Wyjaśnienie właściwości fizykochemicznych β-1,3-glukanazy i peroksydazy mechanizmu obronnego ściany komórkowej pszenicy przed inwazją Diuraphis noxia

Dzięki tym badaniom staramy się wyjaśnić biochemiczne funkcje peroksydazy i beta 1 do 10x, które są indukowane podczas rosyjskiej mszycy pszennej. Enzymy, o których wspomniałem, stanowią ostatnie interesujące osiągnięcia w naszych badaniach, ponieważ modyfikują ścianę komórkową, ścianę komórkową roślin podczas interakcji z rosyjską mszycą pszeniczną. Z tego powodu zatrzymują żerowanie w odpornej kulturze.

A to badanie jest częścią programu przedhodowlanego. Pokazuje to, że biochemia ma do odegrania rolę w działaniu na rośliny. Tak więc wyzwaniem związanym z produkcją jest obecnie ewolucja biotypów mszyc pszenicy rosyjskiej.

Obecnie mamy biotyp mszycy rosyjskiej od pierwszego do piątego. Biotyp piąty jest najbardziej zjadliwy, ponieważ pokonał całą oporność genów Dn w komercyjnych odmianach pszenicy. Dlatego oznacza to, że musimy opracować strategie, które obejmują biochemię, hodowlę i insektycydy, aby chronić pszenicę.

Odkryliśmy, że enzymy te występują w peroksydazie. Istotne było dla nas wyekstrahowanie IWF z macierzy komórkowej, a następnie mogliśmy zobaczyć, że beta jeden, trzy i peroksydaza są połączone ze ścianą komórkową lub są związane ze ścianą komórkową i pełnią funkcję w komórce. W następujący sposób peroksydaza sieciuje wyściółkę z węglowodanami, podczas gdy beta jeden trzy glukanazy regulują odkładanie się Carlosa, dzięki czemu roślina jest bardziej odporna.

Metoda opracowana w naszym laboratorium może być stosowana do ekstrakcji beta jeden, trzech glukanaz, a także peroksydazy ze ściany komórkowej jako obszaru aplastycznego. Można to wykorzystać na polach, które biorą udział we wzroście i rozwoju roślin, a także w interakcji ze szkodnikami roślin. Dodatkowo, IWF może być dalej badany w celu znalezienia nowych typów uciekinierów, którzy mogą być podatni na zakażenie krwią.

Na początek opłucz kawałki liści pszenicy dwukrotnie w wodzie destylowanej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia cytozolowe z odciętych końcówek. Włóż kawałki liści do grubościennej szklanej rurki zawierającej bufor ekstrakcyjny. Korzystanie z pompy strumienia wody.

Zastosuj infiltrację próżniową przez pięć minut, aby zaimpregnować liście buforem ekstrakcyjnym. Usuń kawałki liści ze szklanej rurki i osusz je ręcznikiem papierowym. Włóż wysuszone kawałki liści pionowo do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej wyposażonej w perforowany dysk.

Odwiruj liście w temperaturze 500 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów przenieś supernatant do wstępnie schłodzonej mikrorurki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Zebrany supernatant należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia.

Aby rozpocząć, ułóż wymagane materiały eksperymentalne na platformie roboczej. Za pomocą moździerza i tłuczka rozdrobnij resztki liści pszenicy na drobny proszek w ciekłym azocie. Przenieść około 200 miligramów sproszkowanej tkanki liścia do moździerza zawierającego cztery mililitry buforu ekstrakcyjnego.

Inkubować mieszaninę w probówce mikrowirówki na lodzie przez trzy minuty, a następnie odwirować w temperaturze 10 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać sklarowany osad zawierający ekstrakty białkowe w nowej probówce do mikrowirówki. Dodać 200 mikrolitrów ekstraktu enzymatycznego i 300 mikrolitrów substratu rozpuszczonego w 50-milimolowym buforze cytrynianu sodu do 1,5 mililitrowej probówki.

Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w suchym bloku grzewczym przez 24 godziny. Następnego dnia podgrzej probówkę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zakończyć reakcję. Następnie odwirować mieszaninę w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wymieszaj 300 mikrolitrów supernatantu z 600 mikrolitrami trzech pięciu kwasów salicylowych di nitro w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra. I gotuj mieszaninę w 100 stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej zmierz absorbancję przy 540 nanometrach na spektrofotometrze.

Określ aktywność enzymu za pomocą krzywej wzorcowej glukozy. Następnie użyj podanego równania, aby przekształcić aktywność enzymu na określoną aktywność wyrażoną w mikromolach glukozy na godzinę na miligram białka. Dodaj 30 mikrolitrów ekstraktu enzymatycznego, 30 mikrolitrów 1% nadtlenku wodoru i 970 mikrolitrów pięciomilimolowego glikolu do weterynarza Q.

Korzystając z trybu kinetycznego spektrofotometru, monitoruj zmianę absorbancji przy 470 nanometrach. Określ nachylenie, w którym wykres jest liniowy i użyj go jako wartości absorbancji. Obliczyć średnią absorbancję, a następnie obliczyć aktywność peroksydazy za pomocą molowego współczynnika ekstynkcji glikolu i wyrazić aktywność w mikromolach tetraglikolu na minutę na miligram białka.

Dodaj 200 mikrolitrów ekstraktu enzymatycznego i 300 mikrolitrów substratu do 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówek. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 25 i 40 stopni Celsjusza przez osiem godzin. Po inkubacji odwirować mieszaninę reakcyjną beta jeden, trzech glukanów i MLG w stężeniu 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wymieszaj 300 mikrolitrów supernatantu z 600 mikrolitrami trzech odczynników pięciu di nitro kwasu salicylowego w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra. I gotuj mieszaninę w 100 stopniach Celsjusza przez pięć minut. W przypadku beta jeden czteroglukan po zakończeniu reakcji rozcieńczyć mieszaninę 800 mikrolitrami absolutnego etanolu i odwirować przy 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przenieść supernatant do weterynarzy. Zmierz absorbancję na spektrofotometrze przy 590 nanometrach i oblicz aktywność beta jeden trzy glukanazy na beta jeden cztery glukany. Przenieś pięć mililitrów ekstraktów enzymatycznych do 10-kilogramowych filtrów membranowych koncentratujących Daltona.

Odwirować ekstrakt w stężeniu 15 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Inkubować 20 mikrolitrów supernatantu w 40 mikrolitrach trio Pentos Le Minor, Tetrose i Le Minor oraz bios Le Minor w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Po inkubacji gotuj mieszaninę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zakończyć reakcję.

Dodaj trzy mikrolitry mieszanin reakcyjnych trzy do pięciu razy na odpowiednie zaznaczone miejsca na płytce krzemionkowej. Delikatnie umieścić płytkę krzemionkową tak, aby strona zawierająca plamki próbki znajdowała się na dnie zbiornika TLC zawierającego fazę ruchomą. Po około dwóch godzinach delikatnie umieść płytkę krzemionkową w roztworze barwiącym na pięć sekund.

Pozostaw płytkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przed podgrzaniem w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez siedem do 10 minut lub do momentu, gdy pojawią się niebiesko-fioletowe plamki. Zwiększona aktywność specyficzna beta jeden, trzech glukonianów, specyficznej dla MLG beta glukanazy i peroksydazy w naszych zainfekowanych WASA dwóch, odpornych na GALA DNA pięciu próbkach, wykazała, że enzymy te odgrywają rolę w odpowiedzi obronnej. Zarówno beta jeden-trzyglukonaza, jak i peroksydaza wykazywały podobne optymalne warunki pH, przy czym beta glukonian specyficzny dla MLG wykazywał stabilność przy zasadowym pH w porównaniu z beta jeden-trzyglukanazą.

Eseje o stabilności termicznej potwierdziły, że beta jeden trzy glukanazy ma tolerancję do 50 stopni Celsjusza. Sposób działania beta jeden trzy glukanazy na oligosacharydy Le Minor wykazywał wyższą hydrolizę dłuższych oligosacharydów zaatakowanych przez GALA DNA1 i GALA DNA5.