Name: Metody umożliwiające przestrzenną transkryptomikę tkanek kostnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj metody dekalcynacji tkanki kostnej z zachowaniem wysokiej jakości RNA, niezbędne do przestrzennej analizy transkryptomicznej w badaniach nad osteosarkomem. Technika ta umożliwia identyfikację genów kluczowych dla rozwoju przerzutów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Pittsburgh Cure Sarcoma (PCS) i Osteosarcoma Institute (OSI).

Wszystkie procedury opisane poniżej na zwierzętach zostały zatwierdzone zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w Szkole Medycyny Dentystycznej Uniwersytetu w Pittsburghu.
1. Metoda przygotowania bloków FFPE próbek tkanki kostnej, które wymagają demineralizacji
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników i materiałów
	<ol>
		<li>Przygotować EDTA 20% pH 8,0. Na 1 l rozpuść 200 g EDTA w 800 ml ultraczystej wody, dostosuj pH do 8,0 za pomocą wodorotlenku sodu 10 N i na koniec zwiększ objętość do 1 l za pomocą ultraczystej wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Zawsze używaj świeżo przygotowanego EDTA 20% pH 8,0. Wodorotlenek sodu (NaOH) 10 N otrzymuje się przez rozpuszczenie 400 g NaOH w 1 l ultraczystej wody.</li>
		<li>Przygotować paraformaldehyd (PFA) 4% w dygestorium z wykorzystaniem 1x PBS bez wapnia i magnezu. 
		UWAGA: Wyznacz obszar w dygestorii do pracy ze stężonymi roztworami paraformaldehydu lub stałymi roztworami paraformaldehydu i oznacz go jako taki. Aby uniknąć narażenia, należy przechowywać pojemniki tak szczelnie, jak to możliwe. Stosować w najmniejszych ilościach praktycznych potrzebnych do przeprowadzanego eksperymentu. Jeśli ważenie proszku paraformaldehydowego i waga nie może być używana w dygestorium, najpierw weź pojemnik, a następnie dodaj proszek PFA do kaptura i przykryj przed powrotem do wagi w celu zważenia proszku. Zawsze używaj świeżo przygotowanego 4% PFA.</li>
		<li>Do każdej próbki należy użyć odpowiedniego pojemnika. 
		UWAGA: Na przykład w przypadku 1 mg tkanki kostnej należy użyć pojemnika, który pozwala na kontakt co najmniej 1 ml dowolnego roztworu z kością.</li>
		<li>Wysterylizuj cały sprzęt chirurgiczny potrzebny do sekcji.</li>
		<li>Oczyść wszystkie obszary roztworem odkażającym, aby usunąć RNazy.</li>
		<li>Zbierz pozostałe materiały eksperymentalne, w tym pojemniki na lód, spray 70% etanolu i uzyskaj dostęp do wytrząsarki orbitalnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja próbek tkanki kostnej od myszy
	<ol>
		<li>Poddaj mysz eutanazji przez ekspozycję na CO2, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy i połóż ją na plecach. Spryskaj skórę myszy 70% etanolem.</li>
		<li>Za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych otwórz skórę i odsłoń mięsień nogi. Przetnij mięsień wzdłuż nogi, aby uzyskać wyraźny widok na położenie kości, i delikatnie rozdziel kość, aby usunąć ją bez uszkodzenia. 
		UWAGA: Nie jest konieczne całkowite usunięcie całego mięśnia przyczepionego do kości. Staraj się być tak szybki, jak to możliwe, aby ograniczyć degradację RNA.</li>
		<li>Natychmiast umieść próbkę kości w probówce zawierającej 4% PFA i umieść probówkę na lodzie.</li>
		<li>Powtórz procedurę, aby pobrać inne próbki kości zgodnie z potrzebami.</li>
		<li>Próbki z 4% PFA umieścić w mieszadle na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny, aby umożliwić prawidłowe utrwalenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwapnienie próbek tkanki kostnej
	<ol>
		<li>Odzyskaj tkankę kostną z wytrząsarki oczodołowej po utrwaleniu.</li>
		<li>Umyj tkankę kostną 2 razy 1x PBS przez 3 minuty na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min, aby usunąć resztki PFA.</li>
		<li>Za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych usuń wszelkie pozostałe mięśnie nadal przyczepione do kości.</li>
		<li>Umyj tkankę kostną jeszcze raz za pomocą 1x PBS przez 3 min.</li>
		<li>Umieść tkankę kostną w nowym pojemniku o 20% EDTA pH 8,0. Następnie umieść pojemnik na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Wyrzuć roztwór, dodaj świeże 20% EDTA o pH 8,0 do pojemnika i umieść go na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Powtórz krok 1.3.6 10 razy.</li>
		<li>Wyrzucić roztwór, dodać świeży 20% EDTA o pH 8,0 do pojemnika i umieścić go w temperaturze 4 °C w chłodnym pomieszczeniu na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnienie próbek tkanki kostnej
	<ol>
		<li>Pobrać próbkę tkanki kostnej z pojemnika.</li>
		<li>Sprawdź tkankę i sprawdź skuteczność odwapnienia, delikatnie obracając i skręcając kość. Alternatywnie można wykonać zdjęcie rentgenowskie kości za pomocą aparatu rentgenowskiego. 
		UWAGA: Jeśli próbka łatwo się wygina, osiągnięto dobry stopień odwapnienia. Jeśli nie, należy zwiększyć parametry odwapnienia (czas, szybkość mieszania, objętość użytego 20% EDTA pH 8,0 itp.).</li>
		<li>Umyj tkankę kostną 2 razy 1x PBS przez 3 minuty, aby usunąć pozostałości EDTA.</li>
		<li>Umieść tkankę kostną w nowym pojemniku i rozpocznij odwodnienie 70% etanolem. Inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.</li>
		<li>Odrzucić 70% roztwór etanolu, umieścić próbkę w 90% roztworze etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.</li>
		<li>Odrzucić 90% roztwór etanolu, umieścić próbkę w 100% etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.</li>
		<li>Odrzucić 100% etanol, umieścić próbkę w nowym 100% etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.</li>
		<li>Odrzucić 100% etanol, umieścić próbkę w nowym 100% etanolu i inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min.</li>
		<li>Odrzucić 100% etanol, umieścić próbkę w nowym 100% etanolu i inkubować przez 30 minut przy 140 obr./min.</li>
		<li>Wyrzuć 100% etanol, umieść próbkę w nowym 100% etanolu i inkubuj przez 45 minut przy 140 obr./min. 
		UWAGA: Odwodnienie można również przeprowadzić za pomocą automatycznego procesora. W takim przypadku należy skonfigurować program z tymi samymi warunkami, które są zgłaszane dla ręcznego odwadniania. Podane warunki dotyczą próbek nie grubszych niż 4 mm (tj. próbek tkanki kostnej uzyskanych od myszy). W przypadku próbek grubszych niż 4 mm czas odwodnienia musi być określony doświadczalnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie próbek tkanki kostnej
	<ol>
		<li>Umieść próbkę tkanki kostnej w nowym pojemniku i rozpocznij proces oczyszczania za pomocą ksylenu. Inkubować przez 20 minut przy 140 obr./min.</li>
		<li>Wyrzuć zużyty ksylen, dodaj nowy ksylen i inkubuj przez dodatkowe 20 minut przy 140 obr./min.</li>
