Name: Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę respirometrii o wysokiej rozdzielczości do pomiaru oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy. Technika zachowuje integralność błon mitochondriów i umożliwia ocenę elastyczności metabolicznej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Nutrition Obesity Research Center, NIH grant P30 DK056341 i NIH grant K01 HL145326.

Wszystkie procedury z użyciem myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Waszyngtońskiego. W eksperymentach tych można wykorzystać myszy każdej płci, w każdym wieku i o dowolnej masie ciała, w zależności od charakteru pytania badawczego. Myszy wykorzystane w niniejszej procedurze to dorosłe (w wieku 12–16 tygodni) samce myszy typu dzikiego szczepu C57BL/6. Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Recenzencką (Institutional Review Board) Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Uczestnicy badania wyrazili zgodę na wykorzystanie danych, a reprezentatywne dane dotyczące ludzi zawarte w niniejszym protokole pochodzą z opublikowanego badania.14Dane pochodzą od kobiet w okresie pomenopauzalnym (w wieku 55–75 lat) bez cukrzycy. Szczegółowe informacje dotyczące przygotowania odczynników niezbędnych do przeprowadzenia analizy przedstawiono w Tabela 1Informacje dotyczące konkretnych odczynników, narzędzi i urządzeń wykorzystanych w analizie wymieniono w Tabela materiałówSchematyczny przegląd protokołu przedstawiono w Rysunek 1.
<img alt="Przygotowanie odczynników, konfiguracja analizy, analiza oddychania z wykorzystaniem aparatury, analiza danych; schemat naukowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat wysokorozdzielczej respirometrii na próbkach permeabilizowanych mięśni szkieletowych. Metoda szczegółowo opisana w niniejszym opracowaniu podzielona jest na 6 etapów: 1) przygotowanie buforów do oddychania i odczynników, 2) przygotowanie aparatury i odczynników w dniu analizy, 3) przygotowanie i permeabilizacja próbek mięśni, 4) przygotowanie próbki i urządzenia, 5) przeprowadzenie analizy oddychania oraz 6) analiza danych. Stworzono za pomocą BioRender.com <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
1. Przygotowanie analizy i kalibracja urządzenia
<ol>
	<li>W dniu przeprowadzenia analizy wyjąć wymaganą liczbę alikwotów każdego związku oddechowego (blebbistatyna, palmitoylo karnityna, glutaminian, jabłczan, ADP, bursztynian, cytochrom C, FCCP) i rozmrozić je na lodzie. Rozmrozić fiolki z BIOPS i MiR05 na lodzie.</li>
	<li>Przygotować roztwory saponiny i pirogronianu zgodnie z treścią Tabeli 1. Przygotować roztwór roboczy MiR05 zgodnie z Tabelą 1. Przygotować 5 mL roztworu roboczego MiR05 na każdy przyrząd (2 komory). Zwiększyć objętość w razie potrzeby.</li>
	<li>Włączyć system respirometrii wysokiej rozdzielczości oraz system próżniowy. Zdjąć korki, usunąć roztwór konserwujący z 70% etanolu za pomocą próżni i ponownie napełnić komorę ultrapure wodą H2O klasy molekularnej. Usunąć H2O próżniowo i ponownie napełnić. Powtórzyć czynność łącznie 3 razy. Po ostatnim płukaniu dodać do każdej komory 2 mL MiR05 (bez kreatyny lub blebbistatyny).</li>
	<li>Otworzyć oprogramowanie respirometryczne. Po uruchomieniu oprogramowania pojawi się okno wyskakujące z ustawieniami instrumentu. Ustawić prędkość mieszania w komorze na 750 rpm, temperaturę na 37 °C oraz interwał rejestracji danych na 2 s. Ustawić wzmocnienie (gain) na 1 i napięcie polaryzacji na 800 mV dla czujników tlenu. Kliknąć Connect to Oxygraph, aby nawiązać komunikację z instrumentem.</li>
	<li>Po nawiązaniu komunikacji otworzy się okno dialogowe umożliwiające nazwanie i zapisanie pliku eksperymentalnego. Zapisać plik z bieżącą datą i dopiskiem o kalibracji. Po zapisaniu pliku pojawi się okno dialogowe z detalami eksperymentu. Dla pomiaru kalibracyjnego żadne informacje nie są wymagane i można zamknąć to okno.</li>
	<li>Rejestrować stężenie tlenu przez co najmniej 30 min, aby umożliwić rozgrzanie się komór i zarejestrowanie sygnałów do kalibracji powietrznej. Można to robić podczas przygotowywania włókien mięśniowych, zgodnie z opisem w kroku 2 poniżej.</li>
	<li>Pod koniec okresu kalibracji zaznaczyć obszar kalibracji w miejscu, w którym stężenie tlenu (niebieska linia) jest stabilne. Aby to zrobić, przytrzymać klawisz Shift oraz lewy przycisk myszy i przeciągnąć kursor po wybranym obszarze na osi czasu.</li>
	<li>Otworzyć okno kalibracji, przechodząc do Oxygraph &gt; O2 Calibration. Dla kalibracji powietrznej (Air Calibration) wybrać znacznik utworzony w kroku 1.8. Kliknąć Calibrate and Copy to Clipboard.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 1.6-1.8 dla pozostałej komory. Kalibrację powietrzną przeprowadzać codziennie. Zatrzymać rejestrację kalibracji powietrznej i zapisać plik, rozłączając się z instrumentem. Po przygotowaniu próbek przejść do kroku 3 w celu przeprowadzenia analizy.</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie i permeabilizacja włókien mięśni szkieletowych
<ol>
	<li>Izolacja tkanki mysiej
	<ol>
		<li>Dla każdej próbki przeznaczonej do analizy, napełnij jeden dołek 12-dołkowej płytki hodowlanej 1 mL BIOPS. Umieść płytkę na lodzie w celu schłodzenia.</li>
		<li>Po uśmierceniu myszy poprzez inhalację dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie stawów szyjnych, pobierz interesujący badacza mięsień szkieletowy, upewniając się, że usunięto całą tkankę łączną i tłuszczową (Rysunek 2A). Umieść mięsień w jednym z dołków zawierających BIOPS. Przechowuj na lodzie do czasu przygotowania włókien. 
