Name: Kwantyfikacja poziomu 8-oxo-dG za pomocą testu ELISA do oceny oksydacyjnych uszkodzeń DNA w komórkach MCF-7 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Naucz się kwantyfikować 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 za pomocą testu ELISA, oceniając oksydacyjne uszkodzenia DNA indukowane nadtlenkiem wodoru. Ta metoda oferuje wrażliwe i efektywne podejście do badań nad stresem oksydacyjnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Innowacyjny Zespół Badawczy ds. Nauki i Technologii Instytucji Szkolnictwa Wyższego Jiangsu (2021), Program Centrum Badań nad Technologią Inżynieryjną Jiangsu Vocational College (2023), Kluczowy Program Technologiczny Projektów Technologicznych Ludności Suzhou (SKY2021029), Otwarty Projekt Biobanku Zasobów Klinicznych Jiangsu (TC2021B009), Projekt Państwowego Kluczowego Laboratorium Medycyny Radiacyjnej i Ochrony, Uniwersytet Soochow (GZK12023013), programy Wyższej Szkoły Zdrowia Zawodowego w Suzhou (SZWZYTD202201) oraz projekt Qing-Lan w prowincji Jiangsu w Chinach (2021, 2022).

1. Budowamodelu oksydacyjnego uszkodzenia DNA indukowanego przezH2O2 w komórkach MCF-7
<ol>
	<li>Odzyskiwanie komórek MCF-7
	<ol>
		<li>Szybko przenieś probówkę kriogeniczną do hodowli komórkowych, która zawiera 3,5 x 106 komórek MCF-7 i jest przechowywana w lodówce o temperaturze -80°C, do pojemnika piankowego zawierającego ciekły azot. Wyjmij probówkę za pomocą kleszczy i umieść ją w łaźni wodnej o stałej temperaturze 37 °C na około 1 minutę w celu rozmrożenia zakonserwowanych komórek. 
		UWAGA: Podczas procesu rozmrażania w łaźni wodnej należy co jakiś czas potrząsać komórkami, aby zapewnić równomierne ogrzewanie kriowialu.</li>
		<li>Umieścić kriowial w wirówce i odwirowywać w temperaturze pokojowej przy 150 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Za pomocą pipety usunąć supernatant z probówki do przechowywania kriogenicznego i dodać 1 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Dobrze wymieszać i przenieść do naczynia hodowlanego o średnicy 10 mm, uzupełnić dodatkowe 7 ml kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Wstrząsnąć naczyniem hodowlanym na krzyż, aby zapewnić równomierne wymieszanie, i przeprowadzić hodowlę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		UWAGA: Kompletna pożywka hodowlana składa się z pożywki hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną i streptomycyną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena żywotności komórek
	<ol>
		<li>Wybierz komórki MCF-7 w logarytmicznej fazie wzrostu o dobrym statusie komórkowym do eksperymentu. Podczas logarytmicznej fazy wzrostu komórki zazwyczaj wykazują krótszy cykl podziału i wysoką częstotliwość podziałów komórkowych.
		<ol>
			<li>Obserwuj morfologię i tempo wzrostu komórek MCF za pomocą mikroskopu elektronowego. Kiedy komórki mają jednolitą i gęsto upakowaną morfologię jednowarstwową, a proliferacja komórek jest oczywista, można stwierdzić, że komórki są zasadniczo w logarytmicznej fazie wzrostu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Mycie komórek: Za pomocą pipety usuń pożywkę hodowlaną z naczynia hodowlanego, dodaj 1 ml buforu PBS, aby umyć komórki, a następnie wyrzuć PBS.</li>
		<li>Odwarstwienie komórek: Dodaj 1 ml trypsyny, aby umyć komórki, odczekaj około 1 minuty, aż trypsyna całkowicie oderwie komórki od naczynia hodowlanego. Delikatnie postukaj w naczynie hodowlane; Obserwacja ruchu komórek 
		w arkuszach wskazuje na dokładne oderwanie komórki.</li>
		<li>Zakończenie odrywania komórek i zliczania komórek: Dodać 8 ml kompletnej pożywki hodowlanej, aby zakończyć odłączanie, delikatnie pipetować komórki i określać stężenie zawiesiny komórek za pomocą urządzenia do liczenia komórek. 
		UWAGA: Upewnij się, że zawiesina komórek jest jednorodna przed liczeniem, delikatnie pipetując w górę iw dół.</li>
		<li>Wysiew komórek: Dostosuj rozcieńczoną zawiesinę komórek, aby uzyskać gęstość komórek 5 000 komórek na 100 μl. Zaszczepij zawiesinę komórek do 21 dołków 96-dołkowej płytki za pomocą pistoletu do pipet, dozując 100 μl do każdej studzienki. Dodać 100 μl buforu PBS do otaczających studzienek z nasionami, aby zapobiec nadmiernemu parowaniu pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Przygotowanie pożywki zawierającejH2O2: Wybierz 9 dołków na 12-dołkowej płytce do hodowli komórkowej i przypisz etykiety na podstawie gradientu stężeńH2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 mM). Dodać 720 μl kompletnej pożywki do studzienek oznaczonych jako 2,0 mM i 1,5 mM i dodać 360 μl kompletnej pożywki do pozostałych studzienek.