		<li>Wyrzuć zużyty ksylen, dodaj nowy ksylen i inkubuj przez 45 minut przy 140 obr./min. 
		UWAGA: Czyszczenie można również wykonać za pomocą automatycznego procesora. W takim przypadku należy skonfigurować program z tymi samymi warunkami, które są zgłaszane dla ręcznego czyszczenia. Podane warunki dotyczą próbek nie grubszych niż 4 mm (tj. próbek tkanki kostnej uzyskanych od myszy). W przypadku próbek grubszych niż 4 mm czas musi być określony doświadczalnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naciekanie i osadzanie próbek tkanki kostnej
	<ol>
		<li>Po oczyszczeniu pobrać próbkę tkanki kostnej z wytrząsarki orbitalnej/automatycznego procesora.</li>
		<li>Umieść próbkę tkanki kostnej w kasecie do zatapiania i rozpocznij infiltrację woskiem (patrz Tabela Materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Wyrzuć zużyty wosk, dodaj nowy wosk i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Wyrzuć zużyty wosk, dodaj nowy wosk i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Ostrożnie umieść próbkę tkanki kostnej w formie o pożądanej orientacji.</li>
		<li>Poczekaj, aż blok próbki zestali się na zimnej powierzchni.</li>
		<li>Otrzymany FFPE przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do rozpoczęcia krojenia. 
		UWAGA: Blok FFPE może być przechowywany przez wiele lat przed przeprowadzeniem cięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wytyczne dotyczące sekcji niezdemineralizowanych próbek FFPE
UWAGA: Poniższe wskazówki dostarczają cennych wskazówek i instrukcji przydatnych do znacznego poprawy jakości odcinków tkanek przy jednoczesnym uniknięciu degradacji RNA, szczególnie w przypadku małych nieodwapnionych próbek kości. Wytyczne te mogą być również stosowane do odwapnionych próbek kości, jeśli są dostępne. W przypadku większych próbek tkanki kostnej należy przeprowadzić demineralizację w celu uzyskania lepszej jakości skrawków; W takich przypadkach należy postępować zgodnie z metodą opisaną powyżej, a parametry (czas, objętości roztworów itp.) powinny być odpowiednio dostosowane. Poniższe wytyczne są odpowiednie zarówno wtedy, gdy tkanki kostne FFPE zostały już przetworzone (np. blok FFPE pobrany z banków tkanek lub innych laboratoriów), jak i gdy pobrane skrawki zostaną wykorzystane do wykonania dowolnego rodzaju analizy, która wymaga dobrej jakości RNA, wysokiej jakości skrawków tkanek lub obu.
<ol>
	<li>Przygotowanie sprzętu
	<ol>
		<li>Spryskaj wszystkie powierzchnie robocze i narzędzia roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy.</li>
		<li>Przygotować łaźnię wodną z podwójnie destylowaną wodą i ustawić temperaturę na 42 °C.</li>
		<li>Weź ostrze mikrotomu, spryskaj je 70% etanolem, aby usunąć pozostałości oleju, a następnie spryskaj je roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy.</li>
		<li>Przymocuj ostrze do mikrotomu. Upewnij się, że kąt przyłożenia jest ustawiony na 10°. 
		UWAGA: Do cięcia należy zawsze używać nowych ostrzy.</li>
		<li>Przygotuj dwa wiadra lodu.</li>
		<li>Weź pęsetę, szczoteczki i sondy, spryskaj je roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy i umieść je w jednym z dwóch wiader na lód.</li>
		<li>Przygotuj kąpiel lodową, dodając podwójnie destylowaną wodę do drugiego wiadra z lodem. 
		UWAGA: blok FFPE nie powinien unosić się w dodanej wodzie; Dlatego ilość dodanej wody do wiadra z lodem musi być wystarczająca, aby próbka mogła być mokra bez unoszenia się na wodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cięcia
	<ol>
		<li>Wyjąć blok FFPE z magazynu w temperaturze 4 °C i umieścić go w mikrotomie. Ustaw polecenie na Przytnij lub na 14 μm grubości przewijania i rozpocznij przycinanie próbki, aż tkanka zostanie odsłonięta. 
		UWAGA: Jeśli blok FFPE został już przycięty, a tkanka jest już odsłonięta, pomiń krok 2.2.1. Sprawdź, czy blok jest bez i pęknięć. Jeśli tak, przejdź bezpośrednio do kroku 2.2.2. Jeśli nie, wytnij kilka odcinków, aby spłaszczyć powierzchnię i uniknąć i pęknięć, a następnie przejdź do kroku 2.2.2.</li>
		<li>Umieść blok FFPE na łaźni lodowej w celu uwodnienia próbki. Czas nawodnienia należy określić doświadczalnie.
		<ol>
			<li>Zacznij od 2 minut i wydłuż czas, jeśli nawodnienie nie wystarcza. Nie przekraczać 10 minut. Nawilżenie rozszerzy tkankę i zmniejszy powstawanie "żaluzji weneckich" i linii. Dłuższy czas hydratacji może spowodować pęknięcia bloku parafinowego i ewentualnie oderwanie tkanki.</li>
			<li>Jeśli 10 minut jest niewystarczające do uwodnienia próbki, należy wykonać cykle hydratacji nie dłuższe niż 10 minut i spróbować ponownie podzielić na sekcje.</li>
			<li>Jeśli powierzchnia bloku nie jest gładka i czysta z powodu pęknięć lub nacięć, należy rozważyć ponowne osadzenie próbki. Proces ponownego osadzania nie będzie miał wpływu na jakość RNA.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść próbkę w zacisku próbki mikrotomu, wyrównaj ją z ostrzem i rozpocznij cięcie. Ustaw grubość zwoju na 5 μm.</li>
		<li>Zebrać skrawek i umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C za pomocą zimnej pęsety i szczotek. 
		UWAGA: Alternatywnie, jeśli ma być wykonywana izolacja RNA skrawków tkanki, należy zebrać skrawki w probówce wirówkowej i postępować zgodnie ze specyfikacjami produkcyjnymi dotyczącymi przygotowania RNA (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Wykonaj inkubację sekcji w łaźni wodnej, aby rozciągnąć tkankę i wyeliminować wszelkie resztki zmarszczek i fałdów. 
		UWAGA: Czas pływania w łaźni wodnej dla każdej sekcji musi być określony doświadczalnie. Rozważ pozostawienie skrawków kości na dodatkową minutę, jeśli wystąpią problemy z odwarstwieniem tkanek. Nie pozostawiaj sekcji unoszącej się zbyt długo, ponieważ długi czas pływania może uszkodzić tkankę.</li>
		<li>Umieścić wycinek na szkiełku podstawowym i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 42 °C.</li>
		<li>Umieść szkiełko szkiełkowe w eksykatorze lub piekarniku na noc w temperaturze pokojowej w celu prawidłowego wysuszenia.</li>
		<li>Przechowuj szkiełko podstawowe z dołączoną sekcją w temperaturze RT w pudełku na slajdy. 
		UWAGA: Slajdy mogą być przechowywane przez wiele lat w RT. W przypadku, gdy ma być wykonywana transkryptomika przestrzenna, zamiast szkiełka należy umieścić wycinek na szkiełku do przestrzennej ekspresji genów dostarczonym przez producenta i postępować zgodnie z przedstawionymi zaleceniami (patrz Tabela Materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Protocol to Prepare Demineralized FFPE Bone Tissue Samples with RNA Integrity 

