Name: Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj protokół sekwencjonowania RNA jednokomórkowego zarodków myszy podczas gastrulacji. Ta metoda umożliwia analizę decyzji losu komórkowego u embrionów z mutacjami w liniach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Rdzeniowi Genomiki w Fox Chase Cancer Center oraz członkom laboratorium dr Johnathana Whetstine'a, Zachowi Grayowi, Madison Honer i Benjaminowi Fermanowi, za wsparcie techniczne dla eksperymentów sekwencjonowania. Wyrażamy uznanie dla członków laboratorium dr Estaras i Alexa Morrisa, rotacyjnego doktoranta, który przyczynił się do wstępnej analizy badań nad pojedynczymi komórkami. Ta praca jest finansowana z grantów NIH R01HD106969 i R56HL163146 dla Conchi Estaras. Dodatkowo Elizabeth Abraham otrzymała wsparcie w ramach grantu szkoleniowego T32 5T32HL091804-12.

Isolation and Genotyping of Gastrulating Mouse Embryo for Single-Cell Sequencing

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2024).</li>
<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule przedstawiono solidną metodę pozyskiwania wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder z zarodków myszy w gastrulacji, specjalnie zaprojektowanych w celu ułatwienia badań nad mechanizmami specyfikacji losu komórki we wczesnym rozwoju. Metoda ta wypełnia istotną lukę w dziedzinie gastrulacji, optymalizując analizę zarodków wymagających genotypów, takich jak płeć lub geny somatyczne. Wykorzystując mysie modele mutacji genetycznych i sekwencjonowanie pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości na całych zarodkach myszy, proces ten może jeszcze bardziej zwiększyć zrozumienie profili ekspresji genów wczesnej gastruli myszy. Metoda ta demonstruje wykonalność wykorzystania mysiego modelu mutacji genetycznej za pomocą systemu rekombinazy Cre w celu uzyskania wysokiej jakości komórek i jąder we wczesnych punktach rozwojowych dla omiki pojedynczej komórki. Metoda ta ewoluowała w wyniku wielu prób, podczas których próbki nie spełniały norm jakościowych wymaganych do przygotowania i sekwencjonowania biblioteki. Wyjaśniona metodologia generuje wystarczającą liczbę komórek/jąder z zarodków młodszych niż E8 poprzez optymalizację trzech krytycznych etapów: (1) zsynchronizowane ciąże w czasie w celu zwiększenia liczby zarodków, (2) genotypowanie tego samego dnia w celu uniknięcia zamrożenia/rozmrożenia oraz (3) ocena żywotności komórek/jąder w celu uniknięcia sekwencjonowania umierających komórek. Protokół ten zapewnia pomyślne wyniki z jednokomórkowym RNASeq, ale zawiesiny komórek lub jąder uzyskane w tym protokole mogą być przetwarzane na innych platformach sekwencjonowania, w których żywotność komórek jest czynnikiem ograniczającym, takich jak smart-seq, drop-seq i cel-seq16.
W zarodku E7 liczba komórek może się różnić w zależności od szczepu i zmutowanego genotypu. Zazwyczaj zarodek E7 może mieć od setek do kilku tysięcy komórek, a uzyskanie zarodków o pożądanym genotypie jest wyzwaniem, ponieważ tylko 1 lub 2 zarodki na ciężarną matkę spełniają kryteria. Protokół ten pozwala na schwytanie około 300 żywotnych komórek na zarodek E7 do analizy pojedynczej komórki. Próby zwiększenia wielkości puli zarodków poprzez błyskawiczne zamrażanie zarodków pochodzących od ciężarnych matek w różnych dniach okazały się nieskuteczne, ponieważ żywotność komórek była poważnie zagrożona po rozmrożeniu, nawet po dodaniu środków krioprezerwujących. Aby sprostać temu wyzwaniu, zoptymalizowano strategię hodowlaną i synchronizację ciężarnych matek. Aby zwiększyć szanse na wielokrotne izolacje, zaleca się wykorzystanie samic myszy, które urodziły 1-2 razy przed rozmnażaniem, w celu izolacji, ponieważ jest bardziej prawdopodobne, że będą miały większe rozmiary miotu. Monitorowanie cyklu rujowego samicy ma kluczowe znaczenie; Krycie jest bardziej prawdopodobne w fazie rui i rui. Jeśli pojawią się trudności hodowlane, zmiana partnerów hodowlanych po czterech dniach pomoże również, jeśli nie zostanie wyprodukowana wtyczka.
Ważne jest, aby pamiętać, że ta metoda ma ograniczenie: opiera się na obserwowanych zatyczkach, a nawet jeśli zaobserwuje się czop, nie gwarantuje ciąży, a jedynie wskazuje na aktywność seksualną. Dlatego zwiększenie liczby obserwowanych zatyczek w ciągu doby zwiększy prawdopodobieństwo urodzenia więcej niż jednej ciężarnej matki w ciągu doby i bardziej pozytywnych genotypów. Protokół ten wykazał możliwość wykorzystania stadiów embrionalnych w zakresie od E7 do E7.75 jako dowodu słuszności koncepcji podczas gastrulacji. Jednak ten rurociąg może być stosowany od zarodków E6,5 do E8. W przypadku zarodków E6.5 zaleca się zwiększenie liczby ciąż zsynchronizowanych w celu uzyskania co najmniej 7 zarodków o pożądanym genotypie do połączenia. Zamiast tego w przypadku zarodków E8 zwiększ ilość trypsyny używanej do dysocjacji każdego zarodka do ~ 40 μL zamiast 20 μL. Celem jest uzyskanie zawiesiny komórka/jądro w zakresie stężeń 700-1200 komórek na μl przed przystąpieniem do partycjonowania.
Dobra żywotność komórek jest niezbędna dla powodzenia sekwencjonowania pojedynczych komórek. W projekcie chipa mikroprzepływowego dostarczonym przez producentów, pojedyncze komórki są podzielone na kulki żelowe w emulsji (GEM) w chipie zawierającym znane kulki żelowe z kodami kreskowymi11. Jednak zauważalnym ograniczeniem tego procesu jest to, że można dzielić na partycje zarówno pojedyncze komórki wysokiej jakości, jak i niskiej jakości. Nawet przy odpowiedniej liczbie żywych komórek (tj. 1000 komórek/μl), jeśli żywotność zawiesiny jest niska (tj. 1000 komórek żywych i 1000 komórek martwych, co daje 50% żywotności), eksperyment sekwencjonowania prawdopodobnie zakończy się niepowodzeniem. Aby uzyskać optymalne wyniki, zaleca się dążenie do rentowności na poziomie około 90%. Jeśli żywotność komórek spadnie między około 60% a 89%, można podjąć specjalne środki w celu zwiększenia żywotności eksperymentu. Jeśli jednak żywotność komórek jest mniejsza niż 60%, zdecydowanie odradza się kontynuowanie eksperymentu. Powodem tego jest to, że umierające komórki zostaną "wychwycone" w żelu do partycjonowania, a późniejsze przygotowanie biblioteki i kontrole jakości przejdą bez zauważalnych problemów. Jednak rzeczywisty eksperyment sekwencjonowania może się całkowicie nie powieść, ponieważ większość odczytów sekwencjonowania będzie mapować geny mitochondrialne, rybosomalne lub apoptozę, wskazując na oznaki słabej żywotności komórek od samego początku. Dane przedstawione w tym artykule ilustrują proces sekwencjonowania pojedynczych komórek zarodków myszy z gastrulacją z komórkami wysokiej jakości. Metodologia ta może być zastosowana do zrozumienia wielu różnych modeli mutacji genetycznych myszy podczas rozwoju.

Gasgulacja jest podstawowym procesem niezbędnym do normalnego rozwoju. Ten szybki i dynamiczny proces zachodzi, gdy komórki pluripotencjalne przekształcają się w prekursory specyficzne dla linii, które określają, jak powstają narządy. Przez lata gastrulacja była długo definiowana jako tworzenie trzech w dużej mierze jednorodnych populacji: mezodermy, ektodermy i endodermy. Jednak technologie o wysokiej rozdzielczości i pojawiająca się liczba modeli embrionalnych komórek macierzystych1,2 ujawniają bezprecedensową heterogeniczność wśród wczesnych listków zarodkowych3,4. Sugeruje to, że pozostaje jeszcze wiele do odkrycia na temat mechanizmów regulujących różne populacje komórek gastruli. Rozwój embrionalny myszy był jednym z najlepszych modeli do badania wczesnych decyzji dotyczących losu komórek podczas gastrulacji3,5. Gastrulacja u myszy jest szybka, ponieważ cały proces gastrulacji zachodzi w ciągu 48 godzin, od dnia embrionalnego E6.5 do E85.
Ostatnie osiągnięcia w technologiach jednokomórkowych umożliwiły szczegółowe mapowanie rozwoju embrionalnego myszy typu dzikiego, zapewniając kompleksowy przegląd komórkowych i molekularnych krajobrazów zarodków podczas gastrulacji3,4,6,7,8. Jednak analiza zmutowanych zarodków na tych etapach jest mniej powszechna i często ogranicza się do populacji posortowanych przez FACS9,10. Skąpa literatura odzwierciedla wyzwania techniczne związane z manipulacją i preparacją pojedynczych komórek zarodków gastrulatujących, które wymagają genotypowania. Uchwycenie dynamicznego procesu gastrulacji może stanowić wyzwanie ze względu na jego szybki charakter, zwłaszcza w celu zrozumienia zmutowanych zarodków. Czas i synchronizacja ciąż są niezbędne, ponieważ nawet niewielkie różnice między ciążami w czasie mogą być błędnie interpretowane jako fenotyp rozwojowy wynikający ze zmutowanego genu. Staje się to szczególnie ważne, gdy zmutowany gen wpływa na proces gastrulacji13,14. W tym badaniu ustalono wytyczne dotyczące uzyskania zsynchronizowanych ciąż poprzez wizualizację czopów dopochwowych (tj. masy skrzepłego płynu nasiennego powstałego w pochwie samicy po kryciu). Ponadto opracowano strategię mającą na celu uzyskanie wiarygodnych danych dotyczących pojedynczych komórek ze zmutowanych zarodków gastrulujących od E6,5 do E8. Strategia ta została opracowana w celu przezwyciężenia ograniczeń związanych z małą liczbą zarodków o pożądanym genotypie w ciąży oraz spadkiem żywotności spowodowanym zamrażaniem i rozmrażaniem zarodków lub komórek.
