Name: Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy do pomiaru kontaktów retikulum endoplazmatycznego z mitochondriami w żywych komórkach HEK293T. Ta metoda umożliwia ilościową analizę komunikacji między organellami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Dr. Jeffreyowi Goldenowi (Cedars-Sinai Medical Center) za krytyczną recenzję manuskryptu. Prace te zostały częściowo sfinansowane przez National Institute of Neurological Disease and Stroke (NINDS, R01NS113516).

1. Utrzymanie i wysiewanie komórek (Dzień 1)
<ol>
	<li>Utrzymać HEK293T komórek w pożywce do hodowli komórkowej zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (w 100 mm szalkach hodowlanych) w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Przed rozpoczęciem sprawdź zbieganie się płytki, oglądając ją pod mikroskopem. Gdy komórki osiągną około 80-90% zbieżności, przygotuj się do wysiewu komórek na 6-dołkowej płytce hodowlanej, usuwając pożywkę i przemywając 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.</li>
	<li>Wyjmij DPBS z szalki hodowlanej i potraktuj komórki 1 ml 0,05% czerwieni fenolowej trypsyny-EDTA. Inkubować przez 3 minuty, następnie wyjąć płytkę z inkubatora i dodać 9 ml pożywki hodowlanej (DMEM z 10% FBS), aby zatrzymać reakcję trypsyny. Powoli pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że wszelkie komórki nadal przyklejone do płytki zostały usunięte. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usuń pożywkę i ponownie zawieś granulki komórek z 1 ml świeżej pożywki (DMEM + 10% FBS).</li>
	<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
	<ol>
		<li>Zapewnij równomierne rozprowadzenie komórek, delikatnie obracając rurkę. Natychmiast wyjąć 10 μl zawiesiny komórek i umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Dodać 90 μl pożywki do tej samej probówki.</li>
		<li>Po delikatnym wymieszaniu komórek i pożywki, pobrać zawiesinę komórek i nanieść 10 μl na każdą z komór hemocytometru, delikatnie pipetując pod szkiełkiem nakrywkowym.</li>
		<li>Używając obiektywu 10x, ustaw ostrość linie siatki hemocytometru pod mikroskopem. Po ustawieniu ostrości policz liczbę komórek w jednym zestawie 16 kwadratów (4 x 4 kwadraty) za pomocą ręcznego licznika zliczania. Powtarzaj, aż wszystkie cztery zestawy po 16 kwadratów zostaną policzone.</li>
		<li>Oblicz całkowitą liczbę komórek/ml, biorąc średnią liczbę komórek (z każdego z 16 kwadratów narożnych) i mnożąc ją przez 105. 
		UWAGA: Zamiast używać hemocytometru do zliczania komórek, można użyć automatycznego licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu liczenia komórek przygotuj się do umieszczenia komórek w 6-dołkowej płytce o gęstości 7,5 × 105 komórek/studzienkę z 2 ml pożywki/dołek. W probówce o pojemności 50 ml dodaj niezbędną objętość komórek wraz z 13 ml pożywki. Dozować 2 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdego z 6 dołków.
	<ol>
		<li>Przed posiewem należy obliczyć liczbę komórek niezbędną do 7,5 × 105 komórek/studzienkę, stosując C1V1 = C2V2, gdzie C1 jest początkową liczbą komórek (liczba komórek/ml), V1 jest objętością potrzebną do początkowej zawiesiny komórek, C2 jest pożądaną docelową gęstością komórek (liczba komórek/ml), a V2 to ostatnia objętość potrzebna do wysiewu komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po dozowaniu delikatnie postukaj w płytkę ze wszystkich stron, aby rozprowadzić komórki, a następnie umieść ją w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez noc.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek za pośrednictwem polietylenoiminy (PEI) i wysiewanie komórek po transfekcji (Dzień 2)
<ol>
	<li>Wyjąć 6-dołkową płytkę z inkubatora i odessać istniejące pożywki hodowlane z każdej studzienki. Dodaj 2 ml świeżej pożywki do dołka.</li>
	<li>Transfekować komórki za pomocą plazmidowego DNA z podziałem Rluc (pCAG-Mito,Rluc, N-T2A-R, lucC, ER-IRES-mCherry) rozpuszczonego w buforze TE (pH 8,0).
	<ol>
		<li>Dla każdej studzienki wymieszać DNA (750 ng) i PEI (stosunek DNA/PEI = 1:3) w 200 μl DMEM w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Szybko wiruj DNA/PEI na poziomie 8 przez około 2 sekundy, aby upewnić się, że dobrze się ze sobą mieszają, tworząc kompleks. Następnie krótko odwiruj w mini wirówce (<3 s).</li>
		<li>Pozostawić mieszaninę DNA/PEI do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodać mieszaninę (upuszczając ją) na powierzchnię pożywki hodowlanej na 6-dołkowej płytce zawierającej komórki. Delikatnie postukać w płytkę (aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę) i inkubować ją w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 6 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotować 96-dołkową płytkę pokrytą poli-D-lizyną (PDL), dodając najpierw 70 μl PDL (50 μg/ml w DPBS) do każdej studzienki i inkubując w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę. Usunąć roztwór PDL, a następnie przemyć każdą studzienkę 2x 100 μl DPBS. Pod koniec drugiego prania upewnij się, że wszystkie pozostałe DPBS zostały usunięte.</li>