		<ol>
			<li>Za pomocą pipety dozować 1,63 μl i 1,22 μl odczynnika 3% H2O2 do studzienek oznaczonych odpowiednio jako 2,0 mM i 1,5 mM. Dokładnie wymieszaj roztwór. Za pomocą pipety przenieść 360 μl 2,0 mM H2O2 do dobrze oznaczonego 1,0 mM i wymieszać; następnie przenieść 360 μl 1,0 mM H2O2 do dobrze oznaczonego 0,5 mM i wymieszać; i na koniec przenieś 360 μL 0,5 mM H2O2 do dobrze oznaczonego 0,25 mM. Odpipetować 360 μl 1,5 mM H2O2 do dobrze oznaczonego 0,75 mM w celu rozcieńczenia i osiągnięcia pożądanego stężenia. (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
			UWAGA: Upewnij się, że roztwór podstawowyH2O2w pipecie został całkowicie przeniesiony do studzienek, aby uniknąć pozostałości roztworu. Zapewnić dokładne wymieszanie roztworów przed przystąpieniem do rozcieńczania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubacja: Po około 24 godzinach wysiewu komórek za pomocą pipety usunąć pożywkę hodowlaną z płytki 96-dołkowej, gdy komórki przylgną do powierzchni. Zgodnie z gradientem stężeń dodać odpowiednie podłoże zawierające H2O2 do każdej studzienki. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na 12 godzin.</li>
		<li>Dodanie odczynnika CCK-8: Po wyznaczonym 12-godzinnym okresie poddawania działaniu substancji należy użyć pipety do usunięcia pożywki hodowlanej z płytki 96-dołkowej, dodać 100 μl kompletnej pożywki hodowlanej i 10 μl odczynnika CCK-8 do każdego dołka i dołączyć trzy ślepe studzienki kontrolne. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godz 
		UWAGA: Podczas procesu dodawania próbek należy unikać tworzenia się pęcherzyków, aby zapobiec zakłóceniom w odczycie wartości OD.</li>
		<li>Pomiar absorbancji: Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora, zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek i zapisać wyniki.</li>
		<li>Zgodnie ze wzorem obliczeniowym IC50, 
		wskaźnik inhibicji (%) = (OD grupy eksperymentalnej leku-średnia OD otworu kontrolnego leku)/ (średnia OD otworu kontrolnego komórki-średnia OD otworu kontrolnego leku) x 100% 
		Obliczyć wyniki jako procent absorbancji w kulturach kontrolnych.</li>
		<li>Zaimportuj przetworzone dane eksperymentalne do oprogramowania do analizy statystycznej, wybierz typ analizy Regresja nieliniowa, skonstruuj czteroparametrowy model logistyczny i przejdź do kliknięcia przycisku Dopasuj krzywą, aby dopasować krzywą. Po zakończeniu procesu dopasowania oprogramowanie automatycznie obliczy wartość IC50.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperyment z utlenianiem komórek MCF-7 indukowany przezH2O2
	<ol>
		<li>Pobierz komórki MCF-7 w logarytmicznej fazie wzrostu z dobrym statusem komórek do eksperymentów.</li>
		<li>Umyj, wykonaj odłączanie komórek, zakończ odłączanie i policz komórki (szczegółowe metody znajdują się w kroku 1.2).</li>
		<li>Wysiew komórek: Dostosuj gęstość zawiesiny komórek do 1 x 106 komórek na naczynie, z 4 ml zawiesiny na naczynie o średnicy 6 cm.</li>
		<li>Oznacz dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 5 ml jako 0.25 mM i 0.75 mM 3% H2O2 . Dodać 4 ml kompletnej pożywki do każdej probówki, a następnie dodać odpowiednio 1,13 μl i 3,40 μl 3% H2O2 . Delikatnie potrząśnij probówkami, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Zastąp pożywkę hodowlaną w trzech szalkach kompletną pożywką zawierającąH2O2o stężeniach 0, 0,25 i 0,75 mM.</li>
		<li>Inkubuj kultury: Włóż naczynia do inkubatora na 12 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek komórkowych i przygotowanie odczynników ELISA
<ol>
	<li>Pobieranie próbek ekstraktów komórkowych
	<ol>
		<li>Pobieranie próbek: Odrzuć supernatant hodowli komórkowej MCF-7, przepłucz, wykonaj odłączanie komórek, zakończ odłączanie i zbieraj komórki. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Wirowanie: Wirować przy 800 x g przez 5 minut, aby zebrać osad komórkowy. Dodaj 200 μl PBS, aby ponownie zawiesić każdą próbkę komórkową i rozbić komórki poprzez powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania. Odwirować lizat komórkowy przy stężeniu 1 500 x g przez 10 minut i za pomocą pipety zebrać supernatant do analizy. 
		UWAGA: Gdy ilość komórek jest niska, zmniejsz objętość PBS używanej do ponownego wymieszania. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, jeżeli natychmiastowa analiza nie jest możliwa. W przypadku długotrwałego przechowywania należy podzielić próbki na porcje w oparciu o ilości jednorazowego użytku i przechowywać je w temperaturze -80 °C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynników ELISA
	<ol>
