Wykorzystanie izolowanego modelu pracującego serca szczura do testowania strategii zachowania serca dawcy
4 października 2024
Opisujemy protokół ex vivo izolowanego działania na szczurzym sercu, aby przetestować strategie zachowania serca dawcy. W artykule opisano protokół stosowania w statycznym przechowywaniu serc dawców gryzoni w chłodniach; Jednak protokół może być również stosowany w przypadku serc dawców uzyskanych po dawstwie po śmierci krążeniowej i śmierci mózgu.
W naszych badaniach wykorzystujemy izolowany obwód perfuzji serca szczura do testowania strategii suplementacji w celu zachowania serca dawcy. Naszym celem jest zidentyfikowanie strategii konserwacji, które mogą poprawić funkcjonalną regenerację serc dawców po długich okresach przechowywania w niskiej temperaturze lub długich okresach ciepłego niedokrwienia po oddaniu po śmierci krążeniowej. Izolowany protokół pracy serca szczura został wykorzystany do wstępnego przetestowania obecnej klinicznej strategii zachowania serca dawcy polegającej na zastosowaniu trójazotanu glicerolu i erytropoetyny w roztworze do konserwacji serca.
Stanowiło to uzasadnienie do przeprowadzenia testów w badaniu przeszczepu serca u świń przed przejściem do kliniki. Zaletą stosowania izolowanego działającego protokołu perfuzji serca szczura w porównaniu z technikami perfuzji Langendorffa jest możliwość uzyskania funkcjonalnych pomiarów serca, takich jak przepływ aortalny i pojemność minutowa serca. Na początek umieść znieczulonego szczura w pozycji leżącej.
Zabezpiecz kończyny zwierzęcia taśmą, a następnie przymocuj stożek nosowy nad zwierzęciem, aby podać tlen. Namocz sterylną gazę w pojemniku z buforem Krebs-Henseleit. Namoczoną gazę połóż na lodzie.
Po wykonaniu bocznego nacięcia w poprzek brzucha przesuń żołądek i jelita, aby umożliwić dostęp do lewej żyły nerkowej. Wstrzyknąć heparynę i uciskać miejsce wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie. Po pozostawieniu heparyny w krążeniu przez kilka minut, przeciąć klatkę piersiową po obu stronach i w poprzek przepony, aby całkowicie otworzyć jamę klatki piersiowej.
Ostrożnie podnieś blok płuca serca i przetnij wzdłuż aorty zstępującej, utrzymując nienaruszony łuk aorty. Przenieś blok płuco-serce do bufora lodowego Krebsa-Henseleita, aby zatrzymać serce. Na początek umieść świeżo wycięty blok płuco-serce szczura na płachcie gazy nad lodem.
Wypreparuj nadmiar tłuszczu wokół aorty, a następnie przytnij aortę, pozostawiając około trzech do pięciu milimetrów na kaniulację. Wykonaj nacięcie o długości od jednego do dwóch milimetrów w tętnicy płucnej. Umieść przycięty blok płuco-serce na lodzie bezpośrednio pod kaniulami.
Następnie użyj zacisku rurki kontrolującej przepływ, aby wyregulować przepływ od strony Langendorffa do kaniulacji aorty. Ostrożnie kaniuluj aortