Name: Wyjaśnienie właściwości fizykochemicznych β-1,3-glukanazy i peroksydazy mechanizmu obronnego ściany komórkowej pszenicy przed inwazją Diuraphis noxia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj rolę β-1,3-glukanazy i peroksydazy w obronie ściany komórkowej pszenicy przed mszycą Diuraphis noxia. Badanie wyjaśnia mechanizmy biochemiczne wzmacniające odporność roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M. Mafa otrzymał dofinansowanie od NRF-Thuthuka (Numer referencyjny: TTK2204102938). S.N. Zondo otrzymał stypendium podyplomowe National Research Foundation na swój tytuł magistra. Autorzy są wdzięczni Radzie Badań Rolniczych - Instytut Małego Ziarna (ARC-SG) za udostępnienie nasion użytych w tym badaniu. Wszelkie opinie, ustalenia i zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów), w związku z czym fundatorzy nie ponoszą żadnej odpowiedzialności w tym zakresie.

Characterization of Cell Wall-Related Enzymes in RWA-Infested Wheat Cultivars

<ol><li>Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+is+involved+in+resistance+responses+in+the+Russian+wheat+aphid-wheat+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction.</a> J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).</li>
<li>Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins+from+Russian+wheat+aphid-infested+wheat+induce+defense+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C+J+Biosci%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses.</a> Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).</li>
<li>Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactive+oxygen+species+are+involved+in+resistance+responses+of+wheat+to+the+Russian+wheat+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid.</a> J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).</li>
<li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+defense-related+genes+in+wheat+and+maize+against+Bipolaris+sorokiniana%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).</li>
<li>Botha, C. E., Matsiliza, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+transport+in+wheat+%28Triticum+aestivum%29+is+caused+by+sustained+phloem+feeding+by+the+Russian+wheat+aphid+%28Diuraphis+noxia%29%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia).</a> S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).</li>
<li>Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+structural+carbohydrates+reinforcements+are+part+of+the+defense+mechanisms+of+wheat+against+Russian+wheat+aphid+%28Diuraphis+noxia%29+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation.</a> Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).</li>
<li>Walker, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sieve+element+occlusion%3A+Interaction+with+phloem+sap-feeding+insects+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review.</a> J Plant Physiol. 269, 153582(2022).</li>
<li>Botha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+developing+Russian+wheat+aphid+biotypes+remains+an+unsolved+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma.</a> Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).</li>
<li>Saheed, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stronger+induction+of+callose+deposition+in+barley+by+Russian+wheat+aphid+than+bird+cherry-oat+aphid+is+not+associated+with+differences+in+callose+synthase+or+%CE%B2-1%2C3-glucanase+transcript+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance.</a> Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).</li>
<li>Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+cell+wall-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+and+peroxidase+induced+during+wheat-Diuraphis+noxia+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Square%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions.</a> Research Square. , (2024).</li>
<li>Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+damage+in+the+vascular+tissues+of+resistant+and+non-resistant+barley+%28Hordeum+Vulgare+L.%29+by+two+South+African+biotypes+of+the+Russian+wheat+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22NISEB+J%22%5BJournal%5D)">Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid.</a> NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).</li>
<li>Mohase, L., Taiwe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+fractions+from+South+African+Russian+wheat+aphid+biotypes+induce+differential+defense+responses+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afri+J+Plant+Soil%22%5BJournal%5D)">Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat.</a> S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).</li>
<li>Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-1%2C3-glucanases+in+wheat+and+resistance+to+the+Russian+wheat+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid.</a> Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Miller, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dinitrosalicylic+acid+reagent+for+determination+of+reducing+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.</a> Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).</li>
<li>Zieslin, N., Ben-Zaken, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidases%2C+phenylalanine+ammonia-lyase+and+lignification+in+peduncles+of+rose+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers.</a> Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).</li>
<li>Damager, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+principles+insight+into+the+%CE%B1-glucan+structures+of+starch%3A+Their+synthesis%2C+conformation%2C+and+hydration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Rev%22%5BJournal%5D)">First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration.</a> Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).</li>
<li>Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insight+into+the+mechanism+and+biosynthesis%3A+proteases+may+regulate+callose+biosynthesis+upon+wounding%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose%22%5BJournal%5D)">New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding.</a> Cellulose. 10, 269-289 (2003).</li>
<li>Cierlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+callose+and+%CE%B2-1%2C3-glucanases+during+aphid+infestation+on+barley+cv.+Clipper%5BTitle%5D)+AND+%22Master+thesis+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper.</a> Master thesis in Molecular Cell Biology. , Sodertorn University College. Stockholm. (2008).</li>
<li>Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization%2C+and+biological+properties+of+%CE%B2-glucans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Adv+Pharm+Technol+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans.</a> J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94(2011).</li>
<li>Mafa, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+complex+oligosaccharides+and+CAZymes+activity+under+acid+conditions+constitute+the+Thatcher+%2B+Lr9+defense+responses+to+Puccinia+triticina%5BTitle%5D)+AND+%22Biologia%22%5BJournal%5D)">Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina.</a> Biologia. 78, 1929-1941 (2023).</li>
<li>Megazyme. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GOPOD+reagent+enzymes%3A+Assay+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Megazyme%22%5BJournal%5D)">GOPOD reagent enzymes: Assay procedure.</a> Megazyme. , 1-4 (2019).</li>
<li>Hlahla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photosynthetic+efficiency+and+carbohydrates+responses+of+six+edamame+%28Glycine+max.+L.+Merrill%29+cultivars+under+draught+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress.</a> Plants. 11 (3), 394(2022).</li>
<li>Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereal+host+interactions+with+Russian+wheat+aphid%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Interact%22%5BJournal%5D)">Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review.</a> J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).</li>
<li>Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphid+infestation+induces+PR-proteins+differently+in+barley+susceptible+or+resistant+to+the+birdcherry-oat+aphid+%28Rhopalosiphum+padi%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi).</a> Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).</li>
<li>Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+secondary+cell+wall+in+plant+resistance+to+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens.</a> Front Plant Sci. 5, 358(2014).</li>
<li>Rajninec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+%CE%B2-1%2C3-glucanse+from+Drosera+binate+exhibits+antifungal+potential+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants.</a> Plants. 10 (8), 1747(2021).</li>
<li>Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+immunocytochemical+localization+of+wheat+%CE%B2-1%2C3-glucanase+induced+by+Russian+wheat+aphid+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afri+J+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation.</a> S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że w związku z tą pracą nie występuje konflikt interesów.

Pszenica i jęczmień to rośliny zbożowe często atakowane przez gatunki mszyc, w tym mszyce pszeniczne (Diuraphis noxia)7,24. Odporne rośliny pszenicy indukują regulację w górę aktywności POD i β-1,3-glukanazy jako reakcje obronne przez cały okres porażenia w celu modyfikacji ściany komórkowej poprzez regulację akumulacji kalozy i ligniny 6,25,26,27. Ważne jest, aby pamiętać, że większość badań wyekstrahowała enzymy POD i β-1,3-glukanazy z apoplastu 3,12,28, co sprawia, że ich funkcje ściany komórkowej są wysoce spekulacyjne. W obecnym badaniu opracowano metodę, która wyekstrahowała β-1,3-glukanazę związaną ze ścianą komórkową, β-glukanazę specyficzną dla MLG i POD jako część białka całkowitego. Enzymy te były wysoce aktywne w odpornych odmianach pszenicy w porównaniu z kontrolą, podczas gdy ich aktywność była opóźniona w odmianach podatnych. Wykorzystanie kontroli w eksperymentach pomogło w zrozumieniu wpływu inwazji na poziom aktywności enzymów związanych ze ścianą. Pobieranie próbek z tkanek trzeciego i drugiego liścia w przypadku próbek porażonych lub kontrolnych jest ważne, ponieważ zapewnia spójność. Próbki należy również pobrać od porażonych i kontrolnych w tym samym okresie, ponieważ aktywność POD, β-1,3-glukanazy i β-glukanazy specyficznej dla MLG zwiększa wzrost siewek pszenicy.
Substrat curdlan użyty w tym badaniu ma strukturę chemiczną podobną do modelozy, polimeru osadzonego w obszarze ściany komórkowej podczas interakcji pszenicy-RWA 7,24. Substrat MLG jęczmienia reprezentuje część hemicelulozy ściany komórkowej obecną w niewielkiej proporcji w porównaniu z ksylanem w większości roślin jednoliściennych. Substraty rozpuszczono w buforze cytrynianu sodu o pH 5, aby naśladować kwaśny stan regionu ściany komórkowej rośliny29. Gdyby β-1,3-glukanaza i β-glukanaza specyficzna dla MLG zostały usunięte za pomocą IWF, całkowite białko wyekstrahowane z pozostałej tkanki liścia nie miałoby aktywności na substratach MLG i twarogu. Ponadto, jeśli ekstrakty białkowe pochodziły z regionu cytoplazmatycznego, wykazywałyby aktywność w neutralnym zakresie pH. Co ciekawe, oba enzymy były obecne w całkowitym ekstrakcie białkowym, ponieważ skutecznie hydrolizowały substraty MLG i curdlan. Hydroliza MLG i curdlanu przez odpowiednie enzymy wytworzyła cukry redukujące, które zostały wykryte przez odczynnik DNS po zmodyfikowanej metodzie przez Mafa i wsp.6. Gdy próbki mają wyższe całkowite stężenie cukrów redukujących, kolor odczynnika DNS zmienia się z żółtego na ciemnobrązowy lub kolor zmienia się z żółtego na jasnobrązowy (wygląda na ciemnopomarańczowy), gdy stężenie cukrów redukujących jest niskie.
Do pomiaru aktywności POD użyto substratu gwajakolu. Ze względu na wysoką sprawność katalityczną POD, zmierzyliśmy jego aktywność za pomocą trybu kinetycznego spektrofotometru. POD jest aktywowany przez niskie stężenieH2O2w obecności substratu (Gwajakol). Aktywność tego enzymu przekształca gwajakol w tetra-gwajakol, który jest brązowo-pomarańczowym związkiem barwiącym. Produkcja tetra-gwajakolu potwierdza, że POD sieciuje związki fenolowe w celu wytworzenia oligomerów lub włącza związki fenolowe do ligniny. POD wykazał wyższy poziom aktywności w opornej na RWASA2 Tugela-Dn5, a następnie umiarkowanie opornej Tugela-Dn1 w porównaniu z kontrolą. Jednak poziomy aktywności POD zostały z czasem znacznie zmniejszone u zainfekowanej, podatnej Tugela. Wyniki tego badania zostały poparte twierdzeniem, że odporne odmiany pszenicy porażone RWASA2 wykorzystują POD do wzmocnienia swojej ściany komórkowej poprzez sieciowanie połączeń ligniny lub ligniny-hemicelulozy6. POD wymagał H2O2 do funkcjonowania, co wskazuje, że zmniejszał utlenianie lub bielenie węglowodanów strukturalnych ściany komórkowej poprzez regulację poziomu H2O2 w regionie ściany komórkowej.
Różne warunki pH i temperatury wykorzystano do określenia optymalnych warunków biochemicznych dla tych enzymów związanych ze ścianą komórkową. Optymalne warunki wykazały, że enzymy mają optymalną aktywność w kwaśnych zakresach pH (pH 5), co sugeruje, że są one związane z regionem ściany komórkowej. Optymalną temperaturę dla β-1,3-glukanazy uzyskano przy 25 °C i 40 °C podczas hydrolizy substratów odpowiednio β-1,3-1,4-glukanu i β-1,3-glukanu. Obserwacja ta potwierdziła, że β-1,3-glukanazy i β-glukanaza specyficzna dla MLG to dwa różne enzymy indukowane w obszarze ściany komórkowej odpornych odmian pszenicy podczas inwazji RWASA2. Mimo że charakterystyka biochemiczna jest obiecującą metodą odkrywania lub identyfikowania różnych enzymów o podobnych substratach, nadal zalecamy stosowanie innych pracochłonnych, ale dokładnych metod, w tym testów western blotting i zymogramu. Wreszcie, nie mogliśmy określić ilościowo sposobu aktywności enzymu dla β-glukanazy specyficznej dla MLG ze względu na brak MLG-oligosacharydów. Jednak β-1,3-glukanazy wyekstrahowane z Tugela-Dn5 i Tugela-Dn1 zarażonych RWASA2 wykazywały wyższą aktywność na LAM5, LAM4 i LAM3, podczas gdy ta pochodząca z podatnej Tugela wykazywała wyższą aktywność na LAM5 i LAM4. Potwierdza to, że badanie sposobu aktywności enzymu może również wychwycić subtelne różnice między β-1,3-glukanazami indukowanymi w odmianach odpornych i podatnych na RWA.
Obecne badanie przedstawia szczegółową procedurę ekstrakcji enzymów związanych ze ścianą komórkową z tkanki liści pszenicy. Po ekstrakcji zidentyfikowaliśmy trzy enzymy związane ze ścianą komórkową, a mianowicie β-1,3-glukanazę, β-glukanazę specyficzną dla MLG i POD. Poziomy aktywności tych enzymów były znacznie wyższe w umiarkowanie odpornych odmianach Tugela-Dn1 i Tugela-Dn5 z zainfekowanymi RWASA2 niż w grupie kontrolnej. Potwierdziły one, że enzymy związane ze ścianą komórkową przyczyniły się do odpowiedzi obronnej u odpornych odmian. Wyniki charakterystyki dają wgląd w to, że POD ściany komórkowej i β-1,3-glukanaza działają w tych samych warunkach, co sugeruje, że synergistycznie wzmacniają ścianę komórkową podczas interakcji pszenicy-RWASA2.
Zidentyfikowano pewne ograniczenia, które kolidują z obecnymi omawianymi protokołami. Niedobór roślin pszenicy może ograniczyć materiał liściowy dostępny do ekstrakcji próbek enzymów. Jeśli IWF z apoplastu nie zostanie pomyślnie wyekstrahowany z próbek liści przed ekstrakcją enzymów ściany komórkowej, może to prowadzić do połączenia zarówno apoplastu, jak i enzymów ściany komórkowej. Połączenie IWF i enzymów regionu ściany komórkowej utrudnia badanie enzymów związanych ze ścianą komórkową, które są związane w ścianie komórkowej. W obecnym protokole nie stwierdzono żadnych innych ograniczeń.