		UWAGA: Zgodnie z niniejszym protokołem można badać dowolny mięsień szkieletowy – typ badanego mięśnia zależy od pytania badawczego, na które szukamy odpowiedzi. W przypadku mięśni szkieletowych o mieszanym typie włókien, takich jak mięsień brzuchaty łydki, możliwe jest rozdzielenie tkanki na sekcje białe i czerwone, aby zmierzyć włókna głównie szybkokurczliwe (sekcje białe) i głównie wolnokurczliwe (sekcje czerwone) (Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja tkanki ludzkiej
	<ol>
		<li>Pobierz tkankę zgodnie z protokołem klinicznym14. Szybko opłucz tkankę zimnym, sterylnym PBS i umieść ją w probówce stożkowej zawierającej 2 mL roztworu BIOPS. Przechowuj tkankę na lodzie do czasu przygotowania włókien.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie włókien
	<ol>
		<li>Permeabilizacja zostanie przeprowadzona w 6-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Dodaj 2 mL roztworu BIOPS do jednego zestawu dołków i 2 mL MiR05 do drugiego zestawu dołków. Jeden zestaw dołków będzie wymagany dla każdej analizowanej próbki.</li>
		<li>Wypełnij tackę lodem i umieść na nim szklaną szalkę Petriego dnem do góry. Pamiętaj, aby mięsień zawsze znajdował się na lodzie.</li>
		<li>Przenieś pobrane próbki mięśni na schłodzoną platformę z szalką Petriego za pomocą pęsety. Używając dwóch pęset z cienkimi końcówkami oraz mikroskopu sekcyjnego z źródłem światła, delikatnie oczyść tkankę, usuwając wszelkie ścięgna, powięzi i tkankę tłuszczową przylegającą do mięśnia.</li>
		<li>Po usunięciu wszystkich zbędnych tkanek pozamięśniowych, delikatnie rozdziel włókna mięśniowe pęsetą z cienkimi końcówkami, aż powstaną małe pęczki półprzezroczystych włókien o długości od 0,75 - 1,0 mm (Rysunek 2C-D). Po rozdzieleniu włókien, za pomocą pęsety przenieś pęczki włókien do dołka na płytce 6-dołkowej zawierającego roztwór BIOPS na lodzie.</li>
		<li>Dodaj 20 µL roztworu saponiny o stężeniu 5 mg/mL do każdego dołka z BIOPS i inkubuj płytkę na lodzie, delikatnie kołysząc w pomieszczeniu chłodniczym przez 20 min.</li>
		<li>Po traktowaniu saponiną przenieś włókna mięśniowe do dołka zawierającego MiR05 w celu opłukania przed analizą. Inkubuj na lodzie, delikatnie kołysząc w pomieszczeniu chłodniczym przez 15 min.</li>
		<li>Po zakończeniu inkubacji włókien w MiR05, zbierz włókna ostrą pęsetą i delikatnie osusz je na chłonnym ręczniku papierowym. Wyzeruj plastikową probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL na wadze analitycznej i umieść w probówce 2-3 mg włókien. Zapisz końcową masę włókien na boku każdej probówki. Umieść probówkę na lodzie. Powtórz czynność dla pozostałych próbek. Natychmiast przejdź do kroku 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Proces kiełkowania nasion; schematy etapów rozwoju nasion, mikroskopia, analiza histologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Separacja włókien mięśni szkieletowych myszy. (A) Makroskopowa morfologia mięśnia brzuchatego myszy po pobraniu. (B) Disekcja mięśnia brzuchatego na segmenty czerwony (lewy) i biały (prawy). (C) Mechanicznie odseparowane włókna mięśniowe. (D) Obraz przy powiększeniu 10x przedstawiający pomyślnie odseparowane włókna mięśniowe. Pasek skali wynosi 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Przygotowywanie próbek mięśni w respirometrze
<ol>
	<li>Odssać za pomocą próżni roztwór MiR05 użyty do kalibracji urządzenia, zgodnie z opisem w kroku 1 powyżej, a następnie dodać 2,1 ml roboczego roztworu MiR05 do każdej komory.</li>
	<li>Utwórz nowy plik dla eksperymentu, stosując te same ustawienia instrumentu, które opisano w kroku 1.5. powyżej. Określ nazwę pliku i ustawienia zapisu.</li>
	<li>Po ustawieniu nazwy pliku wyświetli się kolejne okno dialogowe służące do wprowadzenia szczegółów eksperymentu. Należy wpisać informacje o próbkach oraz masę każdej próbki dodanej do poszczególnych komór. Następnie należy zamknąć okno dialogowe.</li>
	<li>Po przejściu do nowego pliku eksperymentalnego należy przeprowadzić kalibrację, otwierając okno O2 Calibration. Kliknij Kopiuj z pliku i wybierz plik zapisany w kroku 1.9. powyżej. Kliknij Kalibruj i kopiuj do schowka przycisk. Powtórz proces dla pozostałej komory.</li>
	<li>Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie przenieś pęczki włókien mięśniowych do roztworu oddechowego przeznaczonego dla odpowiedniej komory. Powtórz czynność dla pozostałej komory.</li>
	<li>Umieść zatyczki w komorze i ostrożnie przymknij komorę, dociskając zatyczki mniej więcej do połowy ich wysokości. Gdy uszczelki typu o-ring na zatyczkach zetkną się ze ścianką komory i pojawi się opór, dociśnij je, wykonując jednocześnie ruch obrotowy, aby zamknąć komorę. Gdy komora zostanie zamknięta do połowy, na jej górnej części można zauważyć niewielki pęcherzyk powietrza. 