	<li>Po 6 godzinach od transfekcji przygotuj się do wysiewu transfekowanych komórek na 96-dołkowej płytce pokrytej PDL.
	<ol>
		<li>Wyjąć z inkubatora 6-dołkową płytkę zawierającą transfekowane komórki, odessać pożywkę i przemyć każdą studzienkę 2 ml DPBS. Po usunięciu DPBS dodać 350 μl 0,05% czerwieni fenolowej Trypsyna-EDTA i inkubować przez 1-2 minuty. Aby zatrzymać reakcję trypsyny, dodaj 1,7 ml pożywki do każdej studzienki.</li>
		<li>Po przeniesieniu komórek wraz z pożywką do probówki o pojemności 50 ml, wirować probówkę o masie 300 × g przez 5 minut w wirówce stołowej. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml świeżej pożywki. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru (zgodnie z opisem w kroku 1.5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zasiać komórki na 96-dołkowej płytce pokrytej PDL o gęstości 4 × 104 komórek/basenik w 100 μl pożywki hodowlanej. W tym celu w probówce o pojemności 50 ml dodaj niezbędną objętość komórek (obliczenia poniżej) wraz z odpowiednią objętością pożywki (całkowita objętość 12 ml). Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 100 μl rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdej z 96 studzienek. Inkubować komórki przez 18 godzin w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
	<ol>
		<li>Obliczyć liczbę komórek niezbędną do 4 × 104 komórek/studzienkę, używając C1V1 = C2V2, gdzie C1 to początkowa liczba komórek (liczba komórek/ml), V1 to objętość potrzebna od początkowej zawiesiny komórek, C2 to pożądana gęstość komórek docelowych (liczba komórek / ml), a V2 to ostateczna objętość potrzebna do wysiewu komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Leczenie chemiczne i test lucyferazy w żywych komórkach (Dzień 3)
<ol>
	<li>W probówce do mikrofuge o pojemności 1,7 ml przygotuj trzy świeże roztwory 50 μM Rhosin (50 mM zapas w DMSO), 25 μM Ehop-016 (25 mM zapas w DMSO) i 50 μM ZCL278 (50 mM zapas w DMSO) poprzez rozcieńczenie każdego roztworu podstawowego (50 mM Rhosin, 25 mM Ehop-016 i 50 mL ZCL278; wszystko w DMSO) 1:1,000 w wymaganej ilości (50 μL/studzienkę × liczbę dołków) pożywki hodowlanej. Do każdego roztworu dodać żywy substrat komórkowy (50 mM zapas w DMSO) dla lucyferazy Renilla rozcieńczony w stosunku 1:2,000 do końcowego stężenia 25 μM. Aby przygotować roztwory ZCL278 0,5, 5 i 50 μM, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenia przy użyciu początkowych 50 μM ZCL278 w pożywce hodowlanej. 
	UWAGA: Jeśli czas inkubacji chemicznej jest pożądany na mniej niż 1-1,5 godziny, komórki można wstępnie inkubować z żywym substratem komórkowym (dla lucyferazy Renilla) przez 1-1,5 godziny przed traktowaniem każdej substancji chemicznej. Jednocześnie dodajemy substancje chemiczne i żywy substrat komórkowy, aby zoptymalizować protokół dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z każdej studzienki z 96-dołkowej płytki zawierającej transfekowane komórki i dodać 50 μl mieszaniny pożywek chemicznych i substratowych do każdej studzienki.</li>
	<li>Po inkubacji komórek przez 1 h, 2 h lub 5 h, wyjmij płytkę hodowlaną z inkubatora, załaduj ją do czytnika płytek luminescencyjnych i zmierz luminescencję.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem upewnij się, że czytnik płytek jest włączony. Uzyskaj dostęp do oprogramowania czytnika mikropłytek i utwórz nowy plik, klikając przycisk Nowa sesja. Ustaw temperaturę czytnika płytek na 37 °C, klikając Inkubator, zaznaczając opcję temperatury i wpisując 37 °C. W obszarze Układ blachy wybierz opcję Nieznany i określ dołki do zmierzenia, klikając i przeciągając.</li>
		<li>W obszarze Protokół kliknij opcję Luminescencja i zachowaj ustawienia domyślne. Po zakończeniu konfiguracji załaduj płytkę ze zdjętą pokrywką do czytnika płytek i wybierz opcję Uruchom płytkę. Kliknij Start i pojawi się okno zapisywania pliku. Zapisz plik na pulpicie, zmieniając jego nazwę i klikając przycisk Zapisz. 
		UWAGA: Luminescencja będzie nadal wytwarzana przez >24 godziny po dodaniu substratu żywej komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu odczytu wyjmij tabliczkę z czytnika płytek, a następnie kliknij przycisk Uruchom płytę, aby ponownie włożyć czytnik. Po zakończeniu umieścić płytkę z powrotem w nawilżanym inkubatorze (37 °C, 5% CO2) do następnego odczytu.</li>
	<li>Po zakończeniu przenieś dane luminescencji do programu do tworzenia wykresów, aby wykreślić względną jednostkę luminescencji (RLU) (oś y) dla każdej zmiennej (np. substancji chemicznych lub stężeń) (oś x) i przeanalizować dane.</li>
</ol>
4. Walidacja testu luc split-Rinnymi metodami.
<ol>
	<li>Wykonaj inne testy, takie jak test ligacji zbliżeniowej (PLA), transmisyjna mikroskopia elektronowa i monitorowanie mitochondrialnego wychwytu wapnia, aby zweryfikować wyniki uzyskane z testu split-Rluc, jak opisano wcześniej24.</li>
</ol>