<ol><li>Baig, M. A., Bacha, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaig%2C+MA+%22Histology.+Bone%22">Histology. Bone</a>. , StatPearls Publishing. (2024).</li>
<li>Currey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+consequences+of+variation+in+the+mineral+content+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone.</a> J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
<li>Wallington, E. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWallington%2C+EA+%22Histological+Methods+for+Bone%22">Histological Methods for Bone</a>. , Butterworths. London. (1972).</li>
<li>Callis, G. M., Sterchi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decalcification+of+bone%3A+Literature+review+and+practical+study+of+various+decalcifying+agents.+methods%2C+and+their+effects+on+bone+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology.</a> J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).</li>
<li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utilization+of+formalin+fixed-paraffin-embedded+specimens+in+high+throughput+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Genomics%22%5BJournal%5D)">The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies.</a> Int J Genomics. 2017, 1926304(2017).</li>
<li>Trinks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+clinically+relevant+features+in+single-cell+RNA+profiles+of+patient-matched+fresh+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+lung+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Oncol+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue.</a> Cell Oncol (Dordr). , (2024).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single+nucleus+total+RNA+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues+by+snRandom-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq.</a> Nat Commun. 14 (1), 2734(2023).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visium+Spatial+Gene+Expression+Reagent+Kits+for+FFPE+-+User+Guide.%2C+Document+Number+C+CG000407+Rev+C%5BTitle%5D)+AND+%2210x+Genomics%22%5BJournal%5D)">Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE - User Guide., Document Number C CG000407 Rev C.</a> 10x Genomics. , (2021).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+Space+Ranger+Web+Summary+Files+for+Visium+Spatial+Gene+Expression+for+FFPE+F+FFPEAssay.%2C+Document+Number+CG000499+Rev+A%5BTitle%5D)+AND+%2210x+Genomics%22%5BJournal%5D)">Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A.</a> 10x Genomics. , (2022).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visium+Spatial+Gene+Expression+for+FFPE-Tissue+Preparation+Guide.%2C+Document+Number+C+G+CG000408+Rev+D%5BTitle%5D)+AND+%2210x+Genomics%22%5BJournal%5D)">Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D.</a> 10x Genomics. , (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym miejscu przedstawiono szczegółową metodę przygotowania bloków FFPE odwapnionych kości i zachowania integralności RNA do sekwencjonowania (tj. sekwencjonowania nowej generacji (NGS)) lub do innych technik związanych z RNA (tj. hybrydyzacja in situ , ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) itp.).
Metoda wykorzystuje EDTA do odwapniania próbek tkanki kostnej; inkubacja EDTA pozwala na powolną, ale drobną demineralizację próbek, zachowując w ten sposób cechy histologiczne tkanki w najlepszym wydaniu. Zwykle odwapnienie kości przeprowadza się przy użyciu 10% EDTA pH 7,0 przez co najmniej 2 tygodnie poprzez odświeżanie roztworu co drugi dzień4. Długie czasy odwapnienia znacząco przyczyniają się jednak do degradacji RNA 6,7,8. Aby przezwyciężyć ten problem, stężenie EDTA zwiększono do 20%, pH podniesiono do 8,0, a częstotliwość wymiany roztworu zwiększono do co 30 minut. Warunki te, w połączeniu z dużą ilością roztworu, na działanie którego narażona jest tkanka, energicznym mieszaniem i wysokim stosunkiem objętości pojemnika do tkanki, maksymalizowały odwapnienie i skracały czas leczenia, umożliwiając delikatną, ale szybką demineralizację. Warto wspomnieć, że gdy próbki tkanki kostnej mają być wykorzystane do sekwencjonowania transkryptomu, ich całkowite odwapnienie może nie być konieczne. W takim przypadku należy znaleźć optymalną proporcję między wystarczającą demineralizacją a dobrym zachowaniem RNA. Inną ważną rzeczą, o której należy wspomnieć, jest to, że bez względu na to, jak próbki są traktowane, jeśli zostały utrwalone, ich RNA zostanie pofragmentowane. Opisana tutaj metoda pozwala na zatrzymanie fragmentów RNA o wielkości większej niż 200 nukleotydów (%DV200) (Figura 2F), co wskazuje na wysoką jakość RNA 9,11.
Ta metoda ma pewne ograniczenia. Po pierwsze, ponieważ myszy były jedynym źródłem próbek tkanki kostnej, metoda została zwalidowana tylko na kościach mysich, które są stosunkowo małe. Co więcej, nie wiadomo, czy metoda ta może być stosowana u myszy starszych lub młodszych niż 8 tygodni, ponieważ była testowana tylko na 8-tygodniowych myszach. Wybraliśmy 8-tygodniowe myszy, ponieważ są dojrzałe kostnie. Ponieważ starzenie się modyfikuje zawartość minerałów w kościach, może być konieczne wprowadzenie zmian w tym podejściu.
Ponadto podano wytyczne, które mają pomóc poprawić jakość skrawków tkanek, gdy wykorzystywane są próbki FFPE małych nieodwapnionych próbek kości, na przykład gdy są one pobierane bezpośrednio z banków tkanek. W takich sytuacjach nic nie można zrobić, jeśli RNA zostanie zdegradowane, ale można poprawić jakość sekcji. Z drugiej strony, w przypadku próbek o dobrej zawartości RNA, takich jak te pokazane tutaj, przestrzenna analiza transkryptomiczna jest możliwa, jeśli przestrzegane są dostarczone wytyczne. Warto zauważyć, że w próbkach pierwotnego kostniakomięsaka struktura kości może zostać zmieniona przez obecność masy guza, co sprawia, że rzeczywiste próbki są słabsze i kruche, co może ułatwić cięcie. W związku z tym wykorzystano barwienie trichromowe Goldnera, aby ocenić, czy tak jest, ponieważ obszary zmineralizowane i niezmineralizowane można zidentyfikować za pomocą tej techniki barwienia (ryc. 3C).
Podsumowując, przedstawiona metoda stanowi łatwą do zastosowania metodę odwapniania próbek tkanki kostnej i uzyskiwania skrawków FFPE, które mogą być skutecznie stosowane do NGS lub innych technik wymagających integralności RNA. Ponadto podano wytyczne dotyczące cięcia próbek, które mogły nie zostać zdemineralizowane przed zatopieniem parafiny, takich jak próbki uzyskane z banków tkanek. Biorąc pod uwagę szybki rozwój przestrzennych analiz transkryptomicznych, proponowana metoda i wytyczne mogą być bardzo pomocne w badaniach nad kośćmi w ogóle, a także w badaniach nad rakiem kości.

