Osadzony biodruk struktur tkankopodobnych przy użyciu submikrożelowej pożywki κ-karagenowej
3 maja 2024
To badanie wprowadza nowatorską sub-mikrożelową kąpiel zawiesinową κ-karagenową, wykazującą niezwykłe właściwości odwracalnego przejścia między zakleszczeniem a odblokowaniem. Atrybuty te przyczyniają się do budowy biomimetycznych tkanek i narządów w osadzonym biodruku 3D. Udane drukowanie tkanek przypominających serce/przełyk o wysokiej rozdzielczości i wzroście komórek świadczy o wysokiej jakości biodruku i zastosowaniach inżynierii tkankowej.
Biodruk 3D w kąpieli zawiesinowej na bazie mikrożelu zapewnił wszechstronną platformę do wytwarzania złożonych struktur 3D przy użyciu miękkich hydrożeli, ale nadal jest ograniczony przez niską rozdzielczość i dokładność druku, co utrudnia praktyczne zastosowania drukowanych produktów w inżynierii tkankowej. Obecne kąpiele mikrożelowe często charakteryzują się dużymi rozmiarami i słabą dyspersją, co skutkuje dużą średnicą i nieregularną morfologią drukowanych włókien. W związku z tym stanowi to duże wyzwanie w przygotowaniu kąpieli mikrożelowej o małym rozmiarze cząstek i jednolitej morfologii.
Protokół ten oferuje wytwarzanie jednorodnej i biokompatybilnej kationowej, usieciowanej sub-mikrożelowej kąpieli kappa-karagenowej w celu uzyskania wysokiej jakości biodruku dzięki łatwej w obsłudze strategii mielenia mechanicznego. Ponieważ submikrożele kappa-karagenu wykazują jednolitą metodologię z małym rozmiarem cząstek wynoszącym 565 nanometrów i niskim stanem zarodkowym wynoszącym 0,35%, co umożliwia precyzyjną budowę tkanek i narządów z niezwykłą wiernością i wysoką rozdzielczością. Zacznij od dodania 1,75 grama proszku kappa-karagenu do 500 mililitrów PBS w szklanej butelce o pojemności 1000 mililitrów.
Aby przygotować kąpiel w zawiesinie kappa-karagenu, wprowadź do szklanej butelki mieszadło magnetyczne o średnicy 70 milimetrów. Dokręć szklaną nakrętkę butelki, a następnie poluzuj ją o pół obrotu. Podgrzej szklaną butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza.
Następnie włącz mieszadło magnetyczne przy 300 obr./min. Umieść butelkę i mieszaj, aż polimer całkowicie się rozpuści. Używając filtra 0,22 mikrometra, przefiltruj całkowicie rozpuszczony roztwór kappa-karagenu do wysterylizowanej szklanej butelki.
Roztwór kappa-karagenu należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu wywołania żelowania usieciowanego kationem przez 12 godzin. Następnie za pomocą 60-milimetrowego mieszadła magnetycznego zmiel mechanicznie hydrożele kappa-karagenowe, aż pomyślnie przekształcą się w stan ciekły. Aby rozpocząć, włącz sterownik pompy mikrowytłaczania.
Wybierz odpowiednią strzykawkę objętościową i ustaw szybkość wytłaczania na 0,08 mililitra na minutę. Następnie podziel objętość hydrożelu przez szybkość wytłaczania i skoordynuj ją z żądanym czasem drukowania, aby obliczyć czas wytłaczania. Następnie umieścić strzykawkę z igłą o średnicy wewnętrznej 210 mikrometrów w szczelinie strzykawki w biodrukarce.
Wyregulować kontroler strzykawki tak, aby upewnić się, że tłok strzykawki jest w bliskim kontakcie ze śrubą. Następnie umieść trzy mililitry przygotowanej kąpieli zawiesinowej kappa-karagenu w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli komórek. Na podstawie ustawień kodu umieść antenę na platformie i upewnij się, że głowica drukująca znajduje się jeden milimetr nad dnem naczynia.
Następnie włóż kartę SD zawierającą kod do biodrukarki 3D. Aktywuj plik z kodem, uruchom bio-drukarkę i kliknij przycisk Start na kontrolerze. Następnie wystaw wydrukowaną konstrukcję na działanie niebieskiego światła o długości 405 nanometrów przez minutę, aby zainicjować sieciowanie zdjęć.
Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra usuń żel kappa-karagen, a następnie dodaj trzy mililitry PBS do przemycia, a następnie usunięcia. Na początek weź hodowane komórki mięśni gładkich przełyku, gdy osiągną 80% zbieżności. Odessać pożywkę i umyć komórki mięśni gładkich śródbłonka pięcioma mililitrami PBS.
Następnie dodaj dwa mililitry 0,2% trypsyny EDTA do kolby i inkubuj przez dwie minuty, aby strawić komórki. Dodaj dwa mililitry DMEM, aby zakończyć proces trawienia i przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Wirować probówkę o temperaturze 675G przez trzy minuty.
Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w kompozytowych atramentach żelatynowych, metakrylanowych i fibroinowych włókien jedwabiu. Po biodruku i umyciu warstwy mięśni przełyku 3D za pomocą PBS, ostrożnie odessaj PBS i zastąp go trzema mililitrami DMEM uzupełnionymi 10% FBS i 1% penicyliną lub streptomycyną.