Ten artykuł opisuje zoptymalizowaną metodologię od ustanowienia ciąż w czasie za pomocą czopów dopochwowych do końcowego sekwencjonowania pojedynczych komórek/jąder. Metoda ta wyjaśnia, jak zwiększyć liczbę ciąż zsynchronizowanych w celu uzyskania większej liczby zarodków o pożądanym genotypie, izolacji komórek/jąder w celu poprawy żywotności komórek oraz protokołu genotypowania tego samego dnia. Manuskrypt ten opisuje również proces izolacji zarodka w różnych punktach czasowych gastrulacji. Metodologia ta przyczynia się do zwiększenia liczby końcowych żywotnych komórek/jąder zarodków do sekwencjonowania, zapewniając wysoką jakość danych sekwencjonowania. W związku z tym metoda ta otworzy drzwi do badań jednokomórkowych zarodków gastrulujących, które wymagają genotypowania.

<table><tbody><tr><td>10 cm szalka Petriego</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L Reach Końcówka barierowa</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L Reach Końcówka barierowa</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro; L Reach Końcówka barierowa</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 & mikro; m Odwracalne sitko, małe</td><td>komórki macierzyste</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>6 cm szalka Petriego</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>8-paskowe probówki do PCR</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Apex Bioresearch Product</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock Mini sucha kąpiel</td><td>Genesee</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Mikrowirówka z chłodzeniem Hermle</td><td>Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler chromu</td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Zestawy odczynników jednokomórkowych 3' v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAX2000</tr><tr><td>Countess Cell Couning Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Odczynniki</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR woreczek żółtkowy</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol ( DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>GenClone</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000 System obrazowania</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7823</td><td></td></tr><tr><td>Graefe</td><td>Kleszcze Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki NextSeq 1000/2000 P2 (100 cykli) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>NastępnySeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ 1000</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tuba optyczna bez nukleaz Water</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>8x pasek (401428)</td><td>Nasadka tubusu optycznego Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>8x Pasek (401425)</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Poseidon 31-511, HS24 Mikrowirówka, z wirnikiem 24 x 1,5/2,0 mL, 1 wirówka/jednostka</td><td>Genesee</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy do oznaczania ilościowego Qubit dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 3</td> Inhibitor RNazy <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe kleszcze wzorcowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Stacja taśmowa Wskazówki dotyczące ładowania</td><td>Agilent</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>351-007-101</td><td></td></tr><tr><td>Niebieska plama trypanowa 0,4%</td><td>Theromo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy IKA MS3 z adapterem 96-dołkowej płytki do pobierania próbek</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie jednokomórkowego rna zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

W ciągu ostatniej dekady, metody jednokomórkowe stały się złotym standardem w badaniu dynamiki ekspresji genów, heterogeniczności komórek i stanów komórek w próbkach. Przed osiągnięciem postępów w dziedzinie pojedynczych komórek możliwość uchwycenia dynamicznego krajobrazu komórkowego i szybkich przemian komórkowych we wczesnym okresie rozwoju była ograniczona. W artykule zaprojektowano solidny rurociąg do przeprowadzania analizy pojedynczych komórek i jąder na zarodkach myszy od dnia embrionalnego E6.5 do E8, co odpowiada początkowi i zakończeniu gastrulacji. Gastrulacja jest podstawowym procesem podczas rozwoju, który ustanawia trzy listki rozrodcze: mezodermę, ektodermę i endodermę, które są niezbędne do organogenezy. Dostępna jest obszerna literatura na temat omiki jednokomórkowej stosowanej do zarodków perigastrulujących typu dzikiego. Jednak analiza pojedynczych komórek zmutowanych zarodków jest nadal rzadka i często ogranicza się do populacji posortowanych za pomocą FACS. Wynika to częściowo z ograniczeń technicznych związanych z koniecznością genotypowania, ciążami w czasie, liczbą zarodków o pożądanych genotypach w ciąży oraz liczbą komórek na zarodek na tych etapach. W tym miejscu przedstawiono metodologię mającą na celu przezwyciężenie tych ograniczeń. Metoda ta ustala wytyczne dotyczące hodowli i ciąży w czasie, aby osiągnąć większą szansę na zsynchronizowane ciąże z pożądanymi genotypami. Etapy optymalizacji procesu izolacji zarodków w połączeniu z protokołem genotypowania tego samego dnia (3 godziny) pozwalają na wykonanie pojedynczej komórki na bazie mikrokropelek tego samego dnia, zapewniając wysoką żywotność komórek i wiarygodne wyniki. Metoda ta zawiera ponadto wytyczne dotyczące optymalnej izolacji jąder z zarodków. W związku z tym podejścia te zwiększają wykonalność podejść jednokomórkowych do zmutowanych zarodków na etapie gastrulacji. Przewidujemy, że metoda ta ułatwi analizę tego, w jaki sposób mutacje kształtują krajobraz komórkowy gastruli.

