Wszechstronne narzędzie do analizy dynamicznych zmian w ciałach jądrowych w różnych typach komórek
28 czerwca 2024
Ta metoda opisuje protokół immunofluorescencji i proces kwantyfikacji do oceny dystrybucji białek z różnymi wzorcami organizacji jądra w ludzkich limfocytach T. Protokół ten zapewnia wskazówki krok po kroku, począwszy od przygotowania próbki, a skończywszy na wykonaniu półautomatycznej analizy na Fidżi, a kończąc na obsłudze danych przez notebook Google Colab.
Nasze główne zainteresowania badawcze to mechanizm epigenetyczny, który reguluje plastyczność komórkową człowieka i adaptację do środowiska. Obecnie skupiam się na badaniu, w jaki sposób zmiany w organizacji chromatyny w kondensatach jądrowych wywołują patologiczne stany komórkowe. Uważam, że badanie biofizycznych właściwości organizacji chromatyny otwiera nową dziedzinę i oferuje unikalne możliwości rozwoju nowatorskich podejść terapeutycznych.
Testy immunofluorescencyjne są cenne dla badań przesiewowych organizacji białek w kondensatach jądrowych. Jednak analiza obrazu może być trudna ze względu na problemy z doborem parametrów i dużą ilość danych podczas badania wielu warunków. Oferujemy kompleksową metodę wraz ze wskazówkami, jak używać odpowiednich parametrów i zautomatyzowanego potoku analizy, aby usprawnić proces.
Nasz protokół prowadzi użytkowników od przygotowania próbki do analizy danych. Zapewniamy półautomatyczny projekt rurociągu dla osób o ograniczonej wiedzy specjalistycznej w zakresie obliczeń i analizy obrazu. Przepływ pracy jest dostępny dla wszystkich bez żadnych kosztów, wykorzystując szeroko stosowane oprogramowanie typu open source, takie jak Imager w Pythonie i bezpłatną usługę w chmurze Google Colab.
Aby rozpocząć, pobierz i zainstaluj najnowszą wersję Fiji na komputerze. Po pobraniu convert_to_TIFF. py, przeciągnij i upuść skrypt na Fidżi i uruchom kod.
Przejdź do ścieżki, w której jest przechowywany eksperyment. Przekonwertowane pliki TIFF są tworzone w tym samym folderze eksperymentalnym. Kliknij Wtyczki, a następnie 3D Suite i otwórz Opcje Menedżera 3D.
W oknie Menedżer 3D zaznacz pola wyboru odpowiadające Objętości w jednostce, Średnia wartość szarości, Obwiednia w pikselach, Odchylenie standardowe Wartość szarości, Środek ciężkości w pikselu i Środek ciężkości w jednostce. Zaznacz opcje Wyklucz obiekty na krawędziach XY i Wyklucz obiekty na krawędziach Z.Następnie kliknij przycisk OK. Otwórz obraz fluorescencyjny ludzkich limfocytów T. Kliknij Control Shift D, aby zduplikować kanał białkowy, w tym stos.
Zaznacz pole wyboru hyperstack. Określ odpowiedni numer kanału w polu kanałów i odpowiednio zmień jego nazwę. Aby uruchomić rejestrator makr Fidżi, przejdź do Wtyczki, a następnie Makra i wybierz Nagraj.
Następnie, aby otworzyć wtyczkę FindFoci, kolejno kliknij Wtyczki, GDSC, FindFoci i FindFoci GUI. Z menu rozwijanego obrazu wybierz obraz, który ma zostać przeanalizowany. Ustaw Rozmycie gaussowskie na 1,5, metodę tła na odchylenie standardowe powyżej średniej, parametr tła na dziewięć, metodę wyszukiwania na ułamek szczytowego tła, parametr wyszukiwania na 0,7, metodę szczytową na względną nad tłem, parametr pik na 0,2 i minimalny rozmiar na pięć.
Ustaw maksymalne wartości szczytowe na wysokie liczby, aby uwzględnić wszystkie ogniska na obrazie. Aby poprawić identyfikację ognisk, dostosuj rozmycie gaussowskie blisko średnicy ognisk i zwiększ wartości parametru tła, aby nałożyć bardziej rygorystyczne progi. Następnie zmniejsz wartości parametru wyszukiwania, aby uwzględnić obszary bardziej oddalone od piku fluorescencji i zmniejsz wartości parametru piku dla separacji pików.
Uruchom FindFoci i skopiuj ciąg, który pojawi się w oknie rejestratora. Ciąg zawiera wybrane parametry, z wyłączeniem cudzysłowów. Po pobraniu nuclear_prod_q.
py, przeciągnij i upuść skrypt na Fidżi i kliknij Uruchom, aby wykonać kod. W kanale jądra wprowadź numer odpowiadający kanałowi dapE. W przypadku rozmycia gaussowskiego jądra wprowadź wartość sigma potrzebną do rozmycia obrazu na potrzeby segmentacji.
Następnie wprowadź liczbę odpowiadającą kanałowi barwienia będącego przedmiotem zainteresowania dla kanału białkowego. W parametrze FindFoci wklej ciąg reprezentujący zapis makra wybranych parametrów. Zaznacz pole wyboru wizualizacji i kliknij przycisk Przeglądaj, aby wybrać katalog, w którym przechowywane są obrazy.
Po skompilowaniu wszystkich pól kliknij przycisk OK, aby kontynuować wykonywanie. Z listy ROI w oknie Menedżer ROI 3D wybierz kanał jądra i kliknij opcję Live ROI to On.Wybierz ROI należący do tego samego jądra i naciśnij przycisk Merge. A w przypadku niepożądanych jąder naciśnij Delete.
Ponownie kliknij opcję Aktywny zwrot z inwestycji na Wł., zaznacz wszystko i potwierdź, że wszystkie jądra są poprawnie podzielone na segmenty. W folderze kwantyfikacji otwórz plik TXT z zapisami parametrów użytych do analizy. Otwórz Google Colab w przeglądarce.
Następnie z pliku wybierz pozycję Otwórz notes i przekaż skrypt final_nuclear_protein_metrics. ipymb. Prześlij wszystkie foldery zawierające pliki csv z każdego pola obrazu do preferowanego folderu na Dysku Google.
W notesie wskaż ścieżkę do folderu, w którym są przechowywane podfoldery wyników, i uruchom wszystkie komórki. Po zakończeniu kompilacji kodu otwórz końcowy plik arkusza kalkulacyjnego zawierający wszystkie skompilowane dane.
Przegląd
Niniejsza metoda opisuje protokół immunofluorescencji oraz potok kwantyfikacji służący do oceny dystrybucji białek o różnych wzorcach organizacji jądrowej w ludzkich limfocytach T. Protokół zawiera instrukcje krok po kroku, począwszy od przygotowania próbek, poprzez przeprowadzenie półautomatycznej analizy w programie Fiji, aż po przetwarzanie danych za pomocą notatnika Google Colab.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Immunologia
Wstęp
- Badania koncentrują się na mechanizmach epigenetycznych regulujących plastyczność komórkową.
- Zmiany w organizacji chromatyny mogą wywoływać stany patologiczne.
- Analizy immunofluorescencyjne są niezbędne do badania organizacji białek.
- Analiza obrazów stawia wyzwania ze względu na dobór parametrów oraz objętość danych.
Cel badania
- W celu usprawnienia analizy rozkładu białek w kondensatach jądrowych.
- Aby przedstawić kompleksową metodę zautomatyzowanej analizy obrazu.
- W celu pogłębienia wiedzy na temat organizacji chromatyny w limfocytach T.
Zastosowane metody
- Protokół immunofluorescencji dla przygotowania próbek.
- Półautomatyczna analiza z wykorzystaniem oprogramowania Fiji.
- Przetwarzanie danych za pomocą notatnika Google Colab.
- Wskazówki dotyczące wyboru parametrów do analizy obrazów.
Główne wyniki
- Skuteczna ocena wzorców rozmieszczenia białek.
- Usprawniony proces analizy redukuje nakład pracy ręcznej.
- Zwiększona dokładność w kwantyfikacji organizacji jądra komórkowego.
- Ułatwiona analiza biofizyki chromatyny w limfocytach T.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia solidne ramy dla badania organizacji białek.
- Zautomatyzowana analiza może znacznie zwiększyć efektywność badań.
- Uzyskane informacje mogą doprowadzić do nowych podejść terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ilościowa analiza dynamiki ciałek jądrowych ma kluczowe znaczenie dla ograniczania ryzyka związanego z hipotezami na wczesnym etapie odkryć oraz wyjaśniania szlaków mechanistycznych w kontekście specyficznym dla danego typu komórek. Ten rurociąg analityczny umożliwia standaryzowaną i powtarzalną kwantyfikację immunofluorescencji w różnych typach komórek, co zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów oraz genomice funkcjonalnej. Dzięki usprawnieniu zarządzania danymi i analizy, rozwiązanie to wspomaga podejmowanie decyzji dotyczących portfolio w kluczowych punktach zwrotnych procesu odkrywania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę organizacji białek jądrowych i dynamiki chromatyny.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez kwantyfikację zmian w lokalizacji białek w różnych warunkach.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki obiektywnym, ilościowym wynikom obrazowania.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy rozwoju celów w złożonych systemach komórkowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane testy obrazowania dla późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Standaryzuje kwantyfikację ognisk jądrowych oraz rozproszonych dystrybucji białek.
- Umożliwia powtarzalną i skalowalną analizę w wielu typach komórek i warunkach.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu związków na organizację jądra komórkowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki obrazowania z istotnymi dla choroby biomarkerami jądrowymi, jeśli dotyczy.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację celów białkowych jądra komórkowego.
- Umożliwia dostosowanie postępu badań do ryzyka poprzez kwantyfikację odpowiedzi komórkowych na perturbacje.
- Wspiera zrozumienie mechanizmów procesów chorobowych napędzanych przez chromatynę.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten proces integruje etapy od wczesnego odkrywania po opracowanie testów, umożliwiając rzetelną weryfikację hipotez oraz uzyskanie ilościowych wyników niezbędnych do identyfikacji wiodących związków i badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia analizy oparte na hipotezach w zakresie dynamiki ciałek jądrowych i organizacji chromatyny.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne testy obrazowania z ilościowymi wynikami do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia zautomatyzowany pomiar ognisk jądrowych, ich intensywności i rozkładu w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie do fenotypów jądrowych istotnych dla danej choroby, o ile potwierdzają to dane.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje konfigurowalny, otwartoźródłowy przepływ pracy, który można dostosować do różnych celów i typów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach białek jądrowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje analizę obrazowania, poprawia powtarzalność i umożliwia skalowanie w ramach projektów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zwiększa efektywność kapitałową we wczesnej fazie B+R.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój celów białkowych w jądrze komórkowym.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunofluorescencji oraz podstawowych procedur analizy obrazu.
- Wymagany dostęp do oprogramowania Fiji, skryptów Python oraz chmurowych narzędzi do zarządzania danymi.
- Wymaga standaryzacji parametrów obrazowania i protokołów analizy pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek i białek jądrowych poprzez optymalizację parametrów.
- Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od jakości przygotowania próbek i obrazowania.