Przegląd
Niniejsze badanie wprowadza nowatorską kąpiel w zawiesinie submikrożeli κ-karagenanu, która wykazuje niezwykłe właściwości odwracalnego przejścia między stanem zablokowanym a rozblokowanym (jamming-unjamming transition). Cechy te usprawniają konstrukcję biomimetycznych tkanek i organów w osadzanym biodruku 3D, wykazując wysokiej jakości zastosowania w inżynierii tkankowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biodruk 3D
- Inżynieria tkankowa
- Biomateriały
Wstęp
- Kąpiele zawiesinowe na bazie mikrogeli są wykorzystywane do wytwarzania złożonych struktur 3D.
- Obecne kąpiele mikrogelowe borykają się z problemami niskiej rozdzielczości i dokładności druku.
- Duże rozmiary oraz słaba dyspersja mikrogeli utrudniają praktyczne zastosowania.
- Istnieje zapotrzebowanie na kąpiel mikrogelową o małej wielkości cząstek i jednolitym morfologii.
Cel badania
- Przygotowanie homogenicznej i biokompatybilnej kąpieli submikrożelu κ-karagenanu.
- Osiągnięcie wysokiej wierności biodruku poprzez zastosowanie strategii mechanicznego rozcierania.
- Umożliwienie precyzyjnej konstrukcji tkanek i organów z wysoką rozdzielczością.
Zastosowane metody
- Przygotowanie proszku κ-karagenanu w PBS.
- Mielenie mechaniczne w celu uzyskania małej wielkości cząsteczek.
- Ocena rozdzielczości i wierności druku.
- Ocena wzrostu komórek w wydrukowanych tkankach.
Główne wyniki
- Submikrożele κ-karagenianu wykazują jednorodną wielkość cząstek wynoszącą 565 nanometrów.
- Wykazano pomyślny druk tkanek przypominających tkankę serca i przełyku.
- W wydrukowanych strukturach zaobserwowano wysoką rozdzielczość oraz wzrost komórek.
- Odnotowano odwracalne właściwości przejścia jamming-unjamming.
Wnioski
- Kąpiel z sub-mikrożeli κ-karagenanu jest skuteczna w wysokiej jakości biodruku.
- Rozwiązuje ona problemy związane z przygotowaniem kąpieli z mikrożeli.
- Podejście to może znacząco posunąć naprzód zastosowania w inżynierii tkankowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprecyzyjne zatopione biodrukowanie 3D z wykorzystaniem kąpieli submikrożelowych z κ-karagenianu rozwiązuje krytyczny problem w inżynierii tkankowej, umożliwiając precyzyjne i powtarzalne wytwarzanie złożonych struktur przypominających tkanki. Innowacja ta zwiększa pewność predykcyjną w rozwoju wczesnych etapów konstruktów tkankowych i wspiera solidne przepływy translacyjne dla modelowanych tkanek i organów. Podejście to jest strategicznie ukierunkowane na usprawnienie przejść z fazy odkryć do badań przedklinicznych poprzez poprawę jakości konstruktów oraz ich relewantności biologicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie oddziaływań komórka-macierz w kontrolowanych środowiskach 3D.
- Wspiera walidację funkcjonalną biotuszów specyficznych dla tkanek oraz typów komórek.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie powtarzalnych konstrukcji o wysokiej rozdzielczości.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zestandaryzowane, biomimetyczne rusztowania tkankowe do późniejszego przesiewania związków.
- Zapewnia powtarzalne i ilościowe wyniki dzięki jednolitej wielkości cząsteczek mikrożelu.
- Umożliwia tworzenie skalowalnych platform analitycznych poprzez wsparcie dla wielowarstwowych konstrukcji o zdefiniowanej architekturze.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie zaprojektowanych konstruktów do architektury tkanek istotnych dla danej choroby w badaniach translacyjnych.
- Zapewnia wysoką żywotność i proliferację komórek, wspierając opracowywanie modeli przedklinicznych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki możliwości usunięcia medium wspierającego po wydruku.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ta metoda wykorzystująca submikrożele κ-karagenianu integruje cały proces od wczesnego odkrycia, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po badania przedkliniczne, wspierając rozwój modeli tkankowych opartych na hipotezach oraz przygotowanie testów analitycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie tworzenia precyzyjnych konstrukcji tkankowych 3D.
- Screening: Zapewnia powtarzalne rusztowania o wysokiej rozdzielczości do niezawodnej oceny związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów dotyczących żywotności, morfologii i proliferacji komórek w obrębie inżynieryjnych tkanek.
- Badania translacyjne: Ułatwia dostosowanie do modeli tkankowych istotnych dla danej jednostki chorobowej w badaniach przedklinicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje zestandaryzowaną, skalowalną platformę do wielokrotnego zastosowania w wielu programach B&R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w opracowywaniu modeli tkankowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność procesów biodruku 3D.
- Wartość strategiczna: Podnosi jakość decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez redukcję ryzyka biologicznego na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację i rozwój programów inżynierii tkankowej z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie biodruku 3D i formulacji hydrożeli.
- Wymagany jest dostęp do biodrukarek ekstruzyjnych oraz aparatury do kontroli wielkości cząstek.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności wytwarzania konstruktów.
- Metoda jest dostosowalna do różnych typów komórek i biotuszów, przy uwzględnieniu ich kompatybilności.
- W celu uzyskania optymalnych wyników należy zachować jednorodność wielkości cząstek oraz właściwości przejścia żel-sol.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:23
Preparation of the κ-Carrageenan Sub‐Microgel Suspension Bath for Embedded 3D Printing
2:25
Printing Biomimetic Hydrogel Scaffolds Using a Custom‐Designed Micro‐Extrusion Bioprinter
3:50
Embedded 3D Bioprinting of Esophageal Muscle‐Layer Analogs for Tissue Engineering