Kość to wyspecjalizowana tkanka łączna składająca się głównie z włókien kolagenu typu 1 i soli nieorganicznych1. Dzięki temu kość jest niezwykle mocna i sztywna, a jednocześnie lekka i odporna na urazy. Ogromna wytrzymałość kości wynika z jej zawartości minerałów. W rzeczywistości, przy każdym wzroście procentowej zawartości minerałów, sztywność wzrasta pięciokrotnie2. W związku z tym badacze napotykają poważne problemy, gdy analizują, za pomocą sekcji histologicznej, biologię próbki kości.
Histologia kości nieodwapnionej jest wykonalna i czasami wymagana, w zależności od rodzaju badania (np. w celu zbadania mikroarchitektury kości); jest to jednak bardzo trudne, zwłaszcza jeśli próbki są duże. W takich przypadkach przetwarzanie tkanek do celów histologicznych wymaga kilku modyfikacji standardowych protokołów i technik3. Ogólnie rzecz biorąc, aby przeprowadzić typowe oceny histologiczne, tkanki kostne są odwapniane zaraz po utrwaleniu, co może trwać od kilku dni do kilku tygodni, w zależności od wielkości tkanki i zastosowanego środka odwapniającego4. Odwapnione skrawki są często wykorzystywane do badania szpiku kostnego, diagnozy nowotworów itp. Istnieją trzy główne rodzaje środków odwapniających: mocne kwasy (np. kwas azotowy, kwas solny), słabe kwasy (np. kwas mrówkowy) i czynniki chelatujące (np. kwas etylenodiaminoterakowy lub EDTA)5. Silne kwasy mogą bardzo szybko odwapnić kości, ale mogą uszkodzić tkanki; słabe kwasy są bardzo powszechne i nadają się do procedur diagnostycznych; Czynniki chelatujące są zdecydowanie najczęściej stosowane i odpowiednie do zastosowań badawczych, ponieważ w tym przypadku proces demineralizacji jest powolny i łagodny, co pozwala na zachowanie wysokiej jakości morfologii i zachowanie informacji o genach i białkach, co jest wymagane przez wiele procedur (np. hybrydyzacja in situ, barwienie immunologiczne). Jednak gdy konieczne jest zachowanie całego transkryptomu, na przykład w przypadku analiz ekspresji genów, nawet powolna i delikatna demineralizacja może być szkodliwa. W związku z tym potrzebne są lepsze podejścia i metody, gdy analiza morfologiczna tkanek musi być połączona z analizami ekspresji genów w komórkach.
Dzięki niedawnym ulepszeniom w sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) i transkryptomice przestrzennej, teraz możliwe jest badanie ekspresji genów w próbce tkanki nawet wtedy, gdy do przechowywania próbek tkanek użyto zatapiania parafiny z utrwalaniem w formalinie (FFPE)6,7,8. Ta możliwość odblokowała dostęp do większej liczby próbek, takich jak te przechowywane w bankach tkanek na całym świecie. Jeśli ma być zastosowany sekwencjon scRNA, integralność RNA jest najważniejszym wymogiem; jednak w przypadku transkryptomiki przestrzennej próbek FFPE do wizualizacji ekspresji genów w kontekście histologicznym każdego wycinka tkanki niezbędne są zarówno wysokiej jakości skrawki tkanki, jak i wysokiej jakości RNA. Chociaż można to łatwo osiągnąć w przypadku tkanek miękkich, tego samego nie można powiedzieć o tkankach twardych, takich jak kości. W rzeczywistości, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nigdy nie przeprowadzono żadnego badania z wykorzystaniem transkryptomiki przestrzennej na próbkach kości FFPE. Wynika to z braku protokołów, które mogłyby skutecznie przetwarzać tkanki kostne FFPE przy jednoczesnym zachowaniu ich zawartości RNA. W tym przypadku najpierw przedstawiono metodę przetwarzania i odwapniania świeżo uzyskanych próbek tkanki kostnej przy jednoczesnym unikaniu degradacji RNA. Następnie, dostrzegając potrzebę analizy transkryptomicznej próbek FFPE pobranych w bankach tkanek na całym świecie, przedstawiono również opracowane wytyczne dotyczące prawidłowego postępowania z próbkami FFPE kości niezdemineralizowanych.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowana wytrząsarka orbitalna</td><td>VWR</td><td>76683-470</td><td>Służy do utrzymywania tkanek w stanie mieszania podczas inkubacji, zgodnie z instrukcjami metody.</td></tr><tr><td>Szczotki do włosów wielbłądzich</td><td>Ted Pella</td><td>11859</td><td>Służy do obsługi sekcji FFPE zgodnie z wytycznymi.</td></tr><tr><td>Dual Index Kit TS Set A 96 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000251</td><td>Służy do wykonywania transkryptomiki przestrzennej.</td></tr><tr><td>Etanol 200 Proof</td><td>Decon Labs Inc</td><td>2701</td><td>Służy do wykonywania odwodnienia tkanek zgodnie z instrukcjami metody.</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodna (EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S312-500</td><td>Służy do przygotowania EDTA 20% pH 8,0.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszcze ogólnego przeznaczenia Fisherbrand Curved Medium Point</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-110</td><td>Służy do obsługi sekcji FFPE zgodnie z wytycznymi.</td></tr><tr><td>Sonda precyzyjna Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-153</td><td>Służy do obsługi odcinków FFPE zgodnie z wytycznymi.</td></tr><tr><td>Marka rybacka&nbsp; Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Służy do mocowania zwojów podzielonych na sekcje, zgodnie z wytycznymi.</td></tr><tr><td>Wysokoprofilowe diamentowe ostrza mikrotomu</td><td>CL Sturkey</td><td>D554DD</td><td>Służy do cięcia bloków FFPE zgodnie z wytycznymi.</td></tr><tr><td>Sekwencer Novaseq 150PE</td><td>Novogene</td><td>N/A</td><td>.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA) 32% roztwór wodny</td><td>Mikroskopia elektronowa klasy EM Sciences</td><td>15714-S</td><td>Rozcieńczyć do końcowego stężenia 4% za pomocą 1x PBS&nbsp; w celu utrwalenia tkanki.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-049</td><td>Produkt gotowy. Stosować do rozcieńczania PFA i przeprowadzania płukania zgodnie z instrukcją metody.</td></tr><tr><td>Premiere Pływająca kąpiel z tkankami&nbsp;</td><td>Fisher Scientific A84600061</td><td></td><td>Służy do usuwania zmarszczek z odcinków FFPE zgodnie z wytycznymi.</td></tr><tr><td>RNase AWAY Odkażacz powierzchni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7002</td><td>Służy do czyszczenia wszystkich powierzchni zgodnie z instrukcją metody.</td></tr><tr><td>RNeasy DSP FFPE Kit</td><td>Qiagen</td><td>73604</td><td>Służy do izolowania RNA z odcinków FFPE po ich wygenerowaniu, jak podano w wytycznych.</td></tr><tr><td>Półautomatyczny mikrotom obrotowy</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2245</td><td>Służy do sekcji bloków FFPE zgodnie z wytycznymi.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>S8045-500</td><td>Przygotować roztwór 10 N, powoli rozpuszczając 400 g w 1 litrze wody Milli-Q.</td></tr><tr><td>Space Ranger</td><td>10X Genomics</td><td>2.0.1</td><td>Służy do przetwarzania danych wyjściowych sekwencjonowania.</td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>Służy do wykonywania inflacji i osadzania tkanek, zgodnie z instrukcjami metody.</td></tr><tr><td>Visium Accessory Kit</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000194</td><td>Służy do wykonywania przestrzennych eksperymentów transkryptomicznych.</td></tr><tr><td>Zestaw sondy transkryptomu dla człowieka Visium Mały&nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000363</td><td>Służy do wykonywania przestrzennych eksperymentów transkryptomicznych.</td></tr><tr><td>Zestaw szkiełek do przestrzennej ekspresji genów Visium 4 rxns&nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000188</td><td>Służy do umieszczania sekcji podczas wykonywania przestrzennych eksperymentów transkryptomicznych.</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803665</td><td>Służy do oczyszczania tkanek zgodnie z instrukcjami metody.</td></tr></tbody></table>

