Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Interesują nas ewolucja, transmisja i mechanizmy molekularne leżące u podstaw oporności na antybiotyki. W szczególności praca, która została wykorzystana w tym artykule, wynika z naszego zainteresowania odpornością na warunki środowiskowe. Obecnie próbujemy zbudować lokalną bazę danych, aby śledzić przestrzenną zmienność czasową oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, korzystając z danych z jednego roku.

Połączenie technik opartych na kulturach i genomiki służy do wykrywania i monitorowania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. DNA z próbek poddawane jest sekwencjonowaniu PCR lub shotgun w celu profilowania różnorodności drobnoustrojów i wykrywania genów oporności. Dodatkowo do zaawansowanego wykrywania AMR wykorzystywane są meta bary, kodowanie i panele AMR oparte na genach.

Wiadomo, że rozdrobnione DNA o niskiej masie cząsteczkowej jest rezerwuarem genów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, ale niewiele uwagi poświęcono opracowaniu metod specyficznych dla wysokowydajnej ekstrakcji liniowego i niskocząsteczkowego DNA. Nasze prace koncentrują się na wypełnieniu tej luki. Nasz protokół wprowadza prosty etap wstępnego przetwarzania w celu wzbogacenia proporcji DNA o niskiej masie cząsteczkowej wyekstrahowanego ze ścieków.

W rezultacie wychwytuje to środowiskowy oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe w całości, nie wykluczając wolnych frakcji DNA. Protokół ten można przekształcić w metodę bez zestawu przy odrobinie więcej pracy. To z kolei toruje drogę do opracowania opłacalnych technik wychwytywania środowiskowego oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Chcemy wyjść poza notacyjną oporność i zbadać wpływ mechanizmów niegenetycznych na oporność na antybiotyki. Interesuje nas w szczególności porównanie względnego wkładu horyzontalnego transferu genów i mutacji genomowych w adaptację do antybiotyków w różnych środowiskach. Na początek zdekantuj 27,5 mililitra ścieków w 50-mililitrowych probówkach wirówkowych.

Dodaj 13,5 grama glikolu polietylenowego 8 000 i trzy gramy chlorku sodu do probówek i dobrze wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia. Próbkę inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odwirować próbkę o sile 15 500 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant i rozpuścić osad w 800 mikrolitrach roztworu do lizy z zestawu do ekstrakcji DNA z gleby. Następnie dodaj roztwór do zmieszanej rurki z cyrkonem. Przymocuj rurkę koralików poziomo na wirze i wiruj z maksymalną prędkością przez 20 do 30 minut.

Obracaj probówki z prędkością 8 000 G przez 15 sekund. Po usunięciu piany przenieś supernatant do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Odwirować supernatant o sile 15 000 G przez jedną minutę.

Przenieś supernatant do czystej, dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej i dodaj 200 mikrolitrów roztworu strącającego. Wiruj z maksymalną prędkością przez pięć sekund, a następnie inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Ponownie odwirować mieszaninę i przenieść klarowny supernatant do czystej dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Dodać 600 mikrolitrów buforu wiążącego na 700 mikrolitrów supernatantu. Po wirowaniu załaduj 700 mikrolitrów lizatu na krzemionkową kolumnę wirową i inkubuj przez dwie minuty. Odwirować probówkę o stężeniu 15 000 G przez jedną minutę i odrzucić przepływ.

Teraz ostrożnie umieść kolumnę wirującą w czystej, dwumililitrowej tubie zbiorczej. Dodać 500 mikrolitrów buforu do płukania do kolumny wirowej i odwirować przy 15 000 G przez jedną minutę. Odrzuć przepływ i włóż kolumnę wirującą z powrotem do tej samej dwumililitrowej probówki zbiorczej.

Dodać 500 mikrolitrów buforu do płukania etanolem do kolumny wirowej i odwirować przy 15 000 G przez jedną minutę. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę wirującą w nowej, dwumililitrowej probówce zbiorczej. Wirować przy 16 000 G przez dwie minuty w celu usunięcia pozostałości etanolu.

Umieść kolumnę wirującą w rurce o pojemności 1.5 mililitra. Dodaj 100 mikrolitrów podgrzanej wody wolnej od nukleaz do środka białej membrany filtracyjnej i inkubuj przez pięć minut. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 15 000 G przez jedną minutę.

Do wymykającego się DNA dodaj 10 mikrolitrów trzech molowych chlorków sodu i 250 mikrolitrów schłodzonego absolutnego etanolu i odwróć, aby dobrze wymieszać. Zakręć zawartość z prędkością 8 000 G cztery 15 sekund. Inkubować mieszaninę DNA etanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Następnie odwirować mieszaninę w temperaturze 19 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zdekantować probówkę w celu odrzucenia supernatantu. Dodaj 500 mikrolitrów schłodzonego, 70% etanolu do granulatu i odwiruj w 19 000 G przez 15 minut w czterech stopniach Celsjusza. Zdekantować supernatant i delikatnie postukać probówką w bibułkę, aby usunąć resztki etanolu.

Następnie umieść otwarte probówki na bloku grzewczym na pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wysuszyć osad DNA. Ponownie zawiesić osad w 30 do 50 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Obracaj DNA w temperaturze 8 000 G przez 15 sekund.

Na spektrofotometrze nanokroplowym, w ustawieniach kwasu nukleinowego, wybierz aplikację dwuniciowego DNA. Wyczyść cokół niestrzępiącą się bibułką i wodą. Użyj wody wolnej od nukleaz, aby wygasić instrument.

Następnie wytrzyj cokół i załaduj na niego dwa mikrolitry próbki DNA. Zmierzyć proporcje stężenia i absorbancji, aby określić czystość. Po pomiarze przechowuj próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.