		<li>Rozmrażanie odczynników: Pozwól, aby odczynniki ELISA, w tym folie uszczelniające, wstępnie powlekane płytki, wzorce, rozcieńczalnik do próbek, przeciwciało wykrywające-HRP, substrat chromogenowy, roztwór zatrzymujący, skoncentrowany bufor do przemywania (20x) i próbki testowe osiągnęły temperaturę pokojową (18-25 °C) przez 20 minut przed rozpoczęciem testu. Otwórz czytnik ELISA na 15 minut przed użyciem.</li>
		<li>Przygotowanie buforu do płukania: Obliczyć wymaganą objętość rozcieńczonego buforu do płukania, a następnie rozcieńczyć 20x skoncentrowany bufor do płukania wodą destylowaną lub dejonizowaną do 1x roztworu roboczego. Niewykorzystany skoncentrowany bufor do płukania należy włożyć z powrotem do lodówki o temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Bufor do mycia powinien być przygotowany świeży przed użyciem. Jeśli kryształy są obecne w skoncentrowanym buforze do płukania przechowywanym w lodówce, pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową i delikatnie potrząśnij, aż kryształy całkowicie się rozpuszczą przed użyciem.</li>
		<li>Przygotowanie wzorca
		<ol>
			<li>Przygotować roztwory robocze próbek wzorcowych o stężeniach odpowiednio 1,25, 2,5, 5, 10, 20 i 40 ng/ml. Aby zapewnić dokładność wyników eksperymentalnych, przed użyciem należy ostrożnie wymieszać próbki wzorcowe w górę i w dół, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków podczas procesu rozpuszczania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Eksperyment ELISA
<ol>
	<li>Powlekanie płytek: Zaprojektuj z wyprzedzeniem całkowitą liczbę dołków dla wzorców, próbek i ślepej próby/kontroli i wyjmij wymagane paski płyty. Dodać 50 μl wzorcowego roztworu roboczego i próbki detekcyjne o różnych stężeniach do dołków reakcyjnych. Wykonaj wzorce w trzech egzemplarzach i powstrzymaj się od dodawania jakichkolwiek próbek do studzienek ślepych/kontrolnych25. 
	UWAGA: Etapy eksperymentalne testu ELISA są pokazane schematycznie w <silna klasa="xfig">Rysunek 2. Jeżeli stężenie próbki przekracza zakres wykrywania, przed pobraniem próbki należy ją rozcieńczyć rozcieńczalnikiem. Podczas dodawania próbek dodaj je na dno płytki, unikając dotykania ścianek studzienki, delikatnie potrząśnij, aby wymieszać i unikaj tworzenia się pęcherzyków. Aby zapewnić dokładność eksperymentu, każde dodawanie próbki powinno zostać zakończone w ciągu 10 minut.</li>
	<li>Inkubacja: Z wyjątkiem studzienek ślepych, do każdej studzienki reakcyjnej dodać 100 μl przeciwciała detekcyjnego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), uszczelnić studzienki uszczelką płytkową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut w inkubatorze o stałej temperaturze.</li>
	<li>Mycie: Wylać płyn, strząsnąć płyn z dołków płytkowych, osuszyć na bibułę chłonną, dodać 350 μl buforu do każdej studzienki reakcyjnej, odstawić na 1-2 minuty, a następnie wyrzucić bufor do płukania. Powtórz proces prania 5x. 
	UWAGA: Dokładne mycie ma kluczowe znaczenie, ponieważ bezpośrednio wpływa na dokładność wyników eksperymentów. Upewnij się, że bufor do mycia jest całkowicie strząśnięty po każdym praniu. Po umyciu ostrożnie zetrzyj wszelkie pozostałości na dnie płytki, aby uniknąć wpływu na pomiar absorbancji.</li>
	<li>Reakcja barwna: Dodać 50 μl substratu A i 50 μl substratu B do każdej studzienki reakcyjnej, uszczelnić płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 15 min. 
	UWAGA: Po dodaniu odczynnika barwiącego należy niezwłocznie obserwować zmianę koloru w studzienkach reakcyjnych. Jeśli kolor jest zbyt ciemny, dodaj roztwór zatrzymujący, aby wcześniej zakończyć reakcję.</li>
	<li>Zakończyć reakcję i zmierzyć absorbancję: Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego do każdego dołka reakcyjnego i natychmiast zmierzyć wartość OD przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika ELISA (w ciągu 15 minut).</li>
	<li>Analiza danych: Zaimportuj przetworzone dane eksperymentalne do oprogramowania do analizy statystycznej, wybierz typ analizy Regresja liniowa. Skonstruuj krzywą kalibracyjną, wykreślając stężenie wzorców na osi X w stosunku do wartości gęstości optycznej (OD) na osi Y. Wykorzystać ustaloną krzywą kalibracyjną, aby ustalić stężenie 8-oxo-dG obecnego w próbkach. Skonstruuj model matematyczny Logistic i przejdź do kliknięcia przycisku Dopasuj krzywą, aby dopasować krzywą. Po zakończeniu procesu dopasowania oprogramowanie automatycznie oblicza krzywą standardową i wartość P. 
	UWAGA: Krzywa standardowa nie może być ponownie użyta i musi być wyznaczana na nowo dla każdego eksperymentu.</li>
</ol>

