Izolowanie komórek odpornościowych z mózgu i czaszki myszy

Nasze badania koncentrują się na złożonej odpowiedzi immunologicznej po niedokrwieniu mózgu spowodowanym udarem niedokrwiennym i zatrzymaniem akcji serca. Niedokrwienie mózgu wyzwala aktywację rezydujących komórek odpornościowych w mózgu i infiltrację komórek odpornościowych. Jednak nasze zrozumienie tych komórek odpornościowych pozostaje ograniczone.

Celem naszych badań jest przeanalizowanie pochodzenia stanu odpornościowego oraz funkcjonalnych ról tych komórek mózgu po niedokrwieniu. Ostatnie badania podkreślają zaskakującą rolę czaszki w odpowiedzi immunologicznej mózgu po urazie. Dlatego ważne jest przeanalizowanie zmian w komórkach odpornościowych zarówno w tkance mózgowej, jak i w rdzeniu kostnym czaszki po niedokrwieniu mózgu.

W tym celu kluczowy jest krok polegający na uzyskaniu wystarczającej liczby wysokiej jakości komórek odpornościowych do dalszej analizy. Nasze protokoły umożliwiają badaczom szybkie uzyskanie dużych ilości dostępnych komórek odpornościowych z mózgu i rdzenia kostnego czaszki. Protokół komórek odpornościowych mózgu wykorzystuje mechaniczne rozdzielcze podejście w niskich temperaturach, co zapewnia lepszą ochronę profili transkrypcyjnych i proteomicznych.

Protokół rdzenia kostnego czaszki jest prosty, ale skuteczny w wydobywaniu komórek rdzenia kostnego z czaszki. Kontynuować będziemy nasze kompleksowe badania nad wpływem niedokrwienia mózgu na komórki odpornościowe w tkance mózgowej i czaszce. Biorąc pod uwagę, że neurozapalenie odgrywa kluczowa rolę w przeszłej fizjologii urazu mózgu po niedokrwieniu, nasze badania mają na celu odkrycie nowych docelowych terapii ochrony mózgu po udarze niedokrwiennym lub zatrzymaniu akcji serca.

Aby uzyskać pojedynczą zawiesinę komórek z izolowanych mysich mózgu, umieść mózg w wstępnie schłodzonym szkle 15-mililitrowym homogenizatorze zawierającym odpowiednią ilość zimnego buforu Hanksa lub HBSS. Użyj luźnego tłoczącego tłoka, aby delikatnie i powoli rozdzielać tkankę mózgową za pomocą około 100 do 120 uderzeń na lodzie. Przefiltruj powstałą zawiesinę tkanki mózgowej przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikrometrów w 50-mililitrową rurkę wirówkową.

Spłucz rurkę wirówkową pięcioma mililitraami HBSS i kontynuuj filtrację, aby zmaksymalizować kolekcję komórek. Wiruj zawiesinę przefiltrowanej tkanki w wirówce przy 550 G przez sześć minut w czterech stopniach Celsjusza. Usuń nadstan przy użyciu aspiranta próżniowego i zawieś paletę komórek w jednym mililitru 30% roztworu gradientu gęstości izotonicznej. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej rurki wirówkowej.

Dodaj odpowiednią ilość 30% roztworu gradientu gęstości i delikatnie odwróć rurkę, aby zapewnić dokładne zmieszanie. Natychmiast wiruj rurkę przy 840 5G z przyspieszeniem i hamowaniem ustawionym na poziomie trzecim przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza. Po zakończeniu delikatnie wyjmuj rurkę z wirówki bez trząsania i ostrożnie aspiracyjnie usuń górną warstwę mieliny za pomocą jednomilimetrowego końcówki podłączonego do próżni, a następnie aspiracyjnie usuń nadstan, pozostawiając jeden do dwóch mililitrów i zawieś paletę komórek z minimum 10 mililitrów zimnego HBSS.

Wiruj przy 550 G przez sześć minut w czterech stopniach Celsjusza. Przemyj jeszcze raz z minimum siedmiu mililitrów zimnego HBSS i ponownie wiruj po usunięciu jak największej ilości nadstanu, zawieś komórki w 100 do 200 mikrolitrach buforu cytometrii przepływowej do analizy cytometrii przepływowej. Aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek rdzenia kostnego z mysich kości czołowych, pod mikroskopem sekcującym ostrożnie zdejmij oponę twardą z izolowanej czaszki za pomocą tępych kleszczy.

Umieść kości czołowe w naczyniu zawierającym PBS utrzymywanym na lodzie i za pomocą jednomilitrowej pipety przepłucz je, upewniając się, że usunięto resztki krwi z jej powierzchni, przenieś kości czołowe do nowego naczynia zawierającego wystarczającą ilość świeżego zimnego PBS, aby zanurzyć je. Użyj sterylnych nożyczek, aby pokroić kości czołowe na około trzy milimetrowe przez trzy milimetrowe fragmenty w zimnym PBS. Za pomocą igły 18-calowej wykonaj dziurę na dnie 500-mikrolitrowej rurki mikrowirówkowej.

Włóż tę rurkę do 1,5-mililitrowej mikrowirówkowej rurki zawierającej 20 mikrolitrów zimnego PBS. Następnie przenieś fragmenty kości czołowych do 500-mikrolitrowej rurki. Wiruj zestaw przy 10 000 G przez 30 sekund w czterech stopniach Celsjusza.

Zawieś zebrane komórki rdzenia kostnego kości czołowych w 500 mikrolitrach buforu lizy krwinek czerwonych i inkubatoruj w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, przenieś zawiesinę do 15-mililitrowej rurki wirówkowej zawierającej cztery mililitry zimnego PBS, wiruj przy 400 G przez sześć minut w czterech stopniach Celsjusza. Przemyj jeszcze raz z pięcioma mililitrami zimnego PBS. Na koniec zawieś paletę komórek w odpowiednim buforze.