Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Skupiamy się na mechanizmach żeglugi, kontrolując wczesne decyzje dotyczące losu komórek podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych, zarówno in vitro, jak i w modelach mysich. Złożone sieci regulacyjne, różnicowanie nieba podczas rozwoju, a my badamy, w jaki sposób wzajemne oddziaływanie szlaków sygnałowych, czynników transkrypcyjnych i regulatorów epigenetycznych sprzyja różnym siarczanom. Badanie dynamicznego i szybkiego procesu gastrulacji u myszy jest technicznie trudne ze względu na małą liczbę komórek w zarodku i ograniczoną liczbę zarodków o pożądanym genotypie w miocie.

Podczas gdy literatura obszernie pokazuje badanie pojedynczych komórek przy użyciu populacji zarodków posortowanych w komórkach typu dzikiego lub aktywowanych fluorescencyjnie, kompleksowa analiza zarodków z mutacjami linii jest nadal ograniczona. Nasz protokół oferuje możliwość generowania jednokomórkowych zestawów danych omicznych z gastrulatujących zarodków zawierających mutacje liniowe. Pomoże to naukowcom, którzy nie mają lub mają ograniczone doświadczenie w pracy z myszami, lub którzy chcą nauczyć się wczesnej manipulacji zarodkami lub metod jednokomórkowych.

Nasz protokół pomoże odpowiedzieć na nowe pytania naukowe dotyczące gastrulacji i wczesnej organogenezy, w tym rozwoju serca. Dostarczamy potok do analizy zarodków neuronów specyficznych dla linii w roztworze jednokomórkowym, co ułatwi analizę roli określonych genów w zaangażowaniu linii. Mamy nadzieję, że uda nam się wykorzystać tę metodologię do zrozumienia mechanizmów regulacyjnych decyzji dotyczących siarczanów podczas szybkiego i dynamicznego procesu gastrulacji.

Przed rozpoczęciem izolacji mysiego zarodka należy dokładnie oczyścić obszar 70% etanolem. Upewnij się, że wszystkie narzędzia do preparowania są umyte i wysterylizowane. Uzyskaj pięć mililitrów sterylnego DMEM, zawierającego 10% FBS, i 20 mililitrów DPBS, i umieść je na lodzie.

Następnie, aby wykonać izolację zarodka za pomocą mikroskopu stereoskopowego ze stopniem światła przechodzącego i kamerą, należy umieścić prawidłowo uśpioną ciężarną matkę na plecach i wysterylizować obszar w pobliżu ujścia pochwy etanolem. Za pomocą nożyczek preparacyjnych i pęsety podnieś fałd skórny w pobliżu otworu pochwy i wykonaj małe nacięcie w kształcie litery V, powoli odsłaniając macicę ciężarnej matki. Następnie wypreparuj róg macicy tamy, przytrzymując jeden jego koniec pęsetą i przecinając wzdłuż niego, upewniając się, że usunąłeś szyjkę macicy.

Umieść róg macicy na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej DPBS na lodzie. Za pomocą nożyczek preparacyjnych i pęsety usuń mięsień macicy wzdłuż miejsc implantacji i odetnij każde miejsce implantacji lub perły zawierające obrzęki mleczne wewnątrz. Umieść go w świeżym DPBS na sześciocentymetrowej szalce Petriego na lodzie.

Weź jedno miejsce implantacji, umieść je na nowej sześciocentymetrowej szalce Petriego na stoliku mikroskopu stereoskopowego i dodaj do niego 500 mikrolitrów DPBS. Dostosuj ostrość mikroskopu i źródło światła. Przytrzymaj miejsce implantacji jednym zestawem pęsety w jednej ręce.

A drugą ręką powoli włóż kolejną parę kleszczy w koniec miejsca implantacji, wyciętego z rogu macicy, stopniowo odsłaniając obrzęk mleczny. Aby odsłonić zarodek, przytrzymaj antytakisomesometrial koniec izolowanego obrzęku mlecznego za pomocą jednej pary kleszczy. A drugą parą powoli wykonaj poziome cięcie, około jednej czwartej wielkości obrzęku liściastego od końca mesometrialu.

Teraz za pomocą obu kleszczy powoli odpychaj od antymezometrium i obrzęku mlecznego, aż zarodek wyskoczy ze świeżo ściętego końca mesometrialu. Po ujawnieniu zarodka przystąp do usuwania wszelkich dodatkowych przyczepionych tkanek zarodkowych. Jeśli ciemieniowy worek endodermalny i stożek ektołożyskowy nie odpadną spontanicznie od zarodka, użyj kleszczy, aby usunąć je wraz z odpowiednią krwią matki.

