Name: Opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Poznaj model implantacji zarodka in vitro w biologii rozrodu z użyciem mysich zarodków i linii komórkowych endometrium. Metoda ta pozwala badać wpływ hormonów na powodzenie ciąży i poprawiać wyniki IVF.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nasze badania były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82171603), Fundację Miejskiej Komisji Zdrowia w Szanghaju (202140341), Komisję Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (23JC1403803) oraz Program Promocji Innowacji NHC i Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).

Badania eksperymentalne na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Zwierząt Instytutu Technologii Biomedycznych i Farmaceutycznych w Szanghaju. Zapewnij procedury bezpieczeństwa: Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas pracy z chemikaliami lub materiałami biologicznymi.
1. Pozyskiwanie embrionów myszy
UWAGA: Ta sekcja opisuje proces pozyskiwania embrionów myszy. Dorosłe samice myszy (6-8 tygodni, hybrydy C57BL/6 i DBA/2) utrzymywano w standardowych warunkach środowiskowych 12 godzin światła i 12 godzin ciemności w temperaturze 20-25 °C i wilgotności 40-60% z pożywieniem i wodą dostarczaną ad libitum.
<ol>
	<li>Samicom myszy wstrzyknąć dootrzewnowo 10 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG), a następnie wstrzyknąć 10 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) w odstępie 42-48 godzin.</li>
	<li>Połącz każdą samicę myszy z samcem w podobnym wieku i sprawdź, czy następnego ranka nie ma czopa dopochwowego. 
	UWAGA: Korek dopochwowy to jasnożółta grudka czopka powstała po zestaleniu się nasienia w otworze pochwy.</li>
	<li>Poddaj eutanazji samice myszy za pomocą czopów dopochwowych przez wdychanie CO2 .</li>
	<li>Otwórz brzuch i zlokalizuj żeńskie narządy płciowe; rozciągnij jajowód, jajnik i poduszeczki tłuszczowe za pomocą kleszczy; przetnij jajowód i jajnik nożyczkami; a następnie przetnij jajowód i macicę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Otrzymany jajowód przenieść na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wstępnie wypełnioną pożywką M2. 
	UWAGA: Pożywkę M2 należy podgrzewać w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez 30 minut.</li>
	<li>Nakłuć powiększoną bańkę jajowodu igłą 25 G, aby uwolnić lub uszczypnąć kompleks wzgórko-zygotowy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś kompleks wzgórka-zygota do roztworu M2 zawierającego 0,5 mg/ml hialuronidazy i inkubuj przez kilka minut, aż komórki wzgórka ulegną dysocjacji (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3).</li>
	<li>Zebrać zygoty za pomocą pipety do przenoszenia jaj i umyć je w pożywce M2 zawierającej 4 mg/ml BSA w celu usunięcia pozostałości hialuronidazy, komórek wzgórka i zanieczyszczeń.</li>
</ol>
2. Hodowla in vitro zarodka myszy
UWAGA: Ta sekcja szczegółowo opisuje proces hodowli in vitro embrionów myszy od zygot do blastocyst. Mikrokrople do hodowli KSOM należy przygotować z 24-godzinnym wyprzedzeniem, aby zapewnić równowagę temperaturową i gazową.
<ol>
	<li>Przygotować 12 mikrokropelek pożywki KSOM o objętości 20 μl każda na dnie szalki Petriego o średnicy 35 mm. Przykryj mikrokropelki 3-5 ml oleju mineralnego (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4) i umieść szalki Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu zrównoważenia.</li>
	<li>Przenieś zarodki myszy z pożywki M2 na pożywkę KSOM za pomocą pipety transferowej w celu dokładnego umycia. 
	UWAGA: Ten krok wymaga mikroskopu stereoskopowego z podgrzewaniem o temperaturze 37 °C stage. Zminimalizuj czas obchodzenia się z zarodkami poza inkubatorem.</li>
	<li>Umyte zarodki umieścić w przygotowanych mikrokropelkach KSOM i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 dni. 
	UWAGA: Aby zapewnić odpowiednie odżywianie, należy wyhodować 5-10 zarodków na 20 μL mikrokropli.</li>
	<li>Wybierz korzystne blastocysty w zależności od ich wielkości (100-130 μm), wewnętrznej masy komórkowej (wewnętrzna masa komórkowa składa się z wielu komórek, które są zbite), liczby komórek trofoblastu (trofektoderma składa się z wielu komórek, które są spoiste i upakowane razem) oraz stopnia ekspansji (blastocoel zajmuje 80-100% zarodka).</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek endometrium
<ol>
	<li>Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego odessać 1 ml 2% żelatyny za pomocą pipety i dozować do 12-dołkowej płytki hodowlanej. Delikatnie obróć płytkę, aby zapewnić całkowite pokrycie dna żelatyną. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut. Następnie odessać nadmiar żelatyny i pozostawić spód płytki do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Po zakończeniu procesu powlekania należy wyhodować ludzkie komórki gruczolakoraka endometrium (Ishikawa) za pomocą DMEM/F12 (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów), 1 mM pirogronianu sodu, 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml streptomycyny i 100 IU / ml penicyliny, wysiewać je na pokrytych żelatyną 12-dołkowych płytkach (2 × 105komórek/dołk) i inkubować przez 24 godziny.</li>
</ol>
4. Przyczepienie zarodka
<ol>
	<li>Delikatnie umieść 5-15 świeżych blastocyst w każdym dołku 12-dołkowej płytki zawierającej komórki Ishikawy przygotowane w poprzednim kroku do wspólnej hodowli (<silna klasa = "xfig">Ryc. 5).</li>
	<li>Po 48 godzinach inkubacji obserwuj zarodki pod mikroskopem, aby ocenić ich stan przyczepienia. Aby zaobserwować przyczepienie się zarodka, szybko przesuń płytkę trzy razy. Nieprzyłączone zarodki będą wykazywać ruch unoszący się lub toczący się po powierzchni komórek Ishikawy.</li>
	<li>Obliczyć wskaźnik zagnieżdżenia się zarodka za pomocą równania (1); użyć wskaźnika adhezji zarodka do przedstawienia efektu implantacji. 
	Wskaźnik implantacji zarodków = (Dołączone zarodki/Całkowita liczba zagnieżdżonych zarodków) × 100% (1)</li>
</ol>

Evaluating Embryo Adhesion in an In Vitro Co-Culture Model with Ishikawa Cells

<ol><li>Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+study+of+human+embryo+implantation%3A+choice+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines.</a> Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).</li>
<li>Li, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+method+to+quantify+embryo+attachment+to+endometrial+epithelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).</li>
<li>Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+trophoblast+to+uterine+epithelium+as+related+to+the+state+of+trophoblast+differentiation%3A+in+vitro+studies+using+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines.</a> Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).</li>
<li>Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+in+vitro+model+of+human+embryo+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">A high-throughput in vitro model of human embryo attachment.</a> Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).</li>
<li>Karvas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+trophoblast+organoids+model+human+placental+development+and+susceptibility+to+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens.</a> Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+implantation+in+the+laboratory%3A+an+update+on+current+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques.</a> Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).</li>
<li>Berneau, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+osteopontin+in+an+in+vitro+model+of+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation.</a> Cells. 8 (5), 432(2019).</li>
<li>Jiang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HOXA10+sumoylation+inhibits+embryo+implantation+in+women+with+recurrent+implantation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure.</a> Cell Death Discov. 3, 17057(2017).</li>
<li>Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteopontin-integrin+%CE%B1v%CE%B23+interaction+at+implantation%3A+functional+analysis+using+three+different+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models.</a> Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).</li>
<li>Duan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+exposure+to+supraphysiological+estradiol+during+ovarian+stimulation+increased+the+risk+of+adverse+perinatal+outcomes+after+frozen-thawed+embryo+transfer%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study.</a> J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%CE%B21+and+%CE%B23+are+biomarkers+of+uterine+condition+for+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer.</a> J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgelin+2+is+required+for+embryo+implantation+by+promoting+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization.</a> FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).</li>
<li>Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+1+increases+apical+fibronectin+in+blastocysts+to+increase+blastocyst+attachment+to+endometrial+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro.</a> Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).</li>
<li>Kang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-145+suppresses+embryo-epithelial+juxtacrine+communication+at+implantation+by+modulating+maternal+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R.</a> J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).</li>
<li>Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ulipristal+acetate+on+human+embryo+attachment+and+endometrial+cell+gene+expression+in+an+in+vitro+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system.</a> Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+human+endometrium+for+studying+trophoblast-endometrium+interaction+during+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).</li>
<li>Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+human+endometrium%3A+evolution+and+application+for+women%27s+health%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health.</a> Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).</li>
<li>Ahn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microengineered+vascularised+endometrium-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip.</a> Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).</li>
<li>Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mechanical+forces+change+the+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle+in+preparation+for+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation.</a> Cells. 10 (8), 2008(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów finansowych lub innych.

Prostota i szybkość proponowanego modelu implantacji zarodków in vitro oferuje niezwykłe korzyści w badaniach przesiewowych leków na wczesnym etapie i innych zastosowaniach badawczych. Prosty protokół, w połączeniu z wysokoprzepustowym charakterem linii komórkowych Ishikawy, sprawia, że jest to idealny kandydat do badań przesiewowych na dużą skalę, szczególnie na wczesnych etapach odkrywania leków. Liang13 odkrył, że knockdown TAGLN2 zmniejszył zdolność do inwazji komórek trofoblastu. Green14 wykazał, że insulinopodobny czynnik wzrostu poprawił kompetencję adhezyjną mysiej blastocysty w oparciu o układ mysi embrion-komórki Ishikawy. Model ten nie tylko pozwala na szybką ocenę kandydatów na leki, ale także ułatwia badanie innych cząsteczek, takich jak cytokiny i czynniki transkrypcyjne, które odgrywają rolę w implantacji zarodka15,16. Biorąc pod uwagę znaczące implikacje implantacji zarodka dla biologii rozrodu, model ten jest obiecujący dla pogłębienia naszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw choroby i opracowania nowych metod terapeutycznych.
Chociaż obecny model in vitro stanowi cenne narzędzie do badania implantacji zarodków, ważne jest, aby uznać jego ograniczenia. Będąc systemem hodowli 2D, brakuje mu złożoności środowiska 3D in vivo 17, co może znacząco wpływać na interakcje komórka-komórka i szlaki sygnałowe. W związku z tym, chociaż model może dostarczyć wstępnych informacji na temat wpływu różnych cząsteczek na adhezję zarodków, powinien być traktowany jako narzędzie przesiewowe, a nie zamiennik badań in vivo. Przyszłe kierunki mogą obejmować opracowanie bardziej fizjologicznie istotnych systemów hodowli 3D, które lepiej odwzorowują złożone mikrośrodowisko endometrium18, umożliwiając dokładniejsze przewidywanie reakcji leków i mechanizmów molekularnych. Ponadto korzystne byłoby zbadanie możliwości integracji tego modelu z innymi zaawansowanymi technologiami, takimi jak mikrofluidyka i systemy typu organ-on-a-chip19,20, aby jeszcze bardziej zwiększyć jego znaczenie fizjologiczne i możliwości predykcyjne.
Podczas procesu terapii wspomaganego rozrodu superowulacja ma na celu zwiększenie produkcji komórek jajowych w jajnikach, zwiększając w ten sposób szanse na ciążę. Jednak ta procedura może spowodować wyraźny wzrost poziomu estrogenów, przekraczający normalny próg fizjologiczny. Estrogen, hormon niezbędny w żeńskiej reprodukcji, jest odpowiedzialny za promowanie proliferacji endometrium i tworzenie środowiska sprzyjającego implantacji zarodka. Dodatkowo reguluje równowagę innych hormonów rozrodczych, w tym progesteronu. Wykorzystując model in vitro, nasze odkrycia pokazują, że podczas gdy wzrost stężenia estrogenu początkowo zwiększa wskaźniki implantacji zarodków, zbyt wysoki poziom poza zakresem fizjologicznym znacznie utrudnia ten proces. Warto zauważyć, że suplementacja progesteronu może skutecznie przeciwdziałać temu hamującemu efektowi. Obserwacje te sugerują, że nienormalnie wysoki poziom estrogenów podczas superowulacji może być czynnikiem przyczyniającym się do obserwowanych klinicznie niższych wskaźników implantacji związanych z transferami świeżych zarodków w porównaniu z transferami zarodków mrożonych. Co więcej, suplementacja progesteronu po przeszczepie jest obiecująca w zwiększaniu wskaźników powodzenia implantacji zarodków.
Opracowaliśmy proste, opłacalne i niezawodne podejście do wykrywania implantacji zarodków. Zarodki myszy, po osiągnięciu stadium blastocysty poprzez hodowlę in vitro , były hodowane wspólnie z komórkami Ishikawy. Ta eksperymentalna konfiguracja pozwala na zbadanie roli i funkcji różnych cząsteczek, takich jak cytokiny, leki i czynniki transkrypcyjne, we wczesnych stadiach implantacji zarodka. Chociaż uznane linie komórkowe, takie jak komórki Ishikawy, mogą nie zapewniać najbardziej fizjologicznie istotnych systemów modelowych w połączeniu z ludzkimi lub mysimi embrionami, ich zdolności adaptacyjne i możliwości wysokiej przepustowości sprawiają, że są idealne do wczesnych etapów badań przesiewowych leków na dużą skalę. Chociaż opracowane przez nas modele hodowli 2D in vitro wymagają dalszej optymalizacji, stanowią one podstawę dla idealnego modelowania endometrium.

Implantacja zarodka, pierwszy krok udanej ciąży, jest kluczowa dla zrozumienia jej biologicznych podstaw i sprostania wyzwaniom związanym z niepłodnością. Jednak ograniczenia etyczne stanowią poważne ograniczenia w pobieraniu klinicznych próbek zarodków ludzkich, utrudniając badania nad skomplikowanymi interakcjami między ludzkimi embrionami a endometrium we wczesnej ciąży1. Dogłębne zrozumienie tych złożonych mechanizmów jest niezbędne do postępu w podstawowych badaniach biologicznych, odkrywaniu leków i zdrowiu reprodukcyjnym.
Poprzednie modele in vitro wykorzystywały modele adhezyjne, w których jednowarstwowe ludzkie komórki nabłonka endometrium (RL95-2)2 były hodowane wspólnie z embrionalnymi substytutami, takimi jak BeWo, JAr, lub Jeg-33 komórki raka kosmówki. Niemniej jednak wybór wielkości sferoid, w zakresie 70-100 μm, był kluczowy, ponieważ większe lub mniejsze agregaty komórkowe mogły zagrozić dokładności eksperymentu. Warto zauważyć, że tylko 25% sferoid w każdym preparacie spełniało normę dla odpowiedniego rozmiaru4, a różnice były znaczące w porównaniu z warunkami fizjologicznymi blastocyst.
Ponadto, trójwymiarowe (3D) systemy hodowli endometrium i blastocysty oferują bardziej fizjologicznie odpowiednie środowisko5, ale wymagają wysokiej wiedzy technicznej, powolnego wzrostu komórek, wysokich kosztów zasobów i utrzymania, trudności w standaryzacji i niskiej odtwarzalności6.
W tym protokole prezentujemy opłacalny i szybki model implantacji zarodka in vitro, który może być opracowany i wykorzystany w większości laboratoriów. Ogólnym celem tej metody jest zapewnienie wiarygodnej i powtarzalnej platformy do badania interakcji między zarodkami a endometrium w kontrolowanym środowisku. Poprzez symulację kluczowych zdarzeń związanych z implantacją zarodka in vitro, model ten ma na celu wypełnienie luki między modelami zwierzęcymi a warunkami klinicznymi, umożliwiając bardziej precyzyjne i ukierunkowane badania.
W porównaniu do substytutów embrionalnych, użycie blastocyst myszy oferuje bardziej fizjologicznie istotną reprezentację procesu implantacji zarodka in vivo7. Ponadto linia komórkowa Ishikawy, wywodząca się z ludzkiego gruczolakoraka endometrium, posiada mieszane cechy nabłonka gruczołowego i nabłonka światła macicy1, umożliwiając ekspresję enzymów, białek strukturalnych i funkcjonalnych receptorów steroidowych podobnych do tych znajdujących się w normalnym endometrium, zapewniając w ten sposób fizjologicznie istotny substrat do implantacji zarodka. Prostota i szybkość systemu kohodowli umożliwiają wysokoprzepustowe badania przesiewowe i testy na obecność narkotyków8,9,10. Zapewniając solidną i powtarzalną platformę, metoda ta daje możliwość pogłębienia naszej wiedzy na temat implantacji zarodków i jej wpływu na zdrowie człowieka.