	UWAGA: Włókna przepuszczalne podlegają ograniczeniom dyfuzji tlenu w standardowych warunkach oddychania. Aby ominąć to ograniczenie, badanie prowadzone jest przy podwyższonych stężeniach tlenu.11.</li>
	<li>Napełnić plastikową strzykawkę o pojemności 10 ml czystym tlenem z butli tlenowej. Na strzykawkę nałożyć długą, tępą igłę dołączoną do instrumentu. Wprowadzić igłę do pierwszej komory i powoli podać do niej około 1 ml tlenu.</li>
	<li>Monitoruj stężenie tlenu w komorze w oprogramowaniu do respirometrii. Gdy stężenie tlenu w komorze osiągnie poziom 350-400 nmol/mL, delikatnie przekręć korek, jednocześnie dociskając go, aby całkowicie zamknąć komorę. Zajrzyj do komory i upewnij się, że nie pozostały w niej pęcherzyki powietrza. Jeśli obecny jest pęcherzyk powietrza, ostrożnie i szybko otwórz komorę, dodaj 100 µL dodatkowej ilości roztworu roboczego MiR05, a następnie szybko ponownie zamknąć komorę. Powtórzyć czynność dla pozostałych komór.</li>
	<li>Podczas analizy należy utrzymywać stężenie tlenu powyżej 250 nmol/mL. W razie potrzeby należy uzupełnić tlen, częściowo otwierając komorę, wprowadzając dodatkową ilość tlenu strzykawką do pęcherzyka powietrznego, a następnie ostrożnie zamykając komorę.</li>
	<li>Znormalizuj dane dotyczące strumienia tlenu do masy tkanki wykorzystanej w eksperymencie. Aby dostosować wykresy, zmień układ tak, aby odzwierciedlał O2 Strumień (pmol O22 / (s x mg)). Z menu układu (layout menu) wybierz 06 - Układ specyficznego strumienia na jednostkę próbkiDane zostaną teraz przedstawione w formie znormalizowanej do ilości tkanki w każdej komorze.</li>
</ol>
4. Respirometria wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Gdy stężenie tlenu (niebieska linia) i strumień O2 (czerwona linia) ustabilizują się po dodaniu tlenu, rozpocznij protokół oddychania. Tlen można uznać za stabilny, gdy niebieska linia jest płaska lub powoli opada. Strumień O2 również powinien być płaski i mieścić się w zakresie 5 pmol O2 / s x mg.</li>
	<li>Wszystkie odczynniki dodawaj za pomocą szklanych strzykawek. Ważne jest, aby nie używać tej samej strzykawki do substratów, inhibitorów i odsprzęgaczy. Dla każdego z nich przygotuj osobną strzykawkę. Po dodaniu każdego związku rejestruj strumień tlenu przez 1-2 min po ustabilizowaniu się tempa oddychania, zanim dodasz kolejny odczynnik.</li>
	<li>Pomiar oddychania
	<ol>
		<li>Za pomocą szklanej strzykawki 10 µL dodaj 2,5 µL 0,8 M jabłczanu do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i opisz znacznik literą M. Rejestruj stabilny strumień O2 przez 1-2 min.</li>
		<li>Dodaj odczynniki specyficzne dla składnika odżywczego zgodnie z poniższym opisem.
		<ol>
			<li>Glikoliza tlenowa: Za pomocą szklanej strzykawki 10 µL dodaj 10 µL 2 M glutaminianu i 5 µL 2 M pirogronianu do każdej komory. Naciśnij F4 , aby zaznaczyć oś czasu i opisz znacznik jako G P. Rejestruj stabilny strumień O2 przez 1-2 min.</li>
			<li>Kwasy tłuszczowe: Za pomocą szklanej strzykawki 10 µL dodaj 10 µL 2 M glutaminianu i 10 µL 10 mM palmitylo-karnityny do każdej komory. Naciśnij F4 , aby zaznaczyć oś czasu i opisz znacznik jako G PC. Rejestruj stabilny strumień O2 przez 1-2 min.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Za pomocą szklanej strzykawki 25 µL dodaj 20 µL 0,5 M ADP (z MgCl2) do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i opisz znacznik jako ADP. Rejestruj stabilny strumień O2 przez 1-2 min.</li>
		<li>Za pomocą szklanej strzykawki 25 µL dodaj 20 µL 1 M bursztynianu do każdej komory. Naciśnij F4 , aby zaznaczyć oś czasu i opisz znacznik literą S. Rejestruj stabilny strumień O2 przez 1-2 min.</li>
		<li>Za pomocą szklanej strzykawki 10 µL dodaj 5 µL 4 mM cytochromu C do każdej komory. Naciśnij F4 , aby zaznaczyć oś czasu i opisz znacznik jako Cyt C. Rejestruj stabilny strumień O2 przez 1-2 min.</li>
		<li>Tytruj trzy bolusy po 1 µL 1 mM FCCP za pomocą szklanej strzykawki 10 µL. Przy dodawaniu FCCP zazwyczaj występuje efekt mieszania, który skutkuje krótkotrwałym spadkiem poziomu strumienia O2. Odczekaj, aż strumień O2 wzrośnie i się ustabilizuje przed przejściem do następnego kroku. Po każdym dodaniu naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i opisz znacznik jako FCCP. Rejestruj stabilny strumień O2 przez 1 min po każdym dodaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu pomiaru oddychania ostrożnie wyjmij korki, przekręcając i wyciągając je do góry. Przepłucz komory 3x ultra czystą wodą H2O z butelki z atomizerem, a następnie 3x 70% etanolem z butelki z atomizerem. Po ostatnim płukaniu etanolem napełnij komory 70% etanolem w celu przechowywania.</li>
	<li>Osadź korki w komorach aż do poczucia oporu. Nie domykaj korków całkowicie. Nałóż nasadki na korki, zapisz plik z pomiarem i odłącz urządzenie od oprogramowania Respirometry. Wyłącz urządzenie.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz plik analizy w oprogramowaniu do respirometrii. Wyodrębnij dane z obszarów stabilnego przepływu tlenu uzyskanych po wstrzyknięciu związków oddechowych.</li>
	<li>Aby zaznaczyć interesujące obszary, przytrzymaj klawisz Shift, kliknij lewy przycisk myszy i przeciągnij ramkę przez obszar stabilnej szybkości przepływu O2 dla etapów analizy opisanych poniżej.</li>
	<li>Etapy analizy14,15,16,17,18,19,20
	<ol>
		<li>Zaznacz oś czasu po dodaniu malonianu/glutaminianu/pirogronianu (protokół glikolityczny tlenowy) lub malonianu/glutaminianu/palmitoylo-karnityny (protokół kwasów tłuszczowych). Szybkość ta reprezentuje szybkość oddychania stanu 2 Kompleksu I (LEAK(n)).</li>
		<li>Zaznacz oś czasu po dodaniu ADP. Szybkość ta reprezentuje szybkość oddychania stanu 3 Kompleksu I (CI OXPHOS).</li>
		<li>Zaznacz oś czasu po dodaniu bursztynianu. Szybkość ta reprezentuje szybkość oddychania stanu 3 Kompleksów I+II (CI+II OXPHOS).</li>
		<li>Zaznacz oś czasu po dodaniu cytochromu C. Szybkość ta reprezentuje szybkość oddychania stanu 3 Kompleksów I+II+cytochrom (CI+II+Cyt C OXPHOS).</li>
		<li>Zaznacz na osi czasu miareczkowanie FCCP z najwyższą szybkością przepływu O2. Szybkość ta reprezentuje maksymalną szybkość oddychania (MAX ETS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobierz wartości danych dla zaznaczonych obszarów na osi czasu, wybierając Mark &gt; Statistics. Skopiuj szybkość przepływu O2 (pmol O2/(s x mg)) dla zaznaczonej komory do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Powtórz zaznaczanie i wyodrębnianie danych dla pozostałych komór.</li>
	<li>Oblicz wskaźnik kontroli oddechowej (RCR), dzieląc szybkość stanu 3 Kompleksów I+II (po dodaniu bursztynianu) przez szybkość stanu 2 Kompleksu I (przed dodaniem ADP).</li>
</ol>

Real-Time Quantification of Mitochondrial Respiration in Muscle Fibers

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zapewnia kompleksowy i prosty protokół szablonowy do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych zarówno dla próbek ludzkich, jak i mysich. Istnieje kilka zalet stosowania włókien przepuszczalnych zamiast izolowanych mitochondriów. Jedną z kluczowych zalet jest to, że zastosowanie przepuszczalnych włókien wymaga niewielkich (2-5 mg) ilości tkanki, dzięki czemu metoda ta jest odpowiednia zarówno dla próbek biopsji mięśni ludzkich, jak i mięśni myszy. Kolejną zaletą w stosunku do izolowanych mitochondriów jest to, że architektura komórkowa pozostaje nienaruszona, zapewniając zachowanie strukturalnych i funkcjonalnych interakcji między mitochondriami a komponentami komórkowymi 12,21,22,23.
