Name: Rozwój kombinatorycznych terapii w leczeniu urazów rdzenia kręgowego z wykorzystaniem dostarczania komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Poznaj metodę dostarczania komórek macierzystych w leczeniu urazów rdzenia kręgowego z wykorzystaniem hydrogeli z tkanki zdekellularizowanej. Ta technika wspiera badania nad regeneracją nerwów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez PhRMA Foundation oraz National Institutes of Health poprzez nagrodę o numerze P20GM139768 i R15NS121884 przyznanych YS. Chcemy podziękować dr Kartikowi Balachandranowi oraz dr Raj Rao z Wydziału Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Arkansas za umożliwienie nam korzystania z ich sprzętu. Chcemy również podziękować dr Jin-Woo Kimowi oraz panu Patrickowi Kuczwarze z Wydziału Inżynierii Biologicznej i Rolniczej Uniwersytetu Arkansas za szkolenie z zakresu reometru.

Tkanki wieprzowe były pozyskiwane komercyjnie, więc komisja etyczna ds. zwierząt nie wymagała zatwierdzenia.
1. Decelularyzacja rdzenia kręgowego u wieprzi (szacowany czas: 5 dni)
UWAGA: Wykonaj decelularyzację przy użyciu wcześniej ustalonych protokołów z modyfikacjami25,26. Wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnej szafce bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie roztwory powinny być filtrowane sterylnie za pomocą filtra na pokrywce (pory 0,2 μm) do butelek z autoklawem. Zabiegi przeprowadzane w temperaturze 37 °C można wykonywać w inkubatorze lub czystym piekarniku ustawionym na 37 °C.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów decelularyzacji UWAGA: Wszystkie roztwory są obliczane na 1 L. Użytkownicy mogą potrzebować dostosować ostateczną wymaganą objętość do swoich potrzeb eksperymentalnych.<ol>
		<li>Rozcieńcz 500 mL 0,05% trypsyny/etylendiaminetetraoctowego kwasu (EDTA) z 500 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby uzyskać 0,025% trypsynę/EDTA.</li>
		<li>Rozcieńcz 300 mL 10% Triton X-100 z 700 mL PBS, aby uzyskać 3% Triton X-100. Wymieszaj 0,56 g NaCl, 1,31 gNaH,2 PO4H2O oraz 10,85 g HNa2O4P·7H2O na 1 L wody dejonizowanej, aby uzyskać 100 mM Na/50 mM buforu phos.</li>
		<li>Wymieszaj 32,4 g sacharozy z 1 L wody dejonizowanej, aby uzyskać 1 M sacharozy. Wymieszaj 40 g deoksycholatu sodu (SD) z 1 L wody dejonizowanej, aby uzyskać 4% roztwór SD. Rozcieńcz 6,7 mL 15% kwasu nadoctowego z 993,3 mL 4% etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie świńskiego rdzenia kręgowego UWAGA: Rdzenie kręgowe były transportowane zamrożone bez roztworu i przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu użycia.<ol>
		<li>Rozmrażaj rdzeń kręgowy w 4 °C w lodówce przez 18-24 godziny przed decelularyzacją. Użyj sterylnych nożyczek, aby ostrożnie usunąć oporządzenie twarde.</li>
		<li>Przetnij rdzeń kręgowy na małe kawałki (około 1 cm długości). Umieść jedną część w probówce 15 mL lub maksymalnie trzy kawałki w probówce 50 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Decelularyzacja rdzenia kręgowego UWAGA: Po każdym kroku roztwory decelularyzacyjne są ręcznie wlewane do dużej zlewki, aby je wyrzucić. Małe, autoklawowalne sitko ze stali nierdzewnej może pomóc w usuwaniu roztworów decellularyzacyjnych bez utraty tkanek potrzebnych na każdy etap. Rdzeń kręgowy był pobudzony przy 83 obr./min, chyba że zaznaczono inaczej.<ol>
		<li>Płukaj rdzeń kręgowy wodą dejonizowaną przez 18-24 godziny w temperaturze 4 °C i 60 obr./min.</li>
		<li>Płukaj rdzeń kręgowy 0,025% trypsyną/EDTA przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 40 obr./min. Następnie płucz rdzeń kręgowy PBS przez 15 minut, 2 razy.</li>
		<li>Płukaj rdzeń kręgowy 3% Triton X-100 przez 2 godziny. Przepłukaj rdzeń kręgowy buforem fosyalnym 100 mM Na/50 mM przez 15 minut, 2 razy.</li>
		<li>Płukaj rdzeń kręgowy 1 M sacharozą przez 1 godzinę. Następnie płucz rdzeń kręgowy wodą dejonizowaną przez 1 godzinę.</li>
		<li>Płukaj rdzeń kręgowy 4% SD przez 2 godziny. Następnie płucz rdzeń kręgowy buforem fosforowym 100 mM Na/50 mM przez 15 minut, 2 razy.</li>
		<li>Płukaj rdzeń kręgowy 0,1% kwasem nadoctowym w 4% etanolu przez 4 godziny. Następnie płucz rdzeń kręgowy PBS przez 1 godzinę.</li>
		<li>Płukaj rdzeń kręgowy wodą dejonizowaną przez 1 godzinę, 2 razy. Następnie płucz rdzeń kręgowy PBS przez 1 godzinę.</li>
		<li>Liofilizuj rdzeń kręgowy w temperaturze 0,01 mbar i -56 °C przez 3 dni i przechowuj suchy do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Decelularyzacja nerwu kulszowego wieprzowego (szacowany czas: 5 dni)
UWAGA: Wykonaj decelularyzację według wcześniej ustalonego protokołu27. Wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnej szafce bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie roztwory powinny być filtrowane sterylnie za pomocą filtra na pokrywce (pory 0,2 μm) do butelek z autoklawem. Procedury przeprowadzane w temperaturze 37 °C można wykonywać w inkubatorze lub czystym piekarniku ustawionym na 37°C.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów decelularyzacji UWAGA: Wszystkie roztwory są obliczane na 1 L. Użytkownicy mogą potrzebować dostosować ostateczną wymaganą objętość do swoich potrzeb eksperymentalnych.<ol>
		<li>Przygotuj bufor 50 mM Na/10 mM phos, mieszając 1,86 g NaCl, 0,262 g d NaH2PO4H2O oraz 2,17 g HNa2O 4P·7H2O w 1 L wody dejonizowanej.</li>
		<li>Przygotuj roztwór sulfobetainy-10 (SB-10) o pojemności 125 mM przez wymieszanie 38,4 g SB-10 w 1 L buforu 50 mM Na/10 mM fosforu.</li>
		<li>Przygotuj roztwór 3% SD/0,6 mM sulfobetainy-16 (SB-16), mieszając 30 g SD i 0,24 g SB-16 w 1 L buforu 50 mM Na/10 mM phos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie nerwu kulszowego wieprzowego UWAGA: Nerwy kulszowe były transportowane zamrożone z PBS i przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu użycia.<ol>
		<li>Rozmroź nerw kulszowy w 4 °C w lodówce 18-24 godziny przed decelularyzacją.</li>
		<li>Przetnij nerw kulszowy na małe kawałki (około 1 cm długości). Umieść jedną część w probówce 15 mL lub maksymalnie trzy kawałki w probówce 50 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Decellularyzacja nerwu kulszowego UWAGA: Po każdym kroku roztwory decelularyzacyjne są ręcznie wlewane do dużej zlewki do wyrzucenia, a do odrzucania można użyć małego, autoklawowego sito ze stali nierdzewnej, aby pomóc w odrzucaniu roztworów decelularyzacyjnych bez utraty tkanek potrzebnych na każdy etap. Nerw kulszowy był pobudzony przy 15 obr./min, chyba że zaznaczyono inaczej.<ol>
		<li>Płukaj nerw kulszowy wodą dejonizowaną przez 7 godzin. Następnie płucz nerw kulszowy 125 mM sulfobetainy-10 (SB-10) w buforze 50 mM Na/10 mM phos przez 18 godzin.</li>
		<li>Płukaj nerw kulszowy buforem fosowym 100 mM Na/50 mM na 15 minut. Następnie płucz nerw kulszowy 3% SD/0,6 mM sulfobetainy-16 (SB-16) w buforze fosowym 50 mM Na/10 mM przez 2 godziny.</li>
		<li>Przepłukaj nerw kulszowy buforem fosforowym 100 mM Na/50 mM przez 15 minut, 3 razy. Następnie płucze nerw kulszowy 125 mM SB-10 w buforze fosowym 50 mM Na/10 mM fosforu przez 7 godzin.</li>
		<li>Płukaj nerw kulszowy buforem fosowym 100 mM Na/50 mM na 15 minut. Następnie płucz nerw kulszowy 3% SD/0,6 mM SB-16 w buforze 50 mM Na/10 mM phos przez 1,5 godziny.</li>
		<li>Przepłukaj nerw kulszowy buforem fosforowym 50 mM Na/10 mM przez 15 minut, 3 razy. Następnie spłukać nerw kulszowy 75 U/mL deoksyrybonukleazy (DNazy) przez 3 godziny bez pobudzenia.</li>
		<li>Przepłucz nerw kulszowy buforem fosowym 50 mM Na/10 mM na 1 godzinę, 3 razy. Następnie płucz nerw kulszowy 0,2 U/mL chondroitinazy ABC przez 16 godzin bez pobudzenia w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Płukaj nerw kulszowy PBS przez 3 godziny, 3 razy. Liofilizuj nerw kulszowy w temperaturze 0,01 mbar i -56 °C przez 3 dni i przechowuj suchy do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Trawienie zdecelularyzowanych tkanek i wytwarzanie kompozytowych hydrożeli (szacowany czas: 4 dni)
<ol>
	<li>Posiekaj lub zmiel zdecellularizowane tkanki na proszek za pomocą nożyczek lub homogenizatora. Sterylizuj narzędzia do cięcia lub mielenia tkanek za pomocą autoklawu w temperaturze 121 °C przez 45 minut. Metoda tlenku etylenu również jest stosowana.</li>
