Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości
4 października 2024
Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.
Nasze badania koncentrują się na skrzyżowaniu metabolizmu i reakcji na stres w chorobach metabolicznych, co jest głównym tematem programu NORC Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Dzięki synergii między naszymi rdzeniami NORC jesteśmy w stanie stawić czoła złożonym kwestiom związanym z metabolizmem żywieniowym i chorobami poprzez interdyscyplinarne i oparte na współpracy podejście. Tradycyjne testy oddychania mitochondrialnego badały izolowane mitochondria.
Izolowanie mitochondriów jest czasochłonne i może zagrozić integralności zewnętrznej błony mitochondrialnej. Ponadto mitochondria nie działają samodzielnie, ale są częścią dynamicznej sieci komórkowej adaptacji metabolicznej. Nasz protokół utrzymuje tę sieć, aby zapewnić fizjologicznie istotną ocenę funkcji mitochondriów.
Skupiliśmy się na identyfikacji regulatorów dopasowania metabolicznego, które są ważne dla zdrowia i choroby. Kluczowe pytania, które zadajemy, to: Czy te regulatory, takie jak proteaza z miejsca 1, są równie ważne w różnych typach tkanek? I jakie jest ich znaczenie fizjologiczne?
Aby rozpocząć, włącz respirometrię o wysokiej rozdzielczości i system próżniowy. Usuń korki. A następnie, za pomocą systemu próżniowego, usuń 70% roztwór do przechowywania etanolu.
Napełnij komorę ultraczystą wodą molekularną. Po ostatnim myciu dodaj do każdej komory 2 mililitry MiRO5 bez kreatyny i bróbstatyny. Otwórz oprogramowanie do respirometrii.
W wyskakującym okienku ustaw prędkość mieszania w komorze na 750 obr./min, temperaturę na 37 stopni Celsjusza, a interwał zapisu danych na dwie sekundy. Ustaw wzmocnienie na 1, a napięcie polaryzacji na 800 miliwoltów dla czujników tlenu. Kliknij przycisk Connect to Oxygraph (Połącz z Oxygraph), aby nawiązać komunikację z urządzeniem.
W wyświetlonym oknie dialogowym nazwij i zapisz plik eksperymentalny z bieżącymi danymi i kalibracją. Rejestruj stężenie tlenu przez co najmniej 30 minut, aby komory mogły się rozgrzać i zarejestrować sygnały do kalibracji powietrza. Pod koniec kalibracji przytrzymaj Shift i lewy przycisk myszy, a następnie przeciągnij przez region na osi czasu, aby zaznaczyć obszar o stabilnym stężeniu tlenu.
Przejdź do oksygrafu, a następnie kalibracji tlenu. Aby skalibrować powietrze, wybierz znacznik stabilnego stężenia tlenu i kliknij przycisk Kalibruj i kopiuj do schowka. Zatrzymaj rejestrację kalibracji powietrza i zapisz plik.
Po kalibracji systemu respirometrycznego należy wymienić MiRO5 z każdej komory na świeże 2,1 mililitra roztworu MiRO5. W oprogramowaniu do respirometrii wprowadź ustawienia przyrządu. Ustaw nazwę pliku i zapisz ustawienia.
W następnym oknie dialogowym wprowadź informacje o próbce, w tym wagę każdej próbki dodanej do każdej komory. Teraz otwórz okno kalibracji tlenu. Kliknij przycisk Kopiuj z pliku i wybierz zapisany plik kalibracji powietrza.
Następnie kliknij przycisk Kalibruj i kopiuj do schowka. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie przenieś wiązki włókien mięśniowych wcześniej wyizolowane od myszy do roztworu oddechowego. Umieść korki na komorze i wepchnij je mniej więcej do połowy na dno, aby częściowo zamknąć komorę.
Gdy O-ringi na korkach zatrzasną się ze ścianą komory, użyj ruchu skręcającego, naciskając w dół, aby zamknąć. Gdy komora jest zamknięta do połowy, w górnej części komory obserwuje się mały pęcherzyk powietrza. Napełnij 10-mililitrową plastikową strzykawkę czystym tlenem ze zbiornika tlenu.