Zastosowanie pirogronianu, jabłczanu i glutaminianu w naszym tlenowym protokole glikolitycznym zapewnia kompleksową, szeroką ocenę dostarczania NADH do kompleksu I 24,25,26,27,28. Chociaż to kompleksowe podejście zapewnia ocenę aktywności kompleksu I w holistycznych i fizjologicznie istotnych warunkach metabolicznych, zastosowanie jabłczanu pirogronianu lub jabłczanu glutaminianu może być bardziej odpowiednim podejściem eksperymentalnym. Na przykład stosowanie jabłczanu glutaminianu może uwypuklić różnice w funkcji mitochondriów związane z katabolizmem aminokwasów29. Zachęcamy badaczy do starannego rozważenia odpowiedniego podejścia do ich konkretnego modelu badawczego.
Chociaż protokół ten koncentruje się na wykorzystaniu substratów do oceny aktywności mitochondriów, zastosowanie specyficznych inhibitorów może być konieczne do osiągnięcia celów eksperymentalnych. Na przykład rotenon może być stosowany do hamowania kompleksu I 12,21,30, oligomycyny do hamowania kompleksu V (syntazy ATP)12,21, a antymycyny A do blokowania kompleksu III12,21 w celu oceny oddychania niemitochondrialnego. Przedstawiony powyżej protokół można łatwo dostosować do stosowania określonych inhibitorów. Warto zauważyć, że jednym z zastrzeżeń dotyczących stosowania inhibitorów jest to, że związki te są lepkie i wymagają intensywnego czyszczenia w celu usunięcia z komory instrumentu. Stwierdzamy, że użycie roztworu 10% BSA przez 60 minut jest wystarczające do usunięcia resztkowych inhibitorów.
Oddychanie nieszczelne odnosi się do szybkości zużycia tlenu, która jest niezależna od syntezy ATP. Szybkość ta reprezentuje przepływ protonów z powrotem do macierzy mitochondrialnej przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Istnieją trzy akceptowane metody oceny zużycia tlenu niezależnie od syntezy ATP (LEAK). Pierwsza, LEAK(n), mierzy szybkość zużycia tlenu w obecności substratów, ale bez dodatku adenylanów (ADP lub ATP)31,32,33. Ten stan LEAK reprezentuje wewnętrzną nieszczelność błony mitochondrialnej. Druga metoda, LEAK(t), jest mierzona w obecności ATP34, a trzecia, LEAK(o), jest mierzona w obecności inhibitora syntazy ATP oligomycyny 35,36,37. Protokół ten wykorzystuje LEAK(n) do tej oceny, ale w zależności od celów i modeli eksperymentalnych, inne metody pomiaru strumienia tlenu LEAK mogą być odpowiednie.
W tym teście MiR05 jest uzupełniany zarówno kreatyną (3 mg/ml), jak i blebbistatyną (10 μM). Mitochondrialny transport ADP jest ułatwiony przez kinazę kreatynową (CK), a kreatyna jest dodawana do roztworu oddechowego w celu nasycenia aktywności CK38,39. Włókna mięśniowe mogą spontanicznie się kurczyć i są również wrażliwe na skurcz wywołany przez ADP. Aby ocenić aktywność oddechową mitochondriów bez wpływu skurczu, dodano blebbistatynę, aby zahamować aktywność skurczową włókien38. Ponadto badania nad ludzkimi mięśniami sugerują, że metoda biopsji może mieć wpływ na wydolność oddechową (mikrobiopsja kontra igła Bergstroma) i że różnica ta może wynikać z różnic w uzyskanej długości włókien40,41. Krótsze włókna mogą być bardziej podatne na uszkodzenia podczas przygotowywania, a stosowanie blibstatyny pomaga zachować funkcję. Mogą istnieć pewne warunki, w których relaksacja błonnika nie pasuje do celów badawczych i w takim przypadku blebbistatyna może zostać wykluczona z roztworu MiR05.
Przepuszczalność włókien mięśni szkieletowych saponiną generuje pory w błonie plazmatycznej, co pozwala substratom i inhibitorom swobodnie wnikać do komórki. Saponina ma wysokie powinowactwo do cholesterolu, który jest bogaty i obfity w błony komórkowe plazmatyczne, podczas gdy błony mitochondrialne są ubogie w cholesterol42,43. Oczekuje się, że leczenie saponinami zastosowanymi do przygotowania błonnika w tym protokole zachowa integralność błony mitochondrialnej. Do uszkodzenia mitochondriów może również dojść z powodu sił ścinających, które wynikają z mechanicznego rozdzielenia tkanki na włókna. Sugerujemy, aby rozdzielanie tkanek na wiązki włókien odbywało się szybko i przy minimalnej obsłudze. Aby ocenić potencjalne uszkodzenie mitochondriów, włączyliśmy miareczkowanie cytochromu C do protokołu oddychania. Cytochrom C nie może przejść przez nienaruszoną zewnętrzną błonę mitochondrialną12, dlatego każdy wzrost strumieniaO2 po dodaniu cytochromu C wskazuje, że podczas procesu przygotowania próbki doszło do uszkodzenia zewnętrznej błony mitochondrialnej. W jednym z naszych ostatnich badań stwierdziliśmy, że strumieńO2 wzrósł o 8%15 po dodaniu cytochromu C, potwierdzając, że użycie saponin sugerowane w tym protokole nie powoduje uszkodzenia mitochondriów. Sugerujemy, że każda próbka wykazująca większy niż 15% wzrost strumieniaO2 po dodaniu cytochromu C powinna zostać wyłączona z analizy44. Ten etap jest uwzględniany wyłącznie jako środek kontroli jakości, a nie jako ocena aktywności kompleksu dożylnego.