Metodologia opisana w niniejszej pracy została zaprojektowana specjalnie w celu usprawnienia przygotowania próbek embrionów do analiz omicznych pojedynczych komórek (single-cell omics) z okresu od E6.5 do E8. Ten niezawodny schemat składa się z pięciu głównych etapów: synchronizacji ciąż, izolacji embrionów, genotypowania w tym samym dniu, dysocjacji komórek oraz oceny żywotności komórek (Rycina 1A). Choć przedstawione dane koncentrują się na punktach czasowych od E7 do E7.5, metodę tę można zastosować do embrionów aż do etapu E8 (Rycina 1B) z niewielkimi modyfikacjami w procedurze (patrz uwagi w protokole). Synchronizację ciąż osiągnięto poprzez umieszczenie dwóch samic myszy w klatce z samcem. Obecność czopów pochwowych sprawdzano codziennie rano przed godziną 10:00; jeśli stwierdzono obecność czopu, uznawano to za dzień E0.5 do południa tego samego dnia (Rycina 2A). W niniejszym badaniu optymalne warunki uzyskania czopów wymagały sparowania samicy myszy w fazie rujej lub proruji z samcem, który w poprzednich cyklach rozrodczych z sukcesem doprowadził do powstania kilku czopów (Rycina 2B). Do izolacji embrionów dopuszczano wyłącznie przypadki z ewidentną obecnością czopów (Rycina 2C).
Czas rozwoju szacowano zgodnie z harmonogramem przedstawionym na Rysunku 2A. W przypadku etapu E7.5 sekcję embrionów rozpoczęto o godzinie 12:00 w 7ym dniu po dniu stwierdzenia występowania czopa. Rysunek 3 obrazuje prawidłową izolację embrionu w stadium E7.5. Po eutanazji ciężarnej samicy wypreparowano róg macicy, a następnie poszczególne obrzęki decydualne przecięto, odsłaniając embrion; worek żółtkowy odizolowano w celu przeprowadzenia genotypowania (Rysunek 3).
Genotypowanie w tym samym dniu przeprowadzono w ciągu 3 h od izolacji zarodków, postępując zgodnie z krokami przedstawionymi na Rysunku 4A. Podczas procesu genotypowania zarodki przechowywano w lodzie, aby zachować ich integralność. Nie należy zamrażać zarodków, ponieważ zmniejszy to liczbę żywotnych komórek w każdym zarodku. Rysunek 4B,C przedstawiają trzewny worek żółtkowy, ścienny worek endodermalny oraz stożek ektoplacentalny wraz z towarzyszącą krwią matczyną. Do genotypowania wykorzystano trzewny worek żółtkowy (Rysunek 4C). Po strawieniu worka żółtkowego przygotowano mieszaninę do PCR i przeprowadzono reakcję PCR. Otrzymany produkt PCR rozdzielono następnie w żelu agarozowym. Rysunek 4D przedstawia oczekiwane wielkości fragmentów dla alleli LoxP i typu dzikiego (odpowiednio 597 bp i 498 bp) oraz allelu Cre (650 bp). Na Rysunku 4E zaprezentowano przykład genotypowania worków żółtkowych 6 zarodków uzyskanych z par hodowlanych niosących allele Cre i LoxP (flox). Żele obrazują produkty PCR alleli Cre i LoxP u 6 analizowanych zarodków. Zarodki nr 2 i nr 5 niosą 2 allele flox i 1 allel cre; w związku z tym są one uznawane za zarodki kondycjonalnego KO (Rysunek 4E, czerwone kropki). Zarodki 1 i 3 posiadają 2 allele flox, ale są negatywne pod kątem Cre; zatem są one uznawane za kontrole flox. Zarodek 4 posiada 2 allele flox i słabą prążkowanie dla allelu Cre, co skutkuje „niejasnym” genotypem. Zarodek ten nie był dalej przetwarzany (alternatywnie badacz może rozważyć powtórzenie genotypowania lub przeprowadzenie wtórnej walidacji kondycjonalnego KO z użyciem komórek wykazujących ekspresję Cre). Należy zauważyć, że driver Cre użyty w tym eksperymencie nie jest eksprymowany w trzewnym worku żółtkowym15; w związku z czym allele LoxP nie wykazują przesunięcia na żelu zarodków Cre-dodatnich w porównaniu z zarodkami Cre-ujemnymi.