<table><tbody><tr><td>17-β-estradiol</td><td>SIGMA</td><td>3301</td><td>Najsilniejszy hormon estrogenny ssaków</td></tr><tr><td>BD Falcon</td><td>BD</td><td>353001</td><td>Bakteriologiczne szalki Petriego Styl 35 x 10 mm ze szczelną pokrywą, krystaliczny polistyren pierwotny, sterylny</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>ESCO</td><td>klasa <img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/66873/66873eq01.jpg" style="margines: auto; ">BSC</td><td>Operacje aseptyczne, przygotowywanie szalek hodowlanych, rozdzielanie odczynników itp</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo</td><td>8000DH</td><td>Hodowla zarodków</td></tr><tr><td>Płytka</td><td>hodowlana Corning</td><td>3506</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>1133032</td><td>DMEM/F12 (1x), płyn 1:1, zawiera L-glutaminę i 15 mM bufor HEPES</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10099141</td><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, pochodzenie australijskie</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>SIGMA</td><td>G9391</td><td>Typ B, proszek, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>HCG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2520</td><td>Odczynnik do sterylizacji, wstrzyknięcie dootrzewnowe, 50 IU / ml</td></tr><tr><td>Hialuronidazy </td><td>SIGMA</td><td>V900833</td><td>Klasa odczynnika, proszek </td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-D</td><td>(1x), Proszek, bez czerwieni fenolowej, 5 x 10 ml</td></tr><tr><td>L-glutaminy</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>L-glutamina-200 mM (100x), płyn</td></tr><tr><td>M2</td><td>Merck</td><td>MR-015-D</td><td>EmbryoMax M2 Medium (1x), Płyn, z czerwienią fenolową</td></tr><tr><td>Olej mineralny </td>Olej mineralny <td>SIGMA</td><td>M8410</td><td>nadaje się do stosowania jako warstwa wierzchnia do kontroli parowania i zanieczyszczenia krzyżowego w różnych zastosowaniach biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, płyn</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>10 000 jednostek penicyliny (zasada) i 10 000 jednostek streptomycyny (zasada), wykorzystując penicylinę G (sól sodowa) i siarczan streptomycyny w 0,85% soli</td></tr><tr><td>fizjologicznej PMSG</td><td>Nanjing Aibei</td><td>M2620</td><td>Odczynnik do sterylizacji, wstrzyknięcie dootrzewnowe, 50 IU / ml</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>SIGMA</td><td>5341</td><td>Hormon steroidowy wydzielany przez ciałko żółte w drugiej połowie cyklu miesiączkowego</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Pirogronian sodu jest powszechnie dodawany do pożywki do hodowli komórkowych jako źródło węgla oprócz glukozy</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>Pobieranie zarodków i obserwacja rozwoju zarodków</td></tr></tbody></table>

opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

Implantacja zarodka to pierwszy krok do udanej ciąży. Model implantacji zarodka in vitro ma kluczowe znaczenie dla podstawowych badań biologicznych, opracowywania leków i badań przesiewowych. W artykule przedstawiono prosty, szybki i wysoce wydajny model implantacji zarodków in vitro. W tym protokole najpierw wprowadzamy akwizycję blastocysty myszy i preparat ludzkich komórek gruczolakoraka endometrium (Ishikawa) do implantacji, a następnie metodę kohodowli zarodków myszy i komórek Ishikawy. Na koniec przeprowadziliśmy badanie mające na celu ocenę wpływu różnych stężeń 17-β-estradiolu (E2) i progesteronu (P4) na wskaźniki adhezji zarodków w oparciu o ten model. Nasze odkrycia wykazały, że wysokie stężeniaE2 znacznie zmniejszyły adhezję zarodków, podczas gdy dodanie progesteronu może przywrócić wskaźnik adhezji. Model ten oferuje prostą i szybką platformę do oceny i badań przesiewowych cząsteczek biorących udział w procesie adhezji, takich jak cytokiny, leki i czynniki transkrypcyjne kontrolujące implantację i receptywność endometrium.