Umieść długą, igłę na strzykawce, a następnie włóż igłę do pierwszej komory i powoli dostarcz około 1 mililitra tlenu. Monitoruj stężenie tlenu w komorze. Gdy stężenie osiągnie od 350 do 400 nanomoli na mililitr, delikatnie przekręć korek, jednocześnie dociskając, aby całkowicie zamknąć komorę.
Obserwuj komorę i upewnij się, że nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza. Aby znormalizować dane dotyczące strumienia tlenu do masywnej tkanki z menu układu, wybierz układ 6 Strumień właściwy na jednostkę próbki. Upewnij się, że stężenie tlenu i strumień tlenu ustabilizowały się po dodaniu tlenu, aby rozpocząć pomiar oddychania.
Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów dodaj 2,5 mikrolitra 0,8 molowego jabłczanu do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznacz znak M.Record stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. W przypadku glikolitu tlenowego dodaj 10 mikrolitrów 2 molowego glutaminianu i 5 mikrolitrów 2 molowego pirogronianu do każdej komory.
Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznaczyć znak GP. Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Dodaj 10 mikrolitrów 2 molowych glutaminianu i 10 mikrolitrów 10 milimolowych palmitoilo-karnityny do każdej komory dla substratów kwasów tłuszczowych. Naciśnij F4, aby oznaczyć oś czasu i oznaczyć znacznik za pomocą GPC.
Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 25 mikrolitrów dodaj 20 mikrolitrów 0,5 molowego ADP do każdej komory. Naciśnij F4, aby oznaczyć oś czasu i oznaczyć znacznik za pomocą ADP.
Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Teraz dodaj 20 mikrolitrów 1 molowego bursztynianu do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznacz znak S.Nagrywaj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut.
Za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów dodaj 5 mikrolitrów 4-milimolowego cytochromu c do każdej komory. Naciśnij F4, aby zaznaczyć oś czasu i oznaczyć znak cytochromem c. Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut.
Miareczkować w trzech 1-mikrolitrowych bolusach 1-milimolowego FCCP za pomocą szklanej strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów. Dodanie FCCP powoduje krótkotrwały spadek poziomu strumienia tlenu. Przed nagrywaniem poczekaj, aż strumień tlenu wzrośnie i ustabilizuje się.
Naciśnij F4, aby oznaczyć oś czasu i oznaczenie etykiety za pomocą FCCP. Rejestruj stabilny strumień tlenu przez jedną do dwóch minut. Po zakończeniu testu delikatnie przekręć i pociągnij korek do góry, aby go wyjąć.
Przepłucz komorę trzykrotnie ultraczystą wodą, a następnie trzykrotnie 70% etanolem. Umieść korki w komorach, aż poczujesz opór, ale nie zamykaj ich całkowicie. Następnie zakręć korki.
Zapisz plik testowy i odłącz przyrząd od oprogramowania. Na koniec wyłącz respirometr. W prawidłowo przygotowanych próbkach lustrzanych dodatek cytochromu c po ADP nie wpływał na strumień tlenu, potwierdzając integralność zewnętrznej błony mitochondrialnej.
Jednakże, gdy próbki tkanek nie zostały odpowiednio przygotowane, dodanie cytochromu c po ADP doprowadziło do 40% wzrostu strumienia tlenu, co wskazuje na uszkodzenie zewnętrznej błony mitochondrialnej.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia kompleksowy protokół pomiaru fosforylacji oksydacyjnej mitochondriów w świeżych permeabilizowanych włóknach mięśni szkieletowych pochodzących z modeli ludzkich lub mysich. Metoda ta umożliwia ilościowe określenie w czasie rzeczywistym respiracji mitochondrialnej, preferencji substratów energetycznych oraz elastyczności metabolicznej, przy jednoczesnym zachowaniu sieci mitochondrialnych i integralności błon.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Choroba metaboliczna
- Funkcja mitochondrialna
- Metabolizm i odpowiedzi stresowe
Wprowadzenie
- Obecne metody często polegają na izolacji mitochondriów, co stwarza ryzyko naruszenia integralności błon.
- Mitochondria funkcjonują w ramach dynamicznej sieci komórkowej.
- Zrozumienie oddychania mitochondrialnego jest kluczowe dla opracowania metod leczenia chorób metabolicznych.