Prawidłowa liczba komórek oraz ich dobra żywotność są niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia eksperymentu jednokomórkowego. Zawiesiny o niskiej żywotności komórek, wysokim odsetku komórek martwych, występującym agregowaniu lub znacznej ilości debris nie nadają się do dalszego przetwarzania. Optymalne warunki to 700-1200 żywych komórek na µL i żywotność &gt;90%. Rysunek 5A przedstawia panel ilustrujący zarówno dobrą, jak i suboptymalną żywotność komórek. Te same kryteria można zastosować również do izolacji jąder komórkowych, co pokazano na Rysunku 5B. Należy jednak pamiętać, że ocena z użyciem błękitu trypanu różni się w przypadku komórek i jąder: żywe komórki nie wchłaniają błękitu trypanu, podczas gdy żywe jądra tak. Jeśli zawiesina komórek/jąder jest optymalna (&gt;90% żywotności), należy przystąpić do rozdzielania pojedynczych komórek przy użyciu chipa mikrofluidycznego zgodnie z procedurami producenta11. Opcje rozwiązywania problemów przedstawiono dla zawiesin, w których żywotność komórek/jąder mieści się w przedziale 60%-89%, co zilustrowano na Rysunku 5C. Jeśli żywotność, niezależnie od całkowitej liczby komórek, spadnie poniżej 60%, należy rozważyć przerwanie eksperymentu.
Cały proces, od uśmiercenia ciężarnej samicy do konstrukcji biblioteki, trwa łącznie 8 godzin w tym samym dniu (tj. etapy protokołu od 2 do 6 muszą zostać wykonane tego samego dnia). Zgodnie z procedurami opracowanymi przez producentów systemów do analizy pojedynczych komórek11, biblioteki do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) przygotowano z komórek uzyskanych z embrionów E7, przy żywotności komórek od poziomu suboptymalnego do optymalnego, dążąc do szacowanej odzyskiwalności 2000 komórek (Rycina 6). Rycina 6A przedstawia reprezentatywny rozkład wielkości fragmentów bibliotek scRNA-seq zarówno dla warunków suboptymalnych, jak i optymalnych, co wskazuje, że żywotność komórek nie wpływa znacząco na cały proces partycjonowania pojedynczych komórek. Rozkład wielkości fragmentów mieścił się w zakresie 400-500 bp. Wskazuje to, że warunki suboptymalne nie wpływają na proces przygotowania biblioteki. Rycina 6B pokazuje wyniki zarówno udanych, jak i suboptymalnych eksperymentów scRNA-seq. Po sekwencjonowaniu przeprowadzono kontrolę jakości próbek, w wyniku której zaobserwowano, że w przypadkach suboptymalnej żywotności komórek pomyślnie zsekwencjonowano tylko 10% komórek. W przeciwieństwie do tego, próbki optymalne wykazały wyższy odsetek – zsekwencjonowano 91% wszystkich komórek. Potwierdzają to wykresy kodów kreskowych (barcode plots), wskazujące, że warunki suboptymalne charakteryzują się większym szumem tła w porównaniu z warunkami optymalnymi. W obu eksperymentach przeprowadzono analizę klastrowania, która ujawniła 9 klastrów w warunkach optymalnych i 4 w suboptymalnych. Adnotacja klastrów z wykorzystaniem znanych markerów3 ujawniła oczekiwane typy komórek w embrionach E7, w tym epiblast i prążek pierwotny (Rycina 6B). Adnotacja klastrów w eksperymencie suboptymalnym nie była możliwa ze względu na brak wzbogacenia w znane markery dla poszczególnych klastrów. Podkreśla to znaczenie wysokiej jakości komórek, niezbędnych do prawidłowej reprezentacji danych na tych etapach rozwoju.
<img alt="Schemat genotypowania zarodków i oś czasu gastrulacji dla mikrofluidycznej analizy pojedynczych komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Optymalizacja całych zarodków mysich w fazie gastrulacji do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. (A) Schemat procesu pozyskiwania wysokiej jakości komórek i/lub jąder komórkowych z zarodków w fazie gastrulacji. (B) Reprezentatywne obrazy w jasnym polu oraz zaadaptowany schemat3 zarodków mysich podczas gastrulacji od E7 do E8. Pasek skali: 125 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Oś czasu hodowli myszy i etapy receptywności; wykrywanie czopów pochwowych; przewodnik po izolacji zarodków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Strategia wydajnych, zsynchronizowanych ciąż terminowych dla izolacji zarodków podczas gastrulacji. (A) Schemat przedstawiający przebieg ciąż terminowych oraz harmonogram określający czas od wykrycia czopu do izolacji zarodków w celu analizy konkretnych faz gastrulacji. (B) Reprezentatywne obrazy faz cyklu rujowego u samic myszy. Wskazano fazy najbardziej receptywne na rozród. (C) Schemat ilustrujący sposób sprawdzania obecności czopów pochwowych oraz przykłady ujść pochwy bez czopu, z czopem częściowym lub z wyraźnym czopem, które należy uwzględnić przy izolacji zarodków. Ujścia pochwy są powiększone pod każdym obrazem. Czop (skrzepłe nasienie w ujściu pochwy) jest zaznaczony czerwoną strzałką. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat sekcji embrionów, przedstawiający krok po kroku wycięcie macicy i usuwanie embrionów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Sekcja i genotypowanie embrionów E7.5 do sekwencjonowania RNA z pojedynczych komórek. Schematy i zdjęcia procesu izolacji embrionów E7.5 oraz sekcji trzewnego worka żółtkowego. Żółta strzałka wskazuje macicę ciężarnej samicy, a żółta przerywana okrąg zaznacza położenie embrionu. Linie przerywane reprezentują miejsca nacięć wykonanych podczas sekcji. „M” oznacza koniec mezometrialny, natomiast „AM” oznacza koniec antymezometrialny. Paski skali na zdjęciach ze stereomikroskopu wynoszą 400 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces izolacji worka żółtkowego i PCR, schemat blokowy, obrazy zarodków, wyniki żelowania genotypowania, analiza DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Jednodniowe genotypowanie worków żółtkowych z gastrulujących zarodków myszy. (A) Schemat przepływu pracy dla jednodniowego genotypowania worków żółtkowych. (B) Reprezentatywny obraz ściennego worka endodermalnego i stożka ektoplacentalnego wraz z towarzyszącą krwią matczyną. (C) Trzewny worek żółtkowy w zarodkach E7.5 zaznaczony linią przerywaną. Pasek skali: 200 µm. (D) Reprezentatywne żele dla typu dzikiego (+/+), heterozygot (Flox/+) i homozygot flox (Flox/Flox) oraz genotypowanie Cre (Mesp1cre15) z zaobserwowanymi rozmiarami fragmentów DNA. (E) Przedstawiono wyniki jednodniowego genotypowania alleli Cre i flox z worków żółtkowych 6 zarodków (1-6). Dwa zarodki z genotypowaniem flox/flox i ujemnym (-) wynikiem Cre są kontrolami flox (niebieskie kropki), natomiast te z genotypowaniem flox/flox i dodatnim (+) wynikiem Cre są warunkowymi KO (czerwone kropki). Zarodek 4 nie jest optymalny ze względu na słabą prążek Cre (flox/flox i niejasny wynik Cre) i w konsekwencji zostaje wykluczony z dalszego przetwarzania. Zarodki o tym samym genotypie są łączone w pule i przetwarzane w celu sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Należy zauważyć, że obecność allelu Cre w worku żółtkowym nie wpływa na rozmiar prążków flox, ponieważ zastosowana Cre (Mesp1cre) nie jest eksprymowana w worku żółtkowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza żywotności komórek, obrazy mikroskopowe i schemat rozwiązywania problemów dla protokołu mikrofluidycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ocena jakości komórek i żywotności jąder. (A) Reprezentatywne obrazy optymalnych i suboptymalnych warunków żywotności komórek z embrionów E7.5. (B) Reprezentatywne obrazy optymalnych i suboptymalnych warunków żywotności jąder z embrionów E8. (C) Schemat rozwiązywania problemów wskazujący potencjalne rozwiązania pomagające zwiększyć żywotność komórek przed rozpoczęciem partycjonowania pojedynczych komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza żywotności komórek; żel elektroforetyczny, histogram, wykres rankingu kodów kreskowych, wyniki klastrowania UMAP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek z embrionów myszy w stadium E7. (A) Reprezentatywny przebieg rozkładu wielkości fragmentów dla bibliotek sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek z embrionów myszy E7 dla suboptymalnych i optymalnych warunków żywotności komórek, z głównym pikiem w okolicy 400-500 bp. Należy zauważyć, że przebiegi są podobne w obu tych warunkach, co wskazuje, że żywotność komórek nie wpływa na kontrole jakości biblioteki. (B) Analiza wyników sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek dla embrionów myszy E7 w warunkach suboptymalnych i optymalnych, pokazująca obserwowany odzysk celu, ranking kodów kreskowych oraz klastrowanie typów komórek za pomocą rozkładu jednorodnej aproksymacji i projekcji rozmaitości (UMAP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="4">Bufor do lizy</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Nazwa odczynnika</td>
			<td >Stężenie roztworu stokowego</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
			<td >Objętość całkowita 1 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tris-HCL (Ph7)</td>
			<td >1 M</td >
			<td >10 mM</td >
			<td >10 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >NaCl</td >
			<td >5 M</td >
			<td >10 mM</td >
			<td >2 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >MgCl2</td >
			<td >0.1 M</td >
			<td >3 mM</td >
			<td >3 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tween-20</td >
			<td >20%</td >
			<td >0.10%</td >
			<td >5 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Nondiedt P40</td >
			<td >10%</td >
			<td >0.10%</td >
			<td >10 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Digitonin</td >
			<td >5%</td >
			<td >0.01%</td >
			<td >2 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >DTT</td >
			<td > 1 M</td >
			<td >1 mM</td >
			<td >1 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Inhibitor RNazy</td>
			<td >40 U/µL</td >
			<td >1 U/µL</td >
			<td >25 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Woda wolna od nukleaz</td>
			<td >--</td >
			<td >--</td >
			<td >924 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="4">Bufor do płukania</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Nazwa odczynnika</td>
			<td >Stężenie roztworu stokowego</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
			<td >Objętość całkowita 1 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >BSA w PBS</td>
			<td >10%</td >
			<td >1%</td >
			<td >100 µL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PBS</td >
			<td >--</td >
			<td >--</td >
			<td >900 µL</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Skład buforu lizującego do izolacji jąder oraz buforu płukającego.