Determining the Degree of DNA Oxidative Damage in MCF-7 Cells

<ol><li>Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+DNA+damage%3A+Mechanisms%2C+mutation%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease.</a> Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).</li>
<li>Dizdaroglu, M., Jaruga, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+free+radical-induced+damage+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of free radical-induced damage to DNA.</a> Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).</li>
<li>Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P., Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+repair+of+oxidatively+generated+damage+in+cellular+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA.</a> Free Radic Biol Med. 107, 13-34 (2017).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Jaruga, P., Dizdaroglu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+products+of+oxidative+DNA+base+damage+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Repair of products of oxidative DNA base damage in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 24 (8), 1389-1394 (1996).</li>
<li>Fleming, A. M., Burrows, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+ROS-mediated+oxidation+to+the+guanine+base+in+DNA+and+its+biological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemistry of ROS-mediated oxidation to the guanine base in DNA and its biological consequences.</a> Int J Radiat Biol. 98 (3), 452-460 (2022).</li>
<li>Delaney, S., Jarem, D. A., Volle, C. B., Yennie, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+consequences+of+oxidatively+damaged+guanine+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological consequences of oxidatively damaged guanine in DNA.</a> Free Radic Res. 46 (4), 420-441 (2012).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+and+longitudinal+associations+of+acrolein+exposure+with+pulmonary+function+alteration%3A+Assessing+the+potential+roles+of+oxidative+DNA+damage%2C+inflammation%2C+and+pulmonary+epithelium+injury+in+a+general+adult+population%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional and longitudinal associations of acrolein exposure with pulmonary function alteration: Assessing the potential roles of oxidative DNA damage, inflammation, and pulmonary epithelium injury in a general adult population.</a> Environ Int. 167, 107401(2022).</li>
<li>Chiorcea-Paquim, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-oxoguanine+and+8-oxodeoxyguanosine+biomarkers+of+oxidative+DNA+damage%3A+A+review+on+HPLC-ECD+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">8-oxoguanine and 8-oxodeoxyguanosine biomarkers of oxidative DNA damage: A review on HPLC-ECD determination.</a> Molecules. 27 (5), (2022).</li>
<li>He, L., Liu, X. L., Zhang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+urinary+6-sulfatoxymelatonin+and+8-hydroxy-2%27-deoxyguanosine+using+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of urinary 6-sulfatoxymelatonin and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1095, 119-126 (2018).</li>
<li>Lam, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+8-oxo-7%2C8-dihydro-2%27-deoxyguanosine+in+human+biological+matrices+using+ultra-high-performance+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in human biological matrices using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Free Radic Biol Med. 52 (10), 2057-2063 (2012).</li>
<li>Machella, N., Regoli, F., Santella, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+detection+of+8-oxo-DG+and+pah+bulky+adducts+in+fish+liver+and+mussel+digestive+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent detection of 8-oxo-DG and pah bulky adducts in fish liver and mussel digestive gland.</a> Aquat Toxicol. 71 (4), 335-343 (2005).</li>
<li>An, N., Fleming, A. M., White, H. S., Burrows, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+detection+of+8-oxoguanine+in+the+human+telomere+repeat+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence.</a> ACS Nano. 9 (4), 4296-4307 (2015).</li>
<li>Xiao, S., Fleming, A. M., Burrows, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+for+oxidative+DNA+damage+at+single-nucleotide+resolution+with+click-code-seq+v2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Sequencing for oxidative DNA damage at single-nucleotide resolution with click-code-seq v2.0.</a> Chem Commun (Camb). 59 (58), 8997-9000 (2023).</li>
<li>Kong, W., Ji, Y., Zhu, X., Dai, X., You, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+chemical+labeling-based+biosensing+assay+for+rapid+detection+of+8-oxoguanine+and+its+repair+in+vitro+and+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+J+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and application of a chemical labeling-based biosensing assay for rapid detection of 8-oxoguanine and its repair in vitro and in human cells.</a> Chinese J Chem. 40 (19), 2329-2334 (2022).</li>
<li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29.+Quantitative+assay+of+immunoglobulin+g%5BTitle%5D)+AND+%22Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin g.</a> Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li>
<li>Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Immunoassays+in+DNA+damage+and+instability+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Review: Immunoassays in DNA damage and instability detection.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4689-4704 (2019).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> J Invest Dermatol. 133 (9), e12(2013).</li>
<li>Ahirwar, R., Bhattacharya, A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+underpinnings+of+various+non-conventional+ELISA+variants%3A+A+review+article%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Unveiling the underpinnings of various non-conventional ELISA variants: A review article.</a> Expert Rev Mol Diagn. 22 (7), 761-774 (2022).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+nanochains-based+dynamic+elisa+for+rapid+and+ultrasensitive+detection+of+acute+myocardial+infarction+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Magnetic nanochains-based dynamic elisa for rapid and ultrasensitive detection of acute myocardial infarction biomarkers.</a> Anal Chim Acta. 1166, 338567(2021).</li>
<li>Tabatabaei, M. S., Islam, R., Ahmed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+gold+nanoparticles+in+ELISA%2C+PCR%2C+and+immuno-pcr+assays%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Applications of gold nanoparticles in ELISA, PCR, and immuno-pcr assays: A review.</a> Anal Chim Acta. 1143, 250-266 (2021).</li>
<li>Berlina, A. N., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+lateral+flow+immunoassay+for+the+detection+of+food+colorants%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">ELISA and lateral flow immunoassay for the detection of food colorants: State of the art.</a> Crit Rev Anal Chem. 49 (3), 209-223 (2019).</li>
