Metoda oparta na ekstrakcji apoplastów w celu poprawy czystości rekombinowanego białka wytwarzanego przez rośliny
5 lipca 2024
Oczyszczanie białek rekombinowanych z systemów roślinnych jest zwykle kwestionowane przez białka roślinne. Praca ta zapewnia metodę skutecznej ekstrakcji i oczyszczania wydzielanego rekombinowanego białka z apoplastu Nicotiana benthamiana.
Zbadaliśmy, w jaki sposób ekstrahować rekombinowane białka z komórek roślinnych. Bardziej oficjalnie odpowiedzieliśmy na pytanie, czy metoda ekstrakcji białka apoplastowego jest wykonalna w przypadku zastosowania do białek rekombinowanych. Ta metoda ekstrakcji sprawdza białka wydzielane do apoplastu, dzięki czemu mają one wyższą jednorodność.
Nie ma potrzeby niszczenia komórek, co zmniejsza interferencję ze strony białek wewnątrzkomórkowych i późniejsze koszty oczyszczania komórki. Skupimy się na tym, jak zwiększyć wydzielanie białek rekombinowanych w górnej przestrzeni roślinnej, aby jeszcze bardziej poprawić efektywność metody ekstrakcji białek apoplastowych. Aby zaobserwować subkomórkową lokalizację GFP po 48 godzinach agroinfiltracji Nicotiana benthamiana, wybierz płaski liść i wykonaj sześciomilimetrowy otwór za pomocą dziurkacza.
Wlej 30% roztwór sacharozy na szklane szkiełko. Umieść próbkę liścia tyłem do góry i przykryj ją szkłem nakrywkowym. Zebrać nienaruszone, świeże liście N. benthamiana wykazujące ekspresję rekombinowanego GFP po trzech dniach od agroinfiltracji i zważyć liście.
Opłucz blaszkę liściową wstępnie schłodzoną, wysterylizowaną, podwójnie destylowaną wodą, aby usunąć zanieczyszczenia. Zanurz 20 gramów abaksjalną stroną do dołu w 500 mililitrach wstępnie schłodzonego 100-milimolowego buforu fosforanowego w zlewce o pojemności 1,000 mililitrów. Przykryj liście nylonową przędzą o drobnych oczkach o oczkach 100 i plastikową płytką.
Podłączyć zlewkę do pompy próżniowej. Zastosuj próżnię 0,8 megapaskali przez minutę, a następnie szybko przywróć ciśnienie atmosferyczne. Usuń liście z bufora i delikatnie osusz chłonnym papierem.
Zwiń liście i owiń je przędzą siatkową. Do zbierania apoplastycznego płynu myjącego lub AWF należy umieścić zwinięte liście czubkiem do góry w 50-mililitrowych probówkach wirówkowych z przędzą siatkową przymocowaną za pomocą nasadek probówki. Odwirować liście w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Usuń liście i zbierz AWF za pomocą pipety. Dodaj żywicę nikielową Sepharose excel do probówki w stosunku jeden do 1 000 w stosunku do objętości ekstraktu białkowego. Przemyć żywicę niklową trzykrotnie 10-krotnością objętości żywicy podwójnie destylowanej wody i buforu fosforanowego, kolejno oddzielnie.
Inkubować ekstrakt białkowy z żywicą niklową przez dwie godziny, aby umożliwić pełne wiązanie, a następnie wirować w temperaturze 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia niezwiązanych białek w supernatancie. Przemyć trzykrotnie 20-krotnością objętości żywicy buforu fosforanowego. Po ostatnim praniu dodaj 10-krotność objętości żywicy 250 milimolowego imidazolu, aby wymyć GFP His.
Odwirować mieszaninę w stężeniu 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant. Analiza Western blot potwierdziła przejściową ekspresję 30-kilodaltonowego rekombinowanego białka GFP His w N. benthamiana. Mikroskopia fluorescencyjna wykazała obecność GFP His w apoplastach.
Białka AWF ekstrahowane przez wirowanie infiltracji próżniowej zawierają również GFP His. Spośród ośmiu badanych roztworów ekstrakcyjnych, bufor fosforanowy wyekstrahował największą ilość AWF i GFP His. Porównanie buforu fosforanowego o zmiennym pH wykazało poprawę ekstrakcji AWF i GFP His w warunkach obojętnych do łagodnie zasadowych.
Dodatkowo 100-milimolowy bufor fosforanowy wykazał maksymalną skuteczność w odzyskiwaniu AWF i GFP His. Za pomocą 100-milimolowego buforu fosforanowego odzyskano z apoplastu 495 mikrogramów całkowitych białek AWF na gram świeżego liścia. Wyekstrahowany AWF zawierał 10 mikrogramów GFP His, co odpowiadało około 18% GFP His w całkowitym rozpuszczalnym białku.
