Name: Demonstracja transportu błonowego histydyny za pomocą odwróconych worków jelitowych kóz: eksperymentalne narzędzie pedagogiczne dla studentów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: Poznaj metodę transportu histydyny przez błonę enterocytów w jelitach kóz z wykorzystaniem gradientu sodowego. To proste, tanie i powtarzalne narzędzie dydaktyczne umożliwia studentom zrozumienie transportu błonowego bez konieczności tradycyjnych sekcji zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte przez Wydział Biochemii, Sri Venkateswara College, University of Delhi. Autorzy dziękują personelowi laboratorium za wsparcie.

Cały protokół wraz ze wszystkimi krokami jest przedstawiony jako schemat ideowy w Rysunek 4. Metoda została zaadaptowana z poprzedniego badania z użyciem jelit szczurów8. Eksperyment został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Próbki użyte w tym badaniu zostały pozyskane od komercyjnego dostawcy.
UWAGA: Noś rękawiczki podczas tego eksperymentu.
1. Przygotowanie odwróconych worków Jejunum
<ol>
	<li>Wstępnie potraktuj i oczyść kozie jelito czcze.
	<ol>
		<li>Zaopatrz się w wnętrzności świeżo złożonej w ofierze zdrowej kozy od licencjonowanego sprzedawcy.</li>
		<li>Umieść wnętrzności w wystarczającej ilości 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS), tak aby były całkowicie zanurzone do czyszczenia.</li>
		<li>Oddziel jelito cienkie od jelita grubego i upewnij się, że zewnętrzna tkanka łączna została usunięta za pomocą nożyczek.</li>
		<li>Delikatnie przepłukać jelito cienkie 1x PBS za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, upewniając się o usunięciu niestrawionego materiału pokarmowego, aby uzyskać pustą torebkę jelita cienkiego. Powtórz ten proces co najmniej trzy razy, aby skutecznie oczyścić. 
		UWAGA: Unikaj używania nadmiernej siły lub igieł podczas spłukiwania. Użycie siły może spowodować przebicie ścian jelita, a tym samym uszkodzenie enterocytów jelitowych.</li>
		<li>Zmierz całkowitą długość jelita cienkiego za pomocą linijki, aby uzyskać trzy części: dwunastnicę (1/4 jelita cienkiego), a pozostałą część podzieloną równomiernie na jejunum i jelito kręte.</li>
		<li>Kontynuuj eksperyment, używając części Jejunum.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj odwrócone Jejunum.
	<ol>
		<li>Oczyść część jelita czczego, usuwając całą tkankę łączną za pomocą ostrza.</li>
		<li>Pokrój jelito czcze na porcje o długości 12-15 cm, umyj 1x PBS i umieść na szalce Petriego zawierającej PBS.</li>
		<li>Odwróć części jelita czczego za pomocą szklanego pręta, aby umożliwić odsłonięcie części kosmków na zewnątrz. 
		UWAGA: Unikaj używania szklanego pręta o ostrych krawędziach. Ponadto średnica pręta szklanego nie powinna być większa niż średnica worka. 
		UWAGA: W tym momencie można uwidocznić kosmki pod mikroskopem świetlnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
		<li>Delikatnie przepłucz odwrócone części jelita czczego 1x PBS.</li>
		<li>Sprawdź, czy nie ma wycieków z boków odwróconego jelita czczego.</li>
		<li>Pokrój odwrócone części jelita czczego na woreczki o długości 5 cm.</li>
		<li>Zawiąż jeden koniec sznurkiem i ponownie sprawdź, czy na zawiązanym końcu nie ma widocznych wycieków, wypełniając woreczki PBS.</li>
		<li>Zawiąż drugi koniec, aby utworzyć pusty odwrócony worek z kosmkami na zewnętrznej powierzchni.</li>
		<li>Ponownie sprawdź, czy nie ma wycieków zewnętrznych, poklepując odwrócony worek na bibule filtracyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrównoważ odwrócone woreczki w 1x PBS.
	<ol>
		<li>Kontynuuj eksperyment tego samego dnia lub przechowuj woreczki przez noc w 1x PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Eksperymentalna konfiguracja transportu histydyny
<ol>
	<li>Zebrać dwa zestawy po trzy probówki o pojemności 50 ml zgodnie z różnymi stężeniami chlorku sodu, jak podano w tabeli 1.</li>
	<li>Zanurz przygotowane worki jelitowe w określonych probówkach na 30 minut i 60 minut dla każdego z zestawów.</li>
	<li>Po upływie wyznaczonego czasu opróżnij roztwór z worka w oddzielnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i oznacz objętość.</li>
	<li>Zassać płyn do wnętrza woreczka za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml. Alternatywnie odwiąż jeden koniec woreczka i zbierz zawartość do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Oznaczyć 0,1 ml pobranych próbek do oszacowania histydyny i obliczyć stężenie przy użyciu wykresu wzorcowego.</li>
</ol>
3. Ocena histydyny za pomocą reakcji Pauly'ego
<ol>
	<li>Przygotuj krzywą wzorcową dla histydyny.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory o różnych stężeniach histydyny, jak wskazano w Tabeli 2, używając roztworów podstawowych histydyny (5 mM) i wody.</li>
		<li>Dodać kwas sulfanilowy (0,5 ml) i azotan sodu (0,5 ml) do każdej probówki.</li>
		<li>Inkubować probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać po 1 ml węglanu sodu i etanolu do każdej probówki.</li>
		<li>Inkubować probówki przez 20 minut w temperaturze pokojowej (~20 °C) i zanotować absorbancję przy długości fali 490 nm.</li>
		<li>Wykreślić standardową krzywą absorbancji w funkcji stężenia histydyny. 
		UWAGA: Ten test na histydynę opiera się na właściwości histydyny do tworzenia związku diazowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Sodium-Dependent Histidine Absorption in Goat Jejunal Inverted Sacs