<li>Amber, K. T., Bloom, R., Hertl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+with+pooled+analysis+of+clinical+presentation+and+immunodiagnostic+testing+in+mucous+membrane+pemphigoid%3A+Association+of+anti-laminin-332+IGG+with+oropharyngeal+involvement+and+the+usefulness+of+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Eur+Acad+Dermatol+Venereol%22%5BJournal%5D)">A systematic review with pooled analysis of clinical presentation and immunodiagnostic testing in mucous membrane pemphigoid: Association of anti-laminin-332 IGG with oropharyngeal involvement and the usefulness of ELISA.</a> J Eur Acad Dermatol Venereol. 30 (1), 72-77 (2016).</li>
<li>Gervay, J., Mcreynolds, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+elisa+technology+to+measure+biological+activities+of+carbohydrates+relevant+in+disease+status%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Utilization of elisa technology to measure biological activities of carbohydrates relevant in disease status.</a> Curr Med Chem. 6 (2), 129-153 (1999).</li>
<li>Tabatabaei, M. S., Ahmed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).</a> Methods Mol Biol. 2508, 115-134 (2022).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Hayrapetyan, H., Tran, T., Tellez-Corrales, E., Madiraju, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay%3A+Types+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay: Types and applications.</a> Methods Mol Biol. 2612, 1-17 (2023).</li>
<li>Eldahshoury, M. K., Hurley, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+sandwich+ELISA+to+detect+the+adulteration+of+human+breast+milk+by+cow+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct sandwich ELISA to detect the adulteration of human breast milk by cow milk.</a> J Dairy Sci. 106 (9), 5908-5915 (2023).</li>
<li>Tsumuraya, T., Hirama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+designed+synthetic+haptens+to+generate+anti-ciguatoxin+monoclonal+antibodies%2C+and+development+of+a+practical+sandwich+ELISA+to+detect+ciguatoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Rationally designed synthetic haptens to generate anti-ciguatoxin monoclonal antibodies, and development of a practical sandwich ELISA to detect ciguatoxins.</a> Toxins (Basel). 11 (9), 533(2019).</li>
<li>Ito, E., Iha, K., Yoshimura, T., Nakaishi, K., Watabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnosis+with+ultrasensitive+elisa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Early diagnosis with ultrasensitive elisa).</a> Adv Clin Chem. 101, 121-133 (2021).</li>
<li>Larsson, P., Parris, T. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+cell+viability+assays+for+drug+sensitivity+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of cell viability assays for drug sensitivity screens.</a> Methods Mol Biol. 2644, 287-302 (2023).</li>
<li>Gunawardana, C. G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+proteomic+strategies+for+identifying+tumour-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">High throughput proteomic strategies for identifying tumour-associated antigens.</a> Cancer Lett. 249 (1), 110-119 (2007).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+das-ELISA+for+gyrovirus+homsa1+prevalence+survey+in+chickens+and+wild+birds+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of a das-ELISA for gyrovirus homsa1 prevalence survey in chickens and wild birds in China.</a> Vet Sci. 10 (5), 312(2023).</li>
<li>Li, Y., Sun, J., Shang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hogg1+expression+level+on+oxidative+DNA+damage+among+workers+exposed+to+nickel+in+stainless+steel+production+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Lao+Dong+Wei+Sheng+Zhi+Ye+Bing+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Effect of hogg1 expression level on oxidative DNA damage among workers exposed to nickel in stainless steel production environment.</a> Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 32 (8), 578-581 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Rozwój metod ELISA ma ogromne znaczenie zarówno dla istniejących, jak i nowych metodologii wykrywania uszkodzeń DNA. W porównaniu z tradycyjnymi technikami HPLC i spektrometrii mas, podejście to jest nie tylko przyjazne dla użytkownika, ale także wykazuje wysoką czułość i spełnia wymagania wysokoprzepustowych badań przesiewowych30. Umożliwia to monitorowanie 8-oxo-dG w badaniach przesiewowych chorób na dużą skalę, ułatwiając głębsze zrozumienie korelacji między tym biomarkerem a różnymi chorobami.
Podczas procedur doświadczalnych niezbędnych jest kilka krytycznych etapów w celu zapewnienia wiarygodności i odtwarzalności wyników. Początkowo eksperyment biegle ocenił wrażliwość komórek MCF-7 naH2O2, z wartością IC 50 wynoszącą 0,7655 mM po 12 godzinach, podkreślając poziom tolerancji komórek MCF-7. Wynik ten ma ogromne znaczenie naukowe dla zrozumienia antyoksydacyjnych mechanizmów obronnych komórek MCF-7 i ich przetrwania w stresie oksydacyjnym, zapewniając jednocześnie ważny wskaźnik referencyjny dla przyszłych badań przesiewowych leków przeciwutleniających lub powiązanych mechanizmów leczenia31. Ponadto selekcja i parowanie przeciwciał 8-oxo-dG ma zasadnicze znaczenie dla wykrywania testu ELISA i bezpośrednio wpływa na swoistość i czułość systemu wykrywania ELISA. Ponadto optymalizacja strategii wzmacniania sygnału i etapów przetwarzania próbki to ważne czynniki wpływające na dokładność detekcji. Odkryliśmy, że zastosowanie stabilnego systemu reakcji substratowej może zmniejszyć błędy tła i zwiększyć zakres czułości wykrywania.
Podczas procesu eksperymentalnego mogą wystąpić problemy techniczne, takie jak niestabilne przeciwciała, fluktuacje sygnału i reaktywność krzyżowa reagentów. Aby rozwiązać te problemy, przyjęliśmy bardziej stabilny protokół eksperymentalny, który obejmował zastosowanie stabilnych rozpuszczalników przeciwciał w celu poprawy stabilności przeciwciał oraz optymalizacji i dostosowania warunków eksperymentalnych. Dodatkowo, aby rozwiązać problem błędu spowodowanego fluktuacjami sygnału, ustandaryzowaliśmy eksperyment przy użyciu standardowych próbek 8-oxo-dG, aby zapewnić spójność wyników.
Jeśli chodzi o ograniczenia metody eksperymentalnej, chociaż ELISA zapewnia podejście wysokoprzepustowe, może być nadal ograniczony przez specyficzne pokrycie przeciwciałami i nieuniknioną reaktywność krzyżową substratu32. W związku z tym w przypadku próbek złożonych mogą być wymagane dodatkowe etapy oczyszczania lub przetwarzania wstępnego. Co więcej, wykrycie próbek o niższych stężeniach może wymagać dalszej optymalizacji aktywności przeciwciał, aby spełnić wymagania badawcze.
Podsumowując, metoda wykrywania ELISA dla 8-oxo-dG ma ważne implikacje dla konkretnych obszarów badawczych. Ma potencjalną wartość aplikacyjną w monitorowaniu środowiska, ocenie ryzyka chorób i wczesnej diagnostyce oraz zapewnia nowe podejście do wykrywania 8-oxo-dG w rolnictwie, bezpieczeństwie żywności i badaniach przesiewowych leków33. Na przykład w biomonitoringu środowiska wykrywanie stresu związanego z uszkodzeniem oksydacyjnym DNA wywołanego przez toksyny środowiskowe w organizmach może pomóc w identyfikacji potencjalnych zagrożeń w odpowiednim czasie34. Oczekuje się, że w przyszłości, wraz z dalszą optymalizacją technologii wykrywania i jej zastosowaniem w wielu dyscyplinach, metoda ta będzie odgrywać bardziej krytyczną rolę w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych.