	<li>Tkanki trawić osobno w roztworze 0,01 N kwasu solnego (HCl) zawierającym 1 mg/mL pepsyny w stężeniu 15 mg/mL. Szacowane masy zdecellularyzowanego rdzenia kręgowego i nerwu kulszowego to odpowiednio 50-100 mg i 100-150 mg na osobę.</li>
	<li>Umieść pręt magnetyczny i mieszaj w temperaturze 500 obr./min i 4 °C przez co najmniej 4 dni, aby uzyskać roztwory preżelowe.</li>
	<li>Zmieszaj pregel nerwu kulszowego i rdzenia kręgowego w następujących proporcjach objętościowych: 2:1, 1:1 i 1:2. Reguluj pH 7,4 używając 1 N wodorotlenku sodu (NaOH) i HCl, a następnie rozcieńcz do pożądanego stężenia za pomocą podłoża M199 i 1x PBS. Inkubuj w 37 °C przez 30 minut. UWAGA: Dodawaj NaOH po 1 μL na raz. Medium M199 może być używane jako wskaźnik pH, ponieważ gdy pH wynosi 7,4, staje się jasnoróżowe, ale do potwierdzenia poziomu pH powinny być użyte paski pH.</li>
</ol>
4. Weryfikacja decelularyzacji
<ol>
	<li>Barwienie hematoksylyny i eozyny (H&E; Szacowany czas: 8 dni) UWAGA: Po każdym kroku płukania roztwory są ręcznie wlewane do dużej zlewki do odrzucania.<ol>
		<li>Utrwalić świeży i zdecellularizowany rdzeń kręgowy oraz nerw kulszowy w 3,7% formaldehydu w temperaturze 4 °C przez 18 godzin. Włóż jeden kawałek do probówki 15 mL.</li>
		<li>Usuń formaldehyd i umieść chusteczki w 10% sacharozie na jeden dzień. Usuń 10% sacharozy i umieść tkanki w 30% sacharozy na 6 dni.</li>
		<li>Napełnij odpowiednio dopasowany kryomold optymalną temperaturą cięcia (OCT) do połowy. Umieść zdecellularizowane tkanki, pokryj je OCT i pozwól im wchłonąć OCT przez 1 dzień.</li>
		<li>Po 1 dniu zamroz tkanki na noc w temperaturze -80 °C. Kriosekcję tkanek o grubości 10 μm za pomocą kriostatu.</li>
		<li>Płukaj 1x PBS przez 5 minut, 2x. Następnie płucz wodą z kranu przez 5 minut.</li>
		<li>Barwić roztworem hematoksyliny przez 1 minutę. Płukaj wodą z kranu przez 1 minutę, 3 razy.</li>
		<li>Barw roztworem eozyny przez 1 minutę. Płukaj etanolem 95% przez 1 minutę, 2 razy i 100% etanolem przez 1 minutę, 3 razy.</li>
		<li>Płukaj ksylenem przez 1 minutę, 2 minuty, a potem 1 minutę. Pozwól szkiełkom wyschnąć przez 5 minut.</li>
		<li>Użyj patyczka watowego, aby przekroczyć 3–4 krople roztworu dibutyloftalanu polistyren-ksylenowego (DPX) na preparaty. Nakładki nakładkowe na slajdach pokrytych DPX. Pozwól szkiełkom wyschnąć przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza DNA (szacowany czas: 1 godzina)<ol>
		<li>Waż się tkanki decelularizowane i liofilizowane. Izoluj i ilościowo określ DNA za pomocą dostępnych komercyjnie zestawów zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Charakterystyka kompozytowych hydrożeli
<ol>
	<li>Test mętności żelacyjną (szacowany czas: 1 godzina)<ol>
		<li>Umieść 100 μL roztworów preżelowych w każdej jamie na 96-dołowej płycie na lodzie. Mierz absorpcję przy 405 nm co 2 minuty przez 45 minut za pomocą czytnika płytowego.</li>
		<li>Oblicz znormalizowaną absorbancję za pomocą następującego równania: (Absorpcja - początkowaabsorpcja) / (Maksymalna absorpcja -początkowa absorpcja)</li>
		<li>Oblicz nachylenie krzywej oraz czas potrzebny na osiągnięcie żelacji 50% i 95%, odpowiednio t1/2 it 95.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test kompresji (szacowany czas: 1 min na hydrogel)<ol>
		<li>Wytwarzaj kompozytowe hydrożele o stężeniu 12 mg/mL o średnicy 8 mm i wysokości 2 mm.</li>
		<li>Użyj reometru do sprężania próbek z obciążeniem 250 N pomiędzy stalowymi płytami równoległymi ze stali nierdzewnej z częstotliwością odkształcenia 10% wysokości próbki na minę. Oprogramowanie dostarczające odczyty reometru dostarcza krzywą naprężenia-odkształcenia, stosując siłę i mierząc odkształcenie aż do pęknięcia hydrożeli.</li>
		<li>Oblicz moduł Younga z nachylenia liniowego obszaru krzywych naprężenie-odkształcenie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Trójwymiarowa hodowla ludzkich ASC w kompozytowych hydrożelach nerwowych
<ol>
	<li>Przygotowanie trójwymiarowej (3D) platformy (szacowany czas: 3 godziny)<ol>
		<li>Trawienie płytki krzemowej fotorezystorem SU-8, aby uzyskać okrągłe wzory o głębokości 200 μm i średnicy 4 mm.</li>
		<li>Zmieszaj bazę polidimetylosiloksanu (PDMS) i środek utwardzający w proporcji 10:1. Wlej mieszankę na płytkę krzemową i pozostawij ją na 20 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powstające podczas mieszania bazy PDMS i środka utwardzającego.</li>
		<li>Włóż go do piekarnika i utwardzaj przez 2 godziny w temperaturze 70 °C. Rozbij utwardzony arkusz PDMS i wybij go za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 8 mm, aby uzyskać mikrootwory PDMS.</li>
		<li>Umieść mikrootwory w płycie z 96 dołkami i umieść płytkę w czyścicielu plazmy powietrznej, aby sterylizować mikrootwory PDMS.</li>
		<li>Funkcjonalizuj mikrowstudnie PDMS z 1% polietyleiminy (PEI) i 0,1% glutaraldehydu (GA) odpowiednio przez 10 i 20 minut. Myj mikrodołki wodą destylowaną 2 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hASC (szacowany czas: 7 dni)<ol>
		<li>Hodować komórki przechodzące przez 2-5 przejść w ośrodku wzrostu hASC (podłoże bazalne hASC uzupełnione surowicą płodową (FBS) oraz penicyliną/streptomycyną (Pen-streptokok)) aż do połączenia się. Przejdź i oblicz liczbę komórek za pomocą hemacytometru lub licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hydrożele kompozytowe z nerwami obsadzonymi w ASC (szacowany czas: 2 godziny)<ol>
		<li>Zmieszaj pregel nerwu kulszowego i rdzenia kręgowego w proporcjach objętościowych 2:1, 1:1, 1:2 i przygotuj hydrogel wyłącznie z rdzenia kręgowego, nie mieszając żadnego preżelu nerwu kulszowego.</li>
		<li>Dodaj podłoże M199 i dostosuj pH 7,4 za pomocą 1 N NaOH i HCl. Ponownie zawiesij hASC z podłożem wzrostowym w preżelu o gęstości 1 x 106 komórek /mL. UWAGA: Ilość M199 i zawiesiny komórkowej powinna stanowić 10% pregelu.</li>
		<li>Rozcieńcz preżel do 12 mg/mL przy użyciu 1x PBS. Umieść preżel na mikrodołkach i inkubuj przez 30 minut. Hodowanie hydrożeli bogatych w ASC w podłożu wzrostu hASC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test żywotności komórek (szacowany czas: 4 godziny dziennie)<ol>
		<li>Przygotowuj roztwory testowe z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych odczynników zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Aspiruj media w dniach 1, 4, 7 i 14. Dodaj odczynnik do dołków i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3 godziny zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
		<li>Odczytuj fluorescencję przy wzbudzeniu/emisji 560/590 nm za pomocą czytnika płyt. Oblicz różnicę procentową za pomocą następującego równania: [(próbka fluorescencyjna –blank fluorescencyjny) /blank fluorescencyjny] x 100</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powszechnie uważa się, że patofizjologia rdzenia rdzeniowego jest złożona i wielowymiarowa. Chociaż pojedyncze terapie, takie jak transplantacja komórek, podawanie leków czy biomateriały, dostarczyły cennych informacji o SCI, skomplikowany charakter SCI może ograniczać ich indywidualną skuteczność 28,29,30,31. W związku z tym wzrosły wysiłki na rzecz opracowania skutecznych terapii kombinatorycznych. Opisane w tym badaniu kompozytowe hydrożele nerwowe mogą służyć jako skuteczny nośnik komórek lub leków. Jeśli chodzi o komórki, ASC są jednym z obiecujących kandydatów do przeszczepu komórek. ASC wydzielają czynniki immunomodulacyjne, takie jak interleukina-10 (IL-10) i transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β), a także czynniki neurotrofowe, takie jak czynnik wzrostu nerwów (NGF), neurotroficzny czynnik mózgowy (BDNF), czynnik neurotroficzny pochodzący z gleja (GDNF) oraz neurotrofyna-3 (NT-3), które prowadzą do zwiększonego wzrostu neurytów zwojów grzbietowego korzenia in vitro oraz do odzysku funkcji in vivo17,19,32, 33,34. ASC podawane w roztworach wodnych sprzyjały funkcjonalnej regeneracji po SCI u szczurów i ludzi; jednak odnotowano wyzwania związane z mediacją migracji, różnicowaniem, przeżywalnością i różnicowaniem ASCw 35,36,37. Ponadto istnieją sprzeczne doniesienia dotyczące potencjału nowotworowego przeszczepionych ASC; podczas gdy niektóre badania wskazywały, że ASC mogą przyczyniać się do proliferacji i przerzutów różnych typów nowotworów, inne badania wykazały również potencjał antynowotworowy 38,39,40,41 Dlatego długoterminowy profil bezpieczeństwa ASC w kompozytowych hydrożelach nerwowych wymaga zbadania w przyszłości. Tutaj zdecellularizowane rdzenie kręgowe i nerwy kulszowe zostały przebadane osobno w celu naprawy rdzenia rdzeniowego.
Decellularizowane rdzenie kręgowe zostały wstrzyknięte do modelu szczura z rdzeniem rdzeniowym i stymulowały wrost aksonów w zmianę oraz podwyższoną funkcjonalność; jednak z powodu szybkiego rozkładu powstała torbiel, a rekonwalescencja po 4-8 tygodniachleczenia 4, 42 uległa słabości. Bezkomórkowy zdecellularizowany hydrogel nerwu kulszowego był wstrzykiwany szczurom rdzenia rdzeniowego i sprzyjał regeneracji nerwów, jednak skuteczność hydrożelu była ograniczona z powodu szybkiej degradacji24. Dlatego podejścia kombinatoryczne wykorzystujące tkanki decellularne zyskały ostatnio na uwadze. Zgłoszono, że zdecelularizowane hydrożele rdzenia kręgowego sprzyjały proliferacji, migracji i różnicowaniu komórek macierzystych nerwowych/progenitorowych do neuronów4. Ułatwił także wyrost 3D neurytów z komórek neuroblastoma N1E-115, co wskazuje, że zdecellularizowane hydrożele rdzenia kręgowego mogą być atrakcyjnym rusztowaniem wspierającym regenerację aksonów26. Decellularizowane nerwy kulszowe były badane za pomocą enkapsulacji Schwanna i wykazały potencjał jako przeszczep nerwu po SCI43. Połączenie zdecellularizowanych rdzeni kręgowych i nerwów kulszowych ma sprzyjać zarówno regeneracji aksonów, jak i odbudowie tkanek. Obecne badanie nie obejmuje również oceny terapeutycznych efektów hydrożeli nerwowych z ASC. Dlatego niezbędne jest ocenienie potencjałów regeneracyjnych, takich jak efekty proangiogenne i neurotroficzne, platformy za pomocą badań in vitro i in vivo . Ponadto kompozytowe hydrożele nerwowe mogą być łatwo stosowane do otoczenia innych typów komórek, takich jak komórki Schwanna, komórki macierzyste węchowe czy komórki macierzyste nerwowe, aby poprawić skuteczność terapeutyczną przeszczepu komórek. Byłoby intrygujące zbadać bezpieczeństwo i skuteczność różnych typów komórek w kompozytowym hydrożelu nerwowym na różnych etapach rdzenia rdzeniowego.
Jednym z kluczowych kroków przy tworzeniu kompozytowych hydrożeli jest przygotowanie odpowiedniej ilości tkanek, zwłaszcza rdzenia kręgowego. Wydajność zdecellularyzowanych rdzenia kręgowego jest znacząco niska, co zaznacza protokół (50-100 mg kawałka rdzenia kręgowego i 100-150 mg fragmentu nerwu kulszowego); dlatego nie zaleca się pozyskiwania lub pozyskiwania rdzenia kręgowego od małych zwierząt, takich jak myszy i szczury. Przynajmniej średniej wielkości zwierzęta, takie jak króliki, sugeruje się, że zyskują znaczną liczbę macierzy rdzenia kręgowego. Ważne jest również sprawdzanie pH podczas trawienia zdecellularyzowanych tkanek, ponieważ dodanie tkanek może przesunąć pH poza wymagany zakres aktywacji pepsyny, który wynosi około 1,5-2. Czas mieszania przy decelularyzacji rdzenia kręgowego jest dłuższy niż w przypadku wcześniej ustalonej metody26 , ponieważ tempo mieszania jest wolniejsze w obecnym protokole. Rotator używany w tym protokole oferuje do 83 obr./min, podczas gdy w wcześniej stosowanych metodach maksymalnie 200 obr./min. Dlatego czas mieszania został dwukrotnie wydłużony, aby dokładnie umyć wszystkie zanieczyszczenia komórkowe. Aby zapewnić, że wszystkie roztwory decellularizacyjne mogą przeniknąć do tkanek i wypłukać całą zawartość komórkową oraz jądrową, czas i szybkość mieszania należy optymalizować za pomocą histologii lub analizy DNA po stronie użytkownika. Sugeruje się, aby stosunek między tkankami a roztworem decelularyzacji wynosił co najmniej 1:15 [w/v]. Zdecellularizowane tkanki w wcześniej ustalonym protokole26 były trawione/mieszane w temperaturze pokojowej; jednak w tym protokole były trawione za pomocą pręta magnetycznego na płycie mieszającej w temperaturze 4 °C i 500 obr./min przez 4 dni. Silnik na płytce mieszającej mógł generować ciepło i wprowadzać je do roztworu preżelu. Dlatego zaleca się trawienie w niskich temperaturach lub użycie płyty mieszającej z regulowaną temperaturą.
Jak zauważono w analizie DNA (Rysunek 2B), usunięcie rdzenia twardego rdzenia kręgowego jest kluczowe, ponieważ w środku rdzenia twardego można znaleźć znaczną ilość DNA. Opona twarda, w przeciwieństwie do parenchymy rdzenia kręgowego, składa się z tkanki włóknistej; dlatego należy stosować inne metody decellularyzacji, jak wcześniej udokumentowano44,45. Do weryfikacji skuteczności procesu decellularyzacji wykorzystano barwienie H&E oraz analizę DNA zdecellularizowanych tkanek. Aby osiągnąć cele skutecznej decelularyzacji, należy spełnić następujące kryteria: 1. Sucha masa ECM poniżej 50 ng dsDNA/mg, 2. Długość fragmentu DNA poniżej 200 bp, 3. Brak materiału jądrowego w przekrojach tkanek lub H&E5. Jakościowa analiza barwienia H&E po decelularyzacji wykazała brak barwienia jąder, co sugeruje skuteczne usunięcie komórek. Ponadto zachowano składniki ECM, takie jak kolagen i inne białka matrycy, a intensywność barwienia została zmniejszona po decelularyzacji, co odzwierciedla usunięcie materiału komórkowego. Po decelularyzacji zawartość DNA wynosiła 0,63 ng w nerwie kulszowym oraz 23,74 ± 6,69 ng w rdzeniu kręgowym na mg suchej masy ECM, co jest poniżej dopuszczalnego progu dla aplikacji in vivo.
Pomiary reologiczne kompozytowych hydrożeli muszą być starannie zaprojektowane, ponieważ reometry o wysokiej sile ściskania ani testery rozciągające nie mogą być używane do analizy właściwości mechanicznych miękkich materiałów, takich jak kompozytowe hydrożele nerwowe powstałe w tym badaniu. Próbki są rozrywane/rozrywane, gdy są chwytane na testerze rozciągającego, a kompresja z dużą siłą nie dostarczy danych wystarczająco czułych do analizy. W tym badaniu zastosowano reometr o sile kompresji 250 N i zaleca się znalezienie urządzenia o podobnej lub odpowiedniej sile do zastosowań użytkowników. Alternatywnie różne pomiary reologiczne, takie jak oscylacyjne pomiary ścinania, mogą pomóc w określeniu modułów przechowywania i strat. Ograniczenie w tym badaniu stanowi ograniczenie obniżonych właściwości mechanicznych po decellularyzacji. Mimo że moduł Younga wszystkich grup hydrożelowych jest podobny do modułu zdecellularyzowanego rdzenia kręgowego, znacząco różni się od świeżego rdzenia kręgowego (dane nie pokazano). Komórki macierzyste nerwowe i MSC hodowane na stosunkowo miękkich materiałach wykazały zwiększoną różnicowanie neuronów i ekspresję β-III tubuliny, odpowiednio46,47. Możliwe jest jednak wzmocnienie lub połączenie zdecelularyzowanych materiałów z innymi materiałami, takimi jak algian, poliglikol etylenowy, genipina i glutaraldehyd 48,49,50,51. Konieczna będzie optymalizacja, aby zapewnić, że strategie wzmacniające właściwości mechaniczne hydrożeli nie wpływają na zachowanie lub żywotność komórek.
Zmienność hydrożeli kompozytowych nerwowych w poszczególnych partiach można zaobserwować częściowo z powodu różnic w wieku, płci, wadze i gatunku zwierząt. Kontrolowane i konsekwentne stosowanie tego samego rodzaju zwierząt może pomóc zminimalizować tę zmienność. Łączenie próbek tkanek od różnych zwierząt może również pomóc zmniejszyć zmienność między partiami52. Jednym z potencjalnych wyzwań przy przenoszeniu tego badania na zastosowania kliniczne jest skalowalność. Niska wydajność decelularyzacji rdzenia kręgowego utrudniałaby produkcję dużej ilości zdecelularyzowanych tkanek. Trzeba by opracować i zoptymalizować nowe metody, aby uzyskać więcej tkanek, lub oporządzone mater mogłyby być zdecelularyzowane razem, aby zwiększyć wydajność po decelularyzacji. Kolejnym potencjalnym wyzwaniem jest uzyskanie zgody regulacyjnej. W USA FDA odpowiada za regulacyjne zatwierdzanie terapii komórkowych53. Organ regulacyjny Republiki Korei zatwierdził wejście na rynek CARTISTEM, który jest produktem opartym na MSC na bazie MSC z allogenicznymi MSC pochodzącymi z krwi pępowinowej oraz 4% hydrożelu hialuronianowego do leczenia wad chrząstki kolana54. Takie precedensy mogą usprawnić proces przeglądu regulacyjnego, dostarczając danych o bezpieczeństwie i efektywności.

