Tworzenie organoidów grasicy ludzkiej w trójwymiarowych hydrożelach fibrynowych
4 października 2024
Tutaj opisujemy protokół tworzenia ludzkich organoidów grasicy pochodzących z iPSC, hodowanych w hydrożelach fibrynowych 3D, mających na celu wspomaganie dojrzewania komórek nabłonka grasicy (TEC) i przedłużonego utrzymania, a także tymopoezę in vitro.
Staramy się badać mechanizmy odpowiedzialne za samotolerancję, autoimmunizację, a zwłaszcza rolę, jaką odgrywa powietrze w ekspresji antygenów własnych, jakie komórki nabłonka grasicy prezentują rozwijającym się tymocytom. Nasze badania mają zastosowanie w terapii komórkowej w kontekście chorób autoimmunologicznych, przeszczepów narządów i nowotworów. Nasz system wytwarza organoidy grasicy, które są formowane i wysiewane w sposób odtwarzający kluczowe sygnały biologiczne i mechaniczne, które są niezbędne do utrzymania i dojrzewania komórek nabłonka grasicy.
Te, które z kolei są niezbędne do wspomagania tymobiozy, mogą utrzymywać się w organizmie do sześciu tygodni. Nasze odkrycia przyczyniają się do opracowania lepszych technik produkcji limfocytów t in vitro z wieloma potencjalnymi zastosowaniami w badaniach i terapii komórkowej. Mamy nadzieję, że wraz z postępem naszych badań przyczynimy się do lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw samotolerancji i autoimmunizacji.
Obecnie koncentrujemy się na dalszym charakterystyzowaniu naszych organoidów pod względem składu i organizacji komórek, a naszym celem jest zbadanie roli, jaką odgrywa gen r w regulacji ekspresji antygenu komórkowego w grasicy i ustalenie modelu badawczego dla epizodu choroby autoimmunologicznej. Aby rozpocząć rozmrażanie trombiny i aprotyniny na lodzie, umieść fiolkę z fibrynogenem w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą pipety zhomogenizuj je pod maską.
Następnie za pomocą sterylnych szczypiec umieść wkładki w dołkach hodowlanych, pozostawiając co najmniej jedną kolumnę lub rząd pusty na płytce. Do probówki o pojemności 0,25 mililitra najpierw dodaj wymagane objętości fibrynogenu i aprotyniny. Następnie dodaj trombinę do probówki i szybko spłucz dwa razy bez tworzenia pęcherzyków.
Narysuj całą zawartość tuby. Ustaw pipetę pionowo nad środkiem wkładki i delikatnie przepłucz mieszaninę odczynników, nie wytwarzając pęcherzyków powietrza. Inkubować przez co najmniej godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu zestalenia, aż mieszanina stanie się nieprzezroczysta biała.
W przypadku rozsiewu organoidów potwierdź pod mikroskopem, że mikromasy tworzą kuliste masy komórek ze zwartym chórem otoczonym halo o niższej gęstości wczesnych przodków grasicy. Odetnij końcówkę stożka P 200 i umyj ją roztworem zapobiegającym przywieraniu. Przechyl płytkę do pozycji prawie pionowej i zassaj masy komórek z dna studzienki.
Delikatnie nałóż masę na wierzch hydrożeli, nie dotykając żelu. Sprawdź pod mikroskopem, czy w dołkach płytkowych nie pozostał organoid. Następnie powoli dodaj jedną czwartą objętości pożywki hodowlanej na górze hydrożelu, nie dotykając go, i dodaj pozostałe 3/4 s na dnie dołka.
Dodaj jeden mililitr PBS do pustych studzienek hodowlanych, aby utrzymać wilgotność na płytce i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Organoidy tworzą kuliste lub podłużne struktury i czasami łączą się, tworząc większe struktury w hydrożelach.
Przegląd
W niniejszym badaniu przedstawiono protokół tworzenia organoidów grasicy pochodzących z ludzkich iPSC w trójwymiarowych hydrożelach fibrynowych. Celem jest wsparcie dojrzewania komórek nabłonkowych grasicy i ułatwienie tymopoezy in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Immunologia
Wstęp
- Zrozumienie autotolerancji i autoimmunizacji jest kluczowe dla postępów w terapii.
- Komórki nabłonka grasicy odgrywają kluczową rolę w prezentacji autoantygenów rozwijającym się tymocytom.
- Organoidy grasicy mogą na potrzeby badawcze naśladować środowisko grasicy.