Podczas gdy respirometria o wysokiej rozdzielczości doskonale sprawdza się w zapewnianiu bardzo czułych i wiarygodnych pomiarów zużycia tlenu, znaczącym ograniczeniem oprzyrządowania jest to, że tylko dwie próbki mogą być mierzone jednocześnie na urządzenie. Wymaga to starannego rozważenia przy projektowaniu badań obejmujących kohorty z wieloma próbami. Chociaż może istnieć pokusa, aby przeprowadzać pomiary na różnych zestawach próbek w ciągu dnia, zdecydowanie zalecamy badaczom rozważenie wpływu rytmu okołodobowego na metabolizm. Badania nad mięśniami szkieletowymi zarówno ludzi, jak i gryzoni wykazały wpływ zegara biologicznego na funkcję mitochondriów45,46. W związku z tym zalecamy przeprowadzanie pomiarów przez kilka dni o tej samej porze dnia, aby uwzględnić te wahania okołodobowe.
Wreszcie, aby zapewnić powtarzalne i solidne pomiary respirometryczne, respirometr musi być regularnie czyszczony, konserwowany i kalibrowany. Kalibracja powietrza, zgodnie z opisem w protokole, powinna być przeprowadzana codziennie. Zalecamy użytkownikom przeprowadzanie pełnej comiesięcznej kalibracji (zarówno powietrznej, jak i zerowej) polarograficznych czujników tlenu. Użytkownicy powinni zapoznać się z dokumentacją producenta i webstrona w celu uzyskania dalszych informacji na temat tej metody kalibracji oraz instrukcji dotyczących rutynowej konserwacji przyrządu.
Respirometria o wysokiej rozdzielczości pozostaje złotym standardem w pomiarze oddychania mitochondrialnego. Metoda opisana w tym protokole ułatwia rzetelną ocenę pojemności mitochondriów zarówno w mięśniach szkieletowych gryzoni, jak i ludzkich. Protokół ten został zastosowany w badaniach oceniających funkcję mitochondriów związaną z genetycznymi modelami myszy15,16, w kontekście przewlekłej choroby nerek19, po podaniu suplementu diety14,20 i ćwiczeniach17,18.

Mitochondria są kamieniem węgielnym produkcji energii komórkowej, co czyni je niezbędnymi do utrzymania optymalnej homeostazy komórkowej i organizmu. Te organelle o podwójnej membranie są przede wszystkim odpowiedzialne za fosforylację oksydacyjną. Proces ten skutecznie przekształca składniki odżywcze, takie jak cukry i kwasy tłuszczowe, w adenozynotrójfosforan (ATP), komórkową walutę energii. Poza rolą w metabolizmie energetycznym, mitochondria są również kluczowymi regulatorami różnych procesów komórkowych, w tym apoptozy, homeostazy wapnia i reaktywnych form tlenu (ROS)1,2. Ze względu na ich kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy komórkowej i organizmu, zakłócenia funkcji mitochondriów często mają szkodliwy wpływ na zdrowie tkanek i organizmów. W mięśniach szkieletowych dysfunkcja mitochondriów jest związana z licznymi stanami chorobowymi, w tym zaburzeniami metabolicznymi (np. otyłością, cukrzycą i chorobami układu krążenia), sarkopenią i dystrofią mięśniową3,4,5,6,7,8.
Dysfunkcja mitochondriów może objawiać się przede wszystkim zmienioną zawartością, liczbą i morfologią mitochondriów, a także zaburzonym metabolizmem. W związku z tym osiągnięcie kompleksowego zrozumienia dysfunkcji mitochondriów wymaga integracyjnego i holistycznego podejścia. Wstępne badania charakteryzacyjne obejmują badanie poziomów ekspresji kompleksów białek łańcucha oddechowego jako odczyt zawartości mitochondriów, ilościowe określenie mitochondrialnego DNA i markerów biogenezy jako miary biogenezy mitochondriów oraz zaawansowane obrazowanie mikroskopem elektronowym w celu oceny morfologii mitochondriów9,10. Dodatkowe oceny funkcji mitochondriów obejmują ocenę produkcji komórkowych ROS i ATP oraz potencjału błony mitochondrialnej9.
Ponieważ mitochondria są niezbędne do produkcji energii komórkowej i homeostazy, cechą charakterystyczną oceny funkcji mitochondriów jest pomiar mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS). Respirometria przepuszczalnych włókien mięśniowych o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zmian w czasie rzeczywistym w tempie zużycia tlenu w mitochondriach jako odczyt dynamicznych zmian aktywności mitochondrialnego łańcucha oddechowego OXPHOS9,11,12. Zastosowanie selektywnych modulatorów i inhibitorów chemicznych pozwala na bezpośredni i sekwencyjny pomiar aktywności różnych kompleksów oddechowych. Chociaż izolowane mitochondria mogą być wykorzystywane w respirometrii, użycie świeżych, przepuszczalnych włókien mięśniowych utrzymuje endogenne sieci mitochondrialne i integralność błony - umożliwiając w ten sposób bardziej fizjologicznie istotne pomiary. Dodatkowo, ponieważ różne typy włókien mięśniowych mają różne preferencje dotyczące podłoża i tempa oddychania, system ten pozwala mierzyć zmiany w preferencjach paliwowych i elastyczności metabolicznej w oparciu o typ włókna13.
Tutaj opisujemy kompleksowy protokół pomiarów mitochondrialnych OXPHOS przy użyciu ludzkich lub mysich włókien mięśni szkieletowych w systemie respirometrycznym o wysokiej rozdzielczości. Uwzględniono metody ilościowego oznaczania mitochondrialnego oddychania tlenowego we włóknach oksydacyjnych lub glikolitycznych przy użyciu pirogronianu lub palmitoilo-karnityny jako substratu. Protokół ten pozwala na użycie innych substratów paliwowych w celu rozwiązania określonych problemów metabolicznych związanych z defektami w wykorzystaniu substratu i preferencjami paliwowymi.

