Otrzymywanie usieciowanych mikrosfer alginianu sodu z różnymi jonami metali z wykorzystaniem technologii elektrorozpylania mikroprzepływowego
7 czerwca 2024
Protokół opisuje przygotowanie mikrosfer alginianu sodu usieciowanych różnymi jonami metali za pomocą urządzenia mikroprzepływowego do projektowania nośników leków. Zbadano również właściwości przeciwdrobnoustrojowe i powolne uwalnianie tych mikrosfer przez leki.
Mikrosfery wodorowe charakteryzują się dobrą kompatybilnością, elastycznością projektowania i wysokim stopniem personalizacji. Mają szerokie zastosowanie w dziedzinach biomedycznych, takich jak dostarczanie leków terapeutycznych i konstruowanie odkryć w zakresie naprawy TC. W niniejszej pracy przygotowaliśmy mikrosfery wodorowe za pomocą prostego urządzenia mikroprzepływowego.
Ostatnio próbowaliśmy użyć mikrosfer wodorowych wypełnionych małymi cząsteczkami z tradycyjnej medycyny chińskiej, aby wspomóc całe leczenie. W tym badaniu stwierdziliśmy, że mikrosfery alginianu sodu usieciowane jonami i miedzi mają dobre właściwości przeciwdrobnoustrojowe, a zatem ALGMS miedzi i ALGMS są odpowiednie do leczenia bakteryjnych chorób zakaźnych. Do rzeczywistości wymieszaj ALG z ultraczystą wodą w łaźni wodnej zahartowanej w temperaturze 50 stopni Celsjusza.
Oddzielnie przygotować frakcję masową z 5% roztworami chlorku wapnia, chlorku żelaza, siarczanu i siarczanu miedzi w wodzie ultraczystej. Wlej każdy roztwór osobno do naczynia zbiorczego. Umieść szklaną rurkę kapilarną nad płomieniem palnika, aby go zmiękczyć i rozciągnąć do różnych średnic.
Za pomocą noża do szkła odetnij drobne części i delikatnie wypoleruj port końcówki papierem ściernym z węglika krzemu. Podłącz gruby koniec rurki kapilarnej do długiej rurki, a drugi koniec do igły dozującej i pięciomililitrowej strzykawki. Podłączyć strzykawkę do mikroprzepływowej pompy strzykawkowej, a rurkę kapilarną na jednym końcu do uchwytu.
Podłączyć czerwony zacisk końcowy wysokiego napięcia zasilacza wysokonapięciowego do igły dozującej strzykawki i umieścić srebrny klips w płynie zbiorczym. Taka konfiguracja tworzy proste mikroprzepływowe urządzenie do elektrorozpylania. Umieść naczynia zbiorcze zawierające różne jony metali bezpośrednio pod rurką kapilarną.
Włącz mikroprzepływową pompę strzykawkową, wybierz szybkie przewijanie do przodu, aby zalać rurkę ALG i ustaw natężenie przepływu na dwa mililitry na godzinę. Włącz wyłącznik zasilania wysokiego napięcia i przekręć pokrętło, aby ustawić napięcie na pięć do siedmiu kilowoltów. Zbieraj mikrosfery ALG usieciowane różnymi jonami metali.
Po utworzeniu mikrosfer hydrożelowych ALG przenieś je do indywidualnie oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra. Mikrofotografie mikrosfer ALG wykazały dobrą sferyczność, gładką powierzchnię i równomierny rozkład wielkości cząstek. Skaningowa mikroskopia elektronowa wykazała, że mikrosfery były na ogół kuliste, z dobrze zdefiniowaną okrągłością.
Na początek przygotuj mikrosfery hydrożelowe, wapnia, miedzi i alginianu żelaza. W celu przeprowadzenia testu skuteczności przeciwdrobnoustrojowej dodaj 10 mililitrów każdego z dwóch roztworów bakteryjnych do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Następnie inkubuj kultury z 0,5 mililitra mikrosfer hydrożelowych w wytrząsarce o stałej temperaturze.