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry.+7th+Edition%22">Lehninger Principles of Biochemistry. 7th Edition</a>. , W.H. Freeman and Company. (2017).</li>
<li>Stillwell, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStillwell%2C+W+%22Membrane+Transport.+An+Introduction+to+Biological+Membranes%22">Membrane Transport. An Introduction to Biological Membranes</a>. , Elsevier Science. (2013).</li>
<li>Fick, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+liquid+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+London%2C+Edinburgh%2C+and+Dublin+Philosophical+Magazine+and+Journal+of+Science%22%5BJournal%5D)">On liquid diffusion.</a> The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 10 (63), 30-39 (1855).</li>
<li>Sherwood, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherwood%2C+L+%22Introduction+to+Human+Physiology%22">Introduction to Human Physiology</a>. , Brooks/Cole Cengage Learning. (2013).</li>
<li>Bröer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+amino+acid+transport+and+metabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Intestinal amino acid transport and metabolic health.</a> Annu Rev Nutr. 43, 73-99 (2023).</li>
<li>Avissar, N. E., Ryan, C. K., Ganapathy, V., Sax, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-dependent+neutral+amino+acid+transporter+ATB0+is+a+rabbit+epithelial+cell+brush-border+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Na+-dependent neutral amino acid transporter ATB0 is a rabbit epithelial cell brush-border protein.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 281 (3), C963-C971 (2001).</li>
<li>Bröer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transport+across+mammalian+intestinal+and+renal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia.</a> Physiol Rev. 88 (1), 249-286 (2008).</li>
<li>Agar, W. T., Hird, F. J. R., Sidhu, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uptake+of+amino+acids+by+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The uptake of amino acids by the intestine.</a> BBA - Biochim Biophys Acta. 14 (1), 80-84 (1954).</li>
<li>Pauly, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+die+Konstitution+des+Histidins%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Mitteilung.+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Über die Konstitution des Histidins.</a> I. Mitteilung. Biological Chemistry. 42 (5-6), 508-518 (1904).</li>
<li>Wilson, T. H., Wiseman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+sacs+of+everted+small+intestine+for+the+study+of+the+transference+of+substances+from+the+mucosal+to+the+serosal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface.</a> J Physiol. 123 (1), 116-125 (1954).</li>
<li>Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+everted+gut+sac+as+a+simple+and+accurate+technique+to+measure+paracellular+transport+across+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine.</a> Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 23 (2), 313-323 (1998).</li>
<li>Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everted+gut+sac+model+as+a+tool+in+pharmaceutical+research%3A+Limitations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: Limitations and applications.</a> J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).</li>
<li>Pento, J. T., Mousissian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+deterioration+of+active+transport+in+duodenal+segments+of+rat+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Methods%22%5BJournal%5D)">Time-dependent deterioration of active transport in duodenal segments of rat intestine.</a> J Pharmacol Methods. 20 (1), 9-14 (1988).</li>
<li>Williams, L., Sembiante, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiential+learning+in+U.S.+undergraduate+teacher+preparation+programs%3A+A+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Teach+Teach+Educ%22%5BJournal%5D)">Experiential learning in U.S. undergraduate teacher preparation programs: A review of the literature.</a> Teach Teach Educ. 112, 103630(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Transport membranowy jest jednym z najbardziej podstawowych pojęć nauczanych studentom studiów licencjackich wszystkich głównych dyscyplin nauk biologicznych, podstawowych lub stosowanych. Tradycyjnie, ruch przez błony był wizualizowany przy użyciu metabolitów znakowanych izotopami promieniotwórczymi. Jednak metody te są niezwykle niebezpieczne i niewykonalne w nauczaniu lub uczeniu się. Chociaż uczenie się przez doświadczenie jest najlepszą techniką pedagogiczną do zrozumienia tak złożonych koncepcji, jest to wyzwanie, które jest dodatkowo potęgowane przez brak infrastruktury, drogie barwniki/metabolity na bazie fluorescencji i, co najważniejsze, zakaz eksperymentów z sekcjami na zwierzętach. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania narzędzi i alternatywnych metod, które są nie tylko bezpieczne, ale także niedrogie i wykonalne w warunkach laboratoryjnych na studiach licencjackich. W tym miejscu opracowano nowatorską metodę nauczania transportu membranowego dla studentów studiów licencjackich. Opisany protokół, adaptacja Agara i in. 19548, demonstruje jednokierunkowy aktywny transport błonowy histydyny przez komórki jelita koziego. Badanie to zostało podjęte w celu zademonstrowania zastosowania testu opartego na kolorymetrii do wizualizacji wchłaniania histydyny przez błony jelitowe. Jest prosty, powtarzalny i zrozumiały dla studentów i można go wykonać w dowolnym środowisku laboratoryjnym.