<table><tbody><tr><td>10 &mikro; L Strzykawka Hamilton (szklana strzykawka)</td><td>ThermoFisher</td><td>14-813-125</td><td>Do miareczkowania do testu oddechowego</td></tr><tr><td>25 &mikro; L Strzykawka Hamilton (szklana strzykawka)</td> <td>ThermoFisher</td><td>14-813-133</td><td>Do miareczkowania do pomiaru oddechu</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Merck</td><td>117105</td><td>Test respirometryczny</td></tr><tr><td>Naczynie do spreparowania z czarnego szkła</td><td>Scintica</td><td>DD-90-S-BLK</td><td>Do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>Blebbistatyna</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td>Roboczy roztwór MiR05</td></tr><tr><td>BSA, bez kwasów tłuszczowych</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td>MiR05</td></tr><tr><td>Roztwór Węglan wapnia</td><td>Sigma</td><td>C4830</td><td>BIOPS Roztwór</td></tr><tr><td>Kreatyna</td><td>Sigma</td><td>27900</td><td>Działający roztwór MiR05</td></tr><tr><td>Cytochrom C</td><td>Sigma</td><td>C7752</td><td>Test respirometryczny</td></tr><tr><td>DatLab</td><td>Oroboros Instruments</td><td>N/A</td><td>Oprogramowanie do respirometrii</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>Rozwiązanie BIOPS</td></tr><tr><td>D-Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>MiR05 Rozwiązanie</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>BIOPS & Roztwór MiR05</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Test respirometryczny</td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma</td><td>G1626</td><td>Test respirometryczny</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7523</td><td>MiR05 Roztwór</td></tr><tr><td>Imidazol&nbsp;</td><td>Rozwiązanie Sigma</td><td>56750</td><td>BIOPS</td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5379</td><td>MiR05 Roztwór</td></tr><tr><td>Kwas laktobionowy</td><td>Sigma</td><td>153516</td><td>MiR05</td></tr><tr><td>Roztwór Jabłczan</td><td>Sigma</td><td>M1000</td><td>Test respirometryczny</td></tr><tr><td>Hydrat MES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>BIOPS Roztwór</td></tr><tr><td>MgCl2 - 6 H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>BIOPS & MiR05 Roztwór</td></tr><tr><td>System Oroboros Oxygraph-2K (O2K)</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10203-03</td><td>Respirometr o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Palmitoilo-karnityna</td><td>Sigma</td><td>P4509</td><td>Test respirometryczny</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma</td><td>P1767</td><td>Roztwór BIOPS</td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta</td><td>Fisher</td><td>17-467-168</td><td>Do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>S2149</td><td>Do przepuszczalności włókien</td></tr><tr><td>Sód ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td>Roztwór BIOPS</td></tr><tr><td>Fosfokreatyna sodu</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>BIOPS Roztwór</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Test respirometryczny</td></tr><tr><td>Bursztynian</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Test respirometryczny</td></tr><tr><td>Tauryna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td>BIOPS & Rozwiązanie MiR05</td></tr></tbody></table>

pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Measurement of Mitochondrial Respiration in Human and Mouse Skeletal Muscle Fibers by High-Resolution Respirometry

Funkcja mitochondriów, kamień węgielny produkcji energii komórkowej, jest kluczowa dla utrzymania homeostazy metabolicznej. Jego dysfunkcja w mięśniach szkieletowych jest związana z powszechnymi zaburzeniami metabolicznymi (np. cukrzycą i otyłością), dystrofiami mięśniowymi i sarkopenią. Chociaż istnieje wiele technik oceny zawartości i morfologii mitochondriów, charakterystyczną metodą oceny funkcji mitochondriów jest pomiar mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) za pomocą respirometrii. Kwantyfikacja mitochondriów OXPHOS dostarcza informacji na temat efektywności mitochondrialnej produkcji energii oksydacyjnej i bioenergetyki komórkowej. Respirometr o wysokiej rozdzielczości zapewnia bardzo czułe, solidne pomiary mitochondrialnego OXPHOS w przepuszczalnych włóknach mięśniowych, mierząc w czasie rzeczywistym zmiany w tempie zużycia tlenu w mitochondriach. Zastosowanie przepuszczalnych włókien mięśniowych, w przeciwieństwie do izolowanych mitochondriów, zachowuje sieci mitochondrialne, utrzymuje integralność błony mitochondrialnej i ostatecznie pozwala na bardziej fizjologicznie istotne pomiary. System ten pozwala również na pomiar preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej - dynamicznych aspektów metabolizmu energetycznego mięśni. W tym miejscu przedstawiamy obszerny przewodnik po mitochondrialnych pomiarach OXPHOS we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy przy użyciu respirometru o wysokiej rozdzielczości. Grupy mięśni szkieletowych składają się z różnych rodzajów włókien, które różnią się preferencjami paliwowymi mitochondriów i bioenergetyką. Za pomocą respirometru o wysokiej rozdzielczości opisujemy metody oceny zarówno tlenowych substratów glikolitycznych, jak i kwasów tłuszczowych w celu oceny preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej w sposób zależny od rodzaju włókna. Protokół jest wszechstronny i ma zastosowanie zarówno do włókien mięśniowych ludzi, jak i gryzoni. Celem jest zwiększenie odtwarzalności i dokładności ocen funkcji mitochondriów, co poprawi naszą wiedzę na temat organelli ważnych dla zdrowia mięśni.

Rysunek 3 i Rysunek 4 przedstawiają odpowiednio wykresy zużycia tlenu dla protokołów respirometrii glikolitycznej tlenowej oraz respirometrii kwasów tłuszczowych dla prawidłowo przygotowanych włókien czerwonych i białych mięśnia brzuchłego myszy. Przedstawiono również reprezentatywne wyniki ilościowe dla odniesienia. Rysunek 5 przedstawia wykres zużycia tlenu w respirometrii glikolitycznej tlenowej w prawidłowo przygotowanych próbkach biopsji mięśni ludzkich. Przedstawiono również reprezentatywne wyniki ilościowe. Należy zauważyć, że w przypadku Rysunku 3, Rysunku 4 i Rysunku 5 dodanie cytochromu C po dodaniu ADP nie wpływa na przepływ tlenu, co wskazuje, że zewnętrzna błona mitochondrialna próbki jest nienaruszona. Rysunek 6 przedstawia wykres zużycia tlenu w respirometrii glikolitycznej tlenowej, w której dodanie cytochromu C po ADP powoduje gwałtowny wzrost (o 40%) przepływu tlenu, co wskazuje na uszkodzenie zewnętrznej błony mitochondrialnej, w związku z czym próbka nie powinna być użyta do respirometrii – potencjalnymi przyczynami takiego wyniku mogą być niewłaściwa obsługa lub zamrażanie/rozmrażanie tkanki, zbyt długotrwała permeabilizacja tkanki oraz nieużycie świeżo wyizolowanej tkanki.