Uszkodzenie oksydacyjne DNA jest konsekwencją braku równowagi między generacją reaktywnych form tlenu (ROS) a komórkowym systemem obrony antyoksydacyjnej1. Polega przede wszystkim na utlenianiu zasad DNA, purynowych i pirymidynowych2,3. Ta oksydacyjna modyfikacja zasad DNA nie tylko zagraża integralności genomu, ale także obejmuje szeroki zakres problemów patologicznych, w tym raka, choroby neurodegeneracyjne i choroby sercowo-naczyniowe4,5. Baza guaninowa w DNA ma najniższy potencjał redukcyjny i jest najbardziej podatna na utlenianie6. Dlatego 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyna (8-oxo-dG) służy jako podstawowy marker do oceny stopnia uszkodzenia oksydacyjnego DNA7,8. Dokładna kwantyfikacja 8-oxo-dG stała się kluczową kwestią w odniesieniu do różnych aspektów występowania choroby, progresji i oceny wieloczynnikowego obciążenia oksydacyjnego9.
Tradycyjne metody wykrywania 8-oxo-dG, takie jak wysokosprawna chromatografia cieczowa z detekcją elektrochemiczną (HPLC-ECD), spektrometria mas i pokrewne techniki z łącznikami, wykazują wysoką czułość i specyficzność10,11,12. Jednak techniki te często wiążą się ze złożonymi wymaganiami operacyjnymi i wysokimi kosztami, co utrudnia ich szerokie zastosowanie i praktyczność w wysokoprzepustowej analizie próbek. Wraz z ciągłym postępem nauki i technologii pojawiło się wiele nowych, wydajnych i dokładnych metod. Zastosowanie tych nowych technologii umożliwia nam dokładniejsze ilościowe określenie poziomu 8-oxo-dG i zapewnia bardziej zaawansowane narzędzia do dogłębnego badania związku między stresem oksydacyjnym a chorobami. Na przykład naukowcy zastosowali technologię nanoporów do ilościowego wykrywania i sekwencjonowania DNA13, identyfikowania typów uszkodzeń DNA za pomocą strategii sekwencjonowania kodu jednym kliknięciem14, opracowywania metod sekwencjonowania o wysokiej przepustowości i tworzenia bioczujników opartych na 8-oxoG poprzez integrację biotyny-streptawidyny z ELISA15. Wśród nich test ELISA, ze swoimi uznanymi zaletami pod względem swoistości, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i kosztów, jest jednym z idealnych rozwiązań do wykrywania 8-oxo-dG. Dlatego tak ważne jest opracowanie wysokoprzepustowej, wysoce czułej, wygodnej i szybkiej metody wykrywania 8-oxo-dG.
Technika testu immunoenzymatycznego (ELISA), opracowana w 1971 roku16, szybko się rozwinęła w ciągu ostatnich 50 lat i stała się obecnie jedną z najczęściej stosowanych metod wykrywania w dziedzinie biologii i medycyny17,18,19. Technologia ELISA charakteryzuje się wysoką czułością i swoistością, krótkim czasem reakcji i jest łatwa w użyciu, co czyni ją powszechnie uznawanym wyborem do badań próbek na dużą skalę i analizy o wysokiej przepustowości20. W rezultacie, test ELISA jest szeroko stosowany do ilościowej lub półilościowej analizy związków, białek, przeciwciał lub cząsteczek w komórkach21,22,23. Na przykład został wykorzystany do wykrywania biomarkerów związanych z różnymi chorobami, pozostałościami leków i biomolekułami24. Testy ELISA można podzielić na cztery główne typy w oparciu o projekt eksperymentalny i zasady25. Metody te obejmują bezpośredni test ELISA, pośredni test ELISA, test ELISA typu sandwich oraz konkurencyjny test ELISA26,27. Spośród nich do badania w tym artykule wybrano test ELISA, który wykorzystuje dwa specyficzne przeciwciała, jedno do wychwytywania cząsteczki docelowej, a drugie do wykrywania. Zasada eksperymentalna testu ELISA typu sandwich jest następująca: Po pierwsze, specyficzne przeciwciało jest unieruchamiane w studzienkach mikropłytki w celu wychwycenia interesującego analitu. Po dodaniu wzorca lub próbki docelowy analit wiąże się z unieruchomionym przeciwciałem. Następnie dodaje się znakowane przeciwciało, które rozpoznaje inny epitop na antygenie, tworząc strukturę kanapkową. Po usunięciu niezwiązanych przeciwciał dodaje się substrat. Pod katalitycznym działaniem przeciwciała wtórnego zachodzi reakcja barwna, a intensywność koloru jest dodatnio skorelowana ze stężeniem docelowego analitu w próbce. Na koniec zmierzono gęstość optyczną (OD) w celu określenia stężenia próbki. Test Sandwich ELISA ma zalety zwiększonej czułości i swoistości dla próbek docelowych, dzięki czemu nadaje się do wykrywania niskich stężeń docelowych analitów i próbek złożonych28. Dodatkowo uzyskane wyniki można określić ilościowo w celu dalszej analizy. Czynniki te sprawiają, że test ELISA typu sandwich jest powszechnie stosowaną metodą wykrywania zarówno w badaniach naukowych, jak i laboratoriach klinicznych29.
To badanie miało na celu ilościowe wykrycie 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 w celu określenia stopnia uszkodzenia oksydacyjnego DNA w komórkach. Badanie to składa się z dwóch głównych części: skonstruowania modelu uszkodzenia oksydacyjnego DNA komórki MCF-7 oraz wykrycia 8-oxo-dG za pomocą testu ELISA. Po pierwsze, komórki MCF-7 hodowano in vitro i traktowano różnymi stężeniamiH2O2przez różny czas. Żywotność komórek oceniano za pomocą testu CCK-8 w celu określenia połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50)H2O2w komórkach MCF-7. Na podstawie wartości IC50 wybrano odpowiedni czas zabieguH2O2i stężenie indukcyjne. Aby wyekstrahować próbki komórek MCF-7 uszkodzonych przez utlenianie, uzyskano próbki komórek i supernatanty i dodano je do dołków połączonych enzymatycznie wcześniej pokrytych przeciwciałami 8-oxo-dG. 8-oxo-dG obecny w próbce zwiąże się z przeciwciałami związanymi z nośnikiem w fazie stałej. Następnie dodano przeciwciała 8-oxo-dG znakowane peroksydazą chrzanową. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w stałej temperaturze, aby zapewnić całkowite związanie próbki i przeciwciała. Niezwiązany enzym usunięto przez mycie, a następnie dodano substrat kolorymetryczny, który uzyskał niebieski kolor. Pod działaniem kwasu roztwór zmienił kolor na żółty. Ostatecznie wartość OD próbek studzienki reakcyjnej zmierzono przy 450 nm, a stężenie 8-oxo-dG w próbce było proporcjonalne do wartości OD. Generując krzywą wzorcową, można obliczyć stężenie 8-oxo-dG w próbce.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA(1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek-8</td> Płytka do liczenia komórek <td>Dojindo</td><td></td> CK04 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Inkubator</td> CO2 Thermo 51032872 DMEM basic(1X)Gibco C11995500BT FBS PAN <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>ST30-3302</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism X9</td><td>Oprogramowanie GraphPad Oprogramowanie</td><td></td> do <td>analizy statystycznej</td></tr><tr><td>wirówka szybkoobrotowa</td><td>Termo</td><td>&nbsp; 9AQ2861</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki zestaw ELISA 8-oxo-dG</td><td>Pipety Zcibio</td><td>ZC-55410</td><td></td></tr><tr><td>L-1000XLS+</td> Pipety <td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>L-20XLS+</td><td>Zbiornik</td><td></td> ciekłego azotu 17014392 <td></td></tr><tr><td></td><td>Rainin Mvecryoge</td><td>YDS-175-216</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 CELL</td><td>BNCC</td><td>BNCC100137</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytkowy fotometr Multiskan FC</td><td>Thermo</td><td>1410101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PBS Solarbio</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100X</td><td>Beyotime</td><td>C0222</td><td></td></tr><tr><td>Trójokularowy mikroskop żywych komórek</td><td>Motic</td><td>1.1001E+12</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka ultraniskotemperaturowa</td><td>Haire</td><td>V118574</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja poziomu 8-oxo-dg za pomocą testu elisa do oceny oksydacyjnych uszkodzeń dna w komórkach mcf-7