A Simple Assay to Measure ER-Mitochondria Contacts for High-Throughput Screens

<ol><li>Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites-emerging+intracellular+signaling+hubs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).</li>
<li>Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites%3B+a+multifaceted+factory+for+Ca2%2B+signaling+and+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).</li>
<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+together+to+define+membrane+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).</li>
<li>Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+connection%3A+How+membrane+contact+sites+have+changed+our+view+of+organelle+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology.</a> Cell. 187 (2), 257-270 (2024).</li>
<li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There%27s+something+wrong+with+my+MAM%3B+the+ER-mitochondria+axis+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases.</a> Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).</li>
<li>Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+associated+membranes+%28MAMs%29%3A+emerging+drug+targets+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes.</a> Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).</li>
<li>Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entangled+ER-mitochondrial+axis+as+a+potential+therapeutic+strategy+in+neurodegeneration%3A+A+tangled+duo+unchained%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained.</a> Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).</li>
<li>Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+and+their+critical+role+in+aging+and+age-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).</li>
<li>Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites+in+the+control+of+glucose+homeostasis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update.</a> Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).</li>
<li>Bouguerra, M. D., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+interactions%3A+Both+strength+and+weakness+within+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).</li>
<li>Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+junctions+with+cellular+organelles%3A+Ca2%2B+signalling+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective.</a> Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).</li>
<li>Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+of+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A computational model of motor neuron degeneration.</a> Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).</li>
<li>Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites+reporters%3A+strengths+and+weaknesses+of+the+available+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).</li>
<li>Valm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+systems-level+spectral+imaging+and+analysis+to+reveal+the+organelle+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome.</a> Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).</li>
<li>Csordás, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).</li>
<li>Cieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPLICS%3A+a+split+green+fluorescent+protein-based+contact+site+sensor+for+narrow+and+wide+heterotypic+organelle+juxtaposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition.</a> Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).</li>
<li>Kakimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+multiple+inter-organelle+contact+sites+using+the+organelle-+targeted+split-GFP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system.</a> Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).</li>
<li>Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+diffusion+and+trapping+of+STIM1+and+Orai1+at+ER-plasma+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+regulates+ER-mitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts.</a> Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Cho, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+peroxidase+proximity+labeling+coupled+with+biochemical+fractionation+identifies+promoters+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts.</a> J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia-linked+REEP1+modulates+endoplasmic+reticulum%2Fmitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts.</a> Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).</li>
<li>Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+actomyosin%3A+Partners+in+regulating+epithelial+cell-cell+junction+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function.</a> Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Użyliśmy testu ponownego składania lucyferazy 8 z podziałem Renilla (test luca split-R) w celu ilościowego określenia poziomu sprzężeń ER-mitochondriów. W tym badaniu zmodyfikowaliśmy oryginalny konstrukt split-Rluc24, generując pojedynczy wektor, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, kodując każdy składnik split-Rluc (MitoRlucN i RlucCER) oraz sekwencję samorozszczepiającego peptydu 2A z wirusa Thosea asigna, aby zapewnić ekspresję tej samej ilości każdej podzielonej połówki lucyferazy. Jako substrat dla lucyferazy Renilla, zamiast koelenterazyny, zastosowano zmodyfikowany substrat żywych komórek (chroniona pochodna koelenterazyny; patrz tabela materiałów) z następujących powodów. Po pierwsze, w przeciwieństwie do koelenterazyny, która generuje autoluminescencję w środowisku wodnym (szczególnie gorszą w surowicy), ta chroniona pochodna generuje bardzo niską autoluminescencję (często niewykrywalną) w pożywce zawierającej 10% surowicy, a zatem jej stosunek sygnału do tła jest wyższy niż generowany przez koelennterazinę. Po drugie, w przeciwieństwie do koelenkterazyny, gdzie luminescencja jest najsilniejsza krótko po dodaniu substratu, ale zaczyna bardzo szybko słabnąć, luminescencja wytwarzana przez zmodyfikowany żywy substrat osiąga najwyższy punkt osiągany około 1,5 godziny po dodaniu substratu i pozostaje ciągła przez ponad 24 godziny. Te zmiany w kinetyce reakcji ułatwiają pomiar luminescencji w płytce wielodołkowej, co jest bardzo przydatne w przypadku wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Co więcej, luminescencja wytwarzana przez chronione podłoże pozostaje stała w długim okresie, co pozwala na pomiar pojedynczego zestawu próbek w wielu punktach czasowych, w przeciwieństwie do pomiaru wielu zestawów próbek używanych w różnych punktach czasowych (jeden punkt na próbkę).
Korzystając z tej zaktualizowanej wersji konstruktu luc split-R, przetestowaliśmy, czy GTPazy RHO, RAC i CDC42 uczestniczą w tworzeniu kontaktu ER-Mito. Dodaliśmy inhibitory GTPazy, Rhosin (inhibitor RHO), Ehop-016 (inhibitor RAC) i ZCL278 (inhibitor CDC42), aby HEK293T komórek eksprymujących składniki split-Rluc. Wyniki naszych testów wskazują, że ZCL278 jest najsilniejszym inhibitorem tworzenia kontaktów ER-mitochondriów, a Ehop-016 jest kolejnym znaczącym inhibitorem, podczas gdy Rhosin nie wpływa na ich kontakty. Dane te sugerują, że polimeryzacja aktyny za pośrednictwem CDC42 (a także w mniejszym stopniu za pośrednictwem RAC) jest wymagana do utrzymania kontaktów ER-mitochondriów w komórce, podczas gdy polimeryzacja aktyny za pośrednictwem RHO prawdopodobnie nie jest ważna.
Aby zapewnić maksymalną wydajność, istnieje wiele krytycznych kroków, które należy wziąć pod uwagę w przypadku tego protokołu. Przede wszystkim należy zbadać ilość transfekowanego konstruktu, ponieważ zbyt duża ilość DNA może mieć toksyczny wpływ na komórki. Po drugie, ponieważ liczba komórek może mieć znaczący wpływ na mierzone poziomy lucyferazy, utrzymanie gęstości komórek tak blisko, jak stwierdzono w protokole, ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia idealnej i stałej 80% zbieżności komórek do czasu testu. Może nastąpić zmniejszenie luminescencji, jeśli komórki osiągną konfluencję w czasie ekspozycji chemicznej, ponieważ komórki zlewające się wytwarzają ogólnie mniej białka. Po trzecie, aby upewnić się, że komórki nie złuszczają się podczas dodawania chemikaliów i substratu, używamy 96-dołkowej płytki wstępnie pokrytej poli-D-lizyną. Po czwarte, w przypadku związków (w tym substratu) stosowanych w tym protokole ważne jest, aby utrzymywać je w temperaturze -20 °C lub niższej (-70 °C) w podwielokrotnościach i dodawać je do komórek natychmiast rozmrożonych. Wreszcie, ze względu na możliwe wahania temperatury, które mogą wpływać na aktywność lucyferazy, najlepiej jest zdecydować się na użycie najbardziej wewnętrznych dołków płytki i zignorować dołki wyściełające zewnętrzną stronę płytki.
Test split-Rluc8 oferuje łatwą, ale solidną metodę określania kontaktów ER-mitochondriów, idealną do wysokoprzepustowych badań przesiewowych; Istnieją jednak pewne ograniczenia, na które należy zwrócić uwagę. W przypadku fizjologii komórki istnieje kwestia zmian w zachowaniu komórek spowodowanych ciągłą nadekspresją konstruktu DNA. Obecnie pracujemy nad konstruktem z indukowalnym promotorem, który ma zwalczać potencjalne zmiany w fizjologii komórki spowodowane ciągłą nadekspresją. Ponadto, gdy test ten jest stosowany do celów przesiewowych, należy zauważyć, że wyniki fałszywie dodatnie mogą wynikać z jakiegokolwiek pośredniego wpływu leków na i) poziomy ekspresji, ii) skuteczność ukierunkowania na organelle wspomnianych fragmentów białka lub iii) aktywność enzymatyczną odtworzonych lucyferazy. Ze względu na te ograniczenia test ten musi być testowany w połączeniu z innymi metodami w celu dalszej walidacji wyników. Tabela 1 odnosi się do różnych metod testowania tych miejsc kontaktowych wraz z ich zaletami i wadami. Skorzystaliśmy z innych metod, w tym między innymi testów ligacji zbliżeniowej (PLA), które wykrywają bliskość między białkami, oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), która pozwala na wyraźną wizualizację kontaktów organelli, w połączeniu z testem split-Rluc, aby potwierdzić, że wynikające zmiany w RLU są rzeczywiście spowodowane zmianami w miejscach kontaktu ER-mitochondriów (Figura 4 i Lim i wsp.24). Wykazaliśmy również korelację między zmianami w kontaktach ER-mitochondria a parametrami funkcjonalnymi, takimi jak transfer wapnia i rozszczepienie mitochondriów (Figura 4 i Lim i wsp.24). Aby upewnić się, że wpływ leków na aktywność rozszczepionego Rluc nie jest spowodowany zwiększoną ekspresją genu split-Rluc, inhibitor transkrypcji lub translacji może być dodany do leków, tak jak zrobiliśmy to wcześniej24.
W przypadku zastosowania systemu split-Rluc w zróżnicowanych neuronach w hodowli, w której szybkość transfekcji jest niska, alternatywnym podejściem byłaby infekcja wirusowa (z lentiwirusem wykazującym ekspresję składników split-Rluc). Jego zastosowanie można rozszerzyć w celu stworzenia systemu badań przesiewowych, w którym komórki (np. ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) są modyfikowane tak, aby stabilnie wyrażały każdy składnik split-Rluc, MitoRlucN i RlucCER, albo przez infekcję wirusową, albo przez edycję genów za pośrednictwem CRSPR. Jednak w przypadku stabilnego systemu ekspresji należy mieć świadomość, że może istnieć presja selekcyjna na komórki lepiej tolerujące system split-Rluc, który może nie być reprezentatywny dla normalnego stanu fizjologicznego. Ta adaptacja lub selekcja może wprowadzić błąd systematyczny w wynikach eksperymentu.
Podsumowując, pomimo niektórych ograniczeń omówionych powyżej, split-Rluc jest szybkim, prostym i potężnym testem do wysokoprzepustowych badań przesiewowych pod kątem małych cząsteczek lub genów regulujących kontakty międzyorganellowe w komórce, jak wykazano w naszym poprzednim badaniu przesiewowym leków24.