metody umożliwiające przestrzenną transkryptomikę tkanek kostnych

Methods to Enable Spatial Transcriptomics of Bone Tissues

Zrozumienie relacji między komórkami i ich lokalizacji w każdej tkance jest niezbędne do odkrycia procesów biologicznych związanych z normalnym rozwojem i patologią choroby. Transkryptomika przestrzenna to potężna metoda, która umożliwia analizę całego transkryptomu w próbkach tkanek, dostarczając w ten sposób informacji o ekspresji genów komórkowych i kontekście histologicznym, w którym znajdują się komórki. Chociaż metoda ta jest szeroko stosowana w przypadku wielu tkanek miękkich, jej zastosowanie do analiz tkanek twardych, takich jak kości, było wyzwaniem. Głównym wyzwaniem jest niemożność zachowania dobrej jakości RNA i morfologii tkanek podczas przetwarzania próbek tkanek twardych do sekcji. W związku z tym opisano tutaj metodę przetwarzania świeżo pobranych próbek tkanki kostnej w celu efektywnego generowania przestrzennych danych transkryptomicznych. Metoda pozwala na odwapnienie próbek, zapewniając udane skrawki tkanek z zachowanymi szczegółami morfologicznymi przy jednoczesnym uniknięciu degradacji RNA. Ponadto podano szczegółowe wytyczne dla próbek, które wcześniej były zatopione w parafinie, bez demineralizacji, takich jak próbki pobrane z banków tkanek. Korzystając z tych wytycznych, przedstawiono wysokiej jakości dane transkryptomiki przestrzennej wygenerowane z próbek tkanek z banku tkanek guza pierwotnego i przerzutów do płuc kostniakomięsaka kostnego.