Około 296 000 osób cierpi na urazowe SCI, a każdego roku w USA pojawia się około 18 000 nowych przypadków SCI. Urazowe mięśnie rdzenia rdzeniowego najczęściej są spowodowane upadkami, ranami postrzałowymi, wypadkami samochodowymi oraz aktywnościami sportowymi, a często prowadzi do trwałej utraty funkcji sensoryczno-ruchowych poniżej miejsca urazu. Szacowane koszty leczenia SCI w ciągu życia wynoszą od jednego do pięciu milionów dolarów na osobę, przy znacząco niższej oczekiwanej długości życia1. Jednak rdzenie rdzeniowe jest nadal słabo poznane i w dużej mierze nieuleczalne, głównie z powodu złożonych patofizjologicznych konsekwencjipo urazie. Badane były różne strategie, w tym przeszczepy komórek oraz rusztowania oparte na biomateriałach. Chociaż przeszczepianie komórek i biomateriałów wykazało potencjał, wielowymiarowy charakter SCI sugeruje, że podejścia kombinatoryczne mogą być bardziej korzystne3. W rezultacie wiele strategii kombinatorycznych zostało zbadanych, które wykazały lepszą skuteczność terapeutyczną niż pojedyncze składniki. Jednak potrzebne są dalsze badania, aby dostarczyć nowe biomateriały do dostarczania komórek i leków3.
Jednym z obiecujących podejść do wytwarzania naturalnych hydrożeli jest decelularyzacja tkanek. Proces decelularyzacji wykorzystuje metody jonowe, niejonowe, fizyczne i kombinatoryczne, aby usunąć wszystkie lub większość materiałów komórkowych i jądrowych, zachowując jednocześnie komponenty ECM. Usuwając wszystkie lub większość składników komórkowych, hydrożele pochodzące z ECM są mniej immunoaktywne dla gospodarza po wszczepieniu/wstrzyknięciu4. Istnieje kilka parametrów, które należy zmierzyć, aby ocenić jakość zdecellularyzowanych tkanek: usunięcie zawartości komórkowej/jądrowej, właściwości mechaniczne oraz zachowanie ECM. Ustalono następujące kryteria, aby uniknąć niepożądanych odpowiedzi immunologicznych: 1) mniej niż 50 ng dwuniciowego DNA (dsDNA) na mg suchej masy ECM, 2) długość fragmentu DNA poniżej 200 bp oraz 3) prawie lub wcale widoczny materiał jądrowy zabarwiony 4'6-diamidino-2-fenuylindolem (DAPI)5. Właściwości mechaniczne można ilościowo ocenić za pomocą testów rozciągania, kompresji i/lub reologii, a powinny być podobne do oryginalnej tkanki6. Ponadto zachowanie białek można oceniać za pomocą proteomiki lub testów ilościowych koncentrujących się na głównych składnikach zdecellularyzowanych tkanek, takich jak laminina, glikozaminoglikan (GAG) i proteoglikan siarczanu chondroityny (CSPG) dla rdzenia kręgowego 7,8. Zweryfikowane hydrożele pochodzące z ECM mogą być recelularyzowane różnymi typami komórek, aby wspomóc terapię komórkową9.
Badano różne typy komórek, takie jak komórki Schwanna, komórki otulające węch, komórki macierzyste pochodzące ze szpiku kostnego (MSC) oraz komórki macierzyste/progenitorowe nerwowe, pod kątem naprawy rdzenia rdzeniowego 10,11,12. Jednak kliniczne wykorzystanie tych komórek jest ograniczone ze względu na kwestie etyczne, rzadką integrację z sąsiednimi komórkami/tkankami, brak źródeł tkanek dla wysokiej wydajności, brak możliwości samoodbudowy i/lub ograniczoną zdolność proliferacji 13,14,15. W przeciwieństwie do tych typów, ludzkie tłuszczowe MSC (hASC) są atrakcyjnym kandydatem, ponieważ łatwo izolują je w sposób minimalnie inwazyjny za pomocą lipoaspiratów, a można uzyskać dużą liczbę komórek16. Ponadto hASC mają zdolność wydzielania czynników wzrostu i cytokin o potencjale neuroochronnym, angiogenetycznym, gojeniu ran, regeneracji tkanek oraz immunosupresji 17,18,19,20,21.
Jak opisano, przeprowadzono wiele badań22, 23, 24 i wiele z nich wyciągnęło wnioski, ale niejednorodne cechy rdzenia rdzeniowego ograniczyły ich skuteczność w wspieraniu funkcjonalnego powrotu do zdrowia. W związku z tym zaproponowano podejścia kombinatoryczne w celu zwiększenia skuteczności leczenia SCI. W tym badaniu opracowano kompozytowe hydrożele poprzez połączenie zdecellularizowanych rdzeni kręgowych i nerwów kulszowych w trójwymiarowej (3D) hodowli hASC. Skuteczną decelularyzację potwierdzono analizami histologicznymi i DNA, a różne proporcje kompozytowych hydrożeli nerwowych charakteryzowano kinetyką żelowania i testami kompresyjnymi. Badana jest żywotność hASC w kompozytowych hydrożelach nerwowych, aby udowodnić, że ten hydrożel może być wykorzystywany jako platforma do hodowli komórek 3D.

