Transformacja mitochondrialna w drożdżach piekarskich w celu zbadania translacji i składania kompleksów oddechowych

Nasze badania dotyczą regulacji syntezy białek mitochondrialnych i ich związku z wewnętrznym zespołem błonowym, kluczowym dla fosforylacji oksydacyjnej. Wykorzystując Saccharomyces cerevisiae jako model, zbadaliśmy molekularny mechanizm funkcji mitochondriów, wykorzystując jego przydatność do szczegółowych badań molekularnych i genetycznych. W badaniach w naszej dziedzinie wykorzystuje się wiele technologii, takich jak między innymi głębokie sekwencjonowanie RNA, technologie multiomiczne, mikroskopia krioelektronowa, bombardowanie z dużą prędkością w celu przekształcenia mitochondriów drożdży.

Wnieśliśmy istotny wkład w zrozumienie roli i mechanizmów działania wielu białek biorących udział w regulacji translacji mitochondriów oraz w składaniu kompleksów oddechowych III i IV. Dotyczy to między innymi białek takich jak MSS51, PET309, PET54, mS38, cvp3, cvp6. Protokół ten jest niezbędnym narzędziem do zrozumienia, w jaki sposób mitoribosomy znajdują StAR w niemitochondrialnych mRNA.

Był to klucz do zrozumienia roli specyficznych nukleotydów mitochondrialnych mRNA w regulacji translacji. Oto kilka przykładów tego, co te techniki mogą rozwiązać. Jedynym dostępnym zasobem do proteinazy sekwencji mitochondrialnych i wykorzystania translacji w mitochondrialnym DNA jest nasz protokół.

Transformacja tych mitochondriów przez bombardowanie z dużą prędkością. Metoda ta dostarczyła bezcennych informacji na temat translacji i montażu kompleksów oddechowych, których w inny sposób nie moglibyśmy uzyskać. Na początek dodaj 1,5 mililitra 70% etanolu do 30 miligramów 0,7 mikrometra cząstek wolframu w mikroprobówce.

Odwirować mieszaninę przy 13 200 G przez 15 minut. Dodaj 1,5 mililitra sterylnej wody do cząstek, a następnie zwiruj i ponownie odwiruj. Po odrzuceniu supernatantu dodać 500 mikrolitrów sterylnego 50% glicerolu do cząstek wolframu.

Aby pokryć cząstki, najpierw dodaj pięć mikrogramów plazmidu o wielkości dwóch mikronów i 15 mikrogramów plazmidu bakteryjnego zawierającego sekwencję mitochondrialną do mikroprobówki umieszczonej na lodzie. Dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny cząstek wolframu do rurki i wiruj. Następnie dodaj cztery mikrolitry jednego molowca spermidyny i ponownie wiruj.

Teraz odpipetuj 100 mikrolitrów lodowatego 2,5 molowego chlorku wapnia do probówki. Po krótkim wirowaniu zawiesinę inkubować na lodzie przez 10 minut. Odwirować cząstki wolframu w temperaturze 13,200 G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie umyj cząstki w 200 mikrolitrach 100% etanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Na koniec ponownie zawiesić cząsteczki wolframu w 60 do 70 mikrolitrach 100% etanolu o temperaturze pokojowej. Aby przygotować materiały biolistyczne, umieść sześć wysterylizowanych uchwytów na nośniki makro na sterylnej szklanej płytce.

Użyj pary sterylnych kleszczyków, aby włożyć nośniki makro do każdego z sześciu uchwytów nośników makro. Odpipetować 10 mikrolitrów cząstek wolframu pokrytych DNA na każdą powierzchnię makronośnika i równomiernie rozprowadzić na całej powierzchni za pomocą końcówki pipety. Zaszczep szczep receptora drożdży roh zero w dwóch mililitrach pożywki YPR.

Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza w obracającym się kole. Następnego dnia przenieś 300 mikrolitrów kultury do probówki zawierającej 30 mililitrów świeżej pożywki YPR. Umieść kulturę na wytrząsarce obrotowej na dwie noce w temperaturze 30 stopni Celsjusza i 200 obrotach na minutę, aż kultura zostanie nasycona.

Odwirować komórki drożdży w temperaturze 600 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 600 mikrolitrach pożywki YPD po odrzuceniu supernatantu. Teraz użyj sterylnego szklanego uchwytu, aby rozprowadzić 100 mikrolitrów zawiesiny komórek drożdży na stałej pożywce do bombardowania.