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu opisuje sposób przetwarzania świeżo wyizolowanych kości w celu uzyskania odwapnionych próbek FFPE, które można łatwo kroić za pomocą mikrotomu przy jednoczesnym zachowaniu integralności RNA (Rysunek 1). Metoda ta została z sukcesem zastosowana w przypadku kości udowych myszy, lecz może być stosowana również dla innych próbek tkanki kostnej o podobnych wymiarach lub dostosowana do większych preparatów kostnych (np. próbek ludzkich) poprzez zwiększenie wszystkich parametrów (czasu, objętości roztworów itp.).
<img alt="Schemat przetwarzania kości: fiksacja, dekalcyfikacja, odwodnienie, zatapianie, krojenie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66850/66850fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja protokołu. Schemat metody otrzymywania bloków FFPE z dekalcyfikowanych tkanek kostnych z zachowaną integralnością RNA (punkty 1 i 2). Schemat wytycznych dotyczących krojenia bloków FFPE (punkt 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66850/66850fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Aby zweryfikować prawidłowy czas odwapniania, przeprowadzono badanie kinetyczne, w którym porównano kości udowe nieodwapnione, odwapniane przez 3 h (z wymianą EDTA co 30 min łącznie 6 razy) oraz odwapniane przez 24 h (z wymianą EDTA co 30 min łącznie 10 razy, a następnie pozostawione w EDTA przez noc) (Rysunek 2). Uzyskane bloki FFPE poddano następnie sekcjonowaniu zgodnie z powyższymi wytycznymi, a następnie zweryfikowano jakość histologiczną i integralność RNA otrzymanych przekrojów. W tym celu strukturę i morfologię przekrojów tkankowych oceniono za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E), a następnie poddano inspekcji mikroskopowej (Rysunek 2A,C,E), natomiast jakość RNA oceniono poprzez analizę wartości rozkładu fragmentów RNA o wielkości powyżej 200 nukleotydów (200 nt) (znanej jako wynik DV200)4 (Rysunek 2B,D,F). Obrazy H&amp;E wykazały, że przekroje kości udowych nieodwapnionych oraz odwapnianych przez 3 h wykazywały liczne pęknięcia, dziury i uszkodzenia (Rysunek 2A,C), podczas gdy przekroje kości udowych odwapnianych przez 24 h wykazały dobrą jakość histologiczną (Rysunek 2E). Wszystkie próbki wykazały wyniki DV200 wyższe niż 50%, co jest uważane za wartość minimalną do przeprowadzenia analiz scRNA-seq lub transkryptomiki przestrzennej4. Przetestowano również dłuższe czasy inkubacji z codzienną wymianą EDTA w temperaturze 4 °C przy łagodniejszym mieszaniu w mniejszych naczyniach, jednak nie są one zalecane, ponieważ w tych warunkach integralność RNA w próbkach drastycznie spada (Rysunek 2H). W związku z tym czas inkubacji zmniejszono do 24 h, natomiast częstotliwość, intensywność mieszania i objętości roztworu do odwapniania zwiększono, aby przyspieszyć proces odwapniania.
<img alt="Histologia i elektroforegramy procesu dekalcyfikacji kości w czasie; obrazy mikroskopowe i analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66850/66850fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Przekroje i kontrola jakości (QC) integralności RNA z kości udowych 8-tygodniowych myszy po dekalcyfikacji. Kości udowe myszy w wieku 8 tygodni zostały świeżo wypreparowane, utrwalone i dekalcyfikowane w 20% roztworze EDTA o pH 8,0 w różnych punktach czasowych, a następnie zatopione w parafinie zgodnie z opisaną metodą i pocięte według zgłoszonych wytycznych. Kontrolę jakości (QC) histologiczną uzyskanych skrawków przeprowadzono następnie za pomocą H&amp;barwienie E, natomiast integralność RNA oceniono poprzez analizę wartości rozkładu fragmentów RNA o rozmiarze większym niż 200 nukleotydów (200 nt) (DV200).A) H&amp;Barwienie E wykazujące przekroje kości udowej myszy w wieku 8 tygodni bez przeprowadzonej dekalcyfikacji. Prawy obraz przedstawia większe powiększenie obszaru zaznaczonego ramką. (B) Kontrola jakości (QC) RNA w sekcjach kości udowej 8-tygodniowych myszy bez dekalcyfikacji. (C) H&amp;Barwienie E przedstawiające przekroje kości udowej myszy w wieku 8 tygodni po 3 h dekalcyfikacji. Prawy obraz przedstawia większe powiększenie obszaru zaznaczonego ramką. (D) Kontrola jakości RNA w sekcjach kości udowej 8-tygodniowych myszy po 3 h dekalcyfikacji. (E) H&amp;Barwienie E wykazujące przekroje kości udowej 8-tygodniowej myszy po 24 godzinach dekalcyfikacji. Prawy obraz przedstawia powiększenie obszaru zaznaczonego ramką. (F) Kontrola jakości RNA w przekrojach kości udowej myszy w wieku 8 tygodni po 24 h dekalcyfikacji. (G) H&amp;Barwienie E wycinków kości udowej 8-tygodniowych myszy po 72 h dekalcyfikacji. Prawy obraz przedstawia powiększenie obszaru zaznaczonego ramką. (H) Kontrola jakości RNA z przekrojów kości udowej 8-tygodniowych myszy po 72 godzinach dekalcyfikacji. Skróty: H&amp;E = hematoksylina i eozyna; DV200 (%) = % wartości rozkładu fragmentów &gt; 200 nt; nt = nukleotydy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66850/66850fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
Aby przetestować skuteczność opisanych wytycznych dotyczących postępowania z niedemineralizowanymi próbkami FFPE, pobrano bloki FFPE niedemineralizowanych pierwotnych kostniakomięsaków ludzkich oraz przerzutów kostniakomięsaka do płuc z naszego Rejestru Guzów i Banku Tkanki Onkologii Narządu Ruchu (MOTOR), a następnie przeprowadzono analizę transkryptomiczną przestrzenną (Rycina 3). Przed przystąpieniem do analizy transkryptomicznej przestrzennej bloki FFPE ponownie zatopiono w parafinie, aby uzyskać gładką powierzchnię początkową. Następnie oceniono jakość RNA oraz jakość histologiczną przekrojów (dane nie przedstawiono). Etapy nawilżania okazały się kluczowe, ponieważ próbki pierwotnego kostniakomióra nie można było skrawać bez odpowiedniego nawilżenia. Z kolei przerzuty do płuc nie wymagały żadnych etapów nawilżania. Po skrawaniu tkanki umieszczono na szkiełku do transkryptomiki przestrzennej (Rysunek 3A), barwione H&amp;E (Rysunek 3D), a następnie przeprowadzono analizę transkryptomiczną przestrzenną zgodnie ze specyfikacjami producenta (patrz Tabela materiałów). Uzyskane biblioteki cDNA poddano sekwencjonowaniu, a przetworzone dane zwizualizowano za pomocą programu Space Ranger w celu kontroli jakości5 (Rysunek 3B). Wyniki z programu Space Ranger wykazały bardzo wysokie wartości (bliskie 100%) dla poprawnych kodów kreskowych, poprawnych unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI), zasad Q30 oraz mediany wykrytych genów na punkt (między 1700 a 5000), co świadczy o powtarzalności i rzetelności uzyskanych danych (Rycina 3B). Dzięki zastosowaniu bezstronnej analizy skupień opartej na grafach zidentyfikowano 12 głównych klastrów, w tym klastry komórek osteogennych, odpornościowych, nabłonkowych i śródbłonkowe, a także adipocyty (Rysunek 3E). Warto zauważyć, że granice klastrów pokrywały się z krawędziami regionów histologicznych zidentyfikowanych przez patomorfologa (Rysunek 3D). Dodatkowe sekcje tych samych próbek wybarwiono również metodą trichromu Goldnera, aby zwizualizować obszary zmineralizowane (Rycina 3C).
<img alt="Analiza preparatów histologicznych; tkanka nowotworowa vs prawidłowa; adnotacje patomorfologiczne; wykresy populacji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66850/66850fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analiza transkryptomiki przestrzennej dwóch par nieodwapnionych zmian pierwotnego kostniakomięsaka (OS) i przerzutów do płuc. Bloki FFPE dwóch dopasowanych par niedemineralizowanego pierwotnego kostniakomięsaka ludzkiego i przerzutu do płuc zostały pobrane z banku tkanek MOTOR. Próbki pocięto zgodnie z opisanymi wytycznymi i naniesiono na slajd Visium Spatial Gene Expression dla próbek FFPE w celu przeprowadzenia analizy transkryptomiki przestrzennej. (A) Slajd Visium Spatial Gene Expression dla próbek FFPE z naniesionymi skrawkami. (B) Wyniki z programu Space Ranger przedstawiające wspólne parametry użyte do oceny jakości uzyskanych danych dla wszystkich próbek. (C) Barwienie trichromem Goldnera wykazujące lokalizację zmineralizowanych tkanek kostnych i osteoidu. (D) Barwienie H&amp;E przedstawiające adnotacje patomorfologa. (E) Analiza klastrowa wykazująca lokalizację populacji komórek występujących w tkance. Skróty: FFPE = utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie; MOCs = złośliwe komórki osteogenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66850/66850fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy metodę, która pozwala na odwapnienie świeżo pobranych tkanek kostnych i zachowanie wysokiej jakości RNA. Przedstawiono również metodę cięcia próbek niezdemineralizowanych kości z zatopioną parafiną utrwaloną w formalinie (FFPE) w celu uzyskania dobrej jakości wyników, jeśli świeże tkanki nie są dostępne lub nie można ich pobrać.