Następnie, przytrzymując zarodek jedną parą kleszczy, powoli oderwij woreczek żółtkowy trzewny od zarodka za pomocą drugiej pary kleszczy. Zlokalizuj ciemieniowy worek endodermalny i stożek ektołożyskowy. Za pomocą pipety P20 przenieś woreczek żółtkowy z nie więcej niż 10 mikrolitrami DPBS z naczynia do ośmiopaskowej probówki PCR na lodzie.

Rób jasne zdjęcia terenowe świeżo wyizolowanych zarodków, aby upewnić się, że stopień zaawansowania rodzeństwa z miotu jest podobny. Za pomocą pipety P200 powoli przenieś zarodek z 50 mikrolitrami DMEM zawierającymi 10% FBS do 1,5 mililitrowej probówki trzymanej na lodzie. Powtórz to samo dla wszystkich obrzęków liściastych, używając czystych narzędzi i nowych tworzyw sztucznych do każdej izolacji.

Po wyizolowaniu woreczka z żółtka trzewnego z zarodka myszy przystąp do trawienia każdego woreczka żółtkowego w ośmiopasmowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub probówce PCR. Za pomocą pipety P20 dodaj 19,3 mikrolitra buforu do lizy DNA matrycy PCR i 0,7 mikrolitra 0,2 mikrograma na mililitr proteinazy K do każdej próbki woreczka żółtkowego. Wirować próbkę przez 10 sekund i za pomocą mini wirówki z adapterem paskowym wirować próbki o masie 1 000 G przez 10 sekund.

Umieść ośmiopaskową probówkę do PCR w bloku grzewczym o temperaturze 85 stopni Celsjusza na 45 minut, wirując przez pięć sekund co pięć minut. Po 45 minutach ponownie odwiruj probówkę w dół przy 1 000 G przez 10 sekund przed przystąpieniem do PCR w celu pożądanej identyfikacji genetycznej. Aby przeprowadzić reakcję PCR do genotypowania Cre, należy przygotować wzorcową mieszankę PCR zawierającą wyświetlane składniki do ośmiopaskowej probówki PCR dla każdego woreczka żółtkowego.

Kontynuuj uruchamianie programu amplifikacji cyklu termicznego PCR przy użyciu wyświetlanego cyklu, a następnie uruchom produkty PCR na 1% żelu agarozowym, aby wyciągnąć wnioski dotyczące genotypowania. Przechowuj pozostałe strawione próbki woreczka żółtkowego w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Gdy produkt PCR został oddzielony na żelu agarozowym, oczekiwano rozmiarów fragmentów dla zamków p i alleli typu dzikiego, a także żywicy allelu Cre.

Przystąp do przeprowadzenia dysocjacji komórek izolowanych mysich zarodków po potwierdzeniu genotypów. Za pomocą pipety P200 dodaj 50 mikrolitrów DMEM z 10% FBS do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Po połączeniu zarodków o tym samym genotypie w nowej probówce, umieść ją na lodzie.

Pozwól połączonym zarodkom osiąść na dnie probówki, a następnie umyj zarodki za pomocą 50 mikrolitrów DPBS i poczekaj, aż się uspokoją, zanim usuniesz jak najwięcej DPBS bez usuwania zarodków. Następnie dodaj 100 mikrolitrów trypsyny do połączonych zarodków i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez pięć minut. Delikatnie przesuwaj rurkę o pojemności 1,5 mililitra co 30 sekund, aby pomóc komórkom w dysocjacji.

Po pięciu minutach zneutralizuj trypsynę za pomocą 300 mikrolitrów DMEM zawierającego 10% FBS. Odwirować zarodki w sile 100 G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić uzyskane podniebienie małe w 40 mikrolitrach DMEM z 10% FBS i umieścić rurkę na lodzie.

Wymieszaj pięć mikrolitrów zawiesiny komórek z pięcioma mikrolitrami tripu i niebieskiego w nowej 1,5 mililitrowej probówce i dokładnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół. Przenieś mieszaninę na szkiełko, aby określić liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek. Na koniec przejdź do partycjonowania pojedynczych komórek za pomocą chipa mikroprzepływowego zgodnie z protokołem producenta.