<table><tbody><tr><td>Solena wewnętrzna 3-(Decyldimetylamonio)propanowego sulfonianu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4266</td><td>Stosowane podczas decelularyzacji nerwu kulszowego, SB-10</td></tr><tr><td>3-(N,N-Dimetylpalmitylammonio)sulfonian propanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6883</td><td>Stosowany podczas decellularyzacji nerwu kulszowego, SB-16</td></tr><tr><td>Odczynnik AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAL1100</td><td>Stosowane podczas testu wiejlności komórek AlamaBlue</td></tr><tr><td>Chondroitinaza ABC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3667</td><td>Stosowane podczas decellularyzacji nerwu kulszowego</td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonuklaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td>Stosowane podczas decellularyzacji nerwu kulszowego</td></tr><tr><td>Heptahydrat fosforanu sodowego</td><td>VWR</td><td>BDH9296</td><td>Chemiczny dla 100 mM Na/50 mM fosforu i 50 mM Na/10 mM buforu fosforowego</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestaw do produkcji chusteczek</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Wykorzystywane podczas analizy DNA</td></tr><tr><td>Montaż Dpx do histologii, medium montażowe na zamku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6522</td><td>Używany podczas H& Barwienie E</td></tr><tr><td>Eozyną</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110216</td><td>Używany podczas H& Barwienie E</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Używany podczas H& Barwienie E</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (GA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>Stosowane podczas funkcjonalizacji powierzchni PDMS</td></tr><tr><td>Medium wzrostu hASC</td><td>Lonza</td><td>PT-4505</td><td>Stosowany do hodowli hASC, zawierających surowicę płodową bydła oraz penicylinę/streptomycynę</td></tr><tr><td>Hematoksyliną</td><td>VWR</td><td>26041-06</td><td>Używany podczas H& Barwienie E</td></tr><tr><td>Komórka macierzysta pochodząca z ludzkiego tłuszczu</td><td>Lonza</td><td>PT-5006</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Używany do trawienia zdecelularyzowanych tkanek i korygowania roztworów preżeli</td></tr><tr><td>Medium M199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td>Używany do rozcieńczania preżeli do pożądanego stężenia</td></tr><tr><td>Optymalna mieszanka temperatualna</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7000</td><td>Wykorzystywane do trawienia zdecelularyzowanych tkanek</td></tr><tr><td>Kwas nadoctowy</td><td>Lab Alley</td><td>PAA1001</td><td>Stosowane podczas decelularyzacji rdzenia kręgowego</td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)</td><td>VWR</td><td>97062-948</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik tablic</td><td>BioTek Instruments</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleimina (PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978</td><td>Stosowane podczas funkcjonalizacji powierzchni PDMS</td></tr><tr><td>Nerw kulszowy wieprzowy</td><td>Tissue Source LLC</td><td></td><td>Żywe świnie, bez danych identyfikowalnych i bez szczegółów dotyczących śledzenia</td></tr><tr><td>Rdzeń kręgowy u wieprzowinki</td><td>Tissue Source LLC</td><td></td><td>Żywe świnie, bez danych identyfikowalnych i bez szczegółów dotyczących śledzenia</td></tr><tr><td>System dsDNA QuantiFluor</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Wykorzystywane do analizy zawartości DNA</td></tr><tr><td>Rheometr</td><td>TA Instruments</td><td>DHR 2</td><td></td></tr><tr><td>Wytrzymały rotator</td><td>Glas-co</td><td>099A RD4512</td><td>Stosowane podczas decelularyzacji rdzenia kręgowego</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>VWR</td><td>BDH9286</td><td>Chemiczny dla 100 mM Na/50 mM fosforu i 50 mM Na/10 mM buforu fosforowego</td></tr><tr><td>Deoksycholatan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat diwodrowego sodu</td><td>VWR</td><td>BDH9298</td><td>Chemiczny dla 100 mM Na/50 mM fosforu i 50 mM Na/10 mM buforu fosforowego</td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415443</td><td>Stosowany do regulacji roztworów preżeli</td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Materiały zaawansowane do kajaku</td><td>SU8-100</td><td>Używane do pokrywania płytki krzemowej</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>Stosowane podczas decelularyzacji rdzenia kręgowego</td></tr><tr><td>Zestaw Sylgard 184 silikonowego elastomeru</td><td>DOW</td><td>1317318</td><td>Polidimetyloksyloksanu (PDMS) baza i środek utwardzający</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Stosowane podczas decelularyzacji rdzenia kręgowego</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td>Stosowane podczas pracy z hASC oraz podczas decelularyzacji rdzenia kręgowego</td></tr><tr><td>Rotator rewolweru rurowego</td><td>Thermo Fisher</td><td>88881001</td><td>Stosowane podczas decellularyzacji nerwu kulszowego</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>VWR</td><td>MK866816</td><td>Używany podczas H& Barwienie E</td></tr></tbody></table>