Model odwróconego worka jelitowego został po raz pierwszy opracowany przez Wilsona i Wisemana10, który później został ulepszony w celu zwiększenia żywotności tkanek. Mechanizmy i kinetyka wchłaniania leków zostały wyjaśnione za pomocą odwróconych worków jelitowych11. Do zalet tego modelu należy duża powierzchnia do absorpcji; Jednak żywotność tkanek jest jednym z parametrów ograniczających. Doniesiono, że tkanka jelitowa pozostaje żywotna i aktywna metabolicznie w warunkach fizjologicznych przez ~2 h11. Innym potencjalnym zastrzeżeniem tego podejścia, które należy wziąć pod uwagę, jest niemożność usunięcia błony śluzowej mięśni i błony surowiczej z preparatów odwróconego worka. Wiązanie niektórych związków z warstwą mięśniową może ograniczać lub niedocenić transport tych związków. Chociaż model odwróconego worka jelitowego jest zarówno wrażliwy, jak i specyficzny, na wyniki może wpływać wiele czynników. Niektóre takie czynniki obejmują wiek, płeć, gatunek, dietę i stan chorobowy zwierzęcia, a także segment jelita używany do analizy (jelito kręte, jejunum, dwunastnica i okrężnica). Czynniki środowiskowe, takie jak pH, napowietrzenie i temperatura, również wpłynęłyby na wyniki12.
Wykazano, że opóźnienie w pobraniu jelita i stan zwierzęcia (żywy/martwy) wpływa na aktywny transport w dwunastniczych odcinkach jelita szczura. Pobieranie próbek od znieczulonych zwierząt zapewnia minimalne opóźnienia czasowe, co pozwala uniknąć pogorszenia jakości transportera13. Jednak w świetle zakazu przeprowadzania sekcji zwłok zwierząt na uniwersytetach, w naszym zestawie doświadczalnym wykorzystano jelita świeżo ofiarowanych zwierząt. Chociaż protokół ten może być z powodzeniem stosowany do ustalenia jakościowego wychwytu metabolitu przez enterocyty, jego zastosowanie w badaniach dotyczących kinetyki transportu błonowego jest ograniczone. Najważniejszym etapem tego protokołu jest pomyślne przygotowanie szczelnych worków jelitowych z żywotnymi enterocytami. Delikatna natura i żywotność kosmków i enterocytów stanowią wyzwanie, któremu można sprostać dzięki praktyce. Ponadto, biorąc pod uwagę, że materiał wyjściowy nie pochodzi z żadnej wsobnej, syngenicznej populacji zwierząt, zmienność wyników między doświadczeniami jest istotną wadą. Problem ten można przezwyciężyć za pomocą wielu powtórzeń pochodzących od tego samego zwierzęcia. Mając na uwadze powyższe rozważania, metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu powinna być ściśle stosowana jako narzędzie pedagogiczne w praktycznym kształceniu na poziomie licencjackim.
Przedstawiony protokół został z powodzeniem wykorzystany do zademonstrowania transportu histydyny. Jednokierunkowy wychwyt zarówno sodu, jak i histydyny do odwróconych woreczków wskazuje na symportowy typ wtórnego transportu aktywnego. Wchłanianie jelitowe aminokwasów obojętnych odbywa się zgodnie z kinetyką wektorową, która zależy od gradientu stężeń ustawionego przez ATPazę Na+ K +. Podobny układ utrzymuje wewnątrzkomórkowy ujemny potencjał błonowy i zewnątrzkomórkowe stężenie sodu wynoszące 150 mM. Oba te czynniki napędzają aktywny transport obojętnych aminokwasów przez B0AT na końcu wierzchołkowym, a następnie ruch z enterocytów na końcu podstawno-bocznym przez LAT1. Co ciekawe, przy wyższych stężeniach soli (200 mM) nie było istotnej różnicy w absorpcji w funkcji czasu. W tym miejscu nie możemy komentować powodu takiej obserwacji; jednakże ten sam układ doświadczalny może zostać rozszerzony o wiele stężeń sodu ze zmiennymi punktami czasowymi i kontrole z 150 mM chlorku choliny, aby wykazać transport zależny od sodu i możliwy udział wynikający z nasycenia.
Zasadniczo, odwrócone pęcherzyki jelita czczego od kóz / świni / szczura / myszy mogą być wykorzystane do wykazania wchłaniania jelitowego różnych metabolitów dietetycznych, pod warunkiem, że istnieje test biochemiczny do oszacowania. Dodatkowo można również przeanalizować wpływ innych składników, które mogą potencjalnie zakłócać wchłanianie jelitowe lub inhibitory transportu błonowego. Odwrócone worki są skutecznie wykorzystywane jako narzędzie w badaniach farmaceutycznych do badania wchłaniania leków in vitro , metabolizmu jelitowego leków oraz roli transportera w wchłanianiu leków. Wreszcie, technika ta jest przykładem demonstracji ex vivo transportu błonowego i nie opiera się na ekstrakcie bezkomórkowym (in vitro), ale na próbce tkanki. Jednak ta zaleta jest równoważona przez dostępność niezakażonych jelit kóz/świń/szczurów, które mogą być czynnikiem ograniczającym.
Wśród wielu narzędzi pedagogicznych dostępnych dla nauczyciela w celu usprawnienia procesu uczenia się, uczenie się przez doświadczenie lub "uczenie się przez działanie" to filozofia i metodologia nauczania, która jest najbardziej postępową i skuteczną metodą nauczania, która daje uczniom możliwość uzyskania całościowego zrozumienia tematów wykładów. Uczenie się przez doświadczenie zapewnia praktyczne zaangażowanie uczniów, a także instruktora, który zapewnia wsparcie i mentoring podczas tego aktywnego procesu uczenia się14. Służy jako doskonała alternatywa dla tradycyjnego nauczania teoretycznego w klasie, szczególnie w przypadku niektórych ciężkich i integracyjnych koncepcji, takich jak transport membranowy, które uczniom często trudno jest sobie wyobrazić. Takie ćwiczenia zachęcałyby również do interaktywnego i opartego na współpracy uczenia się zarówno od rówieśników, jak i mentorów. Niniejsza inicjatywa jest krokiem naprzód w kierunku tworzenia i umożliwiania uczenia się, które jest nie tylko pouczające, ale także niezapomniane i może być transformujące dla ucznia, znacząco wpływając na ogólne doświadczenie uczenia się.

Komórki biologiczne są otoczone dwuwarstwą lipidową błony, która oddziela wewnątrzkomórkową cytozol od zawartości zewnątrzkomórkowej. Membrana służy jako półprzepuszczalna bariera, która reguluje ruch substancji rozpuszczonych1. Na transport przez błony biologiczne ma wpływ współczynnik przepuszczalności substancji rozpuszczonej, który zależy od kilku czynników, w tym stężenia i ładunku substancji rozpuszczonej. Ogólnie rzecz biorąc, substancje rozpuszczone przemieszczają się przez błonę za pomocą trzech mechanizmów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1): Dyfuzja pasywna, dyfuzja ułatwiona i transport aktywny2. Prosta dyfuzja to proces, w którym rozpuszczalne, nienaładowane i niepolarne substancje rozpuszczone przechodzą w dół gradientu stężeń przez półprzepuszczalną membranę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Białka błonowe nie pomagają w tym procesie, ponieważ obejmuje on przemieszczanie się substancji rozpuszczonych z obszaru o wyższym stężeniu do regionu o niższym stężeniu. Szybkość dyfuzji jest oparta na prawie Ficka3. Z drugiej strony, ułatwiona dyfuzja jest transportem zależnym od białka, w którym błona pozwala tylko selektywnym substancjom rozpuszczonym przechodzić wzdłuż gradientu stężeń bez wydatkowania energii (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Ten rodzaj transportu jest specyficzny i różni się od prostej dyfuzji kinetyką nasycenia.
Aktywny transport to zależny od białka transport cząsteczek w kierunku przeciwnym do ich gradientu stężenia, tj. z obszaru o niższym stężeniu do obszaru o wyższym stężeniu za pomocą ATP lub gradientów jonów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Kiedy transporter hydrolizuje ATP, transport ten jest określany jako pierwotny transport aktywny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C; lewy panel). Inną formą transportu aktywnego jest wtórny transport aktywny (Rysunek 1C; prawy panel). W wtórnym transporcie aktywnym substancje rozpuszczone są przemieszczane w oparciu o gradient elektrochemiczny. Ma to miejsce, gdy białko transportowe sprzęga ruch jonu (zwykle Na+) w dół jego gradientu stężeń z ruchem innej cząsteczki lub jonu w kierunku przeciwnym do jego gradientu stężenia. Ten rodzaj ruchu substancji rozpuszczonej może być kotransportem (Symport), w którym zarówno substancja rozpuszczona, jak i jon poruszają się w tym samym kierunku lub wymianą (antyport), w którym to przypadku substancja rozpuszczona i jon poruszają się w przeciwnych kierunkach.
Aminokwasy i monosacharydy z pożywienia są wchłaniane w jelicie cienkim. Jelito cienkie można funkcjonalnie podzielić na trzy segmenty: dwunastnicę, jelito kręte i jelito kręte (<silna klasa="xfig">Ryc. 2). Wchłanianie substancji rozpuszczonej zachodzi w całym jelicie cienkim, przy czym maksymalne wchłanianie zachodzi w jelicie czczym i na bliższym końcu jelita krętego. Enterocyty jelitowe są komórkami spolaryzowanymi, a ścisłe połączenia łączące dwie sąsiednie komórki tworzą dwa odrębne miejsca błony - podstawno-boczne i wierzchołkowe miejsce błony (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2). Absorpcja substancji rozpuszczonych w świetle generowanych przez trawienie zachodzi w miejscu błony wierzchołkowej4.
Transport histydyny w enterocytach jelitowych na błonie wierzchołkowej jest przykładem wtórnego aktywnego symportu, który jest zależny od sodu. Na końcu podstawno-bocznym histydyna wchodząca do enterocytów przesuwa się w dół gradientu stężeń do krążenia wrotnego wątroby. Wewnątrzkomórkowe stężenia sodu w enterocytach utrzymują się na poziomie 12 mmol/L1, czyli mniej niż stężenia zewnątrzkomórkowe/świetlne, ze względu na aktywne wypompowywanie sodu z komórki przez Na+ K + ATPazę znajdującą się na błonie podstawno-bocznej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Na błonie wierzchołkowej enterocytów B0AT i transporter aminokwasów obojętnych sodu (SNAT) 5 są głównymi transporterami, które nie tylko transportują histydynę, ale także aminokwasy, takie jak asparagina i glutamina, w kotransporcie zależnym od sodu5,6. Inne białko transportowe o nazwie Transporter Dużych Aminokwasów (LAT)1 obecne na błonie podstawno-bocznej enterocytów transportuje przez błonę duże neutralne aminokwasy, takie jak leucyna, tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina<klasa sup = "xref">7.
Mając na celu nauczanie koncepcji transportu membranowego zintegrowanej z technikami takimi jak spektrofotometria i rutynowe testy biochemiczne poprzez pedagogikę uczenia się przez doświadczenie, konieczne jest opracowanie metodologii, które mogą nie tylko zademonstrować koncepcję w łatwych do zrozumienia terminach, ale także umożliwić partycypacyjne uczenie się dla studentów studiów licencjackich. Obecnie studenci mają do dyspozycji ograniczone zasoby do praktycznego zaangażowania w naukę takich pojęć biochemii. W tym miejscu przedstawiamy prosty protokół demonstracji transportu histydyny przez błonę jelitową kozy, który jest łatwy do odtworzenia w laboratoriach licencjackich i może być dostosowany do oceny transportu innych metabolitów. Co ważniejsze, metoda wykorzystuje niedrogie materiały w laboratorium licencjackim, umożliwiając w ten sposób naukę przez doświadczenie nawet w najprostszych warunkach laboratoryjnych.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>TARSONS</td><td>500020</td><td></td></tr><tr><td>10 ml probówki</td><td>BOROSIL</td><td>9800U04</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylne probówki Falcon</td><td>TARSONS</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>500 ml zlewka</td><td>BOROSIL</td><td>10044977</td><td></td></tr><tr><td>500 ml kolba stożkowa</td><td>BOROSIL</td><td>691467</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SRL</td><td>42738</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy spektrofotometr</td><td>SYSTRONICS</td><td>2710</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMSURE</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>Finpipettes</td><td>THERMOFISHER</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>Szklany pręt mieszadła</td><td>BOROSIL</td><td>9850107</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna&nbsp;</td><td>SRL</td><td>17849</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe</td><td>KIMTECH</td><td>112-4847</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego&nbsp;</td><td>TARSONS</td><td>460090</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (pH 7,4)</td><td>SRL</td><td>95131</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>ABDOS</td><td>P10102</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>SRL</td><td>89382</td><td></td></tr><tr><td>Azotan sodu&nbsp;</td><td>SRL</td><td>44618</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (bezwodny)</td><td>SRL</td><td>53046</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy (bezwodny)</td><td>SRL</td><td>22249</td><td></td></tr><tr><td>Kwas sulfanilowy&nbsp;</td><td>Zobacz materiał SRL</td><td>15354</td><td></td></tr></tbody></table>