Quantifying the Level of 8-oxo-dG Using ELISA Assay to Evaluate Oxidative DNA Damage in MCF-7 Cells

zasada 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxo-dG) jest dominującą formą powszechnie obserwowanego uszkodzenia oksydacyjnego DNA. Upośledzenie DNA głęboko wpływa na ekspresję genów i służy jako kluczowy czynnik stymulujący zaburzenia neurodegeneracyjne, raka i starzenie się. W związku z tym precyzyjna kwantyfikacja 8-oxoG ma znaczenie kliniczne w badaniach nad metodologiami wykrywania uszkodzeń DNA. Jednak obecnie istniejące podejścia do wykrywania 8-oxoG stanowią wyzwanie pod względem wygody, celowości, przystępności cenowej i zwiększonej czułości. Zastosowaliśmy technikę testu immunoenzymatycznego sprzężonego z enzymem kanapkowym (ELISA), wysoce wydajną i szybką metodę kolorymetryczną, do wykrycia zmian w zawartości 8-okso-dG w próbkach komórek MCF-7 stymulowanych różnymi stężeniami nadtlenku wodoru (H2O2). Określiliśmy stężenieH2O2, które indukowało uszkodzenie oksydacyjne w komórkach MCF-7, wykrywając jego wartość IC 50 w komórkach MCF-7. Następnie potraktowaliśmy komórki MCF-7 0, 0,25 i 0,75 mM H2O2 przez 12 godzin i wyekstrahowaliśmy 8-oxo-dG z komórek. Na koniec próbki poddano testowi ELISA. Po wykonaniu szeregu etapów, w tym rozprowadzania płytki, mycia, inkubacji, opracowywania koloru, zakończenia reakcji i zbierania danych, z powodzeniem wykryliśmy zmiany w zawartości 8-okso-dG w komórkach MCF-7 indukowane przezH2O2. Dzięki takim wysiłkom dążymy do ustalenia metody oceny stopnia uszkodzeń oksydacyjnych DNA w próbkach komórkowych, a tym samym do przyspieszenia rozwoju bardziej celowych i wygodnych podejść do wykrywania uszkodzeń DNA. Przedsięwzięcie to może wnieść znaczący wkład w eksplorację analiz asocjacyjnych między uszkodzeniami oksydacyjnymi DNA a różnymi dziedzinami, w tym badaniami klinicznymi nad chorobami i wykrywaniem substancji toksycznych.

Jak zilustrowano na Rysunku 3, oś X oznacza stężenie H2O2 zastosowane do komórek MCF-7, natomiast oś Y wskazuje żywotność komórek. Traktowanie stężeniem 0,75 mM przez 12 h zmniejszyło żywotność komórek MCF-7 do 67%. Wraz ze wzrostem stężenia odnotowano istotny spadek żywotności komórek MCF-7, szczególnie przy stężeniu 1,5 mM, gdzie żywotność spadła poniżej 3% (Tabela 1). Wyniki eksperymentalne sugerują wartość IC50 wynoszącą 0,7655 mM dla komórek MCF-7.
W tej serii eksperymentów zastosowaliśmy ulepszoną technikę ELISA do oznaczania ilości poziomu 8-oxo-dG. Na podstawie analizy danych równanie regresji krzywej wzorcowej wynosi:
Y = 23,66 × X + 0,07038.
Jak przedstawiono na Rysunku 4A, krzywa kalibracyjna wykazała wysoką liniowość (R²=0,978), a Rysunek 4B pokazuje, że zależności między zmierzonymi stężeniami 8-oxo-dG w próbkach a odpowiadającymi im ilościami dodanymi były silnie skorelowane, co wskazuje na dobrą precyzję (współczynnik zmienności wynosił mniej niż 5%). Ponadto spójność uzyskanych wyników w wielu powtórzeniach świadczy o wiarygodności i powtarzalności metody eksperymentalnej.
Podsumowując, dane eksperymentalne wskazują, że nasza zoptymalizowana metoda ELISA pozwala na skuteczne wykrywanie wahań poziomów 8-oxo-dG w ściśle kontrolowanych warunkach. Ma to istotne znaczenie dla przyszłych zastosowań tej techniki w szerszym zakresie typów próbek w celu monitorowania uszkodzeń DNA wywołanych stresem oksydacyjnym. Pomimo pewnych ograniczeń, perspektywy zastosowania tej metody wydają się obiecujące po optymalizacji warunków eksperymentalnych.
<img alt="Schemat rozcieńczeń seryjnych; przygotowanie stężeń H2O2, redukcja stopniowa, technika laboratoryjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie rozcieńczeń H2O2. Schemat przedstawia metodę przygotowania rozcieńczeń nadtlenku wodoru (H2O2), obejmującą staranne łączenie roztworów i precyzyjne przenoszenie różnych stężeń H2O2 do probówek oznaczonych odpowiednio jako 1,0 mM, 0,5 mM i 0,25 mM. Docelowe stężenie uzyskuje się poprzez przeniesienie 1,5 mM H2O2 do probówki oznaczonej jako 0,75 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu ELISA; detekcja przeciwciał, antygen znakowany HRP, konfiguracja reakcji z substratem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Test immunoenzymatyczny (ELISA) do wykrywania antygenu. Ten schemat ilustruje sekwencyjne etapy testu immunoenzymatycznego (ELISA) do wykrywania antygenu: dodanie próbki i przygotowanie próby ślepej; inkubacja antygenu znakowanego HRP; płukanie i przygotowanie płytki; dodanie substratu i inkubacja; przerwanie reakcji i pomiar gęstości optycznej (OD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres przeżywalności komórek w zależności od stężenia H₂O₂; IC50=0,7655 mM; analiza krzywej zależności dawka-odpowiedź." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: H2O2 hamował proliferację komórek MCF-7. Przeżywalność komórek oceniono za pomocą testu CCK-8 po traktowaniu różnymi stężeniami H2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 lub 2,0 mM) przez 12 h, a wartość IC50 obliczono dla wskazanych warunków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Krzywa wzorcowa i wykres słupkowy; ilościowe oznaczenie 8-oxo-dG względem wartości OD, analiza stężeń H2O2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza ilościowa 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 po traktowaniu H2O2. (A) Krzywa wzorcowa ELISA dla 8-oxo-dG. Przedstawia zależność między znanymi stężeniami 8-oxo-dG (1,25, 2,5, 5, 10, 20 i 40 ng/mL) a odpowiadającymi im wartościami absorbancji. Równanie regresji krzywej wzorcowej to Y = 23,66 × X + 0,07038. (n=3, R2=0,978). (B) Stężenie 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 traktowanych H2O2. Wykres przedstawia poziomy 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 poddanych działaniu różnych stężeń H2O2 (0, 0,25 i 0,75 mM). Każdy punkt danych reprezentuje średnią ± SE (błąd standardowy) z trzech niezależnych eksperymentów (n=3), obrazując wpływ stresu oksydacyjnego na uszkodzenia DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Parametr</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Stężenie H2O2 , mM</td>
			<td >0</td>
			<td >0.25</td>
			<td >0.5</td>
			<td >0.75</td>
			<td >1</td>
			<td >2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Żywotność komórek MCF-7, %</td>
			<td >100</td>
			<td >82.8</td>
			<td >81.37</td>
			<td >61.07</td>
			<td >13.4</td>
			<td >2.77</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Żywotność komórek MCF-7 traktowanych H2O2.