Rosyjskie mszyce pszeniczne (RWA) atakują pszenicę i jęczmień, powodując znaczne straty w plonach lub obniżenie jakości ziarna. Pszenica reaguje na porażenie poprzez wywołanie kilku reakcji obronnych, w tym zwiększenia poziomu aktywności β-1,3-glukanazy i peroksydazy w odpornych odmianach, podczas gdy odmiany podatne zmniejszają aktywność tych enzymów we wczesnym okresie porażenia1,2,3,4. Kluczowe funkcje β-1,3-glukanazy i POD w roślinie pszenicy obejmowały regulację akumulacji kalozy w odmianie odpornej i wygaszanie reaktywnych form tlenu (ROS) w ścianie komórkowej i regionach apoplastycznych podczas inwazji RWA1,3,5,6,7. Mafa et al.6 wykazali, że istnieje silna korelacja między zwiększoną aktywnością POD a zwiększoną zawartością ligniny w odpornej odmianie pszenicy po inwazji RWASA2. Ponadto zwiększona zawartość ligniny wskazywała, że ściana komórkowa porażonej odmiany pszenicy odpornej została wzmocniona, co doprowadziło do zmniejszenia nawożenia RWA.
Większość grup badaczy ekstrahowała i badała apoplastyczną β-1,3-glukanazę i POD podczas interakcji pszenica/jęczmień-RWA; ponadto, większość tych badań twierdziła, że te enzymy wpływają na ścianę komórkową rośliny pszenicy zaatakowanej RWA bez pomiaru obecności enzymu w obszarze ściany komórkowej. Tylko w kilku badaniach wykorzystano techniki mikroskopowe, aby wykazać, że poziomy aktywności β-1,3-glukanazy były powiązane z regulacją kalozy7,8,9 lub wyekstrahowane główne składniki ściany komórkowej, aby wykazać korelację między aktywnością POD a modyfikacją ściany komórkowej w klasie resistant<sup="xref">6,10. Brak sondowania związku β-1,3-glukanazy i POD ze ścianą komórkową wskazuje na potrzebę opracowania metod, które pozwolą naukowcom bezpośrednio mierzyć enzymy związane ze ścianą komórkową.
Obecna metoda proponuje, że konieczne jest usunięcie płynu apoplastycznego z tkanki liścia przed ekstrakcją enzymów związanych ze ścianą komórkową. Procedura ekstrakcji płynu apoplastycznego musi być wykonana dwukrotnie z tkanki liścia, która służy do ekstrakcji enzymów związanych ze ścianą komórkową. Proces ten zmniejsza zanieczyszczenie i pomylenie enzymów apoplastycznych z enzymami znajdującymi się w regionach ściany komórkowej. Tak więc w tym badaniu wyekstrahowaliśmy POD związany ze ścianą komórkową, β-1,3-glukanazę i β-glukanazę specyficzną dla MLG i przeprowadziliśmy ich charakterystykę biochemiczną.