rozwój kombinatorycznych terapii w leczeniu urazów rdzenia kręgowego z wykorzystaniem dostarczania komórek macierzystych

Development of Combinatorial Therapeutics for Spinal Cord Injury using Stem Cell Delivery

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) powoduje trwały deficyt sensorycyjny poniżej miejsca urazu. Dotyka około ćwierć miliona osób w USA i stanowi niewyobrażalny problem zdrowia publicznego. Przeprowadzono badania mające na celu skuteczne leczenie; jednak SCI nadal jest uważane za nieuleczalne ze względu na złożony charakter miejsca urazu. Badane są różne strategie, w tym dostarczanie leków, przeszczepianie komórek oraz biomateriały do zastrzyków, ale sama jedna z nich ogranicza ich skuteczność w regeneracji. W związku z tym terapie kombinatoryczne zyskały ostatnio na uwadze, aby ukierunkować wielowymiarowe cechy urazu. Wykazano, że macierze zewnątrzkomórkowe (ECM) mogą zwiększać skuteczność przeszczepów komórek w leczeniu rdzenia rdzeniowego. W tym celu opracowano i scharakteryzowano hydrożele 3D składające się z zdecelularyzowanych rdzeni kręgowych (dSC) i nerwów rwy kulszowej (dSN) w różnych proporcjach. Analiza histologiczna dSC i dSN potwierdziła usunięcie składników komórkowych i jądrowych, a po decelularyzacji zachowano natywne architektury tkanek. Następnie powstały kompozytowe hydrożele o różnych proporcjach objętościowych i poddane analizom kinetyki mętności żelacyjnej, właściwości mechanicznych oraz osadzonej w ludzkiej tkance macierzystej (hASC). Nie stwierdzono istotnych różnic w właściwościach mechanicznych między różnymi proporcjami hydrożeli i macierzy rdzenia kręgowego zdecellularizowanego. Ludzkie ASC osadzone w żelach pozostawały żywotne przez cały 14-dniowy cykl kultury. Badanie to umożliwia generowanie tkankowo inżynieryjnych kombinatorycznych hydrożeli, które prezentują specyficzne dla nerwów ECM oraz proregeneracyjne komórki macierzyste mezenchymalne. Ta platforma może dostarczyć nowych informacji na temat strategii neuroregeneracyjnych po SCI w przyszłych badaniach.