Zastosowane metody
- Respirometria wysokiej rozdzielczości
- Włókna mięśni szkieletowych myszy i ludzi
- Pomiary strumienia tlenu w czasie rzeczywistym dla różnych substratów
Główne wyniki
- Zapewniono fizjologicznie istotną ocenę funkcji mitochondriów.
- Wykazano zdolność do oceny elastyczności metabolicznej.
- Zidentyfikowano rolę regulatorów metabolicznych w różnych typach tkanek.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie metabolizmu mitochondrialnego w stanie zdrowia oraz w przebiegu chorób.
- Wspiera ona badania nad chorobami metabolicznymi oraz mechanizmami adaptacji do stresu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Respirometria wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych włóknach mięśni szkieletowych umożliwia precyzyjny, istotny fizjologicznie pomiar mitochondrialnego fosforylowania oksydacyjnego, które jest krytycznym determinantem komórkowego metabolizmu energetycznego. Podejście to wspiera wczesne odkrywanie i walidację celów terapeutycznych w ramach portfela chorób metabolicznych, dostarczając rzetelnych, ilościowych informacji na temat funkcji mitochondriów i elastyczności metabolicznej. Integracja tych pomiarów zwiększa pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych w procesach badawczo-rozwojowych (R&D) dotyczących zdrowia metabolicznego i mięśniowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie bioenergetyki mitochondriów oraz adaptacji metabolicznej w tkance mięśniowej istotnej w kontekście chorobowym.
- Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka poprzez zachowanie sieci mitochondrialnych i integralności błon podczas oceny funkcjonalnej.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla regulatorów dostosowania metabolicznego w różnych typach tkanek.
- Dostarcza ilościowych danych służących do określenia wiarygodności prognostycznej i segregacji projektów w badaniach nad chorobami metabolicznymi.
Przesiew i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy włókien mięśniowych do późniejszego przesiewu związków i badań mechanistycznych.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne pomiary zużycia tlenu na potrzeby opracowywania testów.
- Umożliwia ocenę oddychania specyficznego dla danego substratu, co wspiera przesiew metabolicznych modulatorów.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w modelach ludzkich i gryzoni.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje pomiary funkcji mitochondriów z punktami końcowymi istotnymi dla chorób w zaburzeniach metabolicznych i mięśniowych.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki zastosowaniu fizjologicznie nienaruszonych włókien mięśniowych.
- Dostarcza danych skorygowanych o ryzyko w celu podejmowania decyzji o dalszym rozwoju programów dotyczących zdrowia metabolicznego i mięśniowego.
- Usprawnia redukcję ryzyka dzięki ilościowemu określeniu elastyczności metabolicznej i preferencji paliwowych w odpowiednich modelach.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół wysokorozdzielczej respirometrii łączy wczesny etap odkryć, identyfikację związków wiodących oraz badania przedkliniczne, umożliwiając rzetelną ocenę funkcji mitochondriów w włóknach mięśniowych ludzi oraz myszy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków adaptacji metabolicznej oraz regulacji mitochondriów.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki przepływu tlenu w celu weryfikacji gotowości testu i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza dane o oddychaniu w czasie rzeczywistym, specyficzne dla substratu, umożliwiające porównanie warunków metabolicznych i interwencji.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotność fizjologiczną w celu dopasowania biomarkerów i modelowania chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje ustandaryzowaną, międzygatunkową platformę do wielokrotnego zastosowania w badaniach nad metabolizmem i zdrowiem mięśni.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad mitochondriami i metabolizmem.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów funkcji mitochondrialnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych danych funkcjonalnych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów dotyczących zdrowia metabolicznego i mięśniowego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji włókien mięśniowych oraz obsłudze respirometrii wysokiej rozdzielczości.
- Wymaga dostępu do specjalistycznego instrumentarium i oprogramowania analitycznego do pomiaru strumienia tlenu.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania próbek i normalizacji danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowana zarówno do włókien mięśniowych ludzi, jak i gryzoni, co wspiera potrzeby badań translacyjnych.
- Prawidłowe przygotowanie próbek jest kluczowe dla zachowania integralności błony mitochondrialnej i wiarygodności danych.