Interakcje między ER a mitochondriami są kluczowe dla homeostazy komórkowej i przeżycia1,2,3,4. Wcześniejsze dowody wskazują, że każdy rodzaj zakłócenia lub rozregulowania w miejscach kontaktu ER-mitochondriów może przyczyniać się do wielu chorób neurodegeneracyjnych, metabolicznych i sercowo-naczyniowych, a także raka5,6,7,8,9,10. Na przykład nieprawidłowy wzrost wychwytu Ca2+ do mitochondriów może prowadzić do śmierci komórki poprzez otwarcie porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów, które są powszechnie obserwowane w niektórych modelach choroby Alzheimera5,11. Podobnie, zmniejszone kontakty ER-mitochondria mogą powodować zmniejszenie produkcji ATP i upośledzenie spożycia Ca2+, co widać w modelach stwardnienia zanikowego bocznego5,11,12. Ponieważ prowadzonych jest coraz więcej badań w dziedzinie kontaktów ER-mitochondria, odkrywane są dodatkowe białka i geny związane z chorobą, które mogą wpływać na te kontakty. Pomimo obecnej wiedzy i dowodów wskazujących na rolę miejsc kontaktu ER-mitochondriów, nadal potrzeba wielu prac, aby wyjaśnić, w jaki sposób kontakty te mogą prowadzić do utraty funkcji komórkowych i ostatecznie śmierci komórki.
Opracowano różne metody oceny bliskości dwóch błon, morfologii strukturalnej i odległości między dwoma miejscami kontaktu organelli3,4,13. Podejścia do monitorowania sprzężenia ER-mitochondriów obejmują obrazowanie oparte na markerach fluorescencyjnych14,15, obrazowanie oparte na reporterze FRET16 oraz obrazowanie oparte na podzielonej sondzie fluorescencji17,18, które wykorzystują mikroskopię epifluorescencyjną i konfokalną. Mikroskopia superrozdzielcza i atomowo-rozdzielcza są również potężnymi narzędziami do dokładnej wizualizacji kontaktów między organellami, chociaż ich wykorzystanie w analizie miejsca kontaktu jest nadal ograniczone, ponieważ wymagają wysoce dedykowanych mikroskopów i wiedzy technicznej19. Ponadto powszechnie stosowana jest transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) i inne techniki EM, takie jak tomografia elektronowa (ET) i mikroskopia krioelektronowa, ponieważ zapewniają one ultrastrukturalne obrazowanie miejsc kontaktu w wysokiej rozdzielczości, które często są niemożliwe do zbadania przy użyciu innych podejść eksperymentalnych20,21,22. Jednak te metody oparte na EM są techniką o bardzo niskiej przepustowości, na którą mogą również wpływać procedury utrwalania chemicznego. Ostatnio metody oparte na znakowaniu zbliżeniowym zostały wykorzystane do wykrywania miejsc kontaktu, a także do identyfikacji nowych białek w miejscu kontaktu. Na przykład test ligacji zbliżeniowej (PLA) został wykorzystany do ilościowego określenia bliskości organelli23,24, podczas gdy poprawiona wersja testu peroksydazy askorbinianu (APEX) została wykorzystana do identyfikacji nowych białek w miejscu kontaktu25,26. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że wszystkie opisane powyżej metody mają mocne strony i wewnętrzne ograniczenia w wykrywaniu kontaktów między organellami. W związku z tym wymagane jest połączenie różnych technik, aby uzyskać dokładną interpretację miejsc kontaktu organelli.
Poprzednio ustaliliśmy test ponownego składania lucyferazy 8 z podziałem Renilla (test luca split-R) do monitorowania poziomu kontaktów z błoną ER-mitochondriów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)24,26,27. Krótko mówiąc, każda podzielona połowa lucyferazy Renilla jest sprzężona z sekwencją ukierunkowaną na ER lub mitochondria. Po transfekowaniu razem każda podzielona połowa enzymu ulega ekspresji w ER lub błonie mitochondrialnej. Kiedy ER i mitochondria znajdują się w bliskiej odległości od siebie, podzielone połówki łączą się i odtwarzają cały enzym z aktywnością lucyferazy. Dla konstrukcji split-Rluc użyliśmy lucyferazy Renilla 8 (Rluc8) w pBAD/Myc-His27 dla początkowego szablonu. Miejsce podziału (między aminokwasami 91 i 92) zostało określone na podstawie poprzednich raportów27. Dla N-końcowej połowy Rluc8, sekwencje DNA dla aminokwasów 1-91 Rluc8 zostały połączone z końcem 3' znacznika FLAG i mysią sekwencją ukierunkowaną na mitochondria AKAP1 w wektorze pcDNA3.1 TOPO przez PCR27. W przypadku C-końcowej połowy ukierunkowanej na ER, sekwencje DNA kodujące aminokwasy 92-311 zostały połączone z końcem 5' znacznika myc i sekwencją lokalizacyjną drożdży UBC6 ER. Tutaj ulepszyliśmy konstrukt plazmidu luc split-Rw taki sposób, że rozszczepione połówki lucyferazy Renilla są wyrażane w pojedynczym wektorze (pCAG) pod tym samym promotorem, a następnie rozszczepiane na dwa fragmenty, gdy T2A, samorozszczepiająca się sekwencja peptydu 2A z wirusa Thosea asigna, jest wprowadzana między dwie podzielone połówki (<silna klasa = "xfig">Figura 1B). Mapa i sekwencje plazmidowego DNA znajdują się w pliku uzupełniającym 1 i rysunku uzupełniającym S1. Korzystając z tego systemu, zmierzyliśmy wpływ trzech substancji chemicznych (hamujących GTPazy biorących udział w polimeryzacji aktyny) na kontakty ER-mitochondria. Ten test luc split-Rjest prostym, ale solidnym systemem testowym do wysokoprzepustowych badań przesiewowych dla modulatorów kontaktowych między organellami24.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml probówka do mikrowirówek SafeSeal</td><td>Sorenson</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka TC Treated</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Końcówki do pipet OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L końcówki do pipet OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mu; L Skośne końcówki OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1210</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe stojaki na mikroprobówki Flipper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8770-11</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka TC Treated&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm Naczynie poddane obróbce TC</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>1250 &mu; L Końcówki Wirówka OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1112-1720</td><td></td></tr><tr><td>5910&nbsp; Ri - Wirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5943000131</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek, bezwodny, &ge; 99,9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EHop 016</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>6248</td><td>Rozpuszczać w DMSO; przechowywać w temperaturze -70 &deg; C</td></tr><tr><td>EnduRen Żywy substrat komórkowy</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>Przechowuj porcje w temperaturze -70 & stopni; C</td></tr><tr><td>Eppendorf 2-20 &mu; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 100-1000 &mu; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 1-10 &micro; Pipeta L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 12-kanałowy</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 200 &mu; Pipeta L</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>3123000055</tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowane, zatwierdzone przez USDA</td><td>regiony ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2&nbsp; Inkubator, 184 l, polerowana stal nierdzewna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>381</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny licznik liczący</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS6594</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr - Neubauer Bright Line, komora podwójnego liczenia</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen TE Bufor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8019005</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25 CFL</td><td></td></tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr> Multi <tr><td>Tube Rack do probówek stożkowych 50 ml, stożkowych i mikrowirówek 15 ml</td><td>Boekel Scientific</td><td>120008</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Liniowy chlorowodorek polietyleniminy klasy transfekcyjnej (MW 40 000)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>USA Scientific</td><td>4440-0101</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek rhozyny</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>5003</td><td>Rozpuścić w DMSO; przechowywać w temperaturze -70 stopni; C</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek Varioskan LUX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2215365</td><td>poziom 8</td></tr><tr><td>System aspiracji próżniowej VWR</td><td>VWR</td><td>75870-734</td><td></td></tr><tr><td>ZCL 278</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>4794</td><td>Rozpuścić w DMSO; przechowywać w temperaturze -70 stopni; Z</td></tr></tbody></table>