<table><tbody><tr><td>10 kDa Wirówka z membraną zagęszczającą</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1NB84206</td><td>Wyłącznie do celów badawczych. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych. Do zagęszczania i oczyszczania roztworów biologicznych.</td></tr><tr><td>2 g Laminaribioza</td><td>Megazyme (Wicklow, Irlandia)</td><td>O-LAM2</td><td>Laminarbioza o wysokiej czystości do stosowania w badaniach, testach enzymów biochemicznych i analizach diagnostycznych in vitro.</td></tr><tr><td>3 g Laminaritriose</td><td>Megazyme (Wicklow, Irlandia)</td><td>O-LAM3</td><td>Laminarytrioza o wysokiej czystości do stosowania w badaniach, testach enzymów biochemicznych i analizach diagnostycznych in vitro.</td></tr><tr><td>3,5 Kwas dinitrosalicylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0550</td><td>Stosowany w kolorymetrycznym oznaczaniu cukrów redukujących</td></tr><tr><td>4 g Laminartetraozy&nbsp;</td><td>Megazyme (Wicklow, Irlandia)</td><td>O-LAM4</td><td>Laminarytetraoza o wysokiej czystości do stosowania w badaniach, testach enzymów biochemicznych i analizach diagnostycznych in vitro.</td></tr><tr><td>5 g Laminaripentaose</td><td>Megazyme (Wicklow, Irlandia)</td><td>O-LAM5</td><td>Laminarinatoza o wysokiej czystości do stosowania w badaniach, biochemicznych testach enzymatycznych i analizach diagnostycznych in vitro.</td></tr><tr><td>95% Absolutny etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107017</td><td>Absolut etanolu do analizy</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B00063</td><td>Kwas Acetc lodowaty 100% do analizy (zawiera kwas octowy)</td></tr><tr><td>Azo-CM-Celuloza</td><td>Megazyme (Wicklow, Irlandia)</td><td>S-ACMC</td><td>Polisacharyd jest barwiony Remazolbrilliant Blue R w ilości ok. jednej cząsteczki barwnika na 20 reszt cukru.</td></tr><tr><td>Beta glukan (jęczmień)&nbsp;</td><td>Megazyme (Wicklow, Irlandia)</td><td>G6513</td><td>Sproszkowane podłoże, słabo rozpuszczalne w wodzie. Służy do oznaczania aktywności &beta;-1,3-glukanazy.</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye</td><td>Bio-Rad Laboratories, Republika Południowej Afryki</td><td>500-0006</td><td>Barwnik do oznaczania kolorymetrycznego, koncentrat, do stosowania z zestawami do oznaczania białek Bio-Rad I i II&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Gibco Europe</td><td>810-1018</td><td>Wyłącznie do użytku laboratoryjnego</td></tr><tr><td>Kwas cytrynianowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759</td><td>Wyłącznie do badań w dziedzinie nauk przyrodniczych. Nie do stosowania w procedurach diagnostycznych.</td></tr><tr><td>CM-curdlan&nbsp;</td><td>Megazyme (Wicklow, Irlandia)</td><td>P-CMCUR</td><td>Sproszkowany substrat do oznaczania aktywności &beta;-1,3-glukanazy. Nierozpuszczalny w wodzie.</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Tylko do badań w dziedzinie nauk przyrodniczych. Nie do stosowania w procedurach diagnostycznych.</td></tr><tr><td>Guaiacol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td>Wskaźnik utleniania. Służy do oznaczania aktywności peroksydazy.</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>BDH Laboratory Supplies, Anglia</td><td>10366</td><td>Silny środek utleniający.</td></tr><tr><td>Mikskaar Professional Substarte</td><td>Mikskaar (Estonia)</td><td>NI</td><td>Podłoże do sadzonek na bazie mchu torfowego.</td></tr><tr><td>Nawóz wielonawożeniowy (5.2.4 (43))Nawóz wielopaszowy</td> <td>Classic</td><td>B1908248</td><td>Rozpuszczalny w wodzie nawóz dla młodych rozwijających się roślin i siewek o wysokim zapotrzebowaniu na fosfor (P) w celu zapewnienia optymalnego rozwoju korzeni.</td></tr><tr><td>Naftol</td><td>Merck, Niemcy</td><td>N2780</td><td>Ulega uwodornieniu w obecności katalizatora.</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33517</td><td>Wrażliwy na światło. Dla R& D tylko używać. Nie do celów związanych z narkotykami, gospodarstwem domowym ani innymi. Dostępna karta charakterystyki</td></tr><tr><td>Czterowodny winian potasowo-sodowy (sól Rochelle)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2377</td><td>stosowany do przygotowania roztworu kwasu 3,5-dinitrosalicylowego stosowanego do oznaczania cukru redukującego.</td></tr><tr><td>Płytka krzemionkowa (TLC Żel krzemionkowy 60 F254)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60778-25EA</td><td>Matryca z żelu krzemionkowego, ze wskaźnikiem fluorescencyjnym 254 nm</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Do R& D tylko używać. Nie do celów związanych z narkotykami, gospodarstwem domowym ani innymi.</td></tr><tr><td>Pirosiarczyn sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31448</td><td>Dodawany jako przeciwutleniacz podczas przygotowywania roztworów kwasu 3,5-dinitrosalicylowego.</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>Stosowany jako roztwór buforowy w badaniach biologicznych w celu utrzymania stałego pH.</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td>Związek nieorganiczny, który jest rozpuszczalny w wodzie. Stosowany jako odczynnik przy opracowywaniu zapraw na bazie krzemianów.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td><td>TIBCO Statistica</td><td>wersja 13.1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>30743</td><td>Kwas siarkowy 95-97% do analizy Hg, odczynnik ACS.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Środek buforujący w mieszaninach inkubacyjnych.&nbsp; Jest również stosowany jako składnik buforu lizy i TE (Tris-EDTA). Wyłącznie do badań w dziedzinie nauk przyrodniczych. Nie do stosowania w procedurach diagnostycznych.</td></tr><tr><td>UV&ndash; Spektrofotometr światła widzialnego</td><td>GENESYS 120&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; NI = nie zidentyfikowano.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wyjaśnienie właściwości fizykochemicznych β-1,3-glukanazy i peroksydazy mechanizmu obronnego ściany komórkowej pszenicy przed inwazją diuraphis noxia

