Kwantyfikacja poziomu 8-oxo-dG za pomocą testu ELISA do oceny oksydacyjnych uszkodzeń DNA w komórkach MCF-7
24 maja 2024
Ten protokół opisuje skuteczną metodę ilościowego wykrywania uszkodzeń oksydacyjnych DNA w komórkach MCF-7 za pomocą technologii ELISA.
Badania te mają na celu ilościowy pomiar 8-oxo-dG w komórkach MCF-7 za pomocą testu ELISA, oceniając wpływ nadtlenku wodoru na uszkodzenia oksydacyjne DNA. W szczególności kroki ELISA są szczegółowo opisane w tym filmie w celu zwiększenia wydajności. Techniki wykrywania 8-Oxo-dG, w tym wysokosprawna chromatografia cieczowa z detekcją elektrochemiczną, spektrometria mas i inne wyrafinowane metodologie wykazały skuteczność.
Jednak sprawy te często wiążą się z wieloma żmudnymi krokami i mogą być dość kosztowne. Protokół ten wypełnia lukę badawczą w skutecznym i czułym wykrywaniu oksydacyjnych uszkodzeń DNA, w szczególności 8-oxo-dG w próbkach komórkowych, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia jego implikacji w chorobach, starzeniu się i odpowiedzi na stresy środowiskowe. Moje laboratorium skupiło się na innowacjach w metodach wykrywania uszkodzeń DNA.
Umożliwi nam to prowadzenie pogłębionych badań z zakresu nauk przyrodniczych nad markerami uszkodzeń DNA. Po wytworzeniu hodowli komórkowej MCF-7 indukowanej nadtlenkiem wodoru, wyrzuć supernatant z naczynia hodowlanego. Dodaj jeden mililitr PBS i delikatnie potrząśnij naczyniem przed wyrzuceniem PBS.
Teraz dodaj jeden mililitr trypsyny, aby umyć komórki. Wstrząśnij naczyniem i odczekaj minutę. Następnie wyrzuć trypsynę.
Delikatnie postukaj w naczynie. Następnie obserwuj ruch komórki w arkuszu, aby potwierdzić oderwanie. Następnie dodaj cztery mililitry kompletnej pożywki hodowlanej i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.
Odwirować zawiesinę o sile 800G przez pięć minut i usunąć supernatant. Dodaj 200 mikrolitrów PBS, aby ponownie zawiesić osad i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie wykonuj powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania, aby zakłócić działanie komórek.
Odwirować lizat komórkowy w stężeniu 1,500 G przez 10 minut i zebrać supernatant do analizy. Rozmrażać odczynniki ELISA w temperaturze pokojowej przez 20 minut przed rozpoczęciem testu. Rozgrzej czytnik ELISA 15 minut przed użyciem.
Rozcieńczyć wymagany 20-krotnie skoncentrowany bufor do przemywania wodą dejonizowaną w roztworze roboczym. Przygotuj roztwory robocze z próbek wzorcowych i ostrożnie wymieszaj je w górę iw dół, nie tworząc pęcherzyków. Dodać 50 mikrolitrów wzorcowego roztworu roboczego i próbek detekcyjnych o różnych stężeniach do studzienek reakcyjnych, z wyłączeniem studzienek ślepych.
Dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wykrywającego sprzężonego z peroksydazą chrzanową do każdej studzienki reakcyjnej. Uszczelnij studzienki uszczelką płytkową i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Po inkubacji usunąć roztwór przeciwciała.
Strząśnij pozostały płyn w studzienkach i osusz na chłonnym papierze. Dodać 350 mikrolitrów buforu do płukania do każdej studzienki reakcyjnej. Po jednej do dwóch minut wyrzuć bufor przed dodaniem 50 mikrolitrów substratów A i B do każdej studzienki reakcyjnej.
Zamknij płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Po 15 minutach dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki reakcji. Natychmiast zmierz wartość gęstości optycznej przy długości fali 450 nanometrów za pomocą czytnika ELISA.
Wpływ nadtlenku wodoru na żywotność komórek MCF-7 wykazał, że leczenie 0,75 milimola przez 12 godzin zmniejszyło żywotność do 67%Przy wyższym stężeniu 1,5 milimola żywotność komórek drastycznie spadła poniżej 3% Komórki MCF-7 po zwiększeniu stężenia nadtlenku wodoru wykazały podwyższony poziom 8-Oxo-dG, ilustrując wpływ stresu oksydacyjnego na uszkodzenie DNA.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wydajną metodę ilościowego wykrywania oksydacyjnych uszkodzeń DNA w komórkach MCF-7 z wykorzystaniem technologii ELISA. Badanie koncentruje się na pomiarze poziomu 8-oxo-dG oraz wpływie nadtlenku wodoru na uszkodzenia DNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Ocena uszkodzeń DNA
Wstęp
- Uszkodzenia oksydacyjne DNA mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia chorób i procesów starzenia.
- 8-oxo-dG jest markerem oksydacyjnych uszkodzeń DNA.
- Tradycyjne metody detekcji mogą być żmudne i kosztowne.
- Do zastosowań badawczych i klinicznych niezbędne są wydajne metody detekcji.
Cel badania
- Opracowanie czułego i wydajnego protokołu wykrywania oksydacyjnych uszkodzeń DNA.
- Ocena wpływu nadtlenku wodoru na komórki MCF-7.
- Uzupełnienie luki badawczej w zakresie metod wykrywania oksydacyjnych uszkodzeń DNA.
Zastosowane metody
- Technologia ELISA do ilościowego oznaczania 8-oxo-dG.
- Ocena wpływu nadtlenku wodoru na uszkodzenia DNA.
- Porównanie z tradycyjnymi metodami, takimi jak HPLC i spektrometria mas.
- Koncentracja na innowacjach metodycznych w celu efektywnej detekcji.
Główne wyniki
- Skutecznie opracowano wydajny protokół ELISA.
- Wykazano wpływ nadtlenku wodoru na oksydacyjne uszkodzenia DNA.
- Przedstawiono kosztowo efektywną alternatywę dla tradycyjnych metod detekcji.
- Podkreślono znaczenie 8-oxo-dG jako biomarkera.
Wnioski
- Metoda ELISA oferuje niezawodne podejście do wykrywania oksydacyjnych uszkodzeń DNA.
- Niniejszy protokół może wspomóc badania nad stresem oksydacyjnym i chorobami z nim związanymi.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu szerszych zastosowań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy pomiar 8-oxo-dG za pomocą metody ELISA w komórkach MCF-7 umożliwia precyzyjną ocenę oksydacyjnych uszkodzeń DNA, które są krytycznym czynnikiem w biologii chorób i toksykologii. Niniejszy schemat postępowania odpowiada na potrzebę czułego, skalowalnego i kosztowo efektywnego wykrywania uszkodzeń DNA, wspierając wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w decyzjach dotyczących portfolio, w których stres oksydacyjny i integralność DNA są centralnymi punktami hipotez terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę szlaków uszkodzeń DNA istotnych dla mechanizmów chorobowych.
- Wspiera walidację funkcjonalną stresu oksydacyjnego jako celu terapeutycznego.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie czynników oksydacyjnych z punktami końcowymi na poziomie molekularnym.
- Dostarcza danych do segregacji celów terapeutycznych na podstawie profili odpowiedzi na uszkodzenia DNA.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę ELISA do wysokoprzepustowego oznaczania ilości uszkodzeń DNA.
- Generuje wyniki ilościowe odpowiednie do przesiewania związków i analizy zależności dawka-odpowiedź.
- Umożliwia skalowalność testu oraz ponowne wykorzystanie platformy w różnych modelach komórkowych i warunkach.
- Wspiera wiarygodną ocenę modulatorów genotoksyczności i stresu oksydacyjnego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność ilościowego oznaczania uszkodzeń DNA z modelami komórkowymi istotnymi dla przebiegu choroby w celu zachowania ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia ocenę stresu oksydacyjnego w badaniach przedklinicznych w oparciu o biomarkery.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów na leki ukierunkowanych na naprawę DNA lub szlaki oksydacyjne.
- Dostarcza punktów końcowych o charakterze mechanistycznym do oceny obciążeń toksykologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda ilościowego oznaczania oparta na technice ELISA integruje się z kontinuum od fazy odkrycia do badań przedklinicznych, wspierając zarówno wczesne badania mechanistyczne, jak i późniejsze badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących utleniania DNA oraz zaangażowania konkretnych szlaków sygnałowych.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków i czynników stresogennych.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie poziomów uszkodzeń DNA w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro ze strategiami przedklinicznymi w zakresie biomarkerów, gdy zostanie wykazany związek z jednostką chorobową.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko zastosowalną platformę do oceny uszkodzeń DNA w różnych programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów związanych z uszkodzeniami DNA oraz w badaniach mechanistycznych.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy dzięki zestandaryzowanym, skalowalnym i czułym protokołom ELISA.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez zapewnienie wiarygodnej kwantyfikacji uszkodzeń DNA.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów z uwzględnieniem ryzyka w przypadku obciążeń związanych z uszkodzeniami DNA lub stresem oksydacyjnym.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej, przeprowadzaniu testów ELISA oraz ilościowej analizie danych.
- Wymaga dostępu do czytników płytek ELISA oraz walidowanych odczynników do detekcji 8-oxo-dG.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do różnych linii komórkowych i modeli stresu oksydacyjnego poprzez optymalizację protokołu.
- Ograniczone do detekcji 8-oxo-dG; do szerszego profilowania uszkodzeń DNA mogą być potrzebne dodatkowe testy uzupełniające.
