Metody umożliwiające przestrzenną transkryptomikę tkanek kostnych

Naszym celem jest znalezienie lepszych podejść terapeutycznych w leczeniu ludzkiego raka kości zwanego kostniakomięsakiem. W tym celu chcemy odkryć procesy biologiczne odpowiedzialne za powstanie tego nowotworu, a przede wszystkim za rozwój jego przerzutów, które są główną przyczyną śmierci pacjenta. Stosując przestrzenną analizę transkryptomiczną na kilku pasujących próbkach ludzkiego pierwotnego kostniakomięsaka i przerzutów do płuc, zlokalizowaliśmy wiele wspólnych populacji komórek pacjentów znajdujących się w obszarach nowotworowych, a porównując je, zidentyfikowaliśmy kilka kluczowych genów, które mogą stanowić cenne cele terapeutyczne w celu zapobiegania przerzutom do płuc.

Przestrzenna analiza transkryptomiczna naszych tkanek, takich jak kości, była bardzo trudna ze względu na niemożność zachowania dobrej jakości RNA i morfologii tkanek, przy jednoczesnym przetwarzaniu tkanki serca do sekcji. Nasz protokół wypełnia tę lukę, umożliwiając naukowcom skuteczne zastosowanie przestrzennej analizy transkryptomicznej również do naszych tkanek. Na początek spryskaj skórę myszy 70% etanolem.

Następnie za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych otwórz skórę i odsłoń mięsień nogi. Przetnij mięsień wzdłuż nogi, aby wyraźnie zobaczyć kość i delikatnie usuń kość, nie uszkadzając jej. Natychmiast umieść kość w probówce zawierającej 4% paraformaldehydu i umieść rurkę na lodzie.

Po pobraniu wszystkich próbek kości umieść probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w chłodnym pomieszczeniu na wytrząsarce orbitalnej na co najmniej 24 godziny. Po utrwaleniu wyjmij tkankę kostną z wytrząsarki oczodołowej i przemyj 1X PBS dwa razy przez trzy minuty każdy. Następnie użyj sterylnych nożyczek preparacyjnych, aby usunąć pozostały mięsień przyczepiony do kości.

Ponownie umyj kość 1X PBS przez trzy minuty. Umieść kość w nowym pojemniku zawierającym 20% EDTA o pH 8 i inkubuj na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp roztwór EDTA świeżym 20% EDTA i powtarzaj mieszanie przez kolejne 30 minut.

Po końcowej obróbce EDTA dodaj świeże EDTA i inkubuj pojemnik w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej przez noc. Następnie wyjmij próbki z pojemnika EDTA i umyj je dwukrotnie 1X PBS, aby usunąć pozostałości EDTA. Rozpocznij proces odwadniania, umieszczając kość w 70% etanolu i inkubując ją przez 15 minut z prędkością 140 obr./min.

Następnie wyrzuć 70% roztwór etanolu i dodaj 90% roztwór etanolu. Inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min. Następnie rozpocznij proces oczyszczania, umieszczając odwodnioną tkankę kostną w nowym pojemniku z ksylenem.

Inkubować przez 20 minut przy 140 obr./min. Zastąp zużyty ksylen świeżym ksylenem i inkubuj przez kolejne 20 minut. Następnie umieść oczyszczoną próbkę kości w kasecie do osadzania i rozpocznij infiltrację woskiem.

Inkubować przez 30 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyrzuć zużyty wosk. Dodaj nowy wosk i inkubuj przez kolejne 30 minut.

Następnie wymień wosk i inkubuj przez kolejne 45 minut. Ostrożnie umieść kość w formie w żądanej orientacji. Pozwól woskowi zestalić się na zimnej powierzchni.

Przechowuj blok w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu pokrojenia. Następnie przygotuj sprzęt do sekcji. Spryskaj wszystkie powierzchnie robocze i narzędzia roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy.

Ustaw również łaźnię wodną z podwójnie destylowaną wodą o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Wyczyść ostrze mikrotomu 70% etanolem, aby usunąć olej, a następnie odkaż, aby usunąć RNazy. Zamocuj ostrze na mikrotomie i upewnij się, że kąt prześwitu jest ustawiony na 10 stopni.

Spryskaj pęsety, szczotki i sondy roztworami odkażającymi i przechowuj je w jednym pojemniku na lód. Przygotuj kąpiel lodową, dodając podwójnie destylowaną wodę do innego wiadra z lodem. Rozpocznij proces cięcia, umieszczając blok FFPE na mikrotomie.

Ustaw mikrotom na przycinanie lub ustaw grubość zwoju na 14 mikrometrów. Rozpocznij przycinanie próbki i kontynuuj, aż tkanka będzie widoczna. Uwodnij blok FFPE, umieszczając go w łaźni lodowej.

Zabezpiecz uwodnioną próbkę w zacisku na próbkę mikrotomu. Dopasuj go do ostrza i ustaw grubość zwoju na pięć mikrometrów. Rozpocznij cięcie tkanki.

Zbierz pociętą tkankę za pomocą zimnej pęsety i szczotek i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Umieść tkankę na szkiełku podstawowym i inkubuj w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Wysuszyć szkiełko przez noc w piekarniku w temperaturze pokojowej.

Przygotowane szkiełko należy przechowywać w pudełku na szkiełka w temperaturze pokojowej. Za pomocą tej metody przygotowano zdemineralizowane próbki kości FFPE z lustrzanych kości udowych. Przebieg czasu odwapnienia został zoptymalizowany poprzez porównanie nieodwapnionych kości udowych z tymi odwapnionymi przez trzy i 24 godziny.

Barwienie H&E wykazało, że krótszy czas odwapnienia prowadził do pęknięć i uszkodzeń skrawków, podczas gdy 24-godzinny proces zapewnił lepszą jakość histologiczną. Ocena jakości RNA przy użyciu wartości rozkładu fragmentów RNA DV200 wykazała, że odwapnione próbki utrzymywały wyniki DV200 powyżej 50%, co nadaje się do analiz takich jak scRNA-seq lub transkryptomika przestrzenna. Jednak wydłużony czas inkubacji spowodował spadek integralności RNA i dlatego nie jest zalecany.