<img alt="Wykres i histogram oddychania mitochondrialnego przedstawiające strumień O2 w czerwonych i białych mięśniach brzuchatym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig03v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zużycie tlenu u myszy. Wyniki pokazują zużycie tlenu w (A) czerwonych i (B) białych mięśniach brzuchatym z zastosowaniem protokołu pirogronianowego. Strumień stanu 2 po dodaniu malonianu, glutaminianu i pirogronianu (cień niebieski, CI LEAK). Znaczną stymulację zużycia O2 obserwuje się po podaniu ADP (cień zielony, CI OXPHOS), a oddychanie jest dalej napędzane po dodaniu bursztynianu (cień fioletowy, CI+II OXPHOS). Cytochrom C nie wywołał znaczącego wzrostu (&lt;15%), co wskazuje na nienaruszoną zewnętrzną błonę mitochondrialną (cień pomarańczowy, CI+II+Cyt C OXPHOS). Mitochondria zostają rozsprzęzone po dodaniu FCCP (cień żółty, MAX ETS). Linia niebieska reprezentuje stężenie tlenu w zamkniętej komorze. Linia czerwona reprezentuje tempo zużycia tlenu (strumień O2). Dodane związki: malonian (m), glutaminian (g), pirogronian (p), adenozylodyfosforan (ADP), cytochrom C (cyt c), cyjano-karbonyl cyjanek p-trifluorometoksyfenylohydrazona (FCCP). (C) Histogram odzwierciedla reprezentatywne wyniki (n=8). Dane przedstawiono jako ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig03largev2.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres analizy oddychania mitochondrialnego porównujący przepływ O2 w czerwonych i białych włóknach mięśnia brzuchatego w poszczególnych etapach OXPHOS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Zużycie tlenu u myszy. Wyniki przedstawiają zużycie tlenu w (A) czerwonych i (B) białych włóknach mięśnia brzuchatego z zastosowaniem protokołu palmitoilokarnitynowego. Przepływ w stanie 2 po dodaniu malonianu, glutaminianu i palmitoilokarnityny (odcień niebieski, CI LEAK). Znaczną stymulację zużycia O2 obserwuje się po podaniu ADP (odcień zielony, CI OXPHOS), a oddychanie jest dalej napędzane po dodaniu bursztynianu (odcień fioletowy, CI+II OXPHOS). Cytochrom C nie wywołał znaczącego wzrostu (&lt;15%), co wskazuje na nienaruszoną zewnętrzną błonę mitochondrialną (odcień pomarańczowy, CI+II+Cyt C OXPHOS). Mitochondria zostają odsprzężone po dodaniu FCCP (odcień żółty, MAX ETS). Linia niebieska reprezentuje stężenie tlenu w zamkniętej komorze. Linia czerwona reprezentuje tempo zużycia tlenu (przepływ O2). Dodane związki: malonian (m), glutaminian (g), palmitoilokarnityna (pc), adenozynodifosforan (ADP), cytochrom C (cyt c), karbonylowy cyjanek-p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP). (C) Wykres słupkowy przedstawia reprezentatywne wyniki (n=7). Dane przedstawiono jako ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres i słupkowy wykres analizy przepływu tlenu, przedstawiające etapy oddychania mitochondrialnego i tempo przepływu O2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki zużycia tlenu w ludzkim mięśniu obszernym bocznym z zastosowaniem protokołu z pirogronianem. (A) Przepływ w stanie 2 po dodaniu jabłczanu, glutaminianu i pirogronianu (odcień niebieski, CI LEAK). Znaczną stymulację zużycia O2 obserwuje się po podaniu ADP (odcień zielony, CI OXPHOS), a oddychanie jest dalej stymulowane po dodaniu bursztynianu (odcień fioletowy, CI+II OXPHOS). Cytochrom C nie wywołał znaczącego wzrostu (&lt;15%), co wskazuje na nienaruszoną zewnętrzną błonę mitochondrialną (odcień pomarańczowy, CI+II+Cyt C OXPHOS). Mitochondria zostają rozsprzężone po dodaniu FCCP (odcień żółty, MAX ETS). Niebieska linia reprezentuje stężenie tlenu w zamkniętej komorze. Czerwona linia reprezentuje tempo zużycia tlenu (przepływ O2). Dodane związki: jabłczan (m), glutaminian (g), pirogronian (p), difosforan adenozyny (ADP), cytochrom C (cyt c), karbonylo cyjanid-p-trifluorometoksyfenylohydrazona (FCCP). (B) Wykres słupkowy przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane z biopsji mięśnia obszernego bocznego (n = 24). Dane przedstawiono jako ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig05largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres stężenia i strumienia tlenu pokazujący 40% wzrost podczas wyników eksperymentu z oddychaniem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66834/66834fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywny wynik wykazujący upośledzoną integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej w czerwonym mięśniu brzuchatym myszy. Strumień stanu 2 po dodaniu malonianu, glutaminianu i pirogronianu (odcień niebieski, CI LEAK). Znaczną stymulację zużycia O2 obserwuje się po podaniu ADP (odcień zielony, CI OXPHOS), a oddychanie jest dalej napędzane po dodaniu bursztynianu (odcień fioletowy, CI+II OXPHOS). Cytochrom C wywołał znaczny wzrost zużycia O2 (&gt;15%), co wskazuje na uszkodzenie zewnętrznej błony mitochondrialnej. Linia niebieska przedstawia stężenie tlenu w zamkniętej komorze. Linia czerwona przedstawia szybkość zużycia tlenu (strumień O2). Dodane związki: malonian (m), glutaminian (g), pirogronian (p), adenozynodifosforan (ADP), cytochrom C (cyt c), karbonylocyjanid-p-trifluorometoksyfenylohydrazon (FCCP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/66834fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Przygotowanie odczynników w postaci związków oddechowych i roztworów oddechowych. Przedstawiono szczegóły dotyczące przygotowania odczynników niezbędnych do analizy, w tym końcowe stężenia zapasowe oraz sposób ich przygotowania i przechowywania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66834/Reagent_Prep_7-31-24.zip" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle ...

