Procedury hodowli in vitro Treponema pallidum, krętka kiły

Wiele z naszych badań ma na celu lepsze zrozumienie metabolizmu T.pallidum. Zrozumienie wymagań dotyczących wzrostu kiły ułatwi tak wiele aspektów badań nad kiłą. Zrozumienie fizjologii, struktury, odporności gospodarza, wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe i być może ostatecznie może doprowadzić do opracowania nowych metod kontroli kiły.

Jednym z naszych największych wyzwań jest obecność komórek ssaków w systemie hodowli. Jeśli uda nam się określić, jakie składniki odżywcze dostarczają komórki, możemy usunąć je z systemu i to go uprości. To pozwoliłoby nam nie mieć zanieczyszczonego DNA ani białka z komórek ssaków, co ułatwiłoby analizy eksperymentalne.

Przez ponad 100 lat po początkowej izolacji T.pallidum rozmnażał się poprzez zakażenie królików. System hodowli in vitro pozwala uniknąć wykorzystywania zwierząt i jest bardziej opłacalny. Pozwala również na stosowanie technik takich jak inżynieria genetyczna, które nie byłyby możliwe w modelu zwierzęcym.

Dostępność metody hodowli in vitro już znacznie zwiększyła liczbę grup badających Treponema pallidum. Doprowadziło to również do postępów, takich jak pierwsza mutageneza organizmu, a także wysokoprzepustowe badania przesiewowe antybiotyków dla antybiotyków przydatnych w leczeniu kiły. Hodowla in vitro utorowała drogę do szczegółowej analizy wymagań dotyczących wzrostu T. pallidum, funkcji genów i celów immunologicznych.

Odpowiedzi na te pytania są trudne, jeśli nie niemożliwe, do skutecznego rozwiązania przy użyciu samego modelu królika. Mamy nadzieję, że te podejścia przyczynią się do poprawy diagnostyki, leczenia i zapobiegania kile. Oprócz naszych wysiłków na rzecz ulepszenia systemu hodowli in vitro, skupimy się na manipulacji genetycznej T. pallidum poprzez mutagenezę transpozonów.

Mamy nadzieję, że uda nam się przeprowadzić funkcjonalne badanie przesiewowe na dużą skalę, aby zidentyfikować geny ważne w patogenezie T. pallidum. Na początek umieść świeżo przygotowane, wstępnie podgrzane podłoże komórkowe Sf1Ep i rozmrożone komórki Sf1Ep w fiolce kriogenicznej na platformie roboczej. Dodaj jeden mililitr pożywki komórkowej Sf1Ep do fiolki kriogenicznej i delikatnie wymieszaj.

Przenieś mieszaninę do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów pożywki komórkowej Sf1Ep i delikatnie wymieszaj. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 100 g przez siedem minut i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 15 mililitrach świeżej pożywki komórkowej Sf1Ep. Przenieść zawiesinę komórkową do kolby do hodowli tkankowych T75 i umieścić ją w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych z nawilżaną masą tkankową na jeden tydzień.

Po inkubacji odessać pożywkę z kolby i przepłukać warstwę komórkową pięcioma mililitrami sterylnego PBS. Po zaessaniu PBS dodać 2,5 mililitra trypsyny-EDTA do kolby i uszczelnić nakrętkę. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Delikatnie postukać w kolbę, aby usunąć komórki i obserwować pod odwróconym mikroskopem, aby potwierdzić rozproszenie komórek. Dodaj pięć mililitrów pożywki wzrostowej Sf1Ep i rozbujaj kolbę, aby wymieszać z trypsyną-EDTA. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki.

I określ ilościowo komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Aby zamrozić komórki Sf1Ep, należy obracać komórki w temperaturze 100 g przez siedem minut i ponownie zawiesić osad w pożywce Sf1Ep uzupełnionej 10% DMSO. Rozprowadź jeden mililitr zawiesiny komórkowej do każdej fiolki kriogenicznej i zamroź na noc w temperaturze od 70 do 80 stopni Celsjusza.

Na początek umieść trypsynizowaną hodowlę komórkową Sf1Ep i sześciodołkową płytkę na platformie roboczej. Dodaj odpowiednią liczbę komórek Sf1Ep i pożywki Sf1Ep do każdego dołka płytki sześciodołkowej. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez noc.

Połącz składniki TpCM-2 w sterylnym pojemniku, dodając ditiotreitol jako suchy proszek na końcu. Delikatnie wymieszaj i przefiltruj pożywkę za pomocą jednostki filtrującej o wielkości 0,22 mikrometra. Wstępnie zrównoważ pożywkę w słoiku beztlenowym, opróżnij komorę za pomocą próżni domowej i trzykrotnie napełnij mieszaniną 95% azotu i 5% dwutlenku węgla.

Następnie napełnij 1,5% tlenu, 5% dwutlenkiem węgla i zrównoważ mieszaninę azotu gazowego. Szybko przenieś pożywkę do inkubatora trójgazowego ustawionego w temperaturze 34 stopni Celsjusza i inkubuj przez noc. Po całonocnej inkubacji usunąć pożywkę z kultury Sf1Ep i przepłukać komórki niewielką objętością wstępnie zrównoważonego TpCM-2.

Po usunięciu płukania dodaj odpowiednią ilość TpCM-2 i zrównoważ płytkę w 1,5% tlenu, 5% dwutlenku węgla i zrównoważ atmosferę azotu w temperaturze 34 stopni Celsjusza przez trzy do czterech godzin. Usunąć istniejącą kulturę T.pallidum z inkubatora o niskiej zawartości tlenu i zbadać warstwę komórek Sf1Ep w każdym studzience. Po zarejestrowaniu gęstości i wyglądu komórek, odpipetować pożywkę z każdej studzienki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Wypłucz każdą studzienkę 0,35 mililitra wstępnie ciepłej trypsyny-EDTA i dodaj płukanie do 15-mililitrowej probówki. Dodaj kolejne 0,35 mililitra trypsyny-EDTA do każdego dołka i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć komórki Sf1Ep z płytki i T.pallidum z komórek Sf1Ep. Po oderwaniu połącz zdysocjowane komórki T.pallidum i Sf1Ep z pożywką rezerwową zebraną w 15-mililitrowej stożkowej probówce i zapisz całkowitą objętość pobraną w celu obliczenia wydajności na kulturę.

Zaszczepić wcześniej przygotowaną płytkę komórek Sf1Ep ustaloną objętością pobranego T.pallidum. Po wymianie atmosfery na płytce inkubować w temperaturze 34 stopni Celsjusza w słoiku zaparzacza lub w inkubatorze trójgazowym. Po zaszczepieniu użyj komory zliczającej Helber, aby policzyć T.pallidum pod mikroskopią w ciemnym polu.

Dodać 50% glicerolu do końcowego stężenia 10% do kultury T.pallidum i rozprowadzić glicerol poprzez delikatne pipetowanie lub inwersję. Rozprowadzić preparat w porcjach o pojemności od jednego do dwóch mililitrów do zakręcanych fiolek zamrażarki i natychmiast umieścić fiolki w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza lub zamrażarce z ciekłym azotem. Przygotować i wstępnie zrównoważyć dwie 96-dołkowe płytki z 1 000 komórek Sf1Ep i 200 mikrolitrami TpCM-2 na dołek i inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowej.

Następnego dnia zastąp pożywkę Sf1Ep TpCM-2, jak opisano wcześniej. Po oznaczeniu ilościowym rozcieńczyć T.pallidum w TpCM-2, aby otrzymać dwa preparaty o stężeniach 10 i 40 komórek na mililitr. Zaszczepić 50 mikrolitrów na studzienkę preparatu 10 T.pallidum na mililitr do jednej z przygotowanych 96-dołkowych płytek.

W dwóch studzienkach kontrolnych na każdej płytce zaszczepić dwa razy 10 do potęgi trzech T.pallidum na mililitr rozcieńczenia. Zrównoważyć płytki z mieszaniną gazów o niskiej zawartości tlenu i inkubować je w słoiku browarniczym lub inkubatorze trójgazowym w temperaturze 34 stopni Celsjusza. Siódmego dnia usuń połowę pożywki i zastąp ją świeżym, zrównoważonym TpCM-2.

Po zidentyfikowaniu dołków dodatnich za pomocą mikroskopii ciemnego pola, trypsynizuj dołki dodatnie i przenieś zawiesinę komórek na wcześniej przygotowane płytki 24-dołkowe w celu dalszej ekspansji. T.pallidum zazwyczaj zachowuje ponad 90% ruchliwości i rozmnaża się logarytmicznie, z czasem podwojenia od 33 do 45 godzin przez około siedem dni przed wejściem w fazę stacjonarną. W ciągu tygodnia krętki przeszły około czterech do pięciu podwojeń.