Tkanki decelularizowane zostały przygotowane według wcześniej ustalonych protokołów z niewielkimi modyfikacjami26,27. Po decelularyzacji, liofilizacji i trawieniu powstały hydrożele kompozytowe nerwowe o stosunkach SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 oraz hydrożele wyłącznie rdzenia kręgowego (Rysunek 1). Usunięcie komponentów jądrowych potwierdzono za pomocą barwienia H&E (Rysunek 2A). Aby ilościowo ocenić decelularyzację, zmierzono resztkowe DNA w obrębie ECM. Zawartość dsDNA w świeżej tkance twardej wynosiła 132,6 ± 21,3 ng dsDNA/mg suchej tkanki, podczas gdy świeży i zdecelularizowany parenchyma rdzenia kręgowego zawierały odpowiednio 22,6 ± 8,3 ng dsDNA/mg w tkance suchej oraz 23,74 ± 6,69 ng dsDNA/mg tkanki suchej (Rysunek 2B). Wskazywał, że opona twarda ma zostać usunięta przed decelularyzacją. Ilość dsDNA w świeżym i zdecellularizowanym nerwie kulszowym wynosiła odpowiednio 222,5 ± 42,65 i 0,63 ng dsDNA/mg tkanki suchej (rysunek 2C).
Oceniono kinetykę żelowania hydrożeli kompozytowych nerwów, aby określić szybkość żelowania (S) oraz czasy osiągnięcia 50% i 95% końcowej mętności (t1/2 it 95). Kinetyka żelowania wykazała kształt egioidalny dla wszystkich grup hydrożelowych (Rysunek 3A). Szybkość żelowania (S) we wszystkich grupach hydrożelowych nie różniła się istotnie od pozostałych. Czas potrzebny do osiągnięcia połowy końcowej mętności, t1/2, wyniósł odpowiednio 11,32 ± 0,57 min, 13,33 ± 0,6 min, 15,7 ± 0,92 min, ±a dla SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 i hydrożeli wyłącznie rdzenia kręgowego. Czas potrzebny do osiągnięcia 95% końcowej mętności, t95, wyniósł odpowiednio 13,8 ± 0,83 min, 15,53 ± 0,83 min, 18,38 ± 0,79 min oraz 19,62 ± 1,27 dla SN:SC= odpowiednio 2:1, 1:1, 1:2 i tylko hydrożele rdzenia kręgowego. Wyniki te wskazują, że hydrożele o większej zawartości nerwu kulszowego szybciej osiągają stan ustalony, a ECM nerwu kulszowego może sprzyjać układaniu hydrożelu. Wynik testu kompresji wykazał tendencję, że hydrożele o większej zawartości rdzenia kręgowego zapewniają zwiększoną sztywność; niemniej jednak, nie różnił się istotnie we wszystkich różnych proporcjach hydrożeli kompozytowych (Rysunek 3B).
Na koniec, aby określić żywotność komórek hASC we wszystkich grupach hydrożelowych, przygotowano hodowle 3D przy użyciu mikrofabrykowanych mikrowwierzli PDMS, jak pokazano na Rysunku 4. Przez cały 14-dniowy hodowlę mierzono żywotność ASC za pomocą komercyjnie dostępnego kolorymetrycznego i fluorescencyjnego testu metabolicznego opartego na mediach komórkowych, gdzie procentowe różnice od odczytów były obliczane w czterech różnych punktach czasowych: dzień 1, dzień 4, dzień 7 i dzień 14 (Rysunek 5). Wartość różnicy procentowej wzrosła wraz ze wzrostem punktów czasu, a wartość hydrożelu opartego wyłącznie na rdzeniu kręgowym była niższa niż w pozostałych grupach w dniach 1, 4 i 14. Łącznie dane te sugerują, że żywotność hASC wzrosła w okresie hodowli z powodu proliferacji komórek i wzrostu aktywności metabolycznej.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66872/66872fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Wytwarzanie kompozytowych hydrożeli nerwowych. Rdzenie kręgowe wieprzów i nerwy kulszowe zostały zdecelularizowane, liofilizowane i strawione w celu uzyskania roztworów preżelowych. Roztwory preżelu z nerwu kulszowego i rdzenia kręgowego zostały zmieszane w proporcjach 2:1, 1:1 i 1:2, a przygotowano także pregel wyłącznie dla rdzenia kręgowego. Wszystkie roztwory preżelowe były inkubowane w temperaturze 37 °C, aby wytworzyć kompozytowe hydrożele nerwowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66872/66872fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66872/66872fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Weryfikacja decelularyzacji. (A) Barwienie H&E świeżych i zdecelularyzowanych świń rdzenia kręgowego oraz nerwów kulszowych. Strzałki wskazują obecność komórek w tkankach. Paski skalowe = 1 mm dla obrazów szerokokątnych i 500 μm dla obrazów powiększanych (200 μm tylko dla obrazów zdecellularizowanych nerwów kulszowych z powiększeniem). (B) analiza DNA świeżej opony twardej, mięździa oraz zdecelularyzowanych rdzeni kręgowych (odpowiednio n=10, 16 i 6). (C) analiza DNA świeżych i zdekomórkowych nerwów kulszowych (odpowiednio n=8 i 3). Paski błędu reprezentują odchylenia standardowe. Analiza statystyczna przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testem post-hoc Tukey'a dla (B) i testem t dla (C). Skróty: ns = nieznaczące. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66872/66872fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66872/66872fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Charakterystyka kompozytowych hydrożeli nerwowych. (A) Znormalizowana absorpcja hydrożeli kompozytowych nerwowych (n = 5). (B) moduł Younga odcelularyzowanych hydrożeli rdzenia kręgowego i nerwowego (n = 4 odpowiednio dla zdecelularyzowanego rdzenia kręgowego i 3 dla każdej złożonej grupy hydrożelowej). Paski błędu reprezentują odchylenia standardowe. Analiza statystyczna została przeprowadzona za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testem post-hoc Tukeya. Skróty: ns = nieznaczące. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66872/66872fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66872/66872fig04v2.jpg" /> 
Rysunek 4: Schematyczny obraz hodowli 3D. (A) Mikrootwory PDMS zostały wykonane na płytkach krzemowych pokrytych powłoką SU-8. Każdy mikrodołek był wycinany za pomocą dziurkacza biopsyjnego o średnicy 8 mm. (B) Decellularizowany rdzeń kręgowy i nerw kulszowy w różnych proporcjach, dostosowanie pH do 7,4, ponowna zawieszka za pomocą hASC, umieszczenie preżelu na mikrodołku i inkubacja przez 30 minut w 37°C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66872/66872fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66872/66872fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Analiza żywotności komórek. Procentowa różnica hASC hodowanych w kompozytowych hydrożelach nerwowych w dniach 1, 4, 7 i 14 (n = 3). Paski błędu reprezentują odchylenia standardowe. Analiza statystyczna została przeprowadzona za pomocą jednokierunkowej ANOVA z testem post-hoc Tukeya. * s<0,05; ** s<0.01; s<0.005; s<0.001; NS: Nieistotne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66872/66872fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.</a>

W tym badaniu opracowano i scharakteryzowano kompozytowe hydrożele mimetyczne nerwowe, które mogą być wykorzystywane do badania i wykorzystania proregeneracyjnego zachowania komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu do naprawy urazu rdzenia kręgowego.

Rozwój kombinatorycznych terapii w leczeniu urazów rdzenia kręgowego z wykorzystaniem dostarczania komórek macierzystych

Traumatic spinal cord injury (SCI) induces permanent sensorimotor deficit below the site of injury. It affects approximately a quarter million people in ...

W tym badaniu opracowano platformę do dostarczania komórek kombinatorycznych w leczeniu urazów rdzenia kręgowego, wykorzystując zdecelularyzowane hydrożele pochodzenia tkankowego. Skuteczność decelularyzacji i żywotność komórek w kompozytowych hydrożelach analizowana, aby określić ich potencjał jako platformy hodowli 3D. Wyniki pozwolą na dalsze badania potencjału terapeutycznego w leczeniu urazów rdzenia kręgowego.Ostatnio, w dziedzinie naprawy urazów rdzenia kręgowego, decellularyzacja została szeroko wykorzystana w kontekście hydrożeli. Proces ten usuwa wszystkie zanieczyszczenia komórkowe i jądrowe z tkanek lub organów, aby zapobiec negatywnej odpowiedzi immunologicznej, jednocześnie zachowując elementy macierzy zewnątrzkomórkowej. Teraz, gdy hydrożele kompozytowe nerwowe są zoptymalizowane, charakteryzacja platformy będzie kontynuowana, aby zmaksymalizować neuroregeneracyjne zachowanie ASC w naprawie rdzenia kręgowego.Prace te przyczynią się do rozwoju terapii kombinatorycznej w zakresie naprawy urazów rdzenia kręgowego, zwłaszcza w zakresie rozwoju terapii komórkami macierzystymi dla potencjalnego klinicznego tłumaczenia. Na początek rozmroz zamrożony rdzeń kręgowy w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin przed decelularyzacją. Używając sterylnych nożyczek, ostrożnie usuń twardą mater.Przetnij rdzeń kręgowy na małe kawałki, o długości około jednego centymetra. Włóż trzy części do rurki 50-mililitrowej. Płukaj rdzeń kręgowy wodą dejonizowaną w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin przy 60 obr./min.Następnie płucz rdzeń kręgowy 0,025% trypsyny EDTA, a następnie PBS przez 15 minut dwa razy. Następnie płucz rdzeń kręgowy następującymi roztworami decelularyzacji. Na koniec płucz rdzeń kręgowy wodą dejonizowaną przez godzinę dwa razy, a następnie PBS przez godzinę.Następnie liofilizuj rdzeń kręgowy w temperaturze 0,01 milibara i 56 stopni Celsjusza przez trzy dni, zanim przechowujesz go do użycia. Rozmrozić wcześniej zamrożony świński nerw kulszowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce przez 18 do 24 godzin przed decelularyzacją. Teraz przetnij nerw kulszowy na małe kawałki, około jednego centymetra długości.Włóż trzy części do rurki 50-mililitrowej. Płukaj nerw kulszowy wodą dejonizowaną przez siedem godzin. Następnie przepłucz nerw kulszowy następującymi roztworami do decellularyzacji.Następnie liofilizuj go w temperaturze 0,01 milibara i 56 stopni Celsjusza przez trzy dni przed przechowywaniem do użycia. Zacznij od użycia nożyczek autoklawowych, aby rozciąć wcześniej zdecellaryzowany rdzeń kręgowy i nerw kulszowy na proszek. Tkanki trawić osobno w roztworze 0,01 zwykłego kwasu solnego zawierającego jeden miligram na mililitr pepsyny w stężeniu 15 miligramów na mililitr.Włóż do roztworu pręt magnetyczny i mieszaj w temperaturze 500 obr./min przez co najmniej cztery dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać roztwory preżelowe. Zmieszaj preżel nerwu kulszowego i rdzenia kręgowego. Następnie rozcieńcz hydrożel do pożądanego stężenia za pomocą medium M199 i PBS.Użyj jednego zwykłego wodorotlenku sodu i kwasu solnego, aby dostosować pH do 7,4. Po dostosowaniu pH należy ponownie zawiesić ludzkie komórki macierzyste pochodzące z tłuszczu w preżelu o gęstości 1 miliona komórek na mililitr. Rozcieńcz preżel do 12 miligramów na mililitr za pomocą PBS.Włóż go do dołków, a potem załóż pokrywkę PDMS na pregel. Inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj PBS do studni.Zdejmij pokrywę PDMS i roztwór. Dodaj podłoże wzrostu ASC do hydrożeli bogatych w ASC i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza do uprawy.

