Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

W moim laboratorium badamy komunikację międzyorganellową, która przybiera formę kontaktu błonowego i ich rolę w utrzymaniu zdrowia komórek, a także w patogenezie chorób. Szczególnie interesują nas kontakty błonowe między mitochondriami a retikulum endoplazmatycznym i próba zrozumienia, w jaki sposób są one regulowane i jak ich rozregulowanie może prowadzić do neurodegeneracji. Chociaż wiemy, że kontakty mitochondrialne ER są ważne dla zdrowia komórek i że ich rozregulowanie wiąże się z wieloma chorobami, nie wiemy zbyt wiele o tym, jak regulowany jest ich poziom.

Pierwszym krokiem, aby rozwiązać ten problem, jest ustanowienie prostego, niezawodnego protokołu pomiaru poziomu kontaktów mitochondrialnych ER w komórkach. Nasz test rozszczepionej lucyferazy oferuje łatwiejszy i szybszy sposób ilościowego określania kontaktów mitochondrialnych ER w żywych komórkach w porównaniu z większością testów. Wykorzystujemy dwie podzielone połówki lucyferazy renilli, jedną połowę ukierunkowaną na ER, a drugą na mitochondria.

Można je ponownie złożyć razem tylko wtedy, gdy ER i błony mitochondrialne mają bliski kontakt, co skutkuje odtworzoną lucyferazy o pełnej aktywności enzymatycznej. Ta metoda jest prosta, odpowiednia do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i łatwo dostępna dla wielu laboratoriów. Mamy nadzieję, że przyczyni się to do postępu w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych poprzez identyfikację molekularnych i genetycznych modulatorów kontaktów mitochondrialnych ER, które można dalej rozwijać w środki terapeutyczne.

Nasze wyniki utorowały drogę do ważnych pytań, takich jak to, w jaki sposób różne leki lub kombinacje leków wpływają na kontakty mitochondrialne ER i jacy są ważni gracze molekularni stojący za tymi kontaktami? Dzięki tym pytaniom możemy lepiej zrozumieć mechanizm kontaktów mitochondrialnych ER i znaleźć sposoby zwalczania powiązanych chorób. Na początek utrzymuj HEK293T komórek w pożywkach hodowlanych zawierających DMEM z 10% FBS w wilgotnym inkubatorze.

Sprawdź zbieżność płytki pod mikroskopem. Gdy komórki osiągną około 80 do 90% konfluencji, usuń pożywkę i umyj je 10 mililitrami DPBS. Następnie wyjmij DPBS z naczynia hodowlanego.

Potraktuj komórki jednym mililitrem 0,05% trypsyny-EDTA, czerwieni fenolowej i inkubuj komórki przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po wyjęciu płytki z inkubatora dodaj dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej, aby zatrzymać reakcję trypsyny i wymieszaj pipetując, aby usunąć wszelkie pozostałe komórki. Teraz przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki.

Wirować przy 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu pożywki ponownie zawiesić granulki komórek w jednym mililitrze świeżego podłoża. Aby umieścić komórki w płytce sześciodołkowej, połącz niezbędną objętość komórek z 13 mililitrami pożywki w probówce o pojemności 50 mililitrów.

Następnie dozuj dwa mililitry rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdej z sześciu studzienek i delikatnie postukaj w płytkę ze wszystkich stron, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Następnie umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na noc. Na początek weź HEK293T hodowlane z inkubatora.

Odessać istniejące pożywki hodowlane z każdej studzienki i dodać dwa mililitry świeżej pożywki na studzienkę. W celu transekcji komórek za pomocą podzielonego DNA osocza pętli R, wymieszaj DNA i PEI w 200 mikrolitrach DMEM w 1,7 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej dla każdej studzienki. Szybko wiruj DNA i PEI na poziomie ósmym przez około dwie sekundy, aby upewnić się, że dobrze się wymieszają i tworzą kompleks, a następnie krótko odwiruj je w mini-wirówce.

Po inkubacji upuść mieszaninę na powierzchnię pożywki hodowlanej na sześciodołkowej płytce zawierającej komórki. Delikatnie postukaj w płytkę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę i inkubuj ją w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć godzin. Następnie wyjmij płytkę z sześciodołkową płytką z inkubatora.

Odessać pożywkę i umyć każdą studzienkę dwoma mililitrami DPBS. Po usunięciu DPBS dodaj 350 mikrolitrów 0,05% czerwieni fenolowej trypsyny-EDTA. Pod koniec inkubacji dodaj 1,7 mililitra pożywki do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję trypsyny.

Teraz przenieś komórki wraz z pożywką do 50-mililitrowej probówki i wiruj z prędkością 300 g przez pięć minut w wirówce stołowej. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą jednego mililitra świeżej pożywki. Aby wysiać komórki na 96-dołkowej płytce pokrytej poli-D-lizyną, dodaj niezbędną objętość komórek w 50-mililitrowej probówce wraz z odpowiednią objętością pożywki.

Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 100 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdej z 96 studzienek. Inkubuj komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Na początek podzielona pętla R z nasionami transfekowała HEK293T komórki na 96-dołkowej płytce pokrytej poli-D-lizyną.

Następnie przygotuj trzy świeże roztwory rhosin, Ehop-016 i ZCL278 w 1,7 mililitra mikrofuge 2. Dodać substrat z żywych komórek dla lucyferazy waniliowej, rozcieńczony 1 do 2 000 do końcowego stężenia 30 milimolowych do każdego roztworu. Aby przygotować 0,5, 5 i 50 mikromolowe roztwory ZCL278, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie przy użyciu początkowego 50-mikromolowego ZCL278 w pożywkach hodowlanych.

Następnie wyjąć pożywkę z każdej studzienki z 96-dołkowej płytki zawierającej transfekowane komórki. Dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny pożywek chemicznych i substratowych do każdej studzienki. Po inkubacji komórek przez godzinę, dwie godziny lub pięć godzin, załaduj płytkę do czytnika płytek luminescencyjnych i zmierz luminescencję.

Przed rozpoczęciem upewnij się, że czytnik płytek jest włączony. Uzyskaj dostęp do oprogramowania czytnika mikropłytek i kliknij przycisk Nowa sesja, aby utworzyć nowy plik. Kliknij przycisk Inkubator, aby ustawić temperaturę czytnika płytek na 37 stopni Celsjusza.

Sprawdź opcję temperatury i wpisz 37 stopni Celsjusza. W obszarze Układ blachy wybierz opcję Nieznany, a następnie kliknij i przeciągnij studzienkę, aby określić dołki do zmierzenia. Następnie przejdź do Protokołu, kliknij Luminescencja i zachowaj ustawienia domyślne.

Po zakończeniu konfiguracji załaduj płytkę ze zdjętą pokrywką do czytnika płytek i wybierz opcję Uruchom płytkę. Kliknij Start, a pojawi się okno Zapisz plik. Zmień nazwę pliku i kliknij przycisk Zapisz.

Po zakończeniu odczytu wyjmij płytkę z czytnika płytek, a następnie kliknij opcję Uruchom płytę w opcji, aby ponownie włożyć czytnik. Po zakończeniu umieść płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze do następnego odczytu. Po jednej, dwóch i pięciu godzinach leczenia komórki traktowane rhozyną nie wykazywały znaczących zmian w aktywności lucyferazy w porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi DMSO.

Inhibitor GTPazy Rac EHop-016 wykazywał znacznie niższą aktywność lucyferazy niż DMSO. Komórki traktowane ZCL278 miały znacznie niższą aktywność lucyferazy niż kontrolne DMSO we wszystkich trzech punktach czasowych. Aktywność lucyferazy mierzona po jednej, dwóch i pięciu godzinach po leczeniu wykazała odpowiedź zależną od dawki.

Wyższe stężenia ZCL278 nadal wykazywały znaczące zmiany w porównaniu z kontrolnym DMSO.