demonstracja transportu błonowego histydyny za pomocą odwróconych worków jelitowych kóz: eksperymentalne narzędzie pedagogiczne dla studentów

Demonstration of Membrane Transport of Histidine using Goat Intestinal Inverted Sacs: An Experiential Pedagogical Tool for Undergraduates

Histydyna jest niezbędnym aminokwasem, który jest również prekursorem metabolitów związanych z układem odpornościowym, wentylacją płuc i krążeniem naczyniowym. Wchłanianie histydyny w diecie opiera się w dużej mierze na sprzężonym z sodem transporcie aminokwasów obojętnych przez transporter aminokwasów obojętnych (B, 0AT) obecny na błonie wierzchołkowej enterocytów. Tutaj pokazujemy wchłanianie histydyny przez enterocyty kosmków jelitowych ze światła za pomocą odwróconych worków jelita czczego kóz. Pęcherzyki jelita czczego wystawione na działanie różnych stężeń sodu i histydyny oznaczono w celu określenia stężenia histydyny wewnątrz worków w funkcji czasu. Wyniki wskazują na aktywne wchłanianie histydyny. Zwiększenie stężenia soli skutkowało wyższym wchłanianiem histydyny, co sugeruje symuls wchłaniania sodu i histydyny w odwróconych workach jelitowych kóz. Protokół ten może być stosowany do wizualizacji ruchliwości jelitowej aminokwasów lub innych metabolitów z odpowiednimi modyfikacjami. Proponujemy ten eksperyment jako empiryczne narzędzie pedagogiczne, które może pomóc studentom studiów licencjackich zrozumieć koncepcję transportu membranowego.