Elucidating &#946;-1,3-Glucanase and Peroxidase Physicochemical Properties of Wheat Cell Wall Defense Mechanism Against Diuraphis noxia Infestation

Rośliny pszenicy zaatakowane przez rosyjskie mszyce pszeniczne (RWA) wywołują kaskadę reakcji obronnych, w tym reakcje nadwrażliwe (HR) i indukcję białek związanych z patogenezą (PR), takich jak β-1,3-glukanaza i peroksydaza (POD). Badanie to ma na celu scharakteryzowanie właściwości fizykochemicznych POD i β-1,3-glukanazy związanych ze ścianą komórkową oraz określenie ich synergizmu w modyfikacji ściany komórkowej podczas interakcji RWASA2-pszenica. Podatne odmiany Tugela, umiarkowanie odporne Tugela-Dn1 i odporne Tugela-Dn5 zostały wstępnie wykiełkowane i posadzone w warunkach szklarniowych, nawożone 14 dni po posadzeniu i nawadniane co 3 dni. Rośliny zostały porażone przez 20 partenogenetycznych osobników tego samego klonu RWASA2 w fazie 3 liści, a liście zebrano w ciągu 1 do 14 dni po inwazji. Międzykomórkowy płyn do płukania (IWF) ekstrahowano za pomocą filtracji próżniowej i przechowywano w temperaturze -20 °C. Resztki liści rozdrobniono na proszek i wykorzystano jako składniki ściany komórkowej. Aktywność i charakterystykę POD określono przy użyciu 5 mM substratu gwajakolu iH2O2, monitorując zmianę absorbancji przy 470 nm. Aktywność β-1,3-glukanazy, optymalne warunki pH i temperatury wykazano, mierząc całkowitą zawartość cukrów redukujących w hydrolizacie za pomocą odczynnika DNS przy użyciu substratów β-1,3-glukanu i β-1,3-1,4-glukanu, mierząc absorbancję przy 540 nm i stosując krzywą wzorcową glukozy. Optimum pH określono w zakresie od 4 do 9 °C, optimum temperaturowe od 25 do 50 °C, a stabilność termiczną w zakresie od 30 °C do 70 °C. Specyficzność substratu β-1,3-glukanazy określono w temperaturze 25 °C i 40 °C przy użyciu substratów z β-1,3-1,4-glukanu z twarogu i jęczmienia. Dodatkowo określono sposób działania β-1,3-glukanazy za pomocą laminaribiozy do laminaripentaozy. Wzorce produktów hydrolizy oligosacharydów analizowano jakościowo za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i analizowano ilościowo za pomocą HPLC. Metoda przedstawiona w tym badaniu demonstruje solidne podejście do poinekowania pszenicy RWA, ekstrakcji peroksydazy i β-1,3-glukanazy z obszaru ściany komórkowej oraz ich kompleksowej charakterystyki biochemicznej.