- Obecne metody produkcji limfocytów T in vitro wymagają udoskonalenia.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego systemu produkcji organoidów grasicy.
- Zbadanie mechanizmów autotolerancji i autoimmunizacji.
- Zbadanie roli genu r w regulacji ekspresji antygenów w grasicy.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie hydrożeli fibrynowych do hodowli organoidów.
- Wysiew komórek progenitorowych grasicy do hydrożeli.
- Inkubacja w kontrolowanych warunkach w celu promowania formowania organoidów.
- Analiza mikroskopowa w celu potwierdzenia rozwoju organoidów.
Główne wyniki
- Organoidy grasiczowe utrzymywane do sześciu tygodni wykazały integralność strukturalną.
- Organoidy utworzyły struktury od sferycznych do wydłużonych, co wskazuje na pomyślną maturację.
- Wyniki badań przyczyniają się do opracowania lepszych technik produkcji limfocytów T.
- Charakteryzacja organoidów dostarczyła wiedzy na temat składu komórkowego.
Wnioski
- Opracowany protokół pogłębia zrozumienie biologii grasicy.
- Organoidy grasicy stanowią cenny instrument do badania autoimmunizacji.
- Przyszłe badania skupią się na dalszej charakterystyce funkcjonalności organoidów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rekonstrukcja ludzkiego mikrośrodowiska grasicy in vitro rozwiązuje krytyczny problem w modelowaniu rozwoju limfocytów T i autotolerancji w badaniach nad odkrywaniem leków w immunologii. System 3D organoidów grasicy oparty na hydrożelu fibrynowym umożliwia skalowalne i funkcjonalne odtworzenie biologii komórek nabłonkowych grasicy (TEC), co zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach nad wczesną immunomodulacją i terapią komórkową. Platforma ta usprawnia strategie portfelowe ukierunkowane na autoimmunologię, tolerancję transplantacyjną i inżynierię limfocytów T, dostarczając fizjologicznie istotny i powtarzalny model do mechanistycznej minimalizacji ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów autotolerancji i prezentacji antygenu w kontrolowanym systemie istotnym dla organizmu człowieka.
- Wspiera funkcjonalną walidację szlaków selekcji i dojrzewania limfocytów T sterowanych przez TEC.
- Ułatwia mechanistyczną ocenę ryzyka dla celów terapeutycznych zaangażowanych w autoimmunizację i tolerancję immunologiczną.
- Zapewnia platformę do badania funkcji genów w biologii grasicy w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia powtarzalny i skalowalny system hodowli 3D dla kokultury TEC i tymocytów.
- Dostarcza ilościowych wyników dotyczących formowania organoidów, składu komórkowego i generowania limfocytów T.
- Umożliwia standaryzację testów różnicowania komórek odpornościowych na potrzeby przesiewu związków chemicznych lub genetycznego.
- Wspiera późniejszą ocenę czynników immunomodulujących w kontekście istotnym fizjologicznie.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodne z modelowaniem autoimmunizacji i tolerancji przeszczepienia w kontekście chorobowym.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkrywania do przedklinicznej walidacji interwencji immunologicznych.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów do terapii komórkowej i immunomodulacyjnej.
- Wspiera translacyjną eksplorację biomarkerów w systemach organoidów pochodzenia ludzkiego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten trójwymiarowy (3D) model organoidu grasicy wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć po badania przedkliniczne, łącząc wczesne studia mechanistyczne z translacyjnymi badaniami nad układem odpornościowym.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących autotolerancji, prezentacji antygenów oraz funkcji TEC.
- Przesiewanie: Zapewnia standaryzowany, skalowalny system analizy różnicowania i funkcji komórek odpornościowych.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę struktury organoidów, składu komórkowego i liczby uzyskanych limfocytów T.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane in vitro z modulacją odporności w kontekście chorób oraz strategiami biomarkerowymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych programów badawczych nad układem odpornościowym oraz rozwoju terapii komórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów immunologicznych oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w hodowlach 3D.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w ramach portfolio immunomodulacji i terapii komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację zasobów medycyny immunologicznej i regeneracyjnej z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie różnicowania komórek macierzystych, hodowli 3D oraz biologii komórek odpornościowych.
- Niezbędny jest dostęp do specjalistycznej infrastruktury hodowli komórkowych i mikroskopii analitycznej.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Możliwa jest konieczność adaptacji metody dla różnych źródeł dawców lub modeli chorobowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują rzadkość występowania TEC oraz ich wrażliwość na sygnały mikrośrodowiskowe.