development-combinatorial-therapeutics-for-spinal-cord-injury-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Uraz rdzenia kręgowego zaburza komunikację z mózgiem. Aby przywrócić utraconą łączność, wykorzystujemy przeszczep nerwu obwodowego, który stanowi podłoże dla regenerujących się włókien, w połączeniu z czynnikami neurotroficznymi i enzymami modyfikującymi macierz, które usuwają cząsteczki hamujące w celu promowania wzrostu na duże odległości.

Połączenie przeszczepu nerwu obwodowego i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura

Transplantacja prekursorów neuronalnych jest obiecującą strategią ochrony i/lub zastępowania utraconych lub dysfunkcyjnych szyjnych neuronów ruchowych nerwu przeponowego w przypadku urazów rdzenia kręgowego (SCI) oraz w przebiegu stwardnienia bocznego zanikowego (ALS), będącego chorobą neuronów ruchowych. Przedstawiamy protokół dostarczania komórek do przedniego rogu szyjnego rdzenia kręgowego w gryzoniach w modelach ALS i SCI.

Wewnątrzrdzeniowa transplantacja komórek w celu ukierunkowania na przednie rogi rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym w stwardnieniu bocznym zanikowym i urazowym uszkodzeniu rdzenia kręgowego

Źródło: Zweckberger, K., et al. Synergiczne zastosowanie neuronalnych komórek prekursorowych i samoorganizujących się peptydów w eksperymentalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym.  J. Vis. Exp. (2015).Protokół ten demonstruje ukierunkowane podejście do iniekcji w celu naprawy urazu rdzenia kręgowego w modelu szczurzym. Polega na dostarczeniu samoorganizujących się peptydów (SAP) do rdzenia zmiany chorobowej w celu stworzenia rusztowania nośnego, a następnie wstrzyknięciu komórek...

Wstrzykiwanie samoorganizujących się peptydów i nerwowych komórek prekursorowych w celu naprawy rdzenia kręgowego w modelu szczurzym

Matryce fibrynowe zawierające czynniki wzrostu zostały użyte do zatrzymania przeszczepionych nerwowych komórek macierzystych w miejscach całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego. Przeszczepione komórki całkowicie wypełniły jamę chorobową i zróżnicowały się w wiele typów komórek nerwowych, w tym neurony, które rozciągały aksony do rdzenia kręgowego gospodarza na duże odległości.

Promowanie przeżycia i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z koktajlami fibryny i czynnika wzrostu po ciężkim urazie rdzenia kręgowego

Leczenie uszkodzeń rdzenia kręgowego odcinka szyjnego zarówno za pomocą peptydów samoorganizujących się (SAP), jak i nerwowych komórek prekursorowych (NPC), wraz z czynnikami wzrostu, jest obiecującym podejściem do promowania regeneracji i regeneracji. Ustalono szczurzy model klisa do stłuczenia/ucisku tętniaka szyjki macicy i leczenia skojarzonego obejmującego wstrzyknięcie SAP i przeszczep NPC.

Synergiczne zastosowanie neuronalnych komórek prekursorowych i samoorganizujących się peptydów w eksperymentalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym

Uraz rdzenia kręgowego to traumatyczny stan, który powoduje ciężką zachorowalność i wysoką śmiertelność. W niniejszej pracy szczegółowo opisano model kontuzji rdzenia kręgowego u myszy, po którym następuje przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych.

Przeszczepienie nerwowych komórek macierzystych w eksperymentalnym modelu kontuzyjnym uszkodzenia rdzenia kręgowego

To badanie opisuje eksperymentalną platformę do szybkiego charakteryzowania zmodyfikowanych komórek macierzystych i ich zachowań przed ich zastosowaniem w długoterminowych badaniach nad przeszczepami in vivo w celu ratowania i naprawy układu nerwowego.

Wysokoprzepustowa charakterystyka dorosłych komórek macierzystych zmodyfikowanych pod kątem dostarczania czynników terapeutycznych w strategiach neuroprotekcyjnych

Poważne urazy rdzenia kręgowego często skutkują wadami tkanek. Opisano dwie możliwości skutecznego wypełnienia takich luk w celu promowania adaptacji tkanek, reakcji regeneracyjnych i poprawy funkcjonalnej u szczurów poprzez wszczepienie mechanicznego systemu mikrołączników po ostrym urazie i pięć tygodni po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego.

Eksperymentalne strategie wypełniania dużych luk tkankowych w uszkodzonym rdzeniu kręgowym po ostrym i przewlekłym uszkodzeniu

Ten artykuł opisuje technikę wprowadzania pustego przewodu między kikuty rdzenia kręgowego po całkowitym przecięciu i wypełnieniu komórkami Schwanna (SC) oraz wstrzykiwalną macierzą błony podstawnej w celu wypełnienia i wspomagania regeneracji aksonów w poprzek szczeliny.

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

Ten protokół opisuje wytwarzanie systemu hodowli komórek, który umożliwia wysiewanie komórek macierzystych na przewodzącym rusztowaniu polimerowym do stymulacji elektrycznej in vitro, a następnie implantację in vivo rusztowania z komórek macierzystych przy użyciu techniki minimalnie inwazyjnej.

Rusztowanie przewodzące prąd elektryczny do modulacji i dostarczania komórek macierzystych

W tym artykule przedstawiamy powtarzalną metodę generowania i utrzymywania długoterminowych wycinków organotypowych rdzenia kręgowego przeszczepionych z nerwowymi komórkami macierzystymi jako model ex vivo do testowania komórkowych terapii zastępczych.

Długoterminowa organotypowa hodowla warstw rdzenia kręgowego myszy jako platforma do walidacji przeszczepu komórek w urazie rdzenia kręgowego

Poznaj metodę dostarczania komórek macierzystych w leczeniu urazów rdzenia kręgowego z wykorzystaniem hydrogeli z tkanki zdekellularizowanej. Ta technika wspiera badania nad regeneracją nerwów.

Rozwój kombinatorycznych terapii w leczeniu urazów rdzenia kręgowego z wykorzystaniem dostarczania komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów