Name: Procedury hodowli in vitro Treponema pallidum, krętka kiły (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę hodowli in vitro Treponema pallidum z komórkami ssaczymi Sf1Ep. Ta skalowalna technika umożliwia produkcję dużych ilości bakterii i generowanie kultur klonalnych do badań nad kiłą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant R01 AI141958 z Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych/NIAID. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Scalable In Vitro Cultivation of T. pallidum Using Mammalian Cell Co-Culture

<ol><li>Implementing the global health sector strategies on HIV, viral hepatitis and sexually transmitted infections, 2022-2030: Report on progress and gaps. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240094925">https://www.who.int/publications/i/item/9789240094925</a> 2022-2030 (2024).</li>
<li>Antal, G. M., Lukehart, S. A., Meheus, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endemic+treponematoses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The endemic treponematoses.</a> Microbes Infect. 4 (1), 83-94 (2002).</li>
<li>Norris, S. J., Paster, B. J., Smibert, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNorris%2C+SJ+%22Bergey%27s+Manual+of+Systematic+Bacteriology%22">Bergey's Manual of Systematic Bacteriology</a>. 4, Springer. New York, NY. (2010).</li>
<li>Lumeij, J. T., Mikalová, L., Šmajs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+there+a+difference+between+hare+syphilis+and+rabbit+syphilis%3F+Cross+infection+experiments+between+rabbits+and+hares%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Is there a difference between hare syphilis and rabbit syphilis? Cross infection experiments between rabbits and hares.</a> Vet Microbiol. 164 (1-2), 190-194 (2013).</li>
<li>Knauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+and+genetic+diversity+of+Treponema+paraluisleporidarum+isolates+in+European+lagomorphs%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">High prevalence and genetic diversity of Treponema paraluisleporidarum isolates in European lagomorphs.</a> Microbiol Spectr. 12 (1), e0177423(2024).</li>
<li>Šmajs, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Treponema+paraluiscuniculi%2C+strain+Cuniculi+A%3A+the+loss+of+infectivity+to+humans+is+associated+with+genome+decay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Treponema paraluiscuniculi, strain Cuniculi A: the loss of infectivity to humans is associated with genome decay.</a> PLoS One. 6 (5), e20415(2011).</li>
<li>Šmajs, D., Norris, S. J., Weinstock, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+in+Treponema+pallidum%3A+implications+for+pathogenesis%2C+evolution+and+molecular+diagnostics+of+syphilis+and+yaws%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Genet+Evol%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity in Treponema pallidum: implications for pathogenesis, evolution and molecular diagnostics of syphilis and yaws.</a> Infect Genet Evol. 12 (2), 191-202 (2012).</li>
<li>Šmajs, D., Strouhal, M., Knauf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+and+animal+uncultivable+treponemal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Genet+Evol%22%5BJournal%5D)">Genetics of human and animal uncultivable treponemal pathogens.</a> Infect Genet Evol. 61, 92-107 (2018).</li>
<li>Norris, S. J., Cox, D. L., Weinstock, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Treponema+pallidum%3A+correlation+of+functional+activities+with+genome+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biology of Treponema pallidum: correlation of functional activities with genome sequence data.</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 3 (1), 37-62 (2001).</li>
<li>Radolf, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treponema+pallidum%2C+the+syphilis+spirochete%3A+making+a+living+as+a+stealth+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Treponema pallidum, the syphilis spirochete: making a living as a stealth pathogen.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (12), 744-759 (2016).</li>
<li>Schaudinn, F. R., Hoffman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vorl%C3%A4ufiger+bericht+%C3%BCber+das+Vorkommen+f%C3%BCr+Spirochaeten+in+syphilitischen+Krankheitsprodukten+und+bei+Papillomen%5BTitle%5D)+AND+%22Arb+Gesundh+Amt+Berlin%22%5BJournal%5D)">Vorläufiger bericht über das Vorkommen für Spirochaeten in syphilitischen Krankheitsprodukten und bei Papillomen.</a> Arb Gesundh Amt Berlin. 22, 528-534 (1905).</li>
<li>Schaudinn, F., Hoffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+Spirochaetenbefunde+im+Lymphdr%C3%BCsensaft+Syphilitischer%5BTitle%5D)+AND+%22Deut+Med+Wochenschr%22%5BJournal%5D)">Über Spirochaetenbefunde im Lymphdrüsensaft Syphilitischer.</a> Deut Med Wochenschr. 31 (18), 711-714 (1905).</li>
<li>Turner, T. B., Hollander, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+treponematoses%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Biology of the treponematoses.</a> World Health Organization. , (1957).</li>
<li>Lukehart, S. A., Marra, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+laboratory+maintenance+of+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and laboratory maintenance of Treponema pallidum.</a> Curr Protoc Microbiol. , Chapter 12, Unit 12A.1 (2007).</li>
<li>Fieldsteel, A. H., Cox, D. L., Moeckli, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+virulent+Treponema+pallidum+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cultivation of virulent Treponema pallidum in tissue culture.</a> Infect Immun. 32, 908-915 (1981).</li>
<li>Cox, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Culture of Treponema pallidum.</a> Meth Enzymol. 236, 390-405 (1994).</li>
<li>Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vitro+culture+of+the+syphilis+spirochete+Treponema+pallidum+subsp.+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete Treponema pallidum subsp. pallidum.</a> mBio. 9 (3), e01153-e01218 (2018).</li>
<li>Edmondson, D. G., DeLay, B. D., Kowis, L. E., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+affecting+continuous+in+vitro+culture+of+Treponema+pallidum+strains%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Parameters affecting continuous in vitro culture of Treponema pallidum strains.</a> mBio. 12 (1), e03536-e03620 (2021).</li>
<li>Edmondson, D. G., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cultivation+of+the+syphilis+spirochete+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro cultivation of the syphilis spirochete Treponema pallidum.</a> Curr Protoc. 1 (2), e44(2021).</li>
<li>Edmondson, D. G., Wormser, G. P., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+susceptibility+of+Treponema+pallidum+subsp.+pallidum+to+doxycycline%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro susceptibility of Treponema pallidum subsp. pallidum to doxycycline.</a> Antimicrob Agents Chemother. 64 (10), e00979-e01020 (2020).</li>
<li>Leimer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+antibiotic+for+Lyme+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A selective antibiotic for Lyme disease.</a> Cell. 184 (21), 5405-5418 (2021).</li>
<li>Haynes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+linezolid+on+Treponema+pallidum%2C+the+syphilis+agent%3A+A+preclinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of linezolid on Treponema pallidum, the syphilis agent: A preclinical study.</a> EBioMedicine. 65, 103281(2021).</li>
<li>Houston, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+peptides+with+antimicrobial+activity+From+the+syphilis+spirochete%2C+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of peptides with antimicrobial activity From the syphilis spirochete, Treponema pallidum.</a> Front Microbiol. 13, 888525(2022).</li>
<li>Tantalo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+susceptibility+of+Treponema+pallidum+subspecies+pallidum%3A+an+in-vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Microbe%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial susceptibility of Treponema pallidum subspecies pallidum: an in-vitro study.</a> Lancet Microbe. 4 (12), e994-e1004 (2023).</li>
<li>Hayes, K. A., Dressler, J. M., Norris, S. J., Edmondson, D. G., Jutras, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+screen+identifies+beta-lactam+antibiotics+which+can+be+repurposed+to+target+the+syphilis+agent%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Antimicrob+Resist%22%5BJournal%5D)">A large screen identifies beta-lactam antibiotics which can be repurposed to target the syphilis agent.</a> NPJ Antimicrob Resist. 1 (1), 4(2023).</li>
<li>Tantalo, L. C., Molini, B. J., Bose, M., Klausner, J. D., Giacani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+isolation+of+Treponema+pallidum+subsp.+pallidum+from+fresh+and+frozen+needle+aspirates+of+primary+experimental+syphilis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Dis%22%5BJournal%5D)">In vitro isolation of Treponema pallidum subsp. pallidum from fresh and frozen needle aspirates of primary experimental syphilis lesions.</a> Sex Transm Dis. 50 (3), 180-183 (2023).</li>
<li>Edmondson, D. G., De Lay, B. D., Hanson, B. M., Kowis, L. E., Norris, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+isolates+of+Treponema+pallidum+subsp.+pallidum+Nichols+provide+evidence+for+the+occurrence+of+microevolution+during+experimental+rabbit+infection+and+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Clonal isolates of Treponema pallidum subsp. pallidum Nichols provide evidence for the occurrence of microevolution during experimental rabbit infection and in vitro culture.</a> PLoS One. 18 (3), e0281187(2023).</li>
<li>Lin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+TprK+profiling+of+in+vivo+and+in+vitro-propagated+Treponema+pallidum+subsp.+pallidum+reveals+accumulation+of+antigenic+variants+in+absence+of+immune+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal TprK profiling of in vivo and in vitro-propagated Treponema pallidum subsp. pallidum reveals accumulation of antigenic variants in absence of immune pressure.</a> PLoS Negl Trop Dis. 15 (9), e0009753(2021).</li>
<li>De Lay, B. D., Cameron, T. A., De Lay, N. R., Norris, S. J., Edmondson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+transcriptional+profiles+of+Treponema+pallidum+during+experimental+infection+of+rabbits+and+in+vitro+culture%3A+Highly+similar%2C+yet+different%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Comparison of transcriptional profiles of Treponema pallidum during experimental infection of rabbits and in vitro culture: Highly similar, yet different.</a> PLoS Pathog. 17 (9), e1009949(2021).</li>
<li>Romeis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+Treponema+pallidum+subsp.+pallidum%2C+the+syphilis+spirochete%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of Treponema pallidum subsp. pallidum, the syphilis spirochete.</a> PLoS Pathog. 17 (7), e1009612(2021).</li>
<li>Phan, A., Romeis, E., Tantalo, L., Giacani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transformation+and+selection+of+Treponema+pallidum+subsp.+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro transformation and selection of Treponema pallidum subsp. pallidum.</a> Curr Protoc. 2 (8), e507(2022).</li>
<li>Romeis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treponema+pallidum+subsp.+pallidum+with+an+artificially+impaired+TprK+antigenic+variation+system+is+attenuated+in+the+rabbit+model+of+syphilis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Treponema pallidum subsp. pallidum with an artificially impaired TprK antigenic variation system is attenuated in the rabbit model of syphilis.</a> bioRxiv. , 524629(2023).</li>
<li>Fieldsteel, A. H., Becker, F. A., Stout, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+survival+of+virulent+Treponema+pallidum+%28Nichols+strain%29+in+cell-free+and+tissue+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Prolonged survival of virulent Treponema pallidum (Nichols strain) in cell-free and tissue culture systems.</a> Infect Immun. 18, 173-182 (1977).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 6th Edition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22U.S.+Department+of+Health+and+Human+Services%2C+Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%2C+National+Institutes+of+Health%22">U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health</a>. , (2020).</li>
<li>Norris, S. J., Miller, J. N., Sykes, J. A., Fitzgerald, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+oxygen+tension%2C+sulfhydryl+compounds%2C+and+serum+on+the+motility+and+virulence+of+Treponema+pallidum+%28Nichols+strain%29+in+a+cell-+free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Influence of oxygen tension, sulfhydryl compounds, and serum on the motility and virulence of Treponema pallidum (Nichols strain) in a cell- free system.</a> Infect Immun. 22 (3), 689-697 (1978).</li>
<li>Cox, C. D., Barber, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+uptake+by+Treponema+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Oxygen uptake by Treponema pallidum.</a> Infect Immun. 10 (1), 123-127 (1974).</li>
<li>Magnuson, H. J., Eagle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimal+infectious+inoculum+of+Spirochaeta+pallida+%28Nichols+strain%29%2C+and+a+consideration+of+its+rate+of+multiplication+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Syph%22%5BJournal%5D)">The minimal infectious inoculum of Spirochaeta pallida (Nichols strain), and a consideration of its rate of multiplication in vivo.</a> Am J Syph. 32, 1-18 (1948).</li>
<li>Cumberland, M. C., Turner, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+multiplication+of+Treponema+pallidum+in+normal+and+immune+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Syph%22%5BJournal%5D)">The rate of multiplication of Treponema pallidum in normal and immune rabbits.</a> Am J Syph. 33, 201-211 (1949).</li>
<li>Norris, S. J., Edmondson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+multiplication+and+subculture+of+Treponema+pallidum+subsp.+pallidum+in+a+tissue+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the multiplication and subculture of Treponema pallidum subsp. pallidum in a tissue culture system.</a> Infect Immun. 53, 534-539 (1987).</li>
<li>Baseman, J. B., Nichols, J. C., Rumpp, O., Hayes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Treponema+pallidum+from+infected+rabbit+tissue%3A+resolution+into+two+treponemal+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Purification of Treponema pallidum from infected rabbit tissue: resolution into two treponemal populations.</a> Infect Immun. 10, 1062-1067 (1974).</li>
<li>Hanff, P. A., Norris, S. J., Lovett, M. A., Miller, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Treponema+pallidum%2C+Nichols+strain%2C+by+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Dis%22%5BJournal%5D)">Purification of Treponema pallidum, Nichols strain, by Percoll density gradient centrifugation.</a> Sex Transm Dis. 11, 275-286 (1984).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

System Sf1Ep-TpCM-2 jest pierwszą dostępną procedurą, która wspomaga ciągłą hodowlę in vitro T. pallidum. System jest złożony ze względu na ekstremalne wymagania wzrostowe tego organizmu: 1) złożone potrzeby żywieniowe ze względu na ograniczone zdolności biosyntetyczne; 2) słabo poznane zapotrzebowanie na małe ilości tlenu, pomimo wysokiej wrażliwości na reaktywne formy tlenu 9,10,16,36; oraz 3) obecna potrzeba obecności komórek Sf1Ep. Chociaż kuszące jest "pójście na skróty" w procedurze, zaleca się uważne przestrzeganie kroków, aż do osiągnięcia udanej długoterminowej hodowli przed wypróbowaniem modyfikacji. W miarę gromadzenia się dodatkowych informacji na temat wymagań metabolicznych T. pallidum możliwe może być rozwinięcie się stanów aksenicznych, które nie wymagają obecności komórek Sf1Ep. Jednak tempo wzrostu in vitro prawdopodobnie pozostanie powolne (z minimalnym czasem podwojenia wynoszącym od 33 godzin do 46 godzin, w zależności od szczepu)17,18, biorąc pod uwagę, że T. pallidum rozmnaża się w szacowanym czasie podwojenia wynoszącym od 30 godzin do 33 godzin, nawet podczas infekcji ssaków37,38. Podobnie jak w przypadku każdej hodowli bakteryjnej, zaleca się utrzymanie stad o niskim pasażu i przeprowadzenie eksperymentów na kulturach T. pallidum, które mają mniej niż 10 pasaży od tych stad, aby uniknąć "dryfu genetycznego" i związanych z nim zmian fenotypowych spowodowanych mutacjami.
Komórki Sf1Ep najwyraźniej dostarczają treponomom niezbędnych składników odżywczych lub aktywności enzymatycznej. Jednak zużywają również składniki odżywcze (takie jak glukoza i tlen) i mogą powodować warunki toksyczne, takie jak niskie pH 9,16,39. W związku z tym istnieje równowaga między posiadaniem wystarczającej ilości komórek Sf1Ep do wspierania namnażania T. pallidum a zapobieganiem przerostowi i toksyczności komórek ssaków. Wysoka liczba pasaży komórek Sf1Ep ma tendencję do szybszego wzrostu i czasami traci zdolność do wspierania namnażania T. pallidum. W związku z tym liczba pasaży Sf1Ep powinna być monitorowana, a zapasy komórkowe powinny być okresowo zastępowane preparatami mrożonymi o niskiej pasażowości. Obecność komórek Sf1Ep komplikuje również badanie właściwości T. pallidum, takich jak zawartość DNA, RNA i białek oraz aktywność enzymów. Usunięcie komórek króliczych jest możliwe do pewnego stopnia przy użyciu wielokrotnego wirowania na niskiej prędkości (100 x g przez 5 minut) lub bardziej efektywnie przy użyciu gradientów Percoll lub Hypaque40,41. Jednak metody wirowania gradientowego są na ogół skuteczne tylko w przypadku dużej liczby T. pallidum. Alternatywne metody rozmnażania T. pallidum ograniczają się do zakażenia zwierząt laboratoryjnych, takich jak króliki13,14. Takie podejście ma względy etyczne i staje się coraz bardziej kosztowne; jednak model królika jest bardzo przydatny do badania patogenezy T. pallidum i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Ponadto prawdopodobnie istnieją pewne różnice w ekspresji genów, wzroście lub zachowaniu T. pallidum podczas hodowli in vitro i infekcji królików27.
W chwili sporządzania niniejszego raportu system Sf1Ep-TpCM-2 został opracowany w co najmniej 6 grupach badawczych w Stanach Zjednoczonych i Europie i zaowocował 16 publikacjami na tematy od podstawowej biologii i genetyki T. pallidum po podatność na środki przeciwdrobnoustrojowe. Wartość hodowli in vitro w badaniu tego enigmatycznego patogenu prawdopodobnie wzrośnie wraz z szerszym zastosowaniem i przyszłymi ulepszeniami.

Treponema pallidum to gatunek bakterii o spiralnym kształcie (zwanych krętkami), który powoduje kiłę i podobne infekcje u ludzi i innych naczelnych. Kiła jest poważną chorobą o długotrwałych skutkach dla osób zakażonych i szacuje się, że każdego roku na całym świecie występuje ponad 8 milionów nowych przypadków kiły1. T. pallidum został podzielony na trzy podgatunki w oparciu o choroby, które wywołują u ludzi, a także niewielkie różnice genetyczne: podgatunek pallidum (który powoduje chorobę przenoszoną drogą płciową kiłę), podgatunek pertenue (ziewa) i podgatunek endemicum (powodujący bejel lub endemiczną kiłę)2,3. T. pallidum subsp. pertenue powoduje również infekcje u pawianów, szympansów i innych naczelnych. Blisko spokrewniony organizm o nazwie Treponema paraluiscuniculi (zwany również Treponema paraluisleporidarum) powoduje infekcję u królików i zajęcy4,5. Wszystkie te bakterie są bardzo blisko spokrewnione, z ponad 98% identycznością sekwencji DNA na poziomie genomu6,7,8. Każdy z nich ma pojedynczy, mały okrągły chromosom o wielkości około 1,14 miliona par zasad (Mb). Członkowie tej grupy T. pallidum występują tylko w połączeniu ze swoimi ssaczymi gospodarzami; W związku z tym są to obowiązkowe patogeny, które są zależne od gatunku żywiciela w celu przetrwania i wzrostu9,10.
Próby hodowli T. pallidum in vitro rozpoczęły się wkrótce po jego zidentyfikowaniu przez Schaudinn i Hoffmana w 1905 roku11,12. Wysiłki te nie doprowadziły jednak do stałego, powtarzalnego wzrostu organizmu. W rezultacie, badania naukowe nad T. pallidum wymagały namnażania organizmu poprzez eksperymentalne zakażenie zwierząt laboratoryjnych, najczęściej rabbit13,14. W 1981 roku Fieldsteel et al.15 wprowadzili system hodowli tkankowej, który promował namnażanie szczepów T. pallidum przez okres do 2 tygodni. System ten obejmował jednoczesną hodowlę T. pallidum z komórkami nabłonkowymi królika bawełnianego Sf1Ep w zmodyfikowanym pożywce do hodowli tkankowej (T. pallidum Culture Medium 1, TpCM-1) opartej na Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) i 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inne wymagane warunki hodowli to inkubacja w temperaturze 34 °C w atmosferze zawierającej 1,5% O2 i 5% CO29,16. W tym systemie T. pallidum przyłącza się do komórek Sf1Ep i namnaża się, gdy jest w ścisłym związku z powierzchnią komórki ssaków. Pomimo wielu prób subkultur i innych modyfikacji, system Fieldsteel i in. nie był w stanie promować ciągłego wzrostu in vitro.
W 2018 roku nasze laboratorium poinformowało, że użycie zmodyfikowanej pożywki o nazwie TpCM-2 (w której MEM Eagle'a zostało zastąpione bardziej złożonym podłożem do hodowli tkankowej, CMRL 1066) dostarczyło T. pallidum niezbędnych składników odżywczych, aby umożliwić konsekwentną długoterminową hodowlę17. Do tej pory ta modyfikacja doprowadziła do spójnej, ciągłej hodowli co najmniej 5 szczepów T. pallidum subsp. pallidum (Nichols, SS14, Mexico A, UW231B i UW249B) i jednego szczepu T. pallidum subsp. endemicum (Bośnia A)18,19. Na przykład szczep Nichols jest obecnie hodowany nieprzerwanie in vitro od ponad 6 lat. Do tej pory próby hodowli izolatów ziewających (T. pallidum subsp. pertenue) lub T. paraluiscuniculiin vitro zakończyły się niepowodzeniem18. System TpCM-2 nadal wymaga obecności komórek Sf1Ep, niskich stężeń tlenu i inkubacji w temperaturze 34 °C, co czyni system bardziej złożonym niż większość technik hodowli bakteryjnych. Jednak ten zmodyfikowany system hodowli T. pallidum okazał się przydatny do dalszego definiowania wymagań wzrostu bakterii18, określając minimalne stężenia hamujące (MIC) związków przeciwdrobnoustrojowych i peptydów20,21,22,23,24,25, rozmnażanie nowych szczepów z aspiratów tkanek pacjenta26, izolowanie klonalnych populacji organizmu27, charakteryzowanie systemu zmienności antygenowej tprK27,28, badanie ekspresji genów29, oraz przeprowadzanie analizy mutacji30,31,32.
Tutaj opisujemy obecne metody uprawy T. pallidum in vitro. Mamy nadzieję, że informacje te ułatwią szersze zastosowanie tej techniki hodowli in vitro w celu poprawy diagnostyki, leczenia i zapobiegania kile i związanym z nią infekcjom krętkowym.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E8008</td><td></td></tr><tr><td>10x Earle' s Sole zbilansowane, bez Mg2+, Ca2+</td><td>Gibco</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>stożkowe sterylne jednorazowe probówki wirówkowe o pojemności 15 i 50 ml&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td> Nie <td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>2 ml fiolki kriogeniczne&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli T. pallidum</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Talerze muszą mieć pokrywki o niskim parowaniu.</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td></td>Nie</tr> dotyczy <tr><td>75 cm2 kolby do hodowli tkankowych z wentylowanymi nakrętkami</td><td>Corning</td><td>43061U</td><td></td></tr><tr><td>93,5% azotu, 5% CO2 i 1,5% tlenu do pożywki i kultur</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>95% azotu i 5% CO2 do pożywki wstępnej i kultur</td><td>N/A</td> NIE <td>DOTYCZY</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe, klarowne, niskoparne, poddane hodowli tkankowej mikropłytki</td><td>Corning Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Regulowana pipeta wielokanałowa o pojemności 200 ul&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Opcjonalne, ale bardzo pomocne do klonowania</td></tr><tr><td>Woda klasy hodowlanej</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>CMRL 1066 bez L-glutaminy lub czerwieni fenolowej</td><td>US Biological</td><td>C5900-03A</td><td></td></tr><tr><td>CO2 do inkubatorów trójgazowych i inkubatorów do kultur tkankowych&nbsp;</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Kriogeniczny zbiornik do przechowywania komórek z ciekłym azotem</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe jednostki filtrujące, 0,2 i mikro; m , > 100 ml pojemność</td><td>nie</td><td>dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Pipety jednorazowe: 25 mL, 10 mL, 5 mL, zasysające</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1902</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (sterylna klasa hodowli komórkowej)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Gorąco polecamy ten produkt. Należy przeprowadzić wstępną kontrolę pod kątem zgodności kultur T. pallidum w przypadku korzystania z innej marki lub numeru katalogowego.</td></tr><tr><td>Zamrażarka z możliwością utrzymywania temperatury -70 stopni Celsjusza; C lub -80 &deg; C</td><td>N</td><td>/A N/A</td><td>Do przechowywania T. pallidum można zamiast tego stosować przechowywanie ciekłym azotem</td></tr><tr><td>Medium zamrażające (podłoże Sf1Ep + 10% [v/v] DMSO)</td><td>N/A</td> N<td>/D</td><td></td></tr><tr><td>Butle gazowe z odpowiednim wyposażeniem</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GasPak 150 wentylowany słoik anaerobowy (Brewer Jar)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-816</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>N/A</td><td>N/A N/A</td><td></td></tr><tr><td>Komory liczące Helber z orzeczeniami Thoma</td><td>Hawksley Sprzęt medyczny i laboratoryjny</td><td>Do oznaczania ilościowego T. pallidumhemocytometr</td> N/A N/A&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Do oznaczania ilościowego komórek Sf1Ep</td></tr><tr><td>Przełącznik zbiornika inkubatora</td><td>NuAire&nbsp;</td><td>NU-1550 TankGuard Automatyczny przełącznik zbiornika inkubatora CO2</td><td>Opcjonalny, ale bardzo pomocny w utrzymaniu odpowiednich warunków O2.</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony z optyką z kontrastem fazowym</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do oglądania kultur komórkowych Sf1Ep</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z kondensorem ciemnego pola</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Mikroskop powinien mieć obiektyw 40x i okulary 15x.</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowy adapter do aspiratora&nbsp;</td><td>Integra</td><td>155520</td><td>Opcjonalny, ale przydatny do klonowania</td></tr><tr><td>NaHCO3 (7,5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Azot do inkubatora trójgazowego</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>Sf1Ep (NBL-11)</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>CCL-68</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td> <td>soduSigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny PBS (bez chlorku wapnia i chlorku magnezu)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne zbiorniki na odczynniki, rozmiar 50 lub 100 ml</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T. pallidum próbka, mrożona lub świeża&nbsp;</td><td></td><td></td><td>z zakażenia królika lub hodowli in vitro</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych utrzymywany w temperaturze 37 °; C, 5% CO2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trójgazowy inkubator do hodowli tkankowych utrzymywany w temperaturze 34 &deg; C, 5% CO2, 1,5% O2</td><td>Thermofisher</td><td>Heracell&trade; Inkubator CO2 trójgazowy VIOS 160i</td><td>Opcjonalnie; zamiast tego można użyć słoików beztlenowych (patrz Ref. 17)</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Źródło próżni (np. próżnia domowa), rurki próżniowe, wakuometr i złącza</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Woda, odpowiednia do hodowli komórkowych, sterylizowana filtrem, oczyszczona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td>Zalecany do przygotowania podłoża; zmniejsza zmienność kultur</td></tr></tbody></table>

procedury hodowli in vitro treponema pallidum, krętka kiły

Procedures for In Vitro Cultivation of Treponema pallidum, the Syphilis Spirochete

Przez ponad sto lat, Treponema pallidum subsp. pallidum, spiralna bakteria wywołująca kiłę, mogła być rozmnażana tylko przez inokulację i zbiór organizmów z jąder królików. W 2018 roku opisaliśmy metodę ciągłej hodowli T. pallidumin vitro. System ten wykorzystuje kohodowlę z komórkami nabłonkowymi królika (komórki Sf1Ep) w pożywce do hodowli tkankowej zawierającej surowicę o nazwie TpCM-2. Czas podwojenia T. pallidum w hodowli jest podobny do tego, który szacuje się, że występuje podczas naturalnej infekcji (około 33-45 godzin). Organizm może być hodowany w sposób ciągły ze standardowym czasem pasażu wynoszącym 1 tydzień w środowisku o niskiej zawartości tlenu (1,5%) w temperaturze 34 °C. Niniejszy artykuł zawiera protokoły hodowli T. pallidum, metody hodowli i utrzymania wymaganych komórek hodowli tkankowej oraz technikę wytwarzania szczepów izogenicznych poprzez ograniczenie rozcieńczenia. Zdolność do hodowli T. pallidum in vitro otwiera nowe możliwości eksperymentalne w celu zbadania i zrozumienia tego enigmatycznego organizmu.

W opisanych warunkach T. pallidum zazwyczaj zachowuje &gt;90% ruchliwości i namnaża się logarytmicznie, przy czasie podwojenia od 33 h do 45 h, przez około 7 dni przed wejściem w fazę stacjonarną (Rysunek 3). W ciągu 1 tygodnia spirochety przechodzą około 4-5 podwojeń (Rysunek 4). Ponadto różne szczepy T. pallidum mogą rosnąć w różnym tempie. Szczepy z grupy SS14 T. pallidum wykazują tendencję do dłuższego czasu podwojenia niż szczepy z grupy Nichols17.
Dokarmianie kultur może przedłużyć czas ich hodowli o kilka dni, jednak warstwa komórek Sf1Ep często ulega zniszczeniu po tygodniu hodowli. Ponadto treponemy osiągają górną granicę zagęszczenia organizmów wynoszącą około 5 x 107/mL. Kultury przenoszone w odstępach 7-dniowych zazwyczaj kontynuują mnożenie logarytmiczne z minimalną lub żadną fazą adaptacyjną. Organizmy w fazie stacjonarnej często stają się trudne do pasażowania.
Większość T. pallidum przyczepia się do komórek Sf1Ep. Jednak w supernatancie pozostaje wystarczająca ilość T. pallidum, aby można było okresowo pobierać próbki pożywki w celu sprawdzenia żywotności i mnożenia. Jeśli wymagane jest dokładne ilościowe oznaczenie, należy zmierzyć objętość pobranej pożywki, określić liczbę T. pallidum i dodać całkowitą liczbę usuniętych organizmów do końcowego przeliczenia podczas zbioru.
W poprzednich badaniach wydajność klonowania (liczba kultur dodatnich na zaszczepiony organizm) wynosiła 12,5% dla 2 zaszczepionych T. pallidum na studzienkę oraz 6,7% dla 0,5 zaszczepionych T. pallidum na studzienkę27. Zatem prawdopodobne jest, że każda dodatnia studzienka reprezentuje namnożenie pojedynczego organizmu przy obu tych dawkach inokulum. Niemniej jednak klonalność otrzymanych populacji musi zostać zweryfikowana poprzez badanie homogeniczności kultury w miejscach, które w kulturze macierzystej są heterogeniczne. Najbardziej rozstrzygającym sposobem wykazania, że kultura jest izogeniczna, jest sekwencjonowanie całego genomu27.
<img alt="Schemat hodowli T. pallidum; inkubacja przy niskim poziomie tlenu; wysiew komórek; mikroskopia; wzrost bakterii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat procedury hodowli T. pallidum in vitro. Rycina ta została przedrukowana za zgodą Edmondsona i Norrisa (2021)19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat systemu mieszania gazów z filtrem HEPA, manometrem próżniowym; przepływ CO2, N2 do układu z wentylowanym słoikiem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat systemu do równoważenia odczynników hodowli T. pallidum w środowisku o niskiej zawartości tlenu. Wylot słoika Brewera jest połączony za pomocą trójnika ze źródłem próżni (np. próżnią instalacyjną) oraz z butlami z niestandardowymi mieszankami gazów (5% CO2, reszta azot oraz 1,5% O2, 5% CO2, reszta azot). Przepływowy manometr próżniowy mierzy podciśnienie wytworzone w słoiku. W słoiku wytwarza się próżnię do około -58 kPa. Następnie opróżniony słoik jest powoli napełniany mieszankami gazów. Słoik Brewera jest napełniany trzykrotnie mieszanką 5% CO2, reszta azot przed końcowym odessaniem powietrza, a następnie napełniany mieszanką 95% N2, 5% CO2, 1,5% O2. Hodowle lub pożywki są następnie wyjmowane ze słoika i szybko przenoszone do inkubatora z niską zawartością tlenu. Alternatywnie, rurkę między słoikiem Brewera a pierwszym trójnikiem można szczelnie zacisnąć, odłączyć rurkę od trójnika i przenieść cały słoik Brewera do inkubatora w temperaturze 34 °C. Rycina ta została przedrukowana za zgodą Edmondsona i Norrisa (2021)19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy wzrostu i ruchliwości Treponema pallidum; dni hodowli w stosunku do liczby komórek i procenta ruchliwości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Krzywe wzrostu T. pallidum hodowanych z komórkami Sf1Ep w podłożu TpCM-2. Równoległe hodowle w trzech powtórzeniach zaszczepiono T. pallidum. Próbki z powtórzeń pobierano w każdym punkcie czasowym; wyniki przedstawiają średnią + SEM dla tych hodowli. (A) Przedstawiono zmiany liczby T. pallidum na hodowlę oraz (B) procent ruchliwości. Rycina została opracowana za zgodą Edmondsona i wsp.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzrost hodowli Treponema pallidum w ciągu 21 dni; wykres przedstawia przyrost bakterii w skali logarytmicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66880/66880fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4Przykład pasażowania in vitro hodowla *T. pallidum*szczep Nichols. Równolegle w trzech powtórzeniach wysiano hodowle z T. pallidum i pasażowano co tydzień, stosując rozcieńczenie 1:20. Wykres piłokształtny przedstawia liczbę T. pallidum na kulturę oraz liczba przeniesiona do nowych kultur w każdym punkcie czasowym. Wyniki przedstawiają średnią ± SEM dla trzech powtórzeń biologicznych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/66880fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Objętość medium i stosunki wysiewu dla naczyń hodowlanych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Pożywki do hodowli T. pallidum. Wszystkie pożywki po przygotowaniu należy wysterylizować przez filtrowanie. Pożywkę Sf1Ep można przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch miesięcy. Pożywkę TpCM-2 zazwyczaj przygotowuje się na jeden dzień przed użyciem. Pożywkę do dysocjacji należy podzielić na alikwoty i zamrozić. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66880/Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół opisuje hodowlę in vitro patogenu kiły Treponema pallidum subsp. pallidum w kokulturze z komórkami ssaków. Metoda jest skalowalna; może być stosowany do produkcji dużych ilości T. pallidum i do generowania kultur klonalnych.

Procedury hodowli in vitro Treponema pallidum, krętka kiły

For over a century, Treponema pallidum subsp. pallidum, the spiral-shaped bacterium that causes syphilis, could only be propagated by inoculation and ...

Wiele z naszych badań ma na celu lepsze zrozumienie metabolizmu T.pallidum. Zrozumienie wymagań dotyczących wzrostu kiły ułatwi tak wiele aspektów badań nad kiłą. Zrozumienie fizjologii, struktury, odporności gospodarza, wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe i być może ostatecznie może doprowadzić do opracowania nowych metod kontroli kiły.Jednym z naszych największych wyzwań jest obecność komórek ssaków w systemie hodowli. Jeśli uda nam się określić, jakie składniki odżywcze dostarczają komórki, możemy usunąć je z systemu i to go uprości. To pozwoliłoby nam nie mieć zanieczyszczonego DNA ani białka z komórek ssaków, co ułatwiłoby analizy eksperymentalne.Przez ponad 100 lat po początkowej izolacji T.pallidum rozmnażał się poprzez zakażenie królików. System hodowli in vitro pozwala uniknąć wykorzystywania zwierząt i jest bardziej opłacalny. Pozwala również na stosowanie technik takich jak inżynieria genetyczna, które nie byłyby możliwe w modelu zwierzęcym.Dostępność metody hodowli in vitro już znacznie zwiększyła liczbę grup badających Treponema pallidum. Doprowadziło to również do postępów, takich jak pierwsza mutageneza organizmu, a także wysokoprzepustowe badania przesiewowe antybiotyków dla antybiotyków przydatnych w leczeniu kiły. Hodowla in vitro utorowała drogę do szczegółowej analizy wymagań dotyczących wzrostu T. pallidum, funkcji genów i celów immunologicznych.Odpowiedzi na te pytania są trudne, jeśli nie niemożliwe, do skutecznego rozwiązania przy użyciu samego modelu królika. Mamy nadzieję, że te podejścia przyczynią się do poprawy diagnostyki, leczenia i zapobiegania kile. Oprócz naszych wysiłków na rzecz ulepszenia systemu hodowli in vitro, skupimy się na manipulacji genetycznej T. pallidum poprzez mutagenezę transpozonów.Mamy nadzieję, że uda nam się przeprowadzić funkcjonalne badanie przesiewowe na dużą skalę, aby zidentyfikować geny ważne w patogenezie T. pallidum. Na początek umieść świeżo przygotowane, wstępnie podgrzane podłoże komórkowe Sf1Ep i rozmrożone komórki Sf1Ep w fiolce kriogenicznej na platformie roboczej. Dodaj jeden mililitr pożywki komórkowej Sf1Ep do fiolki kriogenicznej i delikatnie wymieszaj.Przenieś mieszaninę do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów pożywki komórkowej Sf1Ep i delikatnie wymieszaj. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 100 g przez siedem minut i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 15 mililitrach świeżej pożywki komórkowej Sf1Ep. Przenieść zawiesinę komórkową do kolby do hodowli tkankowych T75 i umieścić ją w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych z nawilżaną masą tkankową na jeden tydzień.Po inkubacji odessać pożywkę z kolby i przepłukać warstwę komórkową pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Po zaessaniu PBS dodać 2,5 mililitra trypsyny-EDTA do kolby i uszczelnić nakrętkę. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.Delikatnie postukać w kolbę, aby usunąć komórki i obserwować pod odwróconym mikroskopem, aby potwierdzić rozproszenie komórek. Dodaj pięć mililitrów pożywki wzrostowej Sf1Ep i rozbujaj kolbę, aby wymieszać z trypsyną-EDTA. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki.I określ ilościowo komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Aby zamrozić komórki Sf1Ep, należy obracać komórki w temperaturze 100 g przez siedem minut i ponownie zawiesić osad w pożywce Sf1Ep uzupełnionej 10% DMSO. Rozprowadź jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej fiolki kriogenicznej i zamroź na noc w temperaturze od 70 do 80 stopni Celsjusza.Na początek umieść trypsynizowaną hodowlę komórkową Sf1Ep i sześciodołkową płytkę na platformie roboczej. Dodaj odpowiednią liczbę komórek Sf1Ep i pożywki Sf1Ep do każdego dołka płytki sześciodołkowej. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez noc.Połącz składniki TpCM-2 w sterylnym pojemniku, dodając ditiotreitol jako suchy proszek na końcu. Delikatnie wymieszaj i przefiltruj pożywkę za pomocą jednostki filtrującej o wielkości 0,22 mikrometra. Wstępnie zrównoważ pożywkę w słoiku beztlenowym, opróżnij komorę za pomocą próżni domowej i trzykrotnie napełnij mieszaniną 95% azotu i 5% dwutlenku węgla.Następnie napełnij 1,5% tlenu, 5% dwutlenkiem węgla i zrównoważ mieszaninę azotu gazowego. Szybko przenieś pożywkę do inkubatora trójgazowego ustawionego w temperaturze 34 stopni Celsjusza i inkubuj przez noc. Po całonocnej inkubacji usunąć pożywkę z kultury Sf1Ep i przepłukać komórki niewielką objętością wstępnie zrównoważonego TpCM-2.Po usunięciu płukania dodaj odpowiednią ilość TpCM-2 i zrównoważ płytkę w 1,5% tlenu, 5% dwutlenku węgla i zrównoważ atmosferę azotu w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez trzy do czterech godzin. Usunąć istniejącą kulturę T.pallidum z inkubatora o niskiej zawartości tlenu i zbadać warstwę komórek Sf1Ep w każdym studzience. Po zarejestrowaniu gęstości i wyglądu komórek, odpipetować pożywkę z każdej studzienki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Wypłucz każdą studzienkę 0,35 mililitra wstępnie ciepłej trypsyny-EDTA i dodaj płukanie do 15-mililitrowej probówki. Dodaj kolejne 0,35 mililitra trypsyny-EDTA do każdego dołka i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć komórki Sf1Ep z płytki i T.pallidum z komórek Sf1Ep. Po oderwaniu połącz zdysocjowane komórki T.pallidum i Sf1Ep z pożywką rezerwową zebraną w 15-mililitrowej stożkowej probówce i zapisz całkowitą objętość pobraną w celu obliczenia wydajności na kulturę.Zaszczepić wcześniej przygotowaną płytkę komórek Sf1Ep ustaloną objętością pobranego T.pallidum. Po wymianie atmosfery na płytce inkubować w temperaturze 34 stopni Celsjusza w słoiku zaparzacza lub w inkubatorze trójgazowym. Po zaszczepieniu użyj komory zliczającej Helber, aby policzyć T.pallidum pod mikroskopią w ciemnym polu.Dodać 50% glicerolu do końcowego stężenia 10% do kultury T.pallidum i rozprowadzić glicerol poprzez delikatne pipetowanie lub inwersję. Rozprowadzić preparat w porcjach o pojemności od jednego do dwóch mililitrów do zakręcanych fiolek zamrażarki i natychmiast umieścić fiolki w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza lub zamrażarce z ciekłym azotem. Przygotować i wstępnie zrównoważyć dwie 96-dołkowe płytki z 1 000 komórek Sf1Ep i 200 mikrolitrami TpCM-2 na dołek i inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowej.Następnego dnia zastąp pożywkę Sf1Ep TpCM-2, jak opisano wcześniej. Po oznaczeniu ilościowym rozcieńczyć T.pallidum w TpCM-2, aby otrzymać dwa preparaty o stężeniach 10 i 40 komórek na mililitr. Zaszczepić 50 mikrolitrów na studzienkę preparatu 10 T.pallidum na mililitr do jednej z przygotowanych 96-dołkowych płytek.W dwóch studzienkach kontrolnych na każdej płytce zaszczepić dwa razy 10 do potęgi trzech T.pallidum na mililitr rozcieńczenia. Zrównoważyć płytki z mieszaniną gazów o niskiej zawartości tlenu i inkubować je w słoiku browarniczym lub inkubatorze trójgazowym w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Siódmego dnia usuń połowę pożywki i zastąp ją świeżym, zrównoważonym TpCM-2.Po zidentyfikowaniu dołków dodatnich za pomocą mikroskopii ciemnego pola, trypsynizuj dołki dodatnie i przenieś zawiesinę komórek na wcześniej przygotowane płytki 24-dołkowe w celu dalszej ekspansji. T.pallidum zazwyczaj zachowuje ponad 90% ruchliwości i rozmnaża się logarytmicznie, z czasem podwojenia od 33 do 45 godzin przez około siedem dni przed wejściem w fazę stacjonarną. W ciągu tygodnia krętki przeszły około czterech do pięciu podwojeń.

procedures-for-vitro-cultivation-treponema-pallidum-syphilis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Eggers, C. H. Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje przygotowanie genetycznie zmodyfikowanej kultury Borrelia burgdorferi zmodyfikowanej z uśpionym DNA bakteriofaga przenoszącym gen oporności na antybiotyki. Po selekcji i inkubacji antybiotyków induktor chemiczny wyzwala uszkodzenie DNA, prowadząc do wycięcia, replikacji i złożenia nowych wirionów zawierających gen oporności. Po drugim odwirowaniu i...

Przygotowanie i indukcja kultur Borrelia burgdorferi do produkcji cząstek wirusa

Source: Berthold, A., et al. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp.(2022)This video demonstrates the cultivation of pathogenic spirochetes from infected skin tissue to model dermal infection. It highlights their localization in the dermis, interaction with the extracellular matrix, and survival during selective culture conditions.

Cultivation of Pathogenic Spirochetes to Investigate Skin Infection

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Ze względu na nieprzezroczystość gleby, interakcje między jej składowymi mikroorganizmami nie mogą być łatwo zobrazowane za pomocą rozdzielczości komórkowej. Zaprezentowano tu dwa narzędzia mikroprzepływowe, które dają nowe możliwości badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych. Urządzenia są wszechstronne i proste w użyciu, umożliwiając wysoką kontrolę czasoprzestrzenną i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości na poziomie komórkowym.

Narzędzia mikroprzepływowe do badania interakcji grzybowo-mikrobiologicznych na poziomie komórkowym

Zdolność bakteriofaga do przenoszenia DNA między komórkami bakteryjnymi czyni je skutecznymi narzędziami do genetycznej manipulacji ich bakteryjnych gospodarzy. Przedstawiono tutaj metodologię indukcji, odzyskiwania i wykorzystania φBB-1, bakteriofaga Borrelia burgdorferi, do transdukcji heterologicznego DNA między różnymi szczepami krętka boreliozy.

Manipulacja genetyczna krętka boreliozy Borrelia burgdorferi za pośrednictwem fagów

Hodowla in vitro to bezpośrednia metoda wykrywania obecności żywych bakterii. Protokół ten opisuje metody hodowli różnych krętków Borrelia, w tym tych z kompleksu Borrelia burgdorferi sensu lato, gatunków Borrelia z nawracającą gorączką i Borrelia miyamotoi. Gatunki te są wybredne i wolno rosnące, ale można je hodować.

Metody uprawy krętków z kompleksu Borrelia burgdorferi Sensu Lato i nawracającej gorączki Borrelia

Elektroporacja to szybka, szeroko stosowana metoda wprowadzania egzogennego DNA do rodzaju Rickettsia. Protokół ten zapewnia użyteczną metodę elektroporacji do transformacji obligatoryjnych bakterii wewnątrzkomórkowych w rodzaju Rickettsia.

Metoda elektroporacji do transformacji Rickettsia spp. za pomocą fluorescencyjnego wektora wahadłowego wyrażającego białko w liniach komórkowych kleszczy

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Niniejszy artykuł opisuje procedurę tworzenia i wizualizacji biofilmu bakteryjnego hodowanego w szkiełku przedmiotowym z komorą...

In vitro tworzenie biofilmu w szkiełku przedmiotowym z 8-komorowym układem

Opisujemy metodę in vitro hodowli schistosomul pasożytniczego płazińca Schistosoma mansoni, polegającą na pozyskiwaniu i transformacji zakaźnych cerkariów z pośredniego żywiciela – słodkowodnego ślimaka Biomphalaria glabrata.

Transformacja cerkarii i hodowla in vitro schistosomul Schistosoma mansoni

Poznaj metodę hodowli in vitro Treponema pallidum z komórkami ssaczymi Sf1Ep. Ta skalowalna technika umożliwia produkcję dużych ilości bakterii i generowanie kultur klonalnych do badań nad kiłą.

Procedury hodowli in vitro Treponema pallidum, krętka kiły

Przeglądaj więcej filmów