W procesie technik wspomaganego rozrodu kluczowym etapem jest kontrolowana hiperstymulacja owulacji (COH), która prowadzi do znaczącego podniesienia poziomu estrogenów u pacjentek, przekraczającego 10-20 krotnie wartości występujące w cyklach naturalnych11. W tym kontekście postanowiliśmy sprawdzić, czy wysokie stężenia estrogenów w surowicy wpływają na implantację zarodków podczas świeżego transferu zarodków. W oparciu o ten model implantacji zarodków zbadaliśmy wpływ różnych stężeń E2 i P4 na wskaźniki implantacji zarodków12. Po zastosowaniu głodzenia komórki Ishikawa inkubowano z E2 (0, 0,1, 1, 10 i 100 nM) lub kombinacją E2 i P4 (0-0, 100-0, 100-10 i 100-100 nM) przez 48 h. Następnie komórki przeniesiono na 12-dołkowe płytki pokryte żelatyną i do każdego dołka dodano od 5 do 15 blastocyst. Każdą grupę powtórzono 3-krotnie, a wskaźniki implantacji określono po 48 h.
Wyniki wykazały, że stężenia E2 bliskie fizjologicznym (10 nM) zwiększyły wskaźniki implantacji zarodków w porównaniu z 0 nM E2. Jednakże ultra-wysokie stężenia E2 (100 nM) znacząco obniżyły wskaźniki implantacji zarodków. Dodatek P4 w sposób zależny od dawki złagodził negatywny wpływ ultra-wysokiego stężenia E2 na implantację (Rysunek 6). W oparciu o ten model in vitro obrazujemy negatywny wpływ niefizjologicznych, ultra-wysokich stężeń estrogenu na implantację zarodków oraz przedstawiamy zastosowanie tego modelu w badaniach naukowych.
<img alt="Proces sekcji myszy, anatomia rozrodcza, schemat macicy i jajowodu do badań biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Wycięcie jajowodu myszy. Naciągnąć jajowód, jajnik i poduszki tłuszczowe za pomocą pęsety, a następnie przeciąć nożyczkami jajowód oraz jajnik, po czym wyciąć jajowód z macicy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat rozwoju zarodka myszy; zarodek i schemat procesu manipulacji; biologia rozwoju." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Pozyskiwanie zygot. Powiększona część kątnicy jajowodu zostaje przebita pęsetą w celu uwolnienia kompleksu cumulus-zygota. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu agregacji komórek z obrazami mikroskopowymi ilustrującymi tworzenie się skupisk komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Izolacja nagich zygot poprzez trawienie hialuronidazą. Za pomocą pęsety ostrożnie przenieś kompleks cumulus-zygota do roztworu M2 zawierającego 0,5 mg/mL hialuronidazy i pozostaw na kilka minut, aż komórki cumulusa oddzielą się od zygot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat szalki Petriego z mikrokroplami w oleju mineralnym do eksperymentu z równowagą statyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Hodowla zarodków myszy in vitro. Przygotować 12 mikrokropel pożywki KSOM, każda o objętości 20 µL. Przykryć mikrokrople 3-5 mL oleju mineralnego. Przenieść zarodki myszy z pożywki M2 do górnej połowy mikrokropel KSOM w celu dokładnego przemycia, następnie umieścić przemyte zarodki w dolnej połowie i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 4 dni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy morfologii komórek, podkreślający struktury komórkowe do analizy biologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Implantacja zarodka. Ostrożnie umieść od 5 do 15 świeżych blastocyst w każdej studience płytki 12-dołkowej zawierającej komórki Ishikawa do kokultury. Po 48 h inkubacji szybko przesuń płytkę 3 razy. Nieprzytwierdzone zarodki będą wykazywać ruch pływający lub toczący się po powierzchni komórek Ishikawa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres tempa adhezji z efektami traktowania estrogenem (E2) i progesteronem (P4); analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wpływ ultrawysokiego stężenia estrogenu na tempo implantacji zarodka. Gwiazdka oznacza różnicę istotną statystycznie, P &lt; 0,05. Skróty: E2 = estradiol; P4 = progesteron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia prostego i efektywnego modelu implantacji zarodków in vitro do oceny istotnych cząsteczek wpływających na proces implantacji zarodka.

Opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro

Embryo implantation is the first step in the establishment of a successful pregnancy. An in vitro model for embryo implantation is critical for basic ...

Implantacja zarodka. Pierwszy etap udanej ciąży ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia jej biologicznych podstaw i sprostania wyzwaniom związanym z niepłodnością. Celem tego badania jest stworzenie spójnej platformy do analizy interakcji zarodek-endometrium w kontrolowanych warunkach.Opierając się na tym modelu in vitro, stwierdziliśmy, że bardzo wysokie stężenia estrogenu znacznie zmniejszają wskaźniki implantacji zarodków, podczas gdy suplementacja progesteronem może złagodzić te negatywne skutki w zależności od dawki. Badanie to oferuje nowe spostrzeżenia i strategie terapeutyczne mające na celu poprawę wskaźników ciąż w przypadku transferu świeżych zarodków podczas kontrolowanej stymulacji jajników do zapłodnienia in vitro. W porównaniu z trójwymiarowym systemem hodowli, ten model in vitro oferuje prostą, szybką i opłacalną platformę, którą można stworzyć w większości laboratoriów i wykazuje wysoką odtwarzalność i niezawodność, co czyni go korzystnym narzędziem do badań i rozwoju w dziedzinie biologii rozrodu.Na początek należy uzyskać od sześciu do ośmiu tygodni samicy myszy i wstrzyknąć PMSG, a następnie HCG w odstępie 42 do 48 godzin. Skojarzyć samicę myszy z samcem w porównywalnym wieku. Po eutanazji samicy myszy otwórz brzuch i zlokalizuj jej genitalia.Za pomocą kleszczy rozciągnij jajowód, jajnik i poduszeczki tłuszczowe. Nożyczkami przetnij jajowód i jajnik, a następnie macicę. Otrzymany jajowód przenieść na 35-milimetrową szalkę Petriego wstępnie wypełnioną pożywką M2.Nakłuj powiększoną bańkę jajowodu, aby uwolnić lub uszczypnąć kompleks zygoty wzgórkowej. Za pomocą kleszczy przenieś kompleks do roztworu M2 zawierającego 0,5 miligrama na mililitr hialuronidazy i inkubuj przez kilka minut. Za pomocą pipety do przenoszenia jaj zbierz zygoty i umyj je w pożywce M2 zawierającej BSA, aby usunąć resztki hialuronidazy, komórki wzgórka i zanieczyszczenia.Na początek pobierz zarodki ze świeżo pokrytej samicy myszy. Przygotuj 12 mikrokropelek pożywki zoptymalizowanej pod kątem potasa simplex na dnie 35-milimetrowej szalki Petriego. Przykryj mikrokropelki trzema do pięciu mililitrami oleju mineralnego i umieść szalki Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla dla równowagi.Za pomocą pipety transferowej przenieś mysie zarodki z pożywki M2 na pożywkę KSOM. Umyte zarodki umieszczamy w przygotowanych mikrokropelkach KSOM i inkubujemy w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez cztery dni. Wybierz korzystne blastocysty w zależności od ich wielkości, wewnętrznej masy komórkowej, liczby komórek trofoblastu i stopnia ekspansji.Dodaj jeden mililitr 2% żelatyny do 12-dołkowej płytki hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odessaj nadmiar żelatyny i pozwól dnie płytki całkowicie wyschnąć. Wysiewaj ludzkie komórki gruczolakoraka endometrium lub komórki Ishikawy na 12-dołkową płytkę pokrytą żelatyną i inkubuj płytkę przez 24 godziny.Delikatnie umieść od 5 do 15 świeżych blastocyst w każdym dołku 12-dołkowej płytki zawierającej komórki. Po 48 godzinach obserwuj zarodki pod mikroskopem, aby ocenić ich stan przyczepu po trzykrotnym przesunięciu płytki. Nieprzyczepione zarodki będą unosić się lub toczyć po powierzchni komórek.Na koniec oblicz wskaźnik implantacji zarodka w obecności różnych stężeń estrogenów. Wyniki wykazały, że niemal fizjologiczne stężenia 17 beta-estradiolu zwiększyły wskaźniki implantacji zarodków w porównaniu z grupą kontrolną bez 17 beta-estradiolu. Jednak bardzo wysokie stężenia 17 beta-estradiolu w okolicach 100 nanomolowców znacznie zmniejszyły wskaźniki implantacji zarodków.

establishment-of-an-embryo-implantation-model-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie opisujemy wszczepianie komórek rakowych na błonę kosmówkowo-omoczniową kurczaka w celu wygenerowania modelu in ovo. Model z powodzeniem wszczepia komórki raka jajnika w celu zbadania progresji raka ginekologicznego.