Nasze badania koncentrują się na skrzyżowaniu metabolizmu i reakcji na stres w chorobach metabolicznych, co jest głównym tematem programu NORC Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Dzięki synergii między naszymi rdzeniami NORC jesteśmy w stanie stawić czoła złożonym kwestiom związanym z metabolizmem żywieniowym i chorobami poprzez interdyscyplinarne i oparte na współpracy podejście. Tradycyjne testy oddychania mitochondrialnego badały izolowane mitochondria.Izolowanie mitochondriów jest czasochłonne i może zagrozić integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej. Ponadto mitochondria nie działają samodzielnie, ale są częścią dynamicznej sieci komórkowej adaptacji metabolicznej. Nasz protokół utrzymuje tę sieć, aby zapewnić fizjologicznie istotną ocenę funkcji mitochondriów.Skupiliśmy się na identyfikacji regulatorów dopasowania metabolicznego, które są ważne dla zdrowia i choroby. Kluczowe pytania, które zadajemy, to: Czy te regulatory, takie jak proteaza z miejsca 1, są równie ważne w różnych typach tkanek? I jakie jest ich znaczenie fizjologiczne?Aby rozpocząć, włącz respirometrię o wysokiej rozdzielczości i system próżniowy. Usuń korki. A następnie, za pomocą systemu próżniowego, usuń 70% roztwór do przechowywania etanolu.Napełnij komorę ultraczystą wodą molekularną. Po ostatnim myciu dodaj do każdej komory 2 mililitry MiRO5 bez kreatyny i bróbstatyny. Otwórz oprogramowanie do respirometrii.W wyskakującym okienku ustaw prędkość mieszania w komorze na 750 obr./min, temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a interwał zapisu danych na dwie sekundy. Ustaw wzmocnienie na 1, a napięcie polaryzacji na 800 miliwoltów dla czujników tlenu. Kliknij przycisk Connect to Oxygraph (Połącz z Oxygraph), aby nawiązać komunikację z urządzeniem.W wyświetlonym oknie dialogowym nazwij i zapisz plik eksperymentalny z bieżącymi danymi i kalibracją. Rejestruj stężenie tlenu przez co najmniej 30 minut, aby komory mogły się rozgrzać i zarejestrować sygnały do kalibracji powietrza. Pod koniec kalibracji przytrzymaj Shift i lewy przycisk myszy, a następnie przeciągnij przez region na osi czasu, aby zaznaczyć obszar o stabilnym stężeniu tlenu.Przejdź do oksygrafu, a następnie kalibracji tlenu. Aby skalibrować powietrze, wybierz znacznik stabilnego stężenia tlenu i kliknij przycisk Kalibruj i kopiuj do schowka. Zatrzymaj rejestrację kalibracji powietrza i zapisz plik.Po kalibracji systemu respirometrycznego należy wymienić MiRO5 z każdej komory na świeże 2,1 mililitra roztworu MiRO5. W oprogramowaniu do respirometrii wprowadź ustawienia przyrządu. Ustaw nazwę pliku i zapisz ustawienia.W następnym oknie dialogowym wprowadź informacje o próbce, w tym wagę każdej próbki dodanej do każdej komory. Teraz otwórz okno kalibracji tlenu. Kliknij przycisk Kopiuj z pliku i wybierz zapisany plik kalibracji powietrza.Następnie kliknij przycisk Kalibruj i kopiuj do schowka. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie przenieś wiązki włókien mięśniowych wcześniej wyizolowane od myszy do roztworu oddechowego. Umieść korki na komorze i wepchnij je mniej więcej do połowy na dno, aby częściowo zamknąć komorę.Gdy O-ringi na korkach zatrzasną się ze ścianą komory, użyj ruchu skręcającego, naciskając w dół, aby zamknąć. Gdy komora jest zamknięta do połowy, w górnej części komory obserwuje się mały pęcherzyk powietrza. Napełnij 10-mililitrową plastikową strzykawkę czystym tlenem ze zbiornika tlenu.Umieść długą, igłę na strzykawce, a następnie włóż igłę do pierwszej komory i powoli dostarcz około 1 mililitra tlenu. Monitoruj stężenie tlenu w komorze. Gdy stężenie osiągnie od 350 do 400 nanomoli na mililitr, delikatnie przekręć korek, jednocześnie dociskając, aby całkowicie zamknąć komorę.Obserwuj komorę i upewnij się, że nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza. Aby znormalizować dane dotyczące strumienia tlenu do masywnej tkanki z menu układu, wybierz układ 6 Strumień właściwy na jednostkę próbki. Upewnij się, że stężenie tlenu i strumień tlenu ustabilizowały się po dodaniu tlenu, aby rozpocząć pomiar oddychania.Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów dodaj 2,5 mikrolitra 0,8 molowego jabłczanu do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznacz znak M.Record stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. W przypadku glikolitu tlenowego dodaj 10 mikrolitrów 2 molowego glutaminianu i 5 mikrolitrów 2 molowego pirogronianu do każdej komory.Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznaczyć znak GP. Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Dodaj 10 mikrolitrów 2 molowych glutaminianu i 10 mikrolitrów 10 milimolowych palmitoilo-karnityny do każdej komory dla substratów kwasów tłuszczowych. Naciśnij F4, aby oznaczyć oś czasu i oznaczyć znacznik za pomocą GPC.Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 25 mikrolitrów dodaj 20 mikrolitrów 0,5 molowego ADP do każdej komory. Naciśnij F4, aby oznaczyć oś czasu i oznaczyć znacznik za pomocą ADP.Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Teraz dodaj 20 mikrolitrów 1 molowego bursztynianu do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznacz znak S.Nagrywaj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut.Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów dodaj 5 mikrolitrów 4-milimolowego cytochromu c do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznaczyć znak cytochromem c. Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut.Miareczkować w trzech 1-mikrolitrowych bolusach 1-milimolowego FCCP za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów. Dodanie FCCP powoduje krótkotrwały spadek poziomu strumienia tlenu. Przed nagrywaniem poczekaj, aż strumień tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.Naciśnij F4, aby oznaczyć oś czasu i oznaczenie etykiety za pomocą FCCP. Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Po zakończeniu testu delikatnie przekręć i pociągnij korek do góry, aby go wyjąć.Przepłucz komorę trzykrotnie ultraczystą wodą, a następnie trzykrotnie 70% etanolem. Umieść korki w komorach, aż poczujesz opór, ale nie zamykaj ich całkowicie. Następnie zakręć korki.Zapisz plik testowy i odłącz przyrząd od oprogramowania. Na koniec wyłącz respirometr. W prawidłowo przygotowanych próbkach lustrzanych dodatek cytochromu c po ADP nie wpływał na strumień tlenu, potwierdzając integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej.Jednakże, gdy próbki tkanek nie zostały odpowiednio przygotowane, dodanie cytochromu c po ADP doprowadziło do 40% wzrostu strumienia tlenu, co wskazuje na uszkodzenie zewnętrznej błony mitochondrialnej.

measurement-mitochondrial-respiration-human-mouse-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Poznaj metodę respirometrii o wysokiej rozdzielczości do pomiaru oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy. Technika zachowuje integralność błon mitochondriów i umożliwia ocenę elastyczności metabolicznej w czasie rzeczywistym.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów