Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości
October 4th, 2024
Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.
Nasze badania koncentrują się na skrzyżowaniu metabolizmu i reakcji na stres w chorobach metabolicznych, co jest głównym tematem programu NORC Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Dzięki synergii między naszymi rdzeniami NORC jesteśmy w stanie stawić czoła złożonym kwestiom związanym z metabolizmem żywieniowym i chorobami poprzez interdyscyplinarne i oparte na współpracy podejście. Tradycyjne testy oddychania mitochondrialnego badały izolowane mitochondria.
Izolowanie mitochondriów jest czasochłonne i może zagrozić integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej. Ponadto mitochondria nie działają samodzielnie, ale są częścią dynamicznej sieci komórkowej adaptacji metabolicznej. Nasz protokół utrzymuje tę sieć, aby zapewnić fizjologicznie istotną ocenę funkcji mitochondriów.
Skupiliśmy się na identyfikacji regulatorów dopasowania metabolicznego, które są ważne dla zdrowia i choroby. Kluczowe pytania, które zadajemy, to: Czy te regulatory, takie jak proteaza z miejsca 1, są równie ważne w różnych typach tkanek? I jakie jest ich znaczenie fizjologiczne?
Aby rozpocząć, włącz respirometrię o wysokiej rozdzielczości i system próżniowy. Usuń korki. A następnie, za pomocą systemu próżniowego, usuń 70% roztwór do przechowywania etanolu.
Napełnij komorę ultraczystą wodą molekularną. Po ostatnim myciu dodaj do każdej komory 2 mililitry MiRO5 bez kreatyny i bróbstatyny. Otwórz oprogramowanie do respirometrii.
W wyskakującym okienku ustaw prędkość mieszania w komorze na 750 obr./min, temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a interwał zapisu danych na dwie sekundy. Ustaw wzmocnienie na 1, a napięcie polaryzacji na 800 miliwoltów dla czujników tlenu. Kliknij przycisk Connect to Oxygraph (Połącz z Oxygraph), aby nawiązać komunikację z urządzeniem.
W wyświetlonym oknie dialogowym nazwij i zapisz plik eksperymentalny z bieżącymi danymi i kalibracją. Rejestruj stężenie tlenu przez co najmniej 30 minut, aby komory mogły się rozgrzać i zarejestrować sygnały do kalibracji powietrza. Pod koniec kalibracji przytrzymaj Shift i lewy przycisk myszy, a następnie przeciągnij przez region na osi czasu, aby zaznaczyć obszar o stabilnym stężeniu tlenu.
Przejdź do oksygrafu, a następnie kalibracji tlenu. Aby skalibrować powietrze, wybierz znacznik stabilnego stężenia tlenu i kliknij przycisk Kalibruj i kopiuj do schowka. Zatrzymaj rejestrację kalibracji powietrza i zapisz plik.
Po kalibracji systemu respirometrycznego należy wymienić MiRO5 z każdej komory na świeże 2,1 mililitra roztworu MiRO5. W oprogramowaniu do respirometrii wprowadź ustawienia przyrządu. Ustaw nazwę pliku i zapisz ustawienia.
W następnym oknie dialogowym wprowadź informacje o próbce, w tym wagę każdej próbki dodanej do każdej komory. Teraz otwórz okno kalibracji tlenu. Kliknij przycisk Kopiuj z pliku i wybierz zapisany plik kalibracji powietrza.
Następnie kliknij przycisk Kalibruj i kopiuj do schowka. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie przenieś wiązki włókien mięśniowych wcześniej wyizolowane od myszy do roztworu oddechowego. Umieść korki na komorze i wepchnij je mniej więcej do połowy na dno, aby częściowo zamknąć komorę.
Gdy O-ringi na korkach zatrzasną się ze ścianą komory, użyj ruchu skręcającego, naciskając w dół, aby zamknąć. Gdy komora jest zamknięta do połowy, w górnej części komory obserwuje się mały pęcherzyk powietrza. Napełnij 10-mililitrową plastikową strzykawkę czystym tlenem ze zbiornika tlenu.
Umieść długą, igłę na strzykawce, a następnie włóż igłę do pierwszej komory i powoli dostarcz około 1 mililitra tlenu. Monitoruj stężenie tlenu w komorze. Gdy stężenie osiągnie od 350 do 400 nanomoli na mililitr, delikatnie przekręć korek, jednocześnie dociskając, aby całkowicie zamknąć komorę.
Obserwuj komorę i upewnij się, że nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza. Aby znormalizować dane dotyczące strumienia tlenu do masywnej tkanki z menu układu, wybierz układ 6 Strumień właściwy na jednostkę próbki. Upewnij się, że stężenie tlenu i strumień tlenu ustabilizowały się po dodaniu tlenu, aby rozpocząć pomiar oddychania.
Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów dodaj 2,5 mikrolitra 0,8 molowego jabłczanu do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznacz znak M.Record stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. W przypadku glikolitu tlenowego dodaj 10 mikrolitrów 2 molowego glutaminianu i 5 mikrolitrów 2 molowego pirogronianu do każdej komory.
Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznaczyć znak GP. Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Dodaj 10 mikrolitrów 2 molowych glutaminianu i 10 mikrolitrów 10 milimolowych palmitoilo-karnityny do każdej komory dla substratów kwasów tłuszczowych. Naciśnij F4, aby oznaczyć oś czasu i oznaczyć znacznik za pomocą GPC.
Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 25 mikrolitrów dodaj 20 mikrolitrów 0,5 molowego ADP do każdej komory. Naciśnij F4, aby oznaczyć oś czasu i oznaczyć znacznik za pomocą ADP.
Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Teraz dodaj 20 mikrolitrów 1 molowego bursztynianu do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznacz znak S.Nagrywaj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut.
Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów dodaj 5 mikrolitrów 4-milimolowego cytochromu c do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznaczyć znak cytochromem c. Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut.
Miareczkować w trzech 1-mikrolitrowych bolusach 1-milimolowego FCCP za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów. Dodanie FCCP powoduje krótkotrwały spadek poziomu strumienia tlenu. Przed nagrywaniem poczekaj, aż strumień tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.
Naciśnij F4, aby oznaczyć oś czasu i oznaczenie etykiety za pomocą FCCP. Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Po zakończeniu testu delikatnie przekręć i pociągnij korek do góry, aby go wyjąć.
Przepłucz komorę trzykrotnie ultraczystą wodą, a następnie trzykrotnie 70% etanolem. Umieść korki w komorach, aż poczujesz opór, ale nie zamykaj ich całkowicie. Następnie zakręć korki.
Zapisz plik testowy i odłącz przyrząd od oprogramowania. Na koniec wyłącz respirometr. W prawidłowo przygotowanych próbkach lustrzanych dodatek cytochromu c po ADP nie wpływał na strumień tlenu, potwierdzając integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej.
Jednakże, gdy próbki tkanek nie zostały odpowiednio przygotowane, dodanie cytochromu c po ADP doprowadziło do 40% wzrostu strumienia tlenu, co wskazuje na uszkodzenie zewnętrznej błony mitochondrialnej.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia kompleksowy protokół pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, permeabilizowanych włóknach mięśni szkieletowych pochodzących od ludzi lub modeli mysich. Metoda ta umożliwia pomiar rzeczywisty wskaźników oddychania mitochondrialnego, preferencji paliw i elastyczności metabolicznej, zachowując jednocześnie sieci mitochondrialne i integralność błony.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Choroba metaboliczna
- Funkcja mitochondria
- Metabolity i reakcje na stres
Tło
- Obecne metody często izolujące mitochondria ryzykują integralność błony.
- Mitochondria funkcjonują w dynamicznej sieci komórkowej.
- Zrozumienie oddychania mitochondrialnego jest kluczowe dla rozwiązywania chorób metabolicznych.
Stosowane metody
- Wysokorozdzielcze respirometria
- Włókna mięśni szkieletowych od ludzi i myszy
- Pomiar rzeczywisty strumienia tlenu dla różnych substratów
Główne wyniki
- Dostarczyło fizjologicznie istotnej oceny funkcji mitochondrialnej.
- Wykazało zdolność do oceny elastyczności metabolicznej.
- Zidentyfikowało rolę regulatorów metabolicznych w różnych typach tkanek.
Wnioski
- Metoda poprawia zrozumienie metabolizmu mitochondrialnego w zdrowiu i chorobie.
- Wspiera badania nad chorobami metabolicznymi i mechanizmami adaptacji do stresu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution respirometry in permeabilized skeletal muscle fibers enables precise, physiologically relevant measurement of mitochondrial oxidative phosphorylation, a critical determinant of cellular energy metabolism. This approach supports early discovery and target validation for metabolic disease portfolios by providing robust, quantitative insights into mitochondrial function and metabolic flexibility. Integrating these measurements enhances predictive confidence at key inflection points in metabolic and muscle health R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial bioenergetics and metabolic adaptation in disease-relevant muscle tissue.
- Supports biological de-risking by preserving mitochondrial networks and membrane integrity during functional assessment.
- Facilitates functional target validation for regulators of metabolic tailoring across tissue types.
- Provides quantitative data to inform predictive confidence and portfolio triage in metabolic disease research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated muscle fiber systems for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Delivers standardized, reproducible oxygen consumption measurements for assay development.
- Enables assessment of substrate-specific respiration, supporting screening for metabolic modulators.
- Supports scalability and platform reuse across human and rodent models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial function measurements with disease-relevant endpoints in metabolic and muscular disorders.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical validation by using physiologically intact muscle fibers.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in metabolic and muscle health programs.
- Enhances predictive de-risking by quantifying metabolic flexibility and fuel preference in relevant models.
Pipeline & Workflow Integration
This high-resolution respirometry protocol bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling robust mitochondrial function assessment in both human and mouse muscle fibers.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for metabolic adaptation and mitochondrial regulation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative oxygen flux outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Delivers real-time, substrate-specific respiration data to compare metabolic conditions and interventions.
- Translational Research: Maintains physiological relevance for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, cross-species platform for repeated use in metabolic and muscle health research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial and metabolic research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mitochondrial function assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust functional data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic and muscle health programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in muscle fiber isolation and high-resolution respirometry operation.
- Demands access to specialized instrumentation and analytical software for oxygen flux measurement.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data normalization protocols.
- Adaptable to both human and rodent muscle fibers, supporting translational research needs.
- Proper sample preparation is critical to maintain mitochondrial membrane integrity and data validity.