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Skupiamy się na mechanizmach żeglugi, kontrolując wczesne decyzje dotyczące losu komórek podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych, zarówno in vitro, jak i w modelach mysich. Złożone sieci regulacyjne, różnicowanie nieba podczas rozwoju, a my badamy, w jaki sposób wzajemne oddziaływanie szlaków sygnałowych, czynników transkrypcyjnych i regulatorów epigenetycznych sprzyja różnym siarczanom. Badanie dynamicznego i szybkiego procesu gastrulacji u myszy jest technicznie trudne ze względu na małą liczbę komórek w zarodku i ograniczoną liczbę zarodków o pożądanym genotypie w miocie.Podczas gdy literatura obszernie pokazuje badanie pojedynczych komórek przy użyciu populacji zarodków posortowanych w komórkach typu dzikiego lub aktywowanych fluorescencyjnie, kompleksowa analiza zarodków z mutacjami linii jest nadal ograniczona. Nasz protokół oferuje możliwość generowania jednokomórkowych zestawów danych omicznych z gastrulatujących zarodków zawierających mutacje liniowe. Pomoże to naukowcom, którzy nie mają lub mają ograniczone doświadczenie w pracy z myszami, lub którzy chcą nauczyć się wczesnej manipulacji zarodkami lub metod jednokomórkowych.Nasz protokół pomoże odpowiedzieć na nowe pytania naukowe dotyczące gastrulacji i wczesnej organogenezy, w tym rozwoju serca. Dostarczamy potok do analizy zarodków neuronów specyficznych dla linii w roztworze jednokomórkowym, co ułatwi analizę roli określonych genów w zaangażowaniu linii. Mamy nadzieję, że uda nam się wykorzystać tę metodologię do zrozumienia mechanizmów regulacyjnych decyzji dotyczących siarczanów podczas szybkiego i dynamicznego procesu gastrulacji.Przed rozpoczęciem izolacji mysiego zarodka należy dokładnie oczyścić obszar 70% etanolem. Upewnij się, że wszystkie narzędzia do preparowania są umyte i wysterylizowane. Uzyskaj pięć mililitrów sterylnego DMEM, zawierającego 10% FBS, i 20 mililitrów DPBS, i umieść je na lodzie.Następnie, aby wykonać izolację zarodka za pomocą mikroskopu stereoskopowego ze stopniem światła przechodzącego i kamerą, należy umieścić prawidłowo uśpioną ciężarną matkę na plecach i wysterylizować obszar w pobliżu ujścia pochwy etanolem. Za pomocą nożyczek preparacyjnych i pęsety podnieś fałd skórny w pobliżu otworu pochwy i wykonaj małe nacięcie w kształcie litery V, powoli odsłaniając macicę ciężarnej matki. Następnie wypreparuj róg macicy tamy, przytrzymując jeden jego koniec pęsetą i przecinając wzdłuż niego, upewniając się, że usunąłeś szyjkę macicy.Umieść róg macicy na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej DPBS na lodzie. Za pomocą nożyczek preparacyjnych i pęsety usuń mięsień macicy wzdłuż miejsc implantacji i odetnij każde miejsce implantacji lub perły zawierające obrzęki mleczne wewnątrz. Umieść go w świeżym DPBS na sześciocentymetrowej szalce Petriego na lodzie.Weź jedno miejsce implantacji, umieść je na nowej sześciocentymetrowej szalce Petriego na stoliku mikroskopu stereoskopowego i dodaj do niego 500 mikrolitrów DPBS. Dostosuj ostrość mikroskopu i źródło światła. Przytrzymaj miejsce implantacji jednym zestawem pęsety w jednej ręce.A drugą ręką powoli włóż kolejną parę kleszczy w koniec miejsca implantacji, wyciętego z rogu macicy, stopniowo odsłaniając obrzęk mleczny. Aby odsłonić zarodek, przytrzymaj antytakisomesometrial koniec izolowanego obrzęku mlecznego za pomocą jednej pary kleszczy. A drugą parą powoli wykonaj poziome cięcie, około jednej czwartej wielkości obrzęku liściastego od końca mesometrialu.Teraz za pomocą obu kleszczy powoli odpychaj od antymezometrium i obrzęku mlecznego, aż zarodek wyskoczy ze świeżo ściętego końca mesometrialu. Po ujawnieniu zarodka przystąp do usuwania wszelkich dodatkowych przyczepionych tkanek zarodkowych. Jeśli ciemieniowy worek endodermalny i stożek ektołożyskowy nie odpadną spontanicznie od zarodka, użyj kleszczy, aby usunąć je wraz z odpowiednią krwią matki.Następnie, przytrzymując zarodek jedną parą kleszczy, powoli oderwij woreczek żółtkowy trzewny od zarodka za pomocą drugiej pary kleszczy. Zlokalizuj ciemieniowy worek endodermalny i stożek ektołożyskowy. Za pomocą pipety P20 przenieś woreczek żółtkowy z nie więcej niż 10 mikrolitrami DPBS z naczynia do ośmiopaskowej probówki PCR na lodzie.Rób jasne zdjęcia terenowe świeżo wyizolowanych zarodków, aby upewnić się, że stopień zaawansowania rodzeństwa z miotu jest podobny. Za pomocą pipety P200 powoli przenieś zarodek z 50 mikrolitrami DMEM zawierającymi 10% FBS do 1,5 mililitrowej probówki trzymanej na lodzie. Powtórz to samo dla wszystkich obrzęków liściastych, używając czystych narzędzi i nowych tworzyw sztucznych do każdej izolacji.Po wyizolowaniu woreczka z żółtka trzewnego z zarodka myszy przystąp do trawienia każdego woreczka żółtkowego w ośmiopasmowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub probówce PCR. Za pomocą pipety P20 dodaj 19,3 mikrolitra buforu do lizy DNA matrycy PCR i 0,7 mikrolitra 0,2 mikrograma na mililitr proteinazy K do każdej próbki woreczka żółtkowego. Wirować próbkę przez 10 sekund i za pomocą mini wirówki z adapterem paskowym wirować próbki o masie 1 000 G przez 10 sekund.Umieść ośmiopaskową probówkę do PCR w bloku grzewczym o temperaturze 85 stopni Celsjusza na 45 minut, wirując przez pięć sekund co pięć minut. Po 45 minutach ponownie odwiruj probówkę w dół przy 1 000 G przez 10 sekund przed przystąpieniem do PCR w celu pożądanej identyfikacji genetycznej. Aby przeprowadzić reakcję PCR do genotypowania Cre, należy przygotować wzorcową mieszankę PCR zawierającą wyświetlane składniki do ośmiopaskowej probówki PCR dla każdego woreczka żółtkowego.Kontynuuj uruchamianie programu amplifikacji cyklu termicznego PCR przy użyciu wyświetlanego cyklu, a następnie uruchom produkty PCR na 1% żelu agarozowym, aby wyciągnąć wnioski dotyczące genotypowania. Przechowuj pozostałe strawione próbki woreczka żółtkowego w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Gdy produkt PCR został oddzielony na żelu agarozowym, oczekiwano rozmiarów fragmentów dla zamków p i alleli typu dzikiego, a także żywicy allelu Cre.Przystąp do przeprowadzenia dysocjacji komórek izolowanych mysich zarodków po potwierdzeniu genotypów. Za pomocą pipety P200 dodaj 50 mikrolitrów DMEM z 10% FBS do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Po połączeniu zarodków o tym samym genotypie w nowej probówce, umieść ją na lodzie.Pozwól połączonym zarodkom osiąść na dnie probówki, a następnie umyj zarodki za pomocą 50 mikrolitrów DPBS i poczekaj, aż się uspokoją, zanim usuniesz jak najwięcej DPBS bez usuwania zarodków. Następnie dodaj 100 mikrolitrów trypsyny do połączonych zarodków i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez pięć minut. Delikatnie przesuwaj rurkę o pojemności 1,5 mililitra co 30 sekund, aby pomóc komórkom w dysocjacji.Po pięciu minutach zneutralizuj trypsynę za pomocą 300 mikrolitrów DMEM zawierającego 10% FBS. Odwirować zarodki w sile 100 G przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić uzyskane podniebienie małe w 40 mikrolitrach DMEM z 10% FBS i umieścić rurkę na lodzie.Wymieszaj pięć mikrolitrów zawiesiny komórek z pięcioma mikrolitrami tripu i niebieskiego w nowej 1,5 mililitrowej probówce i dokładnie pipetuj mieszaninę w górę iw dół. Przenieś mieszaninę na szkiełko, aby określić liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek. Na koniec przejdź do partycjonowania pojedynczych komórek za pomocą chipa mikroprzepływowego zgodnie z protokołem producenta.

single-cell-rna-sequencing-mutant-whole-mouse-embryos-from-epiblast

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj zaprezentowaliśmy metodę sekwencjonowania mRNA z multipleksowaną pojedynczą komórką do profilowania ekspresji genów w tkankach embrionalnych myszy. Metoda sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki oparta na kropelkach (scRNA-Seq) w połączeniu ze strategiami multipleksowania może profilować pojedyncze komórki z wielu próbek jednocześnie, co znacznie obniża koszty odczynników i minimalizuje eksperymentalne efekty wsadowe.

Multipleksowana analiza sekwencjonowania mRNA pojedynczej komórki komórek embrionalnych myszy

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Poznaj protokół sekwencjonowania RNA jednokomórkowego zarodków myszy podczas gastrulacji. Ta metoda umożliwia analizę decyzji losu komórkowego u embrionów z mutacjami w liniach komórkowych.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Przeglądaj więcej filmów