Ten protokół opisuje skuteczną metodę ilościowego wykrywania uszkodzeń oksydacyjnych DNA w komórkach MCF-7 za pomocą technologii ELISA.

Kwantyfikacja poziomu 8-oxo-dG za pomocą testu ELISA do oceny oksydacyjnych uszkodzeń DNA w komórkach MCF-7

8-Oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dG) base is the predominant form of commonly observed DNA oxidative damage. DNA impairment profoundly ...

Badania te mają na celu ilościowy pomiar 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 za pomocą testu ELISA, oceniając wpływ nadtlenku wodoru na uszkodzenia oksydacyjne DNA. W szczególności kroki ELISA są szczegółowo opisane w tym filmie w celu zwiększenia wydajności. Techniki wykrywania 8-Oxo-dG, w tym wysokosprawna chromatografia cieczowa z detekcją elektrochemiczną, spektrometria mas i inne wyrafinowane metodologie wykazały skuteczność.Jednak sprawy te często wiążą się z wieloma żmudnymi krokami i mogą być dość kosztowne. Protokół ten wypełnia lukę badawczą w skutecznym i czułym wykrywaniu oksydacyjnych uszkodzeń DNA, w szczególności 8-oxo-dG w próbkach komórkowych, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia jego implikacji w chorobach, starzeniu się i odpowiedzi na stresy środowiskowe. Moje laboratorium skupiło się na innowacjach w metodach wykrywania uszkodzeń DNA.Umożliwi nam to prowadzenie pogłębionych badań z zakresu nauk przyrodniczych nad markerami uszkodzeń DNA. Po wytworzeniu hodowli komórkowej MCF-7 indukowanej nadtlenkiem wodoru, wyrzuć supernatant z naczynia hodowlanego. Dodaj jeden mililitr PBS i delikatnie potrząśnij naczyniem przed wyrzuceniem PBS.Teraz dodaj jeden mililitr trypsyny, aby umyć komórki. Wstrząśnij naczyniem i odczekaj minutę. Następnie wyrzuć trypsynę.Delikatnie postukaj w naczynie. Następnie obserwuj ruch komórki w arkuszu, aby potwierdzić oderwanie. Następnie dodaj cztery mililitry kompletnej pożywki hodowlanej i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Odwirować zawiesinę o sile 800G przez pięć minut i usunąć supernatant. Dodaj 200 mikrolitrów PBS, aby ponownie zawiesić osad i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie wykonuj powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania, aby zakłócić działanie komórek.Odwirować lizat komórkowy w stężeniu 1,500 G przez 10 minut i zebrać supernatant do analizy. Rozmrażać odczynniki ELISA w temperaturze pokojowej przez 20 minut przed rozpoczęciem testu. Rozgrzej czytnik ELISA 15 minut przed użyciem.Rozcieńczyć wymagany 20-krotnie skoncentrowany bufor do przemywania wodą dejonizowaną w roztworze roboczym. Przygotuj roztwory robocze z próbek wzorcowych i ostrożnie wymieszaj je w górę iw dół, nie tworząc pęcherzyków. Dodać 50 mikrolitrów wzorcowego roztworu roboczego i próbek detekcyjnych o różnych stężeniach do studzienek reakcyjnych, z wyłączeniem studzienek ślepych.Dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wykrywającego sprzężonego z peroksydazą chrzanową do każdej studzienki reakcyjnej. Uszczelnij studzienki uszczelką płytkową i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Po inkubacji usunąć roztwór przeciwciała.Strząśnij pozostały płyn w studzienkach i osusz na chłonnym papierze. Dodać 350 mikrolitrów buforu do płukania do każdej studzienki reakcyjnej. Po jednej do dwóch minut wyrzuć bufor przed dodaniem 50 mikrolitrów substratów A i B do każdej studzienki reakcyjnej.Zamknij płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Po 15 minutach dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki reakcji. Natychmiast zmierz wartość gęstości optycznej przy długości fali 450 nanometrów za pomocą czytnika ELISA.Wpływ nadtlenku wodoru na żywotność komórek MCF-7 wykazał, że leczenie 0,75 milimola przez 12 godzin zmniejszyło żywotność do 67%Przy wyższym stężeniu 1,5 milimola żywotność komórek drastycznie spadła poniżej 3% Komórki MCF-7 po zwiększeniu stężenia nadtlenku wodoru wykazały podwyższony poziom 8-Oxo-dG, ilustrując wpływ stresu oksydacyjnego na uszkodzenie DNA.

quantifying-level-8-oxo-dg-using-elisa-assay-to-evaluate-oxidative

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Celem tego protokołu jest wykrycie markera utleniania DNA, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxo-dGuo) przez HPLC-ED, w DNA z hodowanych komórek lub tkanek zwierzęcych.

Pomiar HPLC biomarkera utleniania DNA, 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny, w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

Opisano szczegółowe protokoły wykonywania titracji ELISA. Ponadto przedstawiono nowy algorytm do oceny titracji ELISA i uzyskania stałej dysocjacji wiązania rozpuszczalnego ligandu z receptorem unieruchomionym na płytce mikrotytlacyjnej.

Oznaczanie titracji ELISA jako metoda wyznaczania stałej dysocjacji oddziaływań ligand-receptor

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

Naucz się kwantyfikować 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 za pomocą testu ELISA, oceniając oksydacyjne uszkodzenia DNA indukowane nadtlenkiem wodoru. Ta metoda oferuje wrażliwe i efektywne podejście do badań nad stresem oksydacyjnym.

Kwantyfikacja poziomu 8-oxo-dG za pomocą testu ELISA do oceny oksydacyjnych uszkodzeń DNA w komórkach MCF-7

Przeglądaj więcej filmów