Cztery powtórzenia biologiczne odmian pszenicy (Tugela, Tugela-Dn1 oraz Tugela-Dn5) zainfekowano RWASA2 w stadium wzrostu trzech liści. Po infekcji liście zbierano w 1., 2., 3., 7. i 14. dpi. Próby kontrolne nie były infekowane RWASA2, aby wyniki eksperymentu były porównywalne z roślinami pszenicy niepoddanymi stresowi. Eksperymenty przeprowadzono w czterech powtórzeniach, a wyniki przedstawiono jako wartości średnie.
Stężenia białek w ekstraktach z roślin zainfekowanych RWASA2 oraz w ekstraktach kontrolnych określono ilościowo, wykorzystując BSA jako standard białkowy. Było to przydatne przy wyznaczaniu aktywności enzymatycznej β-1,3-glukanazy oraz POD i pozwoliło upewnić się, że stężenia białek zastosowane w każdej reakcji były znane dla każdej próbki; różnice były pomijalne. Dane można przedstawić w formie wykresu lub tabeli. W przypadku pierwszego formatu wykresu przedstawiono aktywności specyficzne enzymów (oś y) w funkcji liczby dni po infekcji (oś x) zarówno dla wyników pomiaru aktywności enzymatycznej, jak i analizy charakterystyki. Zwiększona aktywność specyficzna β-1,3-glukanazy, β-glukanazy specyficznej dla MLG oraz POD w próbkach odpornej odmiany Tugela-Dn5 zainfekowanej RWASA2 wykazała, że enzymy te odgrywają rolę w odpowiedzi obronnej (Rysunek 1 i Rysunek 2). Ponadto oba enzymy znacząco traciły aktywność w czasie w podatnej odmianie Tugela zainfekowanej RWASA2.
Charakterystykę biochemiczną β-1,3-glukanazy oraz POD związanych ze ścianą komórkową określono poprzez wyrażenie aktywności jako procent aktywności względnej lub specyficznej aktywności enzymatycznej, co przedstawiono odpowiednio na wykresach liniowych i słupkowych (Rycina 3). Wyniki wykazały, że zarówno β-1,3-glukanaza, jak i POD miały podobne optymalne warunki pH (pH 5), odpowiadające kwasowym warunkom ściany komórkowej (Rycina 3). Należy zauważyć, że specyficzna dla MLG β-glukanaza również wykazała aktywność specyficzną przy pH 5. Była ona jednak bardziej stabilna w warunkach zasadowych niż β-1,3-glukanaza, która w tych samych warunkach utraciła do 80% aktywności względnej. Wyniki potwierdziły, że dwa enzymy katalizujące substraty MLG i β-1,3-glukanu zostały pomyślnie wyekstrahowane z obszaru ściany komórkowej na podstawie optimum pH. Tezę tę potwierdziły wyniki testu termostabilności (Rycina 4), które wykazały, że β-1,3-glukanaza tolerowała temperatury tylko do 50 °C i utraciła ponad 80% aktywności względnej przy 70 °C (POD wykazał taki sam profil). W przeciwieństwie do nich, enzym β-glukanaza specyficzna dla MLG wykazał najwyższą aktywność przy 25 °C, po czym nastąpił stopniowy spadek aktywności, jednak enzym ten zachował ponad 50% aktywności względnej w temperaturach 50 °C i 70 °C. Obserwacje potwierdziły, że specyficzna dla MLG β-glukanaza wykazuje unikalne właściwości biochemiczne w porównaniu do β-1,3-glukanazy i POD wyekstrahowanych z Tugela, Tugela-Dn1 oraz Tugela-Dn5.
Sposób działania β-1,3-glukanazy zademonstrowano z wykorzystaniem oligosacharydów laminaryny o stopniu polimeryzacji (DP) od 5 do 2 (oznaczonych jako LAM5 do LAM2). Wyniki TLC wykazały, że zainfekowane odmiany Tugela, Tugela-Dn1 oraz Tugela-Dn5 posiadały enzym β-1,3-glukanazę, który w większym stopniu hydrolizował dłuższe oligosacharydy (LAM5 i LAM4) w porównaniu z krótszymi (LAM3). Intensywność modro-fioletowych plamek widocznych na płytce TLC wykazała, że w odmianach odpornych i umiarkowanie odpornych prążki LAM5 i LAM4 były mniej intensywne, a następnie mniej intensywny był prążek LAM3 (Rycina 5). W podatnej odmianie Tugela β-1,3-glukanaza hydrolizowała LAM5 efektywniej niż pozostałe oligosacharydy (LAM4-LAM2), które wykazywały bardziej intensywne prążki. Sposób działania przedstawiono również jako stężenia hydrolizatów w tabeli z mapą ciepła, wskazującą na efektywną hydrolizę oligosacharydów laminaryny o wyższym DP oraz umiarkowaną aktywność podczas hydrolizy krótszych oligosacharydów (LAM3 i LAM2) (Tabela 1).
<img alt="Wykresy słupkowe aktywności peroksydazy (U/mg białka) w odmianach pszenicy po infestacji w ciągu 14 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Aktywność właściwa peroksydazy wyekstrahowanej z roślin Tugela (A), Tugela-Dn1 (B) oraz Tugela-Dn5 (C) zainfekowanych RWASA2, 14 dni po infestacji. Eksperymenty przeprowadzono w czterech powtórzeniach; wartości i słupki błędów reprezentują odpowiednio średnie ± SD. Jednostka U w U/mg białka oznacza µmol tetra-guajakolu/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy aktywności β-1,3-glukanazy; aktywność enzymatyczna po infekcji; porównanie grupy kontrolnej z zainfekowaną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Specyficzna aktywność β-1,3-glukanazy zmierzona w odmianach Tugela, Tugela-Dn1 oraz Tugela-Dn5 zainfekowanych RWASA2. Aktywność enzymu badano z wykorzystaniem dwóch chemicznie odmiennych substratów glukanowych, tj. glukanu β-1,3-1,4 o mieszanych wiązaniach (A-C) oraz curdlanu (D-F). Eksperymenty przeprowadzono w czterech powtórzeniach; wartości i słupki błędów przedstawiają odpowiednio średnie ± SD. U w U/mg białka oznacza µmol/h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Aktywność β-1,3-glukanazy w zależności od pH w kontrolnej i zainfekowanej Tugela, Tugela Dn1, Dn5; wykresy eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analizy pH optymalnego enzymu β-1,3-glukanazy wyekstrahowanej z Tugela, Tugela-Dn1 i Tugela-Dn5 zainfekowanych RWASA2 w 3. dniu po infekcji. Eksperymenty przeprowadzono z użyciem substratów: glukanu o mieszanych wiązaniach β-1,3-1,4 (A-C) oraz curdlanu (D-F). Eksperymenty wykonano w czterech powtórzeniach; wartości i słupki błędów reprezentują odpowiednio średnie ± SD. U w U/mg białka oznacza µmol/h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównujący aktywność β-1,3-glukanazy w odmianach pszenicy w różnych temperaturach, grupa kontrolna vs. zainfekowana." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Test termostabilności. Testy termostabilności β-1,3-glukanazy pozyskanej z odmian Tugela, Tugela-Dn1 i Tugela-Dn5 zainfekowanych RWASA2 3 dni po infekcji, badane na β-1,3-1,4-glukanie (A-C) oraz β-1,3-glukanie (D-F). Eksperymenty przeprowadzono w czterech powtórzeniach; wartości i słupki błędów reprezentują odpowiednio średnie ± SD. Jednostka U w U/mg białka oznacza µmol/h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wynik chromatografii cienkowarstwowej wykazujący rozdział związków; niebieskie i czerwone strzałki wskazują plamy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Analiza mechanizmu działania β-1,3-glukanazy na oligosacharydy laminaryny. Oligosacharydy laminaryny zostały oznaczone jako L5, L4, L3 i L2, co odpowiada odpowiednio laminaripentaozie (LAM5), laminaritetraozie (LAM4), laminaritriozie (LAM3) i laminaribiozie (LAM2). Czerwona strzałka wskazuje glukozę (GLU), a niebieska strzałka profil enzymu bez dodatku oligosacharydów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Oligosacharydy laminarinowe otrzymane z zagęszczonej β-1,3-glukanazy wyekstrahowanej z odmian pszenicy zainfekowanych RWASA2 przez 3 dni. Stężenia oligosacharydów w hydrolizacie określono za pomocą LC-MS. LAM5, LAM4, LAM3, LAM2 i GLU reprezentują odpowiednio laminaripentozę, laminaritetraozę, laminaritriozę, laminaribiozę i glukozę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Obecny protokół opisuje procedury używane do badania i charakteryzowania enzymów związanych ze ścianą komórkową, głównie β-1,3-glukanazy i peroksydazy, w roślinach pszenicy. Ich poziom aktywności wzrasta podczas interakcji pszenica - RWA i bierze udział w odpowiedzi obronnej roślin poprzez wzmocnienie ścian komórkowych, co zniechęca mszyce do żerowania.

Wyjaśnienie właściwości fizykochemicznych β-1,3-glukanazy i peroksydazy mechanizmu obronnego ściany komórkowej pszenicy przed inwazją Diuraphis noxia

Wheat plants infested by Russian wheat aphids (RWA) induce a cascade of defense responses, including the hypersensitive responses (HR) and induction of ...

Dzięki tym badaniom staramy się wyjaśnić biochemiczne funkcje peroksydazy i beta 1 do 10x, które są indukowane podczas rosyjskiej mszycy pszennej. Enzymy, o których wspomniałem, stanowią ostatnie interesujące osiągnięcia w naszych badaniach, ponieważ modyfikują ścianę komórkową, ścianę komórkową roślin podczas interakcji z rosyjską mszycą pszeniczną. Z tego powodu zatrzymują żerowanie w odpornej kulturze.A to badanie jest częścią programu przedhodowlanego. Pokazuje to, że biochemia ma do odegrania rolę w działaniu na rośliny. Tak więc wyzwaniem związanym z produkcją jest obecnie ewolucja biotypów mszyc pszenicy rosyjskiej.Obecnie mamy biotyp mszycy rosyjskiej od pierwszego do piątego. Biotyp piąty jest najbardziej zjadliwy, ponieważ pokonał całą oporność genów Dn w komercyjnych odmianach pszenicy. Dlatego oznacza to, że musimy opracować strategie, które obejmują biochemię, hodowlę i insektycydy, aby chronić pszenicę.Odkryliśmy, że enzymy te występują w peroksydazie. Istotne było dla nas wyekstrahowanie IWF z macierzy komórkowej, a następnie mogliśmy zobaczyć, że beta jeden, trzy i peroksydaza są połączone ze ścianą komórkową lub są związane ze ścianą komórkową i pełnią funkcję w komórce. W następujący sposób peroksydaza sieciuje wyściółkę z węglowodanami, podczas gdy beta jeden trzy glukanazy regulują odkładanie się Carlosa, dzięki czemu roślina jest bardziej odporna.Metoda opracowana w naszym laboratorium może być stosowana do ekstrakcji beta jeden, trzech glukanaz, a także peroksydazy ze ściany komórkowej jako obszaru aplastycznego. Można to wykorzystać na polach, które biorą udział we wzroście i rozwoju roślin, a także w interakcji ze szkodnikami roślin. Dodatkowo, IWF może być dalej badany w celu znalezienia nowych typów uciekinierów, którzy mogą być podatni na zakażenie krwią.Na początek opłucz kawałki liści pszenicy dwukrotnie w wodzie destylowanej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia cytozolowe z odciętych końcówek. Włóż kawałki liści do grubościennej szklanej rurki zawierającej bufor ekstrakcyjny. Korzystanie z pompy strumienia wody.Zastosuj infiltrację próżniową przez pięć minut, aby zaimpregnować liście buforem ekstrakcyjnym. Usuń kawałki liści ze szklanej rurki i osusz je ręcznikiem papierowym. Włóż wysuszone kawałki liści pionowo do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej wyposażonej w perforowany dysk.Odwiruj liście w temperaturze 500 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów przenieś supernatant do wstępnie schłodzonej mikrorurki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Zebrany supernatant należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu użycia.Aby rozpocząć, ułóż wymagane materiały eksperymentalne na platformie roboczej. Za pomocą moździerza i tłuczka rozdrobnij resztki liści pszenicy na drobny proszek w ciekłym azocie. Przenieść około 200 miligramów sproszkowanej tkanki liścia do moździerza zawierającego cztery mililitry buforu ekstrakcyjnego.Inkubować mieszaninę w probówce mikrowirówki na lodzie przez trzy minuty, a następnie odwirować w temperaturze 10 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać sklarowany osad zawierający ekstrakty białkowe w nowej probówce do mikrowirówki. Dodać 200 mikrolitrów ekstraktu enzymatycznego i 300 mikrolitrów substratu rozpuszczonego w 50-milimolowym buforze cytrynianu sodu do 1,5 mililitrowej probówki.Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w suchym bloku grzewczym przez 24 godziny. Następnego dnia podgrzej probówkę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zakończyć reakcję. Następnie odwirować mieszaninę w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wymieszaj 300 mikrolitrów supernatantu z 600 mikrolitrami trzech pięciu kwasów salicylowych di nitro w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra. I gotuj mieszaninę w 100 stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej zmierz absorbancję przy 540 nanometrach na spektrofotometrze.Określ aktywność enzymu za pomocą krzywej wzorcowej glukozy. Następnie użyj podanego równania, aby przekształcić aktywność enzymu na określoną aktywność wyrażoną w mikromolach glukozy na godzinę na miligram białka. Dodaj 30 mikrolitrów ekstraktu enzymatycznego, 30 mikrolitrów 1% nadtlenku wodoru i 970 mikrolitrów pięciomilimolowego glikolu do weterynarza Q.Korzystając z trybu kinetycznego spektrofotometru, monitoruj zmianę absorbancji przy 470 nanometrach. Określ nachylenie, w którym wykres jest liniowy i użyj go jako wartości absorbancji. Obliczyć średnią absorbancję, a następnie obliczyć aktywność peroksydazy za pomocą molowego współczynnika ekstynkcji glikolu i wyrazić aktywność w mikromolach tetraglikolu na minutę na miligram białka.Dodaj 200 mikrolitrów ekstraktu enzymatycznego i 300 mikrolitrów substratu do 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówek. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 25 i 40 stopni Celsjusza przez osiem godzin. Po inkubacji odwirować mieszaninę reakcyjną beta jeden, trzech glukanów i MLG w stężeniu 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wymieszaj 300 mikrolitrów supernatantu z 600 mikrolitrami trzech odczynników pięciu di nitro kwasu salicylowego w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra. I gotuj mieszaninę w 100 stopniach Celsjusza przez pięć minut. W przypadku beta jeden czteroglukan po zakończeniu reakcji rozcieńczyć mieszaninę 800 mikrolitrami absolutnego etanolu i odwirować przy 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie przenieść supernatant do weterynarzy. Zmierz absorbancję na spektrofotometrze przy 590 nanometrach i oblicz aktywność beta jeden trzy glukanazy na beta jeden cztery glukany. Przenieś pięć mililitrów ekstraktów enzymatycznych do 10-kilogramowych filtrów membranowych koncentratujących Daltona.Odwirować ekstrakt w stężeniu 15 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Inkubować 20 mikrolitrów supernatantu w 40 mikrolitrach trio Pentos Le Minor, Tetrose i Le Minor oraz bios Le Minor w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Po inkubacji gotuj mieszaninę w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zakończyć reakcję.Dodaj trzy mikrolitry mieszanin reakcyjnych trzy do pięciu razy na odpowiednie zaznaczone miejsca na płytce krzemionkowej. Delikatnie umieścić płytkę krzemionkową tak, aby strona zawierająca plamki próbki znajdowała się na dnie zbiornika TLC zawierającego fazę ruchomą. Po około dwóch godzinach delikatnie umieść płytkę krzemionkową w roztworze barwiącym na pięć sekund.Pozostaw płytkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przed podgrzaniem w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez siedem do 10 minut lub do momentu, gdy pojawią się niebiesko-fioletowe plamki. Zwiększona aktywność specyficzna beta jeden, trzech glukonianów, specyficznej dla MLG beta glukanazy i peroksydazy w naszych zainfekowanych WASA dwóch, odpornych na GALA DNA pięciu próbkach, wykazała, że enzymy te odgrywają rolę w odpowiedzi obronnej. Zarówno beta jeden-trzyglukonaza, jak i peroksydaza wykazywały podobne optymalne warunki pH, przy czym beta glukonian specyficzny dla MLG wykazywał stabilność przy zasadowym pH w porównaniu z beta jeden-trzyglukanazą.Eseje o stabilności termicznej potwierdziły, że beta jeden trzy glukanazy ma tolerancję do 50 stopni Celsjusza. Sposób działania beta jeden trzy glukanazy na oligosacharydy Le Minor wykazywał wyższą hydrolizę dłuższych oligosacharydów zaatakowanych przez GALA DNA1 i GALA DNA5.

elucidating-13-glucanase-peroxidase-physicochemical-properties-wheat

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Opisano technikę o nazwie Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP), służącą do charakterystyki glikanów ścian komórkowych roślin. Metoda ta łączy specyficzność przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko określonym epitopom glikanów z miniaturową analityczną platformą mikromacierzy, która umożliwia przesiewowe badanie występowania glikanów w szerokim zakresie kontekstów biologicznych.

Profilowanie glikanów polimerów ściany komórkowej roślin z wykorzystaniem mikromacierzy

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Defensyny roślinne odgrywają ważną rolę w obronie roślin przed patogenami. Aby skutecznie wykorzystać te peptydy przeciwgrzybicze jako środki przeciwgrzybicze, zrozumienie ich sposobów działania (MOA) ma kluczowe znaczenie. W tym miejscu opisano metodę obrazowania żywych komórek w celu zbadania krytycznych aspektów MOA tych peptydów.

Obrazowanie żywych komórek grzybów w celu zbadania sposobów wnikania i lokalizacji subkomórkowej przeciwgrzybiczych defensyn roślinnych

Opisano protokół analizy strukturalnej polisacharydów metodą elektroforezy żelowej (PACE), na przykładzie mannanu.

Charakterystyka strukturalna polisacharydów ściany komórkowej Mannanów w roślinach przy użyciu PACE

Ta praca opisuje klonowanie szczepu konia trojańskiego Ustilago maydis w celu dostarczania in situ wydzielanych białek kukurydzy do trzech różnych typów tkanek kukurydzy.

Wykorzystanie Ustilago maydis jako konia trojańskiego do dostarczania białek kukurydzianych in situ

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie zarysu kompleksowych badań biochemicznych i funkcjonalnych ligaz ubikwityny typu E3 typu RING. Ten wieloetapowy potok, ze szczegółowymi protokołami, weryfikuje aktywność enzymatyczną badanego białka i pokazuje, jak powiązać tę aktywność z funkcjonowaniem.

Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Ten protokół opisuje mikroskopijną metodę wykrywania pektyn w interakcji między kawą a grzybem.

Metoda podwójnego barwienia do wykrywania pektyn w interakcji roślina-grzyb

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Poznaj rolę β-1,3-glukanazy i peroksydazy w obronie ściany komórkowej pszenicy przed mszycą Diuraphis noxia. Badanie wyjaśnia mechanizmy biochemiczne wzmacniające odporność roślin.

Wyjaśnienie właściwości fizykochemicznych β-1,3-glukanazy i peroksydazy mechanizmu obronnego ściany komórkowej pszenicy przed inwazją Diuraphis noxia (Wideo) | JoVE Journal

Wyjaśnienie właściwości fizykochemicznych β-1,3-glukanazy i peroksydazy mechanizmu obronnego ściany komórkowej pszenicy przed inwazją Diuraphis noxia

Przeglądaj więcej filmów