Po chromatografii powinowactwa do niklu, GFP Jego czystość osiągnęła 84,3% z ekstrakcji AWF, znacznie wyższą niż czystość 44,9% osiągnięta przez ekstrakcję całkowitym rozpuszczalnym białkami.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje ekstrakcję białek rekombinowanych z komórek roślinnych, ze szczególnym uwzględnieniem wykonalności metody ekstrakcji białek z apoplastu. Metoda ta ma na celu uzyskanie białek rekombinowanych o wyższej homogeniczności, wydzielanych do apoplastu Nicotiana benthamiana, przy jednoczesnym ograniczeniu interferencji białek wewnątrzkomórkowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Ekstrakcja i oczyszczanie białek
- Biotechnologia roślin
- Produkcja białek rekombinowanych
Wstęp
- Wyzwania tradycyjnych metod oczyszczania białek z roślin
- Znaczenie apoplastu w sekrecji białek
- Dążenie do opracowania bardziej efektywnych technik ekstrakcji
Zastosowane metody
- Infiltracja próżniowa i wirowanie w celu ekstrakcji białek
- Nicotiana benthamiana jako organizm modelowy
- Analiza Western blot i mikroskopia fluorescencyjna
Główne wyniki
- Zidentyfikowano optymalne warunki ekstrakcji płynu z płukania apoplastycznego (AWF)
- Osiągnięto znaczący wzrost czystości docelowego białka GFP His
- Wykazano skuteczność buforu fosforanowego w procesie ekstrakcji
Wnioski
- Badanie potwierdza możliwość ekstrakcji białek rekombinowanych z apoplastu bez konieczności rozbijania komórek
- Metoda ta zwiększa wydajność oczyszczania białek w systemach roślinnych, co ma znaczenie dla badań biochemicznych i zastosowań praktycznych
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Oczyszczanie rekombinowanych białek produkowanych w roślinach stanowi krytyczne wąskie gardło w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym, szczególnie w przypadku dążenia do uzyskania czystości klasy terapeutycznej oraz spójności strukturalnej. Metoda ekstrakcji z apoplastu umożliwia uzyskanie wyższej czystości i homogeniczności poprzez izolację białek wydzielanych, co redukuje ilość zanieczyszczeń wewnątrzkomórkowych oraz stopień skomplikowania późniejszych etapów oczyszczania. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną roślinnych systemów ekspresyjnych na etapie odkrywania leków i badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia walidację funkcjonalną wydzielanych białek rekombinowanych przy zminimalizowanych zakłóceniach wewnątrzkomórkowych.
- Poprawia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie, że białka odzwierciedlają zamierzone modyfikacje potranslacyjne.
- Zwiększa pewność co do celu poprzez dostarczenie strukturalnie spójnych antygenów lub przeciwciał do dalszych analiz.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie wysokiej czystości białek do opracowywania testów i procesów przesiewowych.
- Zwiększa powtarzalność i standaryzację poprzez redukcję heterogeniczności próbek.
- Poprawia skalowalność i możliwość ponownego wykorzystania platform w rurociągach produkcji białek pochodzenia roślinnego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami translacyjnymi w zakresie biomarkerów poprzez dostarczanie białek o profilach glikozylacji zbliżonych do naturalnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej dzięki utrzymaniu spójnej jakości białek.
- Zmniejsza ryzyko zmienności między partiami w badaniach przedklinicznych z wykorzystaniem białek pochodzenia roślinnego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda ekstrakcji z apoplastu pozycjonuje systemy ekspresyjne oparte na roślinach jako funkcjonalne platformy, od wczesnego etapu odkrywania leków po badania przedkliniczne, w szczególności w przypadku wydzielanych białek terapeutycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolację białek wydzielanych przy minimalnym zanieczyszczeniu.
- Przesiewanie: Dostarcza białek gotowych do analizy, charakteryzujących się wysoką czystością i powtarzalnością, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Analityka: Zapewnia wyniki ilościowe (np. wydajność białka, czystość) w celu porównania warunków ekstrakcji i optymalizacji procesów.
- Badania translacyjne: Zapewnia zgodność modyfikacji białek z wymaganiami terapeutycznymi, wspierając badania nad biomarkerami i skutecznością.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany protokół ekstrakcji, który można zaadaptować w różnych projektach produkcji opartych na roślinach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad białkami pochodzenia roślinnego.
- Wartość operacyjna: Usprawnia procesy oczyszczania, zwiększa powtarzalność i wspiera skalowalne przepływy pracy.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach rozwoju terapeutyków opartych na roślinach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację projektów ekspresji roślinnej z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o osiągalną czystość i spójność białek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu biologii molekularnej roślin oraz technik oczyszczania białek.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury umożliwiającej infiltrację próżniową, wirowanie oraz chromatografię powinowactwa.
- Konieczna jest standaryzacja warunków buforowych i protokołów ekstrakcji pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych gatunków roślin lub docelowych białek rekombinowanych.
- Wydajność ekstrakcji i uzyskowana ilość białka mogą różnić się w zależności od składu buforu oraz stanu zdrowotnego roślin.
