Śmierć makrofagów THP-1 różnicowanych przez PMA i ATP indukowana przez LPS i ATP i jej walidacja

Zajmujemy się wprowadzoną przez LPS i ATP śmiercią makrofagów THP-1 zróżnicowanych pod kątem PMA. Zgony wprowadzone przez LPS i ATP nie ograniczają się do pyroptozy, ale może również wystąpić apoptoza i nekroptoza. Pozwoli to lepiej zrozumieć śmierć komórki po stymulacji LPS i ATP oraz wybrać bardziej odpowiednie metody eksperymentalne.

Technologia chromowa bada głównie struktury zewnętrzne w tkankach, komórkach i mikroorganizmach. Chrome dostarcza neonatywnych danych strukturalnych dla różnych kompleksów biomolekularnych. Na przykład użycie technik Chrome do przeprowadzenia rekonstrukcji 3D może pomóc nam lepiej zrozumieć charakterystykę części piroptotycznych i nekroptotycznych.

Chociaż pyroptoza jest uważana za dominującą w LPS i śmierci komórki wprowadzonej przez ATP, nie można określić rozprzestrzeniania się tych form śmierci ani czy one istnieją. Walidacja różnorodnej śmierci komórek i jej pomiar będą naszym obszarem badań w przyszłości. Na początek uzyskaj zróżnicowane komórki THP-1 i usuń zużytą pożywkę z dołków płytki hodowlanej.

Po umyciu komórek PBS, dodać do komórek pożywkę bez surowicy zawierającą lipopolisacharyd lub LPS i inkubować płytkę. Następnie dodać trifosforan adenozyny lub roztwór podstawowy ATP do grupy modelowej i inkubować płytkę przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie odessaj cały supernatant z dołków płytki hodowlanej.

Po dwukrotnym umyciu komórek PBS, dodaj 500 mikrolitrów 0,05% trypsyny bez EDTA do każdej studzienki i inkubuj przez 30 sekund. Aby zatrzymać odrywanie komórek, dodaj jeden mililitr pożywki RPMI 164O i przenieś komórki do pięciomililitrowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Po ponownym zawieszeniu komórek w jednym mililitrowym PBS, umieść probówkę z komórkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy minuty i odwiruj. Aby ponownie zawiesić komórki, dodaj 100 mikrolitrów buforu wiążącego 1X i przenieś komórki do nowej pięciomililitrowej probówki. Inkubować probówki kontrolne i modelowe z odpowiednimi odczynnikami w ciemności w temperaturze pokojowej.

Aby zakończyć inkubację, dodaj 400 mikrolitrów PBS do probówki i delikatnie ją przemieszaj. Przefiltruj zawiesinę komórek w nylonowej siatce o grubości 35 mikrometrów, przymocowanej do pięciomililitrowej rurki z okrągłym dnem z polistyrenu. Zanurz czystą szklankę nakrywkową w roztworze ałunu chromowego na dwie godziny i wysusz w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Osadzaj trypsynizowane komórki, jak pokazano wcześniej, i utrwalaj komórki za pomocą 500 mikrolitrów utrwalacza mikroskopu elektronowego przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przez noc inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zebraniu komórek z roztworu utrwalonego, osadzać je w 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 mikrolitrów PBS i delikatnie zdmuchnij komórki.

Zawiesinę komórkową należy upuścić na szkło nakrywkowe i odstawić na pięć minut. Odessać cały supernatant i przemyć komórki trzykrotnie PBS przez pięć minut każda. Dodaj 500 mikrolitrów 1% roztworu utrwalającego kwas osmiczny.

Po godzinie odessać cały supernatant. Po trzech płukaniach PBS odwodnić próbki w rosnących stężeniach etanolu. Włączyć osuszacz punktu krytycznego.

Otwórz zbiornik na dwutlenek węgla i schłodzić komorę do 10 stopni Celsjusza. Szybko owiń próbkę bibułą filtracyjną i włóż ją do komory, gdy ciśnienie w komorze wynosi zero funtów na cal kwadratowy. Gdy temperatura ustabilizuje się do 35 stopni Celsjusza, a ciśnienie osiągnie 1,250 funtów na cal kwadratowy, rozhermetyzuj do 100 funtów na cal kwadratowy na minutę.

Pobrać próbkę, gdy ciśnienie w komorze wynosi zero. Na koniec, za pomocą taśmy przewodzącej, zamontuj próbki na aluminiowych uchwytach na próbki skaningowego mikroskopu elektronowego. Za pomocą napylarki przykryj próbki warstwą złota o grubości od dwóch do pięciu nanometrów.

Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że po stymulacji LPS/ATP komórki w regionie QT znacznie wzrosły, co wskazuje na śmierć komórki. Skaningowe mikrofotografie elektronowe powierzchni błony plazmatycznej wykazały cechy piroptozy, w tym pęcherzenie błony i pęknięcie w komórkach stymulowanych LPS / ATP, podczas gdy komórki kontrolne wyglądały normalnie. Dodatkowo stymulacja LPS/ATP doprowadziła do pojawienia się cech apoptozy w komórkach, takich jak pęcherzenie błony i kurczenie się komórek, a także zaobserwowano komórki z cechami nekroptozy, w tym obrzękiem komórek i pękniętą błoną.