Schemat doświadczenia służący do wykazania mobilności jelitowej histydyny poprzez wchłanianie histydyny przez kosmki jelitowe do światła wyewersyjnych worków przedstawiono na Rysunku 4, w Tabeli 1 oraz Tabeli 2. Przeprowadzono trzy niezależne układy doświadczalne, a reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunku 6.
W podanych warunkach doświadczalnych oznaczenie histydyny z wykorzystaniem reakcji Pauliego wykazywało zgodność z prawem Lamberta-Beera do stężenia 300 µM (Ryc. 6A). Ten test na obecność histydyny opiera się na sprzęganiu aminokwasów z jonem diazoniowym zawartym w odczynniku. Odczynnik Pauliego zawiera kwas sulfanilowy rozpuszczony w stężonym kwasie solnym. Kwas ten ulega diazotyzacji w obecności azotanu sodu i HCl. Sól diazoniowa, p-fenylo-diazosulfonian, reaguje z cząsteczkami histydyny w warunkach zasadowych, tworząc kompleks o barwie od ciemnoczerwonej/pomarańczowej do żółtej, który można odczytać spektrofotometrycznie przy 490 nm (Ryc. 5)9. Należy zauważyć, że test ten daje wynik dodatni dla histydyny i tyrozyny. Metoda zastosowana w niniejszym badaniu jest nieco zmodyfikowaną wersją oryginalnej reakcji, w której azotan sodu jest stosowany bezpośrednio w temperaturze pokojowej (~20 °C), zamiast stosowania azotynu sodu w warunkach chłodzenia9.
Dodatnia reakcja Pauliego zaobserwowana w próbce pobranej z wnętrza wyewersyjnych worków ilustruje wchłanianie histydyny przez kosmki jelitowe. Rysunek 6B pokazuje korelację pomiędzy pobieraniem histydyny a stężeniem sodu w enterocytach jelita czczego. Wzrost wchłaniania histydyny wraz z wydłużeniem czasu inkubacji z 30 do 60 min wskazuje na wtórny transport aktywny.
<img alt="Transport przez błonę komórkową: dyfuzja pasywna, dyfuzja ułatwiona, transport aktywny - schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Różne rodzaje transportu błonowego. Schemat przedstawiający różne rodzaje systemów transportu błonowego. (A) Dyfuzja pasywna. (B) Dyfuzja ułatwiona. (C) Pierwotny transport aktywny (lewa strona) oraz wtórny transport aktywny (prawa strona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat budowy jelita cienkiego; mikrokosmkowie, enterocyty, transport substancji rozpuszczonych, szlaki Na+/K+ ATPase." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Organizacja enterocytów w kosmkach jelitowych. Rysunek ten koncentruje się na jelicie cienkim i przedstawia trzy jego odrębne części, tj. dwunastnicę, jelito cienkie (część środkowa) oraz jelito kręte. Jelito cienkie posiada ponadto wypustki w kształcie palców zwane kosmkami, które zwiększają powierzchnię wchłaniania spożytego pokarmu. Mikrokosmkowie posiadają komórki zwane enterocytami, które zawierają specyficzne transportery odpowiedzialne za wchłanianie aminokwasów. Złącza ścisłe zapobiegają przemieszczaniu się substancji rozpuszczonych pomiędzy komórkami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat transportu aminokwasów przez błonę komórkową; szlaki B^0AT, SNAT5, LAT1; funkcja Na^+/K^+ ATPase." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Enterocyt z transporterami aminokwasów. Schemat przedstawia pojedynczy enterocyt z zaznaczonym konieckiem apikalnym i basolateralnym. Koniec apikalny posiada transportery takie jak białka B0AT oraz SNAT5, natomiast błona basolateralna zawiera transporter LAT1. Białka te wspólnie odpowiadają za transport histydyny z światła jelita do krążenia wrotnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przygotowanie jelita cienkiego (ciekłego) kozy, przemywanie PBS, widok mikrokosmków, ustawienie eksperymentu transportu histydyny, analiza w probówkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Schematyczna prezentacja protokołu obrazującego transport błonowy histydyny z wykorzystaniem wyewersyjnych worków z jelita kozy. Jelita kozy zostały pozyskane, wstępnie potraktowane i oczyszczone zgodnie z opisem. W skrócie, wycięto jelito cienkie (ciekłe) i przygotowano wyewersyjne worki. Worki te wykorzystano do ustawienia eksperymentu w celu ilościowego oznaczenia wychwytu histydyny przy różnych stężeniach soli. Kosmki oglądano przy powiększeniu 400x za pomocą mikroskopu świetlnego. Szczegółowa procedura opisana jest w tekście. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat syntezy barwnika azowego przedstawiający tworzenie soli diazoniowej i reakcję z histydyną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reakcja w metodzie Pauliego. Test Pauliego polega na tworzeniu jonów diazoniowych w odczynniku zawierającym kwas sulfanilowy w stężonym kwasie solnym. W warunkach zasadowych histydyna reaguje z solą diazoniową, co prowadzi do powstania czerwonego związku, którego absorbancję można zmierzyć przy 490 nm za pomocą spektrofotometru. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza absorbancji: stężenie histydyny w funkcji czasu inkubacji, wpływ NaCl; wykresy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Oznaczanie histydyny metodą Pauliego. (A) Krzywa wzorcowa dla histydyny. Różne stężenia histydyny w zakresie 0-300 μM poddano reakcji Pauliego, a utworzony kompleks zmierzono przy długości fali 490 nm. (B) Transport histydyny w workach jelitowych monitorowano przez 30 min i 60 min w obecności 150 mM (czarna linia ciągła) i 200 mM NaCl (szara linia ciągła) roztworu soli. Stężenie histydyny wewnątrz wywiniętych worków oszacowano przy użyciu krzywej wzorcowej (Rycina 6A). Wartości przedstawiono w stosunku do kontroli (0 mM NaCl). Wykonano trzy powtórzenia techniczne, a zaprezentowano dane reprezentatywne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Układ eksperymentalny dla ruchliwości jelitowej histydyny. Tabela ta przedstawia inkubację worków jelitowych w różnych stężeniach chlorku sodu w dwóch punktach czasowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Przygotowanie krzywej wzorcowej dla histydyny.Tabela ta przedstawia poszczególne kroki i składniki reakcji Pauliego z zastosowaniem znanych stężeń histydyny w zakresie od 0-300 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/Table%202.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj przedstawiamy niedrogą i powtarzalną metodę demonstrującą transport błonowy histydyny w jelicie kozy. Proces ten zachodzi poprzez kotransport jonów histydyny i sodu, co jest możliwe dzięki gradientowi sodu przez błonę enterocytów. Metoda ta wykorzystuje pedagogikę uczenia się przez doświadczenie, aby lepiej zrozumieć ruch substancji rozpuszczonej przez błony biologiczne.

Demonstracja transportu błonowego histydyny za pomocą odwróconych worków jelitowych kóz: eksperymentalne narzędzie pedagogiczne dla studentów

Histidine is an essential amino acid that is also a precursor for metabolites implicated in the immune system, pulmonary ventilation, and vascular ...

Tutaj proponujemy narzędzie pedagogiczne dla studentów biologii na studiach licencjackich, w którym demonstrujemy koncepcję transportu błonowego. To, co tutaj robimy, ma na celu pokazanie transportu histydyny, która jest aminokwasem przez błonę enterocytów w prostych, łatwych do wykonania, niedrogich warunkach eksperymentalnych, które można przeprowadzić w prawie każdym laboratorium. Obecnym wyzwaniem, przed którym stoimy w laboratorium licencjackim, jest zakaz, który został nałożony na sekcje zwierząt.Z tego powodu to, co tutaj robimy, to zaopatrywanie się w jelita od zwykłego dostawcy. A jelita, które dostajemy, mają jednak problem, ponieważ nie pochodzą od zwierząt syngenicznych. W związku z tym istniałaby zmienność w próbkach zwierzęcych, które otrzymujemy.Tak więc obecnie nie ma prostych i łatwych do wykonania eksperymentów, które mogłyby ułatwić poznanie pojęć transportu błonowego. Większość dostępnych metod wykorzystuje niebezpieczne chemikalia, które nie są możliwe do nauczania w środowisku UG. Tak więc ta technika demonstruje konfigurację XVIVO, która nie opiera się na ekstraktach bezkomórkowych, ale na próbce tkanki, która może pochodzić z różnych dostępnych źródeł ssaków, więc to jest oczywista zaleta naszej metody.Na początek umieść wnętrzności kóz w PBS tak, aby były całkowicie zanurzone w celu czyszczenia. Oddziel jelito cienkie od jelita grubego. Za pomocą nożyczek usuń zewnętrzną tkankę łączną.Delikatnie przepłucz jelito cienkie PBS za pomocą 10-mililitrowej strzykawki, aby usunąć niestrawiony materiał pokarmowy i uzyskać pustą torebkę jelita cienkiego. Za pomocą linijki zmierz całą długość jelita cienkiego. Podziel jelito na trzy części, dwunastnicę, a pozostałą część równo na jelito czcze i jelito kręte.Za pomocą ostrza usuń całą tkankę łączną, aby oczyścić jelito czcze. Pokrój jelito czcze na porcje o długości od 12 do 15 centymetrów. Po umyciu porcji PBS umieścić je na szalce Petriego zawierającej PBS.Za pomocą szklanego pręta odwróć części jelita czczego, aby odsłonić kosmki na zewnątrz. Delikatnie przepłucz odwrócone porcje jelita czczego PBS. Sprawdź, czy nie ma wycieków z boków odwróconego jelita czczego.Następnie pokrój odwrócone części jelita czczego na woreczki o długości pięciu centymetrów. Zawiąż jeden koniec każdego worka sznurkiem. Napełnij worek PBS, aby ponownie sprawdzić, czy nie ma wycieków wizualnych.Zawiąż drugi koniec woreczków, aby utworzyć puste odwrócone woreczki z kosmkami na zewnętrznej powierzchni. Poklep odwrócony worek na bibule filtracyjnej, aby ponownie sprawdzić, czy nie ma wycieków zewnętrznych. Aby rozpocząć, złóż dwa zestawy po trzy 50-mililitrowe rurki o różnych stężeniach chlorku sodu.Zanurz przygotowane woreczki jelitowe w określonych probówkach na 30 minut i 60 minut na każdy zestaw. Po wyznaczonym czasie opróżnij roztwór wewnątrz woreczka w osobnej mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i określ objętość. Za pomocą dwumililitrowej strzykawki odessać płyn do worka.Aby utworzyć krzywą standardową dla histydyny, przygotuj roztwory o różnych stężeniach histydyny, używając roztworów podstawowych histydyny i wody. Następnie dodaj kwas sulfanilowy i azotan sodu do każdej probówki. Po inkubacji probówek przez pięć minut w temperaturze pokojowej dodaj jeden mililitr węglanu sodu i etanolu do każdej probówki.Na koniec zmierz absorbancję przy długości fali 490 nanometrów. Oszacowanie histydyny za pomocą reakcji poli było zgodne z prawem Lamberta-Beera do 300 mikromolowców histydyny. Zaobserwowano korelację między wychwytem histaminy a stężeniem sodu w enterocytach jelita czczego.

