Opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro
21 czerwca 2024
Ten protokół opisuje metodologie tworzenia prostego i efektywnego modelu implantacji zarodków in vitro do oceny istotnych cząsteczek wpływających na proces implantacji zarodka.
Implantacja zarodka. Pierwszy etap udanej ciąży ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia jej biologicznych podstaw i sprostania wyzwaniom związanym z niepłodnością. Celem tego badania jest stworzenie spójnej platformy do analizy interakcji zarodek-endometrium w kontrolowanych warunkach.
Opierając się na tym modelu in vitro, stwierdziliśmy, że bardzo wysokie stężenia estrogenu znacznie zmniejszają wskaźniki implantacji zarodków, podczas gdy suplementacja progesteronem może złagodzić te negatywne skutki w zależności od dawki. Badanie to oferuje nowe spostrzeżenia i strategie terapeutyczne mające na celu poprawę wskaźników ciąż w przypadku transferu świeżych zarodków podczas kontrolowanej stymulacji jajników do zapłodnienia in vitro. W porównaniu z trójwymiarowym systemem hodowli, ten model in vitro oferuje prostą, szybką i opłacalną platformę, którą można stworzyć w większości laboratoriów i wykazuje wysoką odtwarzalność i niezawodność, co czyni go korzystnym narzędziem do badań i rozwoju w dziedzinie biologii rozrodu.
Na początek należy uzyskać od sześciu do ośmiu tygodni samicy myszy i wstrzyknąć PMSG, a następnie HCG w odstępie 42 do 48 godzin. Skojarzyć samicę myszy z samcem w porównywalnym wieku. Po eutanazji samicy myszy otwórz brzuch i zlokalizuj jej genitalia.
Za pomocą kleszczy rozciągnij jajowód, jajnik i poduszeczki tłuszczowe. Nożyczkami przetnij jajowód i jajnik, a następnie macicę. Otrzymany jajowód przenieść na 35-milimetrową szalkę Petriego wstępnie wypełnioną pożywką M2.
Nakłuj powiększoną bańkę jajowodu, aby uwolnić lub uszczypnąć kompleks zygoty wzgórkowej. Za pomocą kleszczy przenieś kompleks do roztworu M2 zawierającego 0,5 miligrama na mililitr hialuronidazy i inkubuj przez kilka minut. Za pomocą pipety do przenoszenia jaj zbierz zygoty i umyj je w pożywce M2 zawierającej BSA, aby usunąć resztki hialuronidazy, komórki wzgórka i zanieczyszczenia.
Na początek pobierz zarodki ze świeżo pokrytej samicy myszy. Przygotuj 12 mikrokropelek pożywki zoptymalizowanej pod kątem potasa simplex na dnie 35-milimetrowej szalki Petriego. Przykryj mikrokropelki trzema do pięciu mililitrami oleju mineralnego i umieść szalki Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla dla równowagi.
Za pomocą pipety transferowej przenieś mysie zarodki z pożywki M2 na pożywkę KSOM. Umyte zarodki umieszczamy w przygotowanych mikrokropelkach KSOM i inkubujemy w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez cztery dni. Wybierz korzystne blastocysty w zależności od ich wielkości, wewnętrznej masy komórkowej, liczby komórek trofoblastu i stopnia ekspansji.
Dodaj jeden mililitr 2% żelatyny do 12-dołkowej płytki hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odessaj nadmiar żelatyny i pozwól dnie płytki całkowicie wyschnąć. Wysiewaj ludzkie komórki gruczolakoraka endometrium lub komórki Ishikawy na 12-dołkową płytkę pokrytą żelatyną i inkubuj płytkę przez 24 godziny.
Delikatnie umieść od 5 do 15 świeżych blastocyst w każdym dołku 12-dołkowej płytki zawierającej komórki. Po 48 godzinach obserwuj zarodki pod mikroskopem, aby ocenić ich stan przyczepu po trzykrotnym przesunięciu płytki. Nieprzyczepione zarodki będą unosić się lub toczyć po powierzchni komórek.