Metody umożliwiające przestrzenną transkryptomikę tkanek kostnych

Understanding the relationship between the cells and their location within each tissue is critical to uncover the biological processes associated with ...

Naszym celem jest znalezienie lepszych podejść terapeutycznych w leczeniu ludzkiego raka kości zwanego kostniakomięsakiem. W tym celu chcemy odkryć procesy biologiczne odpowiedzialne za powstanie tego nowotworu, a przede wszystkim za rozwój jego przerzutów, które są główną przyczyną śmierci pacjenta. Stosując przestrzenną analizę transkryptomiczną na kilku pasujących próbkach ludzkiego pierwotnego kostniakomięsaka i przerzutów do płuc, zlokalizowaliśmy wiele wspólnych populacji komórek pacjentów znajdujących się w obszarach nowotworowych, a porównując je, zidentyfikowaliśmy kilka kluczowych genów, które mogą stanowić cenne cele terapeutyczne w celu zapobiegania przerzutom do płuc.Przestrzenna analiza transkryptomiczna naszych tkanek, takich jak kości, była bardzo trudna ze względu na niemożność zachowania dobrej jakości RNA i morfologii tkanek, przy jednoczesnym przetwarzaniu tkanki serca do sekcji. Nasz protokół wypełnia tę lukę, umożliwiając naukowcom skuteczne zastosowanie przestrzennej analizy transkryptomicznej również do naszych tkanek. Na początek spryskaj skórę myszy 70% etanolem.Następnie za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych otwórz skórę i odsłoń mięsień nogi. Przetnij mięsień wzdłuż nogi, aby wyraźnie zobaczyć kość i delikatnie usuń kość, nie uszkadzając jej. Natychmiast umieść kość w probówce zawierającej 4% paraformaldehydu i umieść rurkę na lodzie.Po pobraniu wszystkich próbek kości umieść probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w chłodnym pomieszczeniu na wytrząsarce orbitalnej na co najmniej 24 godziny. Po utrwaleniu wyjmij tkankę kostną z wytrząsarki oczodołowej i przemyj 1X PBS dwa razy przez trzy minuty każdy. Następnie użyj sterylnych nożyczek preparacyjnych, aby usunąć pozostały mięsień przyczepiony do kości.Ponownie umyj kość 1X PBS przez trzy minuty. Umieść kość w nowym pojemniku zawierającym 20% EDTA o pH 8 i inkubuj na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 140 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp roztwór EDTA świeżym 20% EDTA i powtarzaj mieszanie przez kolejne 30 minut.Po końcowej obróbce EDTA dodaj świeże EDTA i inkubuj pojemnik w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce orbitalnej przez noc. Następnie wyjmij próbki z pojemnika EDTA i umyj je dwukrotnie 1X PBS, aby usunąć pozostałości EDTA. Rozpocznij proces odwadniania, umieszczając kość w 70% etanolu i inkubując ją przez 15 minut z prędkością 140 obr./min.Następnie wyrzuć 70% roztwór etanolu i dodaj 90% roztwór etanolu. Inkubować przez 15 minut przy 140 obr./min. Następnie rozpocznij proces oczyszczania, umieszczając odwodnioną tkankę kostną w nowym pojemniku z ksylenem.Inkubować przez 20 minut przy 140 obr./min. Zastąp zużyty ksylen świeżym ksylenem i inkubuj przez kolejne 20 minut. Następnie umieść oczyszczoną próbkę kości w kasecie do osadzania i rozpocznij infiltrację woskiem.Inkubować przez 30 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wyrzuć zużyty wosk. Dodaj nowy wosk i inkubuj przez kolejne 30 minut.Następnie wymień wosk i inkubuj przez kolejne 45 minut. Ostrożnie umieść kość w formie w żądanej orientacji. Pozwól woskowi zestalić się na zimnej powierzchni.Przechowuj blok w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu pokrojenia. Następnie przygotuj sprzęt do sekcji. Spryskaj wszystkie powierzchnie robocze i narzędzia roztworami odkażającymi, aby usunąć RNazy.Ustaw również łaźnię wodną z podwójnie destylowaną wodą o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Wyczyść ostrze mikrotomu 70% etanolem, aby usunąć olej, a następnie odkaż, aby usunąć RNazy. Zamocuj ostrze na mikrotomie i upewnij się, że kąt prześwitu jest ustawiony na 10 stopni.Spryskaj pęsety, szczotki i sondy roztworami odkażającymi i przechowuj je w jednym pojemniku na lód. Przygotuj kąpiel lodową, dodając podwójnie destylowaną wodę do innego wiadra z lodem. Rozpocznij proces cięcia, umieszczając blok FFPE na mikrotomie.Ustaw mikrotom na przycinanie lub ustaw grubość zwoju na 14 mikrometrów. Rozpocznij przycinanie próbki i kontynuuj, aż tkanka będzie widoczna. Uwodnij blok FFPE, umieszczając go w łaźni lodowej.Zabezpiecz uwodnioną próbkę w zacisku na próbkę mikrotomu. Dopasuj go do ostrza i ustaw grubość zwoju na pięć mikrometrów. Rozpocznij cięcie tkanki.Zbierz pociętą tkankę za pomocą zimnej pęsety i szczotek i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Umieść tkankę na szkiełku podstawowym i inkubuj w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Wysuszyć szkiełko przez noc w piekarniku w temperaturze pokojowej.Przygotowane szkiełko należy przechowywać w pudełku na szkiełka w temperaturze pokojowej. Za pomocą tej metody przygotowano zdemineralizowane próbki kości FFPE z lustrzanych kości udowych. Przebieg czasu odwapnienia został zoptymalizowany poprzez porównanie nieodwapnionych kości udowych z tymi odwapnionymi przez trzy i 24 godziny.Barwienie H&E wykazało, że krótszy czas odwapnienia prowadził do pęknięć i uszkodzeń skrawków, podczas gdy 24-godzinny proces zapewnił lepszą jakość histologiczną. Ocena jakości RNA przy użyciu wartości rozkładu fragmentów RNA DV200 wykazała, że odwapnione próbki utrzymywały wyniki DV200 powyżej 50%, co nadaje się do analiz takich jak scRNA-seq lub transkryptomika przestrzenna. Jednak wydłużony czas inkubacji spowodował spadek integralności RNA i dlatego nie jest zalecany.