demonstration-membrane-transport-histidine-using-goat-intestinal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Komórki Caco-2 mogą służyć jako model in vitro do badania transportu lipidów przez enterocyty oraz rozpuszczalnych w tłuszczach leków/witamin. Przepuszczalny system błonowy oddziela przedział wierzchołkowy od podstawno-bocznego, podczas gdy system ekspresji lentiwirusa oferuje skuteczną metodę nadekspresji genów. Izolacja lipoprotein jest potwierdzona przez TEM.

Wykorzystanie komórek Caco-2 do badania transportu lipidów przez jelito

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Opisujemy proste metody badania regulacji funkcji i ekspresji transportera serotoniny w jelitach (SERT) za pomocą modelu hodowli in vitro komórek Caco-2 hodowanych w 3D oraz modelu ex vivo jelit myszy. Metody te mają zastosowanie do badania innych transporterów nabłonkowych.

Metody badania funkcji i ekspresji białek transportu nabłonkowego w natywnych komórkach jelitowych i Caco-2 hodowanych w 3D

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Nabłonek jelitowy zapewnia nie tylko wchłanianie składników odżywczych, ale także ochronę przed szkodliwymi substancjami. Najbardziej wierzchołkowo-nabłonkowe połączenie międzykomórkowe, czyli połączenie ścisłe, reguluje przepuszczalność substancji rozpuszczonej i jonów parakomórkowych. W tym miejscu opisano protokół przygotowania arkuszy błony śluzowej oraz oceny selektywności jonowej połączeń ścisłych techniką komory usingowej.

Funkcjonalna ocena bariery połączeń ścisłych jelit i przepuszczalności jonów w tkance natywnej techniką komory ussingowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący hodowlę organoidów jelitowych psów w dwukomorowym, przepuszczalnym systemie wsparcia. Opisano wysiewanie organoidów w przepuszczalnych podporach, utrzymanie monowarstwy i późniejsze eksperymenty z przepuszczalnością leków.

Organoidy jelitowe psów w dwukomorowym przepuszczalnym systemie nośnym

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

Endocytowy i retrogradacyjny transport białek z błony plazmatycznej do sieci trans-Golgiego jest niezbędny do utrzymania homeostazy błony i regulacji sygnalizacji. Tutaj opisujemy metodę obrazowania i ilościowego transportu endocytarnego białek transbłonowych za pomocą mikroskopii komórek żywych, wykorzystując deriwatyzowane nanociała anty-GFP w komórkach HeLa.

Obrazowanie transportu endocytarnego na żywych komórkach z wykorzystaniem funkcjonalizowanych nanociał w hodowanych komórkach

W tym artykule opisano: (1) dostarczanie cząsteczek testowych do noworodków już od DOL 6; oraz (2) ocenę ex vivo funkcji bariery nabłonkowej okrężnicy w biopsjach od DOL 10 do młodych odstawianych od odstawienia (DOL 20) poprzez ocenę przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej za pomocą komór Ussinga.

Oralna gavacja u noworodkowych myszy i funkcjonalna ocena integralności bariery jelitowej za pomocą komór

Poznaj metodę transportu histydyny przez błonę enterocytów w jelitach kóz z wykorzystaniem gradientu sodowego. To proste, tanie i powtarzalne narzędzie dydaktyczne umożliwia studentom zrozumienie transportu błonowego bez konieczności tradycyjnych sekcji zwierząt.

Demonstracja transportu błonowego histydyny za pomocą odwróconych worków jelitowych kóz: eksperymentalne narzędzie pedagogiczne dla studentów (Wideo) | JoVE Journal

Demonstracja transportu błonowego histydyny za pomocą odwróconych worków jelitowych kóz: eksperymentalne narzędzie pedagogiczne dla studentów

Przeglądaj więcej filmów