Na koniec oblicz wskaźnik implantacji zarodka w obecności różnych stężeń estrogenów. Wyniki wykazały, że niemal fizjologiczne stężenia 17 beta-estradiolu zwiększyły wskaźniki implantacji zarodków w porównaniu z grupą kontrolną bez 17 beta-estradiolu. Jednak bardzo wysokie stężenia 17 beta-estradiolu w okolicach 100 nanomolowców znacznie zmniejszyły wskaźniki implantacji zarodków.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na opracowaniu modelu in vitro do analizy implantacji zarodka, która jest kluczowym procesem dla powodzenia ciąży. Wyniki wskazują, że wysokie stężenia estrogenu negatywnie wpływają na wskaźniki implantacji zarodków, podczas gdy progesteron może łagodzić te efekty, dostarczając nowych informacji w celu poprawy wyników IVF.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia rozrodu
- Interakcje embrion-endometrium
- Leczenie niepłodności
Wprowadzenie
- Implantacja zarodka jest niezbędna dla powodzenia ciąży.
- Celem badania jest rozwiązanie problemów związanych z niepłodnością.
- Kontrolowane warunki są niezbędne do badania mechanizmów implantacji.
Zastosowane metody
- Model implantacji zarodka in vitro
- Zarodki mysie i linie komórkowe endometrium
- Techniki hodowli i zabiegi hormonalne
Główne wyniki
- Bardzo wysokie stężenia estrogenów obniżają wskaźniki implantacji.
- Progesteron wpływa korzystnie na implantację w sposób zależny od dawki.
- Model ten stanowi niezawodną platformę do przyszłych badań nad rozrodczością.
Wnioski
- Niniejsze badanie podkreśla wpływ hormonów na implantację zarodka.
- Wyniki sugerują strategie terapeutyczne mające na celu zwiększenie wskaźników ciąż w IVF.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Opracowanie solidnego modelu implantacji zarodka in vitro eliminuje krytyczne wąskie gardło w biologii rozrodu oraz we wczesnych etapach poszukiwania nowych leków. Platforma ta umożliwia kontrolowaną analizę oddziaływań między zarodkiem a endometrium, co zwiększa wiarygodność wyników przesiewowych cząsteczek oraz pozwala na redukcję ryzyka mechanistycznego w przypadku celów terapeutycznych związanych z płodnością. Jej powtarzalność i skalowalność sprawiają, że stanowi ona cenny zasób w procesie selekcji projektów badawczych oraz w badaniach translacyjnych w obszarze zdrowia reprodukcyjnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną ocenę molekularnych regulatorów adhezji zarodka i receptywności błony śluzowej endometrium.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez kwantyfikację wpływu hormonów i cząsteczek kandydackich na wskaźniki implantacji.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolowanie efektów konkretnych szlaków w kontrolowanym środowisku.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany, powtarzalny system kokultury do wiarygodnego przesiewania cytokin, leków i czynników transkrypcyjnych.
- Dostarcza ilościowe dane o szybkości adhezji w celu oceny skuteczności związków i optymalizacji warunków testu.
- Umożliwia szybkie i skalowalne przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszych etapów analizy przesiewowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla badań nad niepłodnością i dysfunkcją błony śluzowej macicy.
- Wspiera identyfikację biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie interwencji molekularnych z funkcjonalnymi efektami implantacji.
- Ułatwia zachowanie ciągłości procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację terapeutyków w obszarze rozrodu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model in vitro stanowi pomost pomiędzy wczesną fazą odkryć a badaniami przedklinicznymi, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących interakcji między embrionem a endometrium oraz testowanie potencjalnych interwencji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących hormonalnych i molekularnych modulatorów implantacji.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków i optymalizacji testów.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie wskaźników adhezji w różnych warunkach eksperymentalnych i stężeniach cząsteczek.
- Badania translacyjne: Łączy ustalenia in vitro z modelami przedklinicznymi zdrowia rozrodczego i niepłodności.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje kosztowo efektywną, skalowalną platformę, którą można dostosować do potrzeb zespołów badawczych i programów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów oraz w badaniach mechanistycznych implantacji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, reprodukowalne i szybkie schematy analiz, odpowiednie do szerokiego zastosowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji typu go/no-go i redukuje ryzyko biologiczne w późnych etapach w portfolio zdrowia reprodukcyjnego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację cząsteczek kandydackich i strategii terapeutycznych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z zarodkami, hodowli komórkowych oraz analizie ilościowych testów analitycznych.
- Wymaga dostępu do standardowej infrastruktury do hodowli komórek oraz mikroskopii do oceny adhezji.
- Wymaga standaryzacji protokołów selekcji zarodków i kokultury pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Można go dostosować do różnych systemów modelowych, lecz może on wymagać optymalizacji ze względu na różnice gatunkowe lub różnice między liniami komórkowymi.
- Ograniczenia obejmują zależność od warunków in vitro, które mogą nie w pełni odzwierciedlać dynamikę implantacji in vivo.