Rozcieńczyć każdy roztwór bakteryjny dziesięć razy do mocy pięć razy sterylną wodą. Za pomocą sterylnych szklanych kulek równomiernie rozprowadź 200 mikrolitrów roztworu bakteryjnego na stałym podłożu LB. Umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 12 godzin, aby ocenić tworzenie kolonii.
Dodać jeden miligram na mililitr albuminy surowicy bydlęcej lub zawiesiny BSA do 500 mikrolitrów każdej mikrosfery i inkubować przez 24 godziny. Dodaj każdą nasyconą próbkę do jednego mililitra PBS i mieszaj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, z ciągłym wytrząsaniem z prędkością 80 obrotów na minutę. Po porcjowaniu zastąp pożywkę nową po 1, 3, 6, 12, 24, 36 i 48 godzinach.
Określić ilościowo stężenia białka sklarowanego nad osadem w określonych momentach. Dodaj przygotowane mikrosfery ALG do PBS i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Uzyskaj pełną krew od zdrowych myszy w probówkach przeciwzakrzepowych zawierających cytrynian sodu.
Po wirowaniu należy odwirować probówkę przez 15 minut z prędkością 1 500 obrotów na minutę, aby uzyskać czerwone krwinki. Po przepłukaniu komórek przygotuj 10% roztwór czerwonych krwinek z PBS i dodaj 20 mikrolitrów roztworu krwinek do grup eksperymentalnych i kontrolnych mikrosfery. Próbki inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny i odwirowywać je z prędkością 1 500 obr./min przez 15 minut.
Po odstawieniu supernatantu na bok, należy sfotografować czerwone krwinki w każdej grupie po hemolizie. Na koniec zmierz wartości absorbancji supernatantów w każdej grupie i oblicz szybkość hemolizy za pomocą wzoru. Różne mikrosfery wykazywały działanie przeciwbakteryjne wobec Staphylococcus aureus i Escherichia coli, przy czym najsilniejsze właściwości przeciwbakteryjne wykazywały mikrosfery ALG miedzi i.
Test uwalniania leku wykazał, że szybkość uwalniania mikrosfery żelaza była stosunkowo szybsza niż w przypadku pozostałych trzech jonów. Ocena biokompatybilności wykazała, że czerwone krwinki w zawiesinie pozostały nienaruszone w kontakcie z różnymi mikrosferami, co wskazuje na minimalną hemolizę przez mikrosfery.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na przygotowaniu mikrosfer alginianu sodu sieciowanych jonami cynku i miedzi przy użyciu urządzenia mikrofluidycznego. W celu oceny potencjalnych zastosowań w dostarczaniu leków przeanalizowano właściwości przeciwdrobnoustrojowe oraz charakterystykę powolnego uwalniania leku z tych mikrosfer.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria biomedyczna
- Systemy dostarczania leków
- Mikrofluidyka
Wprowadzenie
- Alginian sodu jest biokompatybilnym polimerem stosowanym w dostarczaniu leków.
- Mikrosfery mogą usprawnić dostarczanie i uwalnianie czynników terapeutycznych.
- Jony metali, takie jak cynk i miedź, mogą poprawić właściwości przeciwdrobnoustrojowe nośników leków.
- Urządzenia mikroprzepływowe umożliwiają precyzyjną kontrolę procesu wytwarzania mikrosfer.
Cel badania
- Opracowanie mikrosfer z alginianu sodu do zastosowań w dostarczaniu leków.
- Zbadanie właściwości przeciwdrobnoustrojowych sieciowanych mikrosfer.
- Ocena zdolności tych mikrosfer do powolnego uwalniania leku.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mikrosfer alginianu sodu przy użyciu urządzenia mikrofluidycznego.
- Sieciowanie jonami cynku i miedzi.
- Ocena właściwości przeciwdrobnoustrojowych wobec szczepów bakteryjnych.
- Ocena profili uwalniania leku z mikrosfer.
Główne wyniki
- Mikrosfery sieciowane jonami cynku i miedzi wykazały znaczną aktywność przeciwdrobnoustrojową.
- Mikrosfery wykazały kontrolowane i przedłużone uwalnianie leku.
- Sformułowania te są obiecujące w leczeniu infekcji bakteryjnych.
- Podejście mikrofluidyczne umożliwia powtarzalną i skalowalną produkcję.
Wnioski
- Mikrosfery alginianu sodu sieciowane jonami metali są skutecznymi nośnikami leków.
- Posiadają one pożądane właściwości przeciwdrobnoustrojowe w zastosowaniach terapeutycznych.
- Niniejsze badanie stanowi podstawę dla przyszłych badań nad systemami dostarczania leków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikrofluidyczne wytwarzanie sieciowanych mikrosfer alginianu sodu metodą elektrosprayu umożliwia precyzyjną kontrolę wielkości cząstek, ich jednorodności oraz enkapsulacji leku, bezpośrednio rozwiązując problemy z formułowaniem na wczesnych etapach badań i rozwoju w obszarze dostarczania leków. Możliwość dostrojenia właściwości przeciwdrobnoustrojowych oraz kinetyki uwalniania leku poprzez sieciowanie jonami metali zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze kandydatów do badań przedklinicznych. Ta technologia platformowa jest istotna dla zespołów portfelowych poszukujących skalowalnych, reprodukowalnych i biokompatybilnych systemów dostarczania zaawansowanych preparatów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną ocenę biozgodności i aktywności przeciwdrobnoustrojowej nośników leków in vitro.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację wpływu różnych jonów metali sieciujących na działanie biologiczne.
- Ułatwia walidację funkcjonalną nośników w ukierunkowanych zastosowaniach terapeutycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane, jednorodne mikrosfery dla powtarzalnego uwalniania leków i testów przeciwdrobnoustrojowych.
- Umożliwia ilościową ocenę kinetyki uwalniania i aktywności biologicznej dla wielu formulacji.
- Wspiera skalowalny przygotowanie materiałów gotowych do analiz w ramach dalszych etapów procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu choroby, umożliwiając ocenę skuteczności przeciwdrobnoustrojowej przeciwko patogenom o znaczeniu klinicznym.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez dostarczenie danych dotyczących biozgodności i hemolizy.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, wykazując kontrolowane uwalnianie i minimalną cytotoksyczność in vitro.
Integracja potoków i przepływu pracy
Ta mikrofluidyczna metoda elektrosprayu wpisuje się w kontinuum od odkrywania leku do badań przedklinicznych, umożliwiając szybkie prototypowanie i ocenę systemów nośników leków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu wyboru czynnika sieciującego na wydajność i bezpieczeństwo nośnika.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki uwalniania leku oraz aktywności przeciwdrobnoustrojowej.
- Analityka: Zapewnia standaryzowane pomiary hemolizy, uwalniania białek i inhibicji bakteryjnej do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne prace nad formulacją z przedklinicznymi ocenami bezpieczeństwa i skuteczności.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy modułową platformę możliwą do adaptacji dla różnych kandydatów na leki i obszarów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze nośnika leku i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność produkcji mikrosfer.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację technologii dostarczania leków do dalszego rozwoju, w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu mikrofluidyki, chemii polimerów oraz opracowywania analiz analitycznych.
- Niezbędny jest dostęp do aparatury do mikrofluidycznego elektrosprayu oraz zasilaczy wysokiego napięcia.
- Wymagana jest standaryzacja formulacji i protokołów analitycznych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do różnych cząsteczek leków lub modeli biologicznych może wymagać dodatkowej optymalizacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują limity przepustowości oraz konieczność rygorystycznej walidacji in vitro przed badaniami in vivo.