methods-to-enable-spatial-transcriptomics-of-bone-tissues

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji kości długich kończyn tylnych (kości udowych i piszczelowych) od myszy laboratoryjnej. Dalej opisujemy szybką technikę izolacji szpiku kostnego od tych kości, która wykorzystuje wirowanie do usuwania szpiku kostnego z przestrzeni szpiku kostnego.

Mysia kończyna tylna Sekcja kości długich i izolacja szpiku kostnego

Ten protokół opisuje mikrodysekcję laserową do izolacji chrząstki i kości ze świeżo zamrożonych fragmentów zarodka myszy. Chrząstka i kość mogą być szybko uwidocznione przez barwienie fioletem krezylo i precyzyjnie zebrane w celu uzyskania wysokiej jakości RNA do analizy transkryptomicznej.

Laserowe wychwytywanie mikrodysekcji chrząstki embrionalnej i kości myszy w celu analizy ekspresji genów

Tutaj opisujemy protokół dostrajania regionów zainteresowania (ROI) dla technologii Przestrzennej Omiki, aby lepiej scharakteryzować mikrośrodowisko guza i zidentyfikować określone populacje komórek. W przypadku testów proteomicznych zautomatyzowane, dostosowane protokoły mogą kierować wyborem ROI, podczas gdy testy transkryptomiczne można precyzyjnie dostroić przy użyciu ROI tak małych jak 50 μm.

Profilowanie przestrzenne ekspresji białek i RNA w tkance: podejście do precyzyjnego dostrajania wirtualnej mikrodysekcji

W artykule przedstawiono protokół umożliwiający kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomii RNA gospodarza, wirusowego, grzybiczego i mikrobiomowego z fragmentów tkanek osadzonych w parafinie z formaliną zafiksowanymi w parafinę za pomocą Stereo-seq, co umożliwia mapowanie różnorodnych transkryptomów w wysokiej rozdzielczości, jednocześnie zachowując architekturę tkanek.

Kompleksowe profilowanie przestrzenne transkryptomów niezależnych od gatunku za pomocą stereo-seq

W tym artykule przedstawiono protokół korzystania z DeepSpaceDB, dynamicznej, interaktywnej bazy danych do transkryptomiki przestrzennej, oferującej przepływy pracy analizy i przykłady do badania organizacji tkanek i ekspresji genów związanych z chorobą.

Eksploracja zbiorów danych transkryptomiki przestrzennej przy użyciu bazy danych DeepSpaceDB

Protokół ten obejmuje krok po kroku workflow dla zwapniałych próbek naczyniowych: obsługę tkanek, odwapnianie, walidację RNA, wykrywanie poziomu zwapnienia oraz strategie wyboru regionów zainteresowania na Nanostring GeoMx Digital Spatial Profilere (DSP). Celem jest przedstawienie kompleksowej metody zachowania morfologii tkanek naczyniowych oraz RNA do wiarygodnej analizy transkryptomii przestrzennej.

Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Mezenchymalne komórki macierzyste są zwykle pozyskiwane ze szpiku kostnego i wymagają hodowli ekspansywnej. Gdy próbki krzepną przed przetworzeniem, można zastosować protokół z użyciem (enzymatycznej) urokinazy leku trombolitycznego w celu degradacji skrzepu. W ten sposób komórki są uwalniane i dostępne do hodowli ekspansyjnej. Protokół ten stanowi szybką i niedrogą alternatywę dla ponownego próbkowania.

Enzymatyczna metoda ratowania mezenchymalnych komórek macierzystych z zakrzepłych próbek szpiku kostnego

MRP4 reguluje różne cykliczne zdarzenia sygnalizacyjne zależne od nukleotydów, w tym niedawno wyjaśnioną rolę w migracji komórek. Opisujemy bezpośrednie, ale wieloaspektowe podejście do rozwikłania dalszych celów molekularnych MRP4, co skutkuje identyfikacją unikalnego interaktomii MRP4, który odgrywa kluczową rolę w precyzyjnej regulacji migracji fibroblastów.

Metody badania kompleksów makromolekularnych zawierających Mrp4 w regulacji migracji fibroblastów

Drosophila i systemy krwiotwórcze ssaków mają wiele wspólnych cech, co czyni Drosophila atrakcyjnym modelem genetycznym do badania hematopoezy. Tutaj pokazujemy rozwarstwienie i montaż głównego larwalnego narządu krwiotwórczego do immunohistochemii. Opisano również metody oznaczania różnych larwalnych przedziałów krwiotwórczych, w tym krążących hemocytów i siedzących komórek krystalicznych.

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

Poznaj metody dekalcynacji tkanki kostnej z zachowaniem wysokiej jakości RNA, niezbędne do przestrzennej analizy transkryptomicznej w badaniach nad osteosarkomem. Technika ta umożliwia identyfikację genów kluczowych dla rozwoju przerzutów.

Metody umożliwiające przestrzenną transkryptomikę tkanek kostnych

Przeglądaj więcej filmów