Po rozprowadzeniu wszystkich kultur inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez jedną do trzech godzin przed bombardowaniem. Na początek dodaj 70% etanolu do komory biolistycznego systemu dostarczania cząstek. Po 15 minutach wytrzyj etanol czystym ręcznikiem papierowym.

Otwórz zawory zbiornika helu, aby ustawić ciśnienie 2000 funtów na cal kwadratowy. Następnie za pomocą sterylnych kleszczyków umieść płytkę bezpieczeństwa na nasadce mocującej i przykręć nasadkę mocującą do rurki przyspieszającej. Użyj kleszczy, aby umieścić nośnik makr skierowany w dół na uchwycie nośnika makro.

Następnie przykręć pokrywę nośnika makr do górnej części nośnika makr. Umieść system startowy mikro nośnika w komorze próżniowej na piątym poziomie od dołu. Następnie umieść talerz zawierający trawnik roh zero strain na drugim poziomie od dna komory.

Ustaw wyłącznik podciśnieniowy odpowietrznika w pozycji podciśnienia. Gdy próżnia osiągnie od 20 do 21 cali słupa rtęci, zmień przełącznik wstrzymania podciśnienia w pozycję wstrzymania. Naciśnij wyłącznik ognia, aby wystrzelić cząsteczki wolframu.

Gdy ciśnienie osiągnie 1,300 funtów na cal kwadratowy, płytka bezpieczeństwa pęknie, wydając trzask. Natychmiast po pęknięciu płytki bezpieczeństwa należy przestawić przełącznik wstrzymania podciśnienia odpowietrznika w pozycję odpowietrznika, aby zwolnić wyłącznik przeciwpożarowy i podciśnienie. Użyj sterylnych kleszczyków, aby ostrożnie usunąć wszelkie zanieczyszczenia z płytki bezpieczeństwa znajdujące się na powierzchni płytki.

Następnie przykryj talerz pokrywką. Na początek inkubuj biolistyczne płytki bombardowania drożdżami w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu nocy. Zaszczepić szczep testowy przeciwnego typu kojarzenia w dwóch mililitrach pożywki YPD przez noc.

Następnego dnia przenieś 150 mikrolitrów kultury szczepu testera na płytkę YPD. Za pomocą sterylnego szklanego uchwytu rozprowadź tester równomiernie na powierzchni płytki i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Użyj aksamitnych podkładek replikujących i stempla replikatora, aby wykonać replikę płytki wzorcowej przekształconego plazmidowego markera auksotroficznego na pożywce dropout.

Następnie powtórzyć na płytce YPD zawierającej trawnik testera i inkubować. Po 48 godzinach powtórzyć płytkę zawierającą tester na selektywnym podłożu, aby wykryć obecność interesującego genu mitochondrialnego. Porównaj płytkę wzorcową i odpowiadające jej kolonie, aby zidentyfikować dodatnie kolonie.

Umieść dodatnie kolonie z płytki głównej na drugiej selektywnej płytce dropout. Trawnik testowy i komórki transformujące połączyły się ze sobą, tworząc mitochondria we wlewie. Oczyszczone dodatnie syntetyczne kolonie rho minus uzyskano z ujemnych płytek URA.

Niektóre dodatnie syntetyczne kolonie roh minus utraciły konstrukt mitochondrialny. Na początek zaszczep dwie probówki zawierające trzy mililitry pożywki YPD syntetycznymi komórkami ujemnymi roh i komórkami drożdży akceptujących. Następnego dnia przenieś 750 mikrolitrów szczepu dawcy i 250 mikrolitrów szczepu receptorowego do sterylnej mikroprobówki.

Po odwirowaniu mieszaniny przez jedną minutę w temperaturze 13,200 G, przenieść kroplę podniebienia komórkowego na płytkę YPD i inkubować. Sprawdź kulturę pod mikroskopem świetlnym pod kątem obecności schmooze. Jeśli obecny jest schmooze, ponownie zawiesić niewielką ilość masy komórkowej w dwóch mililitrach pożywki YPD.

Inkubuj kulturę przez dwie godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza w obracającym się kole. Dobrze wymieszaj mieszaninę. Następnie rozcieńczyć 10 mikrolitrów zawiesiny komórek w 990 mikrolitrach sterylnej wody.

Rozprowadzić 100 mikrolitrów rozcieńczonej kultury na pożywce dropout, która ułatwia wzrost tylko szczepu akceptującego. Powtórzyć powstałe kolonie na niezbędnych pożywkach selektywnych. Po zidentyfikowaniu pozytywnych kolonii należy je ponownie umieścić na tych samych selektywnych pożywkach, aby oczyścić haploidalny szczep przenoszący interesujące nas mitochondrialne DNA.