Modelowanie raka błony moczowo-omoczniowej kurczaka: model in ovo do badania nowotworzenia i przerzutów komórek rakowych

Ten manuskrypt opisuje metodę hodowli jajników in vitro, która umożliwia obrazowanie żywych komórek zygot i zarodków Arabidopsis. Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji dynamiki wewnątrzkomórkowej podczas polaryzacji zygoty i specyfikacji losu komórki w rozwijających się zarodkach.

In vitro Hodowla zalążków do obrazowania żywymi komórkami polaryzacji zygoty i wzorca zarodka u Arabidopsis thaliana

Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs) są w ciągłym emulucie ocenianym w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z tym ryzyka. Manuskrypt ten opisuje minimalnie inwazyjną procedurę transferu zarodków z skutecznym protokołem kriokonserwacji, który pozwala na wykorzystanie królików jako idealnego zwierzęcego modelu rozrodu człowieka.

Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

Biopsja blastocysty i witryfikacja są niezbędne do skutecznego przeprowadzenia preimplantacyjnych badań genetycznych. Podejście polegające na sekwencyjnym otwieraniu osłonki przejrzystej i pobieraniu 7-8 komórek trofektodermy w 5-7 dniu po inseminacji ogranicza zarówno liczbę wymaganych manipulacji, jak i narażenie zarodka na nieoptymalne warunki środowiskowe.

Biopsja ludzkiej blastocysty i witryfikacja

Prezentujemy model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka jako alternatywny, nadający się do przeszczepu, model in vivo do wszczepiania ginekologicznych i urologicznych linii komórkowych raka oraz guzów pochodzących od pacjentów.

Wykorzystanie błony chorio-omoczniowej kurczaka w modelu in vivo do badania nowotworów ginekologicznych i urologicznych

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Ulepszona platforma do hodowli całych zarodków umożliwia ciągły i solidny rozwój ex utero zarodków myszy po implantacji przez okres do sześciu dni, od etapów pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy. W tym protokole szczegółowo opisujemy standardową procedurę udanej hodowli zarodków przy użyciu statycznych płytek i systemów obrotowych butelek.

Ex Utero Hodowla zarodków myszy od pregastrulacji do zaawansowanej organogenezy

Protokół pokazuje nowatorski model eksperymentalny in vitro, który może podsumować biologię dwóch rodzajów przylegających linii komórkowych za pomocą trójwymiarowego (3D) wydrukowanego rusztowania. Opisano budowę tego modelu i procedury operacyjne, od przygotowania komórek i hodowli komórek po analizę i ocenę.

Model kohodowli z wykorzystaniem dwóch typów przylegających linii komórkowych

Ten protokół opisuje procedury dotyczące in vitro dojrzewania oocytów mysich, in vitro zapłodnienia i późniejszej kultury embrionów do etapu blastocysty.

Dojrzewanie in vitro komórek jajowych myszy, zapłodnienie i hodowlą zarodków przedimplantacyjnych

Christopher C.W. Hughes opisuje użyteczność swojego systemu hodowlanego do badania angiogenezy in vitro. Wyjaśnia on znaczenie fibroblastów, które wydzielają krytyczny, choć niezidentyfikowany, rozpuszczalny czynnik umożliwiający komórkom śródbłonka tworzenie w hodowli naczyń, które rozgałęziają się, tworzą prawidłowe światła i ulegają anastomozie.

Christopher Hughes: Model in vitro do badania angiogenezy (wywiad)

Poznaj model implantacji zarodka in vitro w biologii rozrodu z użyciem mysich zarodków i linii komórkowych endometrium. Metoda ta pozwala badać wpływ hormonów na powodzenie ciąży i poprawiać wyniki IVF.

Opracowanie modelu implantacji zarodka in vitro

Przeglądaj więcej filmów