test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

Miejsca kontaktu retikulum endoplazmatycznego (ER) z mitochondriami odgrywają kluczową rolę w zdrowiu i homeostazie komórek, takich jak regulacja Ca2+ i homeostazy lipidów, dynamika mitochondriów, biogeneza autofagosomów i mitofagosomów oraz apoptoza. Brak utrzymania prawidłowego sprzężenia ER-mitochondriów jest związany z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne i dziedziczna paraplegia spastyczna. Istotne jest zbadanie, w jaki sposób rozregulowanie kontaktów ER-mitochondrialnych może prowadzić do śmierci komórki i czy naprawa tych kontaktów do normalnego poziomu może złagodzić schorzenia neurodegeneracyjne. W związku z tym ulepszone testy, które mierzą poziom tych kontaktów, mogą pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów patogennych tych chorób. W ostatecznym rozrachunku opracowanie prostych i wiarygodnych testów ułatwi opracowanie nowych strategii terapeutycznych. Tutaj opisujemy test rozszczepionej lucyferazy w celu ilościowego pomiaru poziomu kontaktów ER-mitochondriów w żywych komórkach. Test ten można wykorzystać do zbadania patofizjologicznej roli tych kontaktów, a także do identyfikacji ich modulatorów w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych.

Wykorzystaliśmy opisany powyżej protokół do pomiaru poziomu kontaktów między ER a mitochondriami po dodaniu trzech związków znanych z inhibicji specyficznych GTPaz. CDC42, RHO i RAC to GTPazy, które po aktywacji promują polimeryzację aktyny28, a są odpowiednio inhibowane przez ZCL278, Rhosin i Ehop-01624. Komórki HEK293T transfekowane split-Rluc poddano działaniu DMSO (kontrola), ZCL278 (50 µM), Rhosin (50 µM) lub Ehop-016 (25 µM) i inkubowano przez 1 h, 2 h oraz 5 h. Za pomocą czytnika płytek zmierzyliśmy aktywność split-Rluc w określonych punktach czasowych (Rysunek 2).
Komórki traktowane Rhosinem (inhibitorem GTPazy RHO) nie wykazały istotnych zmian w aktywności lucyferazy w porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi DMSO po 1 h, 2 h i 5 h traktowania (p &gt; 0,9999, p= 0,6956, p &gt; 0,9999) (Rysunek 2). Wyniki te dowodzą, że Rhosin nie wpływa na kontakty między siateczką endoplazmatyczną a mitochondriami, co sugeruje brak udziału aktywności GTPazy RHO w regulacji kontaktów między tymi dwiema organellami.
W przeciwieństwie do tego, inhibitor GTPazy RAC Ehop-016 wykazał znacznie niższą aktywność lucyferazy niż DMSO po 1 h, 2 h i 5 h traktowania (p = 0.0106, p = 0.0009, p = 0.0024) (Rycyna 2). Dane te wskazują, że aktywność GTPazy RAC jest niezbędna do utrzymania prawidłowych interakcji między ER a mitochondriami w komórce.
Ostatecznie inhibitor CDC42 ZCL278 wykazał najbardziej drastyczne zmiany w aktywności lucyferazy (Ryc. 2). Komórki traktowane ZCL278 wykazały znaczący spadek aktywności lucyferazy w porównaniu z kontrolnym DMSO i miały najniższe wartości p we wszystkich trzech punktach czasowych, utrzymując p &lt; 0.0001 przez cały czas. Nasze dane wykazują silną inhibicję sprzężenia ER-mitochondria, gdy aktywność GTPazy CDC42 jest blokowana przez ZCL278, co jest zgodne z naszym poprzednim raportem z wykorzystaniem oryginalnego testu split-Rluc wykonanego w komórkach kotransfekowanych dwoma wektorami kodującymi oddzielnie każdą połowę rozszczepionej lucyferazy24.
Biorąc pod uwagę uderzające wyniki dla ZCL278, zwłaszcza w porównaniu z innymi inhibitorami GTPaz, aktywność ZCL278 przetestowano dalej w różnych stężeniach [0.5 µM, 5 µM, 50 µM] w stosunku do kontroli DMSO. Aktywności lucyferazy mierzone po 1 h, 2 h i 5 h od zastosowania preparatu wykazały odpowiedź zależną od dawki; 0.5 µM ZCL278 spowodowało najsłabszy efekt w zakresie aktywności lucyferazy, podczas gdy 5 µM wykazało silniejszą, a 50 µM najsilniejszą redukcję aktywności zrekonstytuowanego enzymu (Rycina 3). Łącznie nasze wyniki wykazują, że ZCL278 hamuje aktywność split-Rluc w sposób zależny od dawki i w miarę upływu czasu wyższe stężenia ZCL278 (inhibitora CDC42) nadal wykazują istotną zmianę w stosunku do kontroli DMSO w porównaniu z niższymi stężeniami.
W celu walidacji naszego testu split-Rluc można przeprowadzić uznane niezależne analizy, takie jak test ligacji w bliskim sąsiedztwie (PLA), transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) oraz monitorowanie poboru wapnia przez mitochondria (Rycina 4 oraz dane nieprzedstawione)24. Izoproterenol, agonista receptora β2 adrenergicznego, który był jednym z związków zidentyfikowanych w naszym przesiewie promotorów kontaktów ER-mitochondria (Rycina 4A), został użyty do potwierdzenia, że aktywność lucyferazy split-Rluc po zastosowaniu izoproterenolu wzrosła z powodu zwiększenia kontaktów ER-mitochondria, co wykazano poprzez zmiany w intensywności sygnału PLA, a także poprzez pobór wapnia przez mitochondria (Rycina 4B-E).
<img alt="Schemat konstruktu Split-Rluc; test aktywności lucyferazy; metoda transfekcji komórek; pomiar luminescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Test ponownego składania split-Rluc. (A) Schematyczny obraz testu Split-RLuc. W przypadku braku kontaktów błonowych między mitochondriami a siateczką śródplazmatyczną, Mito-RlucN oraz RlucC-ER nie wchodzą w interakcję, w związku z czym nie występuje aktywność Rluc8. Jednak interakcja między Mito-RlucN a RlucC-ER, zachodząca w miejscach kontaktu błon siateczki śródplazmatycznej i mitochondriów, prowadzi do pełnej aktywności enzymatycznej, wykrywanej poprzez konwersję substratu do luminescencji. (B) Schematyczna mapa konstrukcji DNA split-Rluc (pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry). (C) Schemat przebiegu testu split-Rluc w komórkach HEK293T. Skróty: Mito = mitochondria; ER = siateczka śródplazmatyczna; IRES = wewnętrzna sekwencja wejścia rybosomu; rb_glob pA = sygnał poliadenylacji królika beta-globiny; T2A = sekwencja samoprzecinającego się peptydu 2A z wirusa Thosea asigna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy, porównanie efektów leczenia lekami w różnych odstępach czasu, krotna zmiana RLU, różnice istotne statystycznie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Aktywności split-Rluc odpowiadające poziomom kontaktów ER-Mito w komórkach traktowanych inhibitorami GTPazy. (A-C) Aktywności zrekonstytuowanej lucyferazy (A) 1 h, (B) 2 h lub (C) 5 h po traktowaniu DMSO (kontrola), Rhosin [50 µM], Ehop-016 [25 µM] lub ZCL278 [50 µM] (n = 12 dla każdej grupy). Wszystkie dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z porównaniami wielokrotnymi. Wartości p podano jako p &gt; 0,05 (ns), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Słupki błędów wskazują średnią ± standardowy błąd pomiaru. Skróty: Mito = mitochondria; ER = siateczka śródplazmatyczna; RLU = względna jednostka światła. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący krotność zmiany RLU w DMSO i ZCL278 po 1, 2 i 5 godzinach; analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Aktywności split-Rluc mierzące poziomy kontaktów ER-Mito w komórkach traktowanych ZCL278. (A-C) Aktywności zrekonstytuowanej lucyferazy po (A) 1 h, (B) 2 h lub (C) 5 h od podania DMSO (kontrola) lub ZCL278 w stężeniach [0.5 µM], [5 µM] lub [50 µM] (n = 12 dla każdej grupy). Wszystkie dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testami wielokrotnymi. Wartości p podano jako p &gt; 0.05 (ns), p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001 (****). Słupki błędów wskazują średnią ± błąd standardowy pomiaru. Skróty: Mito = mitochondria; ER = retikulum endoplazmatyczne; RLU = względna jednostka światła. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający krotność zmiany RLU, obrazy mikroskopowe z PLA i Sec61-GFP, pomiar wapnia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Walidacja testu split-Rluc. (A) Przykład kwantyfikacji aktywności split-Rluc po potraktowaniu komórek HEK293T 11 lekami, w tym izoproterenolem, zidentyfikowanymi w screeningu związków promujących kontakty ER-mitochondria. (B) Przykład testu PLA (proximity ligation assay) w komórkach HeLa potraktowanych DMSO lub izoproterenolem (1 µM). Sygnał PLA (czerwony) wskazuje na bliski kontakt między ER a mitochondriami. Sec61-GFP (zielony): marker ER; DAPI (niebieski): jądro komórkowe. (C) Kwantyfikacja sygnału PLA z punktu A (n = 4 eksperymenty, każdorazowo 77-97 komórek; test Mann-Whitneya). (D) Pobór wapnia przez mitochondria w odpowiedzi na histaminę (100 µM). Zmiana intensywności fluorescencji Mito-R-GECO1 (średnia z wielu komórek HeLa) wykreślona co 2,5 s w komórkach potraktowanych DMSO lub izoproterenolem. Strzałka wskazuje moment dodania histaminy. (E) Lewo: Maksymalny szczyt poboru wapnia przez mitochondria z punktu A. Nieparzysty dwustronny test t (n = 10, DMSO; 14, izoproterenol). Prawo: Szybkość poboru wapnia przez mitochondria (jak w punkcie A; od 7,5 do 12,5 s). Test Mann-Whitneya (n = 12, DMSO; 11, izoproterenol). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Lim et al.24. Skróty: RLU = względna jednostka światła; PLA = test ligacji w bliskości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Podsumowanie aktualnych technik badania kontaktów między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami. Lista zalet i ograniczeń dla każdej metody. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R2_updated_Table1.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Plik Zip zawierający sekwencję DNA (w formatach PDF i GBK) dla pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R3_plasmidDNAsequence.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina dodatkowa S1: Mapa pCAG-MitoRlucN-T2A-RlucCER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_Supplemental%20Figure%201_PlasmidMap_PrimerSequence_.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ustanowiliśmy test ponownego składania lucyferazy z podziałem na monitorowanie kontaktów endoplazmatycznych retikulum-mitochondriów w żywych komórkach. Za pomocą tego testu opisujemy protokół ilościowego pomiaru poziomu tych sprzężeń między organellami w komórkach HEK293T w warunkach obróbki chemicznej.

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

W moim laboratorium badamy komunikację międzyorganellową, która przybiera formę kontaktu błonowego i ich rolę w utrzymaniu zdrowia komórek, a także w patogenezie chorób. Szczególnie interesują nas kontakty błonowe między mitochondriami a retikulum endoplazmatycznym i próba zrozumienia, w jaki sposób są one regulowane i jak ich rozregulowanie może prowadzić do neurodegeneracji. Chociaż wiemy, że kontakty mitochondrialne ER są ważne dla zdrowia komórek i że ich rozregulowanie wiąże się z wieloma chorobami, nie wiemy zbyt wiele o tym, jak regulowany jest ich poziom.Pierwszym krokiem, aby rozwiązać ten problem, jest ustanowienie prostego, niezawodnego protokołu pomiaru poziomu kontaktów mitochondrialnych ER w komórkach. Nasz test rozszczepionej lucyferazy oferuje łatwiejszy i szybszy sposób ilościowego określania kontaktów mitochondrialnych ER w żywych komórkach w porównaniu z większością testów. Wykorzystujemy dwie podzielone połówki lucyferazy renilli, jedną połowę ukierunkowaną na ER, a drugą na mitochondria.Można je ponownie złożyć razem tylko wtedy, gdy ER i błony mitochondrialne mają bliski kontakt, co skutkuje odtworzoną lucyferazy o pełnej aktywności enzymatycznej. Ta metoda jest prosta, odpowiednia do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i łatwo dostępna dla wielu laboratoriów. Mamy nadzieję, że przyczyni się to do postępu w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych poprzez identyfikację molekularnych i genetycznych modulatorów kontaktów mitochondrialnych ER, które można dalej rozwijać w środki terapeutyczne.Nasze wyniki utorowały drogę do ważnych pytań, takich jak to, w jaki sposób różne leki lub kombinacje leków wpływają na kontakty mitochondrialne ER i jacy są ważni gracze molekularni stojący za tymi kontaktami? Dzięki tym pytaniom możemy lepiej zrozumieć mechanizm kontaktów mitochondrialnych ER i znaleźć sposoby zwalczania powiązanych chorób. Na początek utrzymuj HEK293T komórek w pożywkach hodowlanych zawierających DMEM z 10% FBS w wilgotnym inkubatorze.Sprawdź zbieżność płytki pod mikroskopem. Gdy komórki osiągną około 80 do 90% konfluencji, usuń pożywkę i umyj je 10 mililitrami DPBS. Następnie wyjmij DPBS z naczynia hodowlanego.Potraktuj komórki jednym mililitrem 0,05% trypsyny-EDTA, czerwieni fenolowej i inkubuj komórki przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po wyjęciu płytki z inkubatora dodaj dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej, aby zatrzymać reakcję trypsyny i wymieszaj pipetując, aby usunąć wszelkie pozostałe komórki. Teraz przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej probówki.Wirować przy 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu pożywki ponownie zawiesić granulki komórek w jednym mililitrze świeżego podłoża. Aby umieścić komórki w płytce sześciodołkowej, połącz niezbędną objętość komórek z 13 mililitrami pożywki w probówce o pojemności 50 mililitrów.Następnie dozuj dwa mililitry rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdej z sześciu studzienek i delikatnie postukaj w płytkę ze wszystkich stron, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Następnie umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na noc. Na początek weź HEK293T hodowlane z inkubatora.Odessać istniejące pożywki hodowlane z każdej studzienki i dodać dwa mililitry świeżej pożywki na studzienkę. W celu transekcji komórek za pomocą podzielonego DNA osocza pętli R, wymieszaj DNA i PEI w 200 mikrolitrach DMEM w 1,7 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej dla każdej studzienki. Szybko wiruj DNA i PEI na poziomie ósmym przez około dwie sekundy, aby upewnić się, że dobrze się wymieszają i tworzą kompleks, a następnie krótko odwiruj je w mini-wirówce.Po inkubacji upuść mieszaninę na powierzchnię pożywki hodowlanej na sześciodołkowej płytce zawierającej komórki. Delikatnie postukaj w płytkę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę i inkubuj ją w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć godzin. Następnie wyjmij płytkę z sześciodołkową płytką z inkubatora.Odessać pożywkę i umyć każdą studzienkę dwoma mililitrami DPBS. Po usunięciu DPBS dodaj 350 mikrolitrów 0,05% czerwieni fenolowej trypsyny-EDTA. Pod koniec inkubacji dodaj 1,7 mililitra pożywki do każdej studzienki, aby zatrzymać reakcję trypsyny.Teraz przenieś komórki wraz z pożywką do 50-mililitrowej probówki i wiruj z prędkością 300 g przez pięć minut w wirówce stołowej. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą jednego mililitra świeżej pożywki. Aby wysiać komórki na 96-dołkowej płytce pokrytej poli-D-lizyną, dodaj niezbędną objętość komórek w 50-mililitrowej probówce wraz z odpowiednią objętością pożywki.Za pomocą pipety wielokanałowej dozować 100 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdej z 96 studzienek. Inkubuj komórki przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Na początek podzielona pętla R z nasionami transfekowała HEK293T komórki na 96-dołkowej płytce pokrytej poli-D-lizyną.Następnie przygotuj trzy świeże roztwory rhosin, Ehop-016 i ZCL278 w 1,7 mililitra mikrofuge 2. Dodać substrat z żywych komórek dla lucyferazy waniliowej, rozcieńczony 1 do 2 000 do końcowego stężenia 30 milimolowych do każdego roztworu. Aby przygotować 0,5, 5 i 50 mikromolowe roztwory ZCL278, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie przy użyciu początkowego 50-mikromolowego ZCL278 w pożywkach hodowlanych.Następnie wyjąć pożywkę z każdej studzienki z 96-dołkowej płytki zawierającej transfekowane komórki. Dodaj 50 mikrolitrów mieszaniny pożywek chemicznych i substratowych do każdej studzienki. Po inkubacji komórek przez godzinę, dwie godziny lub pięć godzin, załaduj płytkę do czytnika płytek luminescencyjnych i zmierz luminescencję.Przed rozpoczęciem upewnij się, że czytnik płytek jest włączony. Uzyskaj dostęp do oprogramowania czytnika mikropłytek i kliknij przycisk Nowa sesja, aby utworzyć nowy plik. Kliknij przycisk Inkubator, aby ustawić temperaturę czytnika płytek na 37 stopni Celsjusza.Sprawdź opcję temperatury i wpisz 37 stopni Celsjusza. W obszarze Układ blachy wybierz opcję Nieznany, a następnie kliknij i przeciągnij studzienkę, aby określić dołki do zmierzenia. Następnie przejdź do Protokołu, kliknij Luminescencja i zachowaj ustawienia domyślne.Po zakończeniu konfiguracji załaduj płytkę ze zdjętą pokrywką do czytnika płytek i wybierz opcję Uruchom płytkę. Kliknij Start, a pojawi się okno Zapisz plik. Zmień nazwę pliku i kliknij przycisk Zapisz.Po zakończeniu odczytu wyjmij płytkę z czytnika płytek, a następnie kliknij opcję Uruchom płytę w opcji, aby ponownie włożyć czytnik. Po zakończeniu umieść płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze do następnego odczytu. Po jednej, dwóch i pięciu godzinach leczenia komórki traktowane rhozyną nie wykazywały znaczących zmian w aktywności lucyferazy w porównaniu z komórkami kontrolnymi traktowanymi DMSO.Inhibitor GTPazy Rac EHop-016 wykazywał znacznie niższą aktywność lucyferazy niż DMSO. Komórki traktowane ZCL278 miały znacznie niższą aktywność lucyferazy niż kontrolne DMSO we wszystkich trzech punktach czasowych. Aktywność lucyferazy mierzona po jednej, dwóch i pięciu godzinach po leczeniu wykazała odpowiedź zależną od dawki.Wyższe stężenia ZCL278 nadal wykazywały znaczące zmiany w porównaniu z kontrolnym DMSO.

split-luciferase-reassembly-assay-to-measure-endoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Ten film demonstruje test komplementacji rozszczepionej lucyferazy w celu wykrycia interakcji białko-białko. W tym teście interesujące białka są oznaczane do małych i dużych fragmentów enzymu lucyferazy. Kiedy białka wchodzą w interakcję, duże i małe fragmenty łączą się, tworząc aktywny kompleks enzymatyczny, który w obecności określonego substratu uwalnia jasną luminescencję, którą można zmierzyć.

Test dzielonej komplementacji lucyferazy w celu identyfikacji specyficznych interakcji białko-białko

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Tutaj opisujemy procedurę wizualizacji i ilościowego określania z dużą czułością endogennych interakcji między retikulum endoplazmatycznym a mitochondriami w komórkach stałych. Protokół zawiera zoptymalizowany test ligacji zbliżeniowej in situ ukierunkowany na receptor 1,4,5-trifosforanu inozytolu / białko regulowane glukozą 75 / zależny od napięcia kanał anionowy / kompleks cyklofiliny D na granicy faz błony związanej z mitochondriami.

Badanie interakcji retikulum endoplazmatycznego i mitochondriów za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ w komórkach utrwalonych

Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zademonstrowanie występowania heterologicznych interakcji między białkami błonowymi typu III rezydującymi w Golgiego z cytoplazmatycznie eksponowanymi N- i/lub C-końcami w żywych komórkach ssaków przy użyciu najnowszego wariantu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy.

Demonstracja kompleksów heterologicznych utworzonych przez białka błonowe typu III rezydujące w Golgiego przy użyciu testu komplementacji rozszczepionej lucyferazy

Potrzeba nowych podejść do badania miejsc kontaktu z błoną (MCS) wzrosła ze względu na rosnące zainteresowanie badaniem tych struktur komórkowych i ich składników. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który integruje wcześniej dostępne technologie mikroskopowe w celu identyfikacji i ilościowego określenia kompleksów białkowych wewnątrz organelli i między organellami, które znajdują się w MCS.

Wizualizacja i kwantyfikacja endogennych interakcji białek wewnątrz organelli w miejscach kontaktu ER-mitochondria za pomocą testów ligacji zbliżeniowej

Ten protokół opisuje test oparty na bret do pomiaru interakcji kinazy CRAF z białkami 14-3-3 w żywych komórkach. Protokół określa etapy przygotowania ogniw, odczytu emisji BRET i analizy danych. Przedstawiono również przykładowy wynik wraz z identyfikacją odpowiednich elementów sterujących i rozwiązywaniem problemów w celu optymalizacji testu.

Test oparty na rezonansie bioluminescencyjnym (BRET) do pomiaru oddziaływań CRAF z białkami 14-3-3 w żywych komórkach

Poznaj test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy do pomiaru kontaktów retikulum endoplazmatycznego z mitochondriami w żywych komórkach HEK293T. Ta metoda umożliwia ilościową analizę komunikacji między organellami.

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Test ponownego składania rozszczepionej lucyferazy w celu pomiaru kontaktów retikulum-mitochondria endoplazmatyczne w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów