy na 24 godziny. Zanurz odwodnione płuca w salicylanie metylu na 24 godziny. Bezpośrednio po embolizacji w wyekstrahowanych płucach pojawiły się autologiczne skrzepy krwi i obszary z zawałem płuc. Większe obciążenie zatorem skutkowało większą powierzchnią zawału płuc. W porównaniu z próbkami płuc pobranymi natychmiast po embolizacji, próbki płuc pobrane 24 godziny po embolizacji wykazały znacznie zmniejszone obszary zawału, co wskazuje na silny wewnętrzny potencjał fibrynolizy u szczurów. Ten rysunek przedstawia drzewo tętnicze płuc po zagiśnięciu i oczyszczeniu tkanek dla normalnych płuc i dla płuc z zatorowością płucną.
Przegląd
W niniejszym artykule szczegółowo opisano metodologię tworzenia małoinwazyjnego modelu zatorowości płucnej (PE) u szczurów z wykorzystaniem autologicznych skrzeplin krwi. Opisano również techniki ilościowego określania obszaru zawału oraz wizualizacji drzewa tętniczego płuc.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania sercowo-naczyniowe
- Modele zwierzęce
Wprowadzenie
- Modele gryzoni są niezbędne do badania zatorowości płucnej.
- Techniki małoinwazyjne mogą poprawić niezawodność tych modeli.
- Zrozumienie procesu rozpuszczania skrzeplin jest kluczowe dla opracowania modeli przewlekłych.
- Współpraca między zespołami inżynierii biomedycznej a zespołami klinicznymi usprawnia wyniki badań.
Cel badania
- W celu zwiększenia wiarygodności i powtarzalności modeli PE.
- W celu ułatwienia opracowania nowych strategii terapeutycznych w PE.
- W celu przedstawienia szczegółowych protokołów indukowania PE u gryzoni.
Zastosowane metody
- Przygotowanie autologicznych skrzepów krwi z pobranej krwi.
- Minimalnie inwazyjne techniki chirurgiczne do embolizacji.
- Wizualizacja drzewa tętniczego płuc za pomocą odlewu silikonowego.
- Kwantyfikacja obszarów zawału płuc po embolizacji.
Główne wyniki
- Szybka rozpuszczalność skrzepów u gryzoni utrudnia stworzenie modelu przewlekłego PE.
- Wyższe obciążenia zatorowe korelują z większymi obszarami zawału.
- U szczurów zaobserwowano znaczny wrodzony potencjał fibrynolityczny.
- Opracowano skuteczne techniki wizualizacji struktur tętnic płucnych.
Wnioski
- Opisany model usprawnia badanie zatorowości płucnej.
- Techniki małoinwazyjne mogą prowadzić do opracowania lepszych strategii terapeutycznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach w celu poprawy wyników leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne modele przedkliniczne zatorowości płucnej są niezbędne dla badań translacyjnych i innowacji terapeutycznych w chorobach układu sercowo-naczyniowego. Ten małoinwazyjny model szczurzy, wykorzystujący standaryzowane autologiczne skrzepliny krwi oraz ilościową ocenę zawału, rozwiązuje problemy z powtarzalnością i porównywalnością wyników między badaniami w początkowej fazie poszukiwania nowych leków. Zwiększona wierność modelu wspiera pewność predykcyjną oraz decyzje portfelowe skorygowane o ryzyko w przypadku nowych interwencji w PE.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia badanie patofizjologii PE w kontrolowanym, powtarzalnym systemie gryzoni.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie dynamiki powstawania i rozpuszczania skrzeplin istotnych dla człowieka.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla strategii zapobiegania zatorowości zakrzepowej i powikłaniom.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia zestandaryzowaną platformę do oceny potencjalnych terapeutyków ukierunkowanych na formowanie lub rozpuszczanie skrzeplin.
- Dostarcza ilościowe pomiary obszaru zawału w celu określenia skuteczności badanych związków.
- Poprawia powtarzalność testów i porównywalność danych między badaniami dzięki standaryzacji protokołu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z punktami końcowymi istotnymi dla choroby dzięki modelowaniu ostrej PE i wewnątrzpochodnej fibrynolizy in vivo.
- Umożliwia zachowanie ciągłości od odkryć mechanistycznych po walidację przedkliniczną interwencji opartych na biomateriałach.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój terapii PE poprzez wyjaśnienie ograniczeń modelu w przypadku choroby przewlekłej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych w przypadku PE, łącząc wczesne studia mechanistyczne z oceną kandydatów.
- Biologia odkrywcza: Standaryzowana indukcja i wizualizacja skrzepu pozwalają na wyjaśnienie mechanizmów PE oraz odpowiedzi biologicznej.
- Przesiewanie: Ilościowa ocena zawału umożliwia rzetelne porównanie skuteczności różnych związków.
- Analityka: Wspiera analizę statystyczną wielkości zawału i rozpuszczania skrzepu w celu podejmowania decyzji w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Zapewnia platformę do testowania interwencji biomateriałowych i farmakologicznych w kontekście istotnym dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Standaryzacja protokołu pozwala na szerokie wdrożenie w zespołach badawczych zajmujących się układem sercowo-naczyniowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad PE.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, skalowalność i porównywalność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz optymalizuje alokację zasobów dla programów terapeutycznych PE.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów PE i technologii platformowych w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii gryzoni i technik dostępu naczyniowego.
- Wymaga dostępu do infrastruktury obrazowania, perfuzji i klarowania tkanek w celu wizualizacji tętnic.
- Wymaga przestrzegania protokołu w celu standaryzacji i powtarzalności wyników między zespołami.
- Adaptacja do innych gatunków gryzoni lub przewlekłych modeli PE może być ograniczona przez szybką rozpuszczalność skrzeplin.
- Model jest zoptymalizowany pod kątem ostrego PE i może nie w pełni odzwierciedlać przebiegu przewlekłej choroby zatorowo-zakrzepowej.
Częste pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:26
Rat Autologous Blood Clot Preparation
3:19
Establishing a Rat Model of Pulmonary Embolism Using Autologous Blood Clots
5:07
Quantifying and Visualizing Infarcted Areas in the Lungs of the Pulmonary Embolism Rat Model
7:13
Results
