Metoda oparta na ekstrakcji apoplastów w celu poprawy czystości rekombinowanego białka wytwarzanego przez rośliny
July 5th, 2024
Oczyszczanie białek rekombinowanych z systemów roślinnych jest zwykle kwestionowane przez białka roślinne. Praca ta zapewnia metodę skutecznej ekstrakcji i oczyszczania wydzielanego rekombinowanego białka z apoplastu Nicotiana benthamiana.
Zbadaliśmy, w jaki sposób ekstrahować rekombinowane białka z komórek roślinnych. Bardziej oficjalnie odpowiedzieliśmy na pytanie, czy metoda ekstrakcji białka apoplastowego jest wykonalna w przypadku zastosowania do białek rekombinowanych. Ta metoda ekstrakcji sprawdza białka wydzielane do apoplastu, dzięki czemu mają one wyższą jednorodność.
Nie ma potrzeby niszczenia komórek, co zmniejsza interferencję ze strony białek wewnątrzkomórkowych i późniejsze koszty oczyszczania komórki. Skupimy się na tym, jak zwiększyć wydzielanie białek rekombinowanych w górnej przestrzeni roślinnej, aby jeszcze bardziej poprawić efektywność metody ekstrakcji białek apoplastowych. Aby zaobserwować subkomórkową lokalizację GFP po 48 godzinach agroinfiltracji Nicotiana benthamiana, wybierz płaski liść i wykonaj sześciomilimetrowy otwór za pomocą dziurkacza.
Wlej 30% roztwór sacharozy na szklane szkiełko. Umieść próbkę liścia tyłem do góry i przykryj ją szkłem nakrywkowym. Zebrać nienaruszone, świeże liście N. benthamiana wykazujące ekspresję rekombinowanego GFP po trzech dniach od agroinfiltracji i zważyć liście.
Opłucz blaszkę liściową wstępnie schłodzoną, wysterylizowaną, podwójnie destylowaną wodą, aby usunąć zanieczyszczenia. Zanurz 20 gramów abaksjalną stroną do dołu w 500 mililitrach wstępnie schłodzonego 100-milimolowego buforu fosforanowego w zlewce o pojemności 1,000 mililitrów. Przykryj liście nylonową przędzą o drobnych oczkach o oczkach 100 i plastikową płytką.
Podłączyć zlewkę do pompy próżniowej. Zastosuj próżnię 0,8 megapaskali przez minutę, a następnie szybko przywróć ciśnienie atmosferyczne. Usuń liście z bufora i delikatnie osusz chłonnym papierem.
Zwiń liście i owiń je przędzą siatkową. Do zbierania apoplastycznego płynu myjącego lub AWF należy umieścić zwinięte liście czubkiem do góry w 50-mililitrowych probówkach wirówkowych z przędzą siatkową przymocowaną za pomocą nasadek probówki. Odwirować liście w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Usuń liście i zbierz AWF za pomocą pipety. Dodaj żywicę nikielową Sepharose excel do probówki w stosunku jeden do 1 000 w stosunku do objętości ekstraktu białkowego. Przemyć żywicę niklową trzykrotnie 10-krotnością objętości żywicy podwójnie destylowanej wody i buforu fosforanowego, kolejno oddzielnie.
Inkubować ekstrakt białkowy z żywicą niklową przez dwie godziny, aby umożliwić pełne wiązanie, a następnie wirować w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia niezwiązanych białek w supernatancie. Przemyć trzykrotnie 20-krotnością objętości żywicy buforu fosforanowego. Po ostatnim praniu dodaj 10-krotność objętości żywicy 250 milimolowego imidazolu, aby wymyć GFP His.
Odwirować mieszaninę w stężeniu 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant. Analiza Western blot potwierdziła przejściową ekspresję 30-kilodaltonowego rekombinowanego białka GFP His w N. benthamiana. Mikroskopia fluorescencyjna wykazała obecność GFP His w apoplastach.
Białka AWF ekstrahowane przez wirowanie infiltracji próżniowej zawierają również GFP His. Spośród ośmiu badanych roztworów ekstrakcyjnych, bufor fosforanowy wyekstrahował największą ilość AWF i GFP His. Porównanie buforu fosforanowego o zmiennym pH wykazało poprawę ekstrakcji AWF i GFP His w warunkach obojętnych do łagodnie zasadowych.
Dodatkowo 100-milimolowy bufor fosforanowy wykazał maksymalną skuteczność w odzyskiwaniu AWF i GFP His. Za pomocą 100-milimolowego buforu fosforanowego odzyskano z apoplastu 495 mikrogramów całkowitych białek AWF na gram świeżego liścia. Wyekstrahowany AWF zawierał 10 mikrogramów GFP His, co odpowiadało około 18% GFP His w całkowitym rozpuszczalnym białku.
Po chromatografii powinowactwa do niklu, GFP Jego czystość osiągnęła 84,3% z ekstrakcji AWF, znacznie wyższą niż czystość 44,9% osiągnięta przez ekstrakcję całkowitym rozpuszczalnym białkami.
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy ekstrakcji białek rekombinowanych z komórek roślinnych, ze szczególnym skupieniem na wykonalności metody ekstrakcji białek apoplastowych. Metoda ma na celu uzyskanie bardziej jednorodnych białek rekombinowanych wydzielonych do apoplastu Nicotiana benthamiana, zmniejszając ingerencję białek wewnątrzkomórkowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Ekstrakcja i oczyszczanie białek
- Biotechnologia roślin
- Produkcja białek rekombinowanych
Tło
- Wyzwania tradycyjnych metod oczyszczania białek w roślinach
- Znaczenie apoplastu w wydzielania białek
- Poszukiwanie bardziej efektywnych technik ekstrakcji
Stosowane metody
- Infiltracja próżniowa i wirowanie do ekstrakcji białek
- Nicotiana benthamiana jako organizm modelowy
- Analiza Western blot i mikroskopia fluorescencyjna
Główne wyniki
- Zidentyfikowano optymalne warunki do ekstrakcji płynu do płukania apoplastu (AWF)
- Osiągnięto znaczny wzrost czystości docelowego białka GFP His
- Wykazano skuteczność buforu fosforanowego do ekstrakcji
Wnioski
- Badanie potwierdza wykonalność ekstrakcji białek rekombinowanych z apoplastu bez destrukcji komórek
- Ta metoda zwiększa efektywność oczyszczania białek w systemach roślinnych, istotną dla badań biochemicznych i zastosowań
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Purification of plant-produced recombinant proteins is a critical bottleneck for biopharma R&D, especially when targeting therapeutic-grade purity and structural consistency. The apoplast-extraction method enables higher purity and homogeneity by isolating secreted proteins, reducing intracellular contaminants and downstream purification complexity. This approach strengthens predictive confidence in plant-based expression systems at the discovery and preclinical interface.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of secreted recombinant proteins with minimized intracellular interference.
- Improves mechanistic de-risking by ensuring proteins reflect intended post-translational modifications.
- Supports target confidence by delivering structurally consistent antigens or antibodies for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of highly purified proteins for assay development and screening workflows.
- Enhances reproducibility and standardization by reducing sample heterogeneity.
- Improves scalability and platform reuse for plant-based protein production pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by providing proteins with native-like glycosylation profiles.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting consistent protein quality.
- Reduces risk of batch-to-batch variability in preclinical studies involving plant-derived proteins.
Pipeline & Workflow Integration
This apoplast-extraction method positions plant-based expression systems as viable platforms from early discovery through preclinical research, particularly for secreted therapeutic proteins.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating secreted proteins with minimal contamination.
- Screening: Delivers assay-ready proteins with high purity and reproducibility for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs (e.g., protein yield, purity) to compare extraction conditions and optimize workflows.
- Translational Research: Ensures protein modifications align with therapeutic requirements, supporting biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized extraction protocol adaptable across plant-based production projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in plant-derived protein studies.
- Operational Value: Streamlines purification, enhances reproducibility, and supports scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and reduces late-stage biological risk for plant-based therapeutics.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of plant expression projects based on achievable protein purity and consistency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant molecular biology and protein purification techniques.
- Needs access to vacuum infiltration, centrifugation, and affinity chromatography infrastructure.
- Demands cross-team standardization for buffer conditions and extraction protocols.
- May require adaptation for different plant species or recombinant protein targets.
- Extraction efficiency and protein yield may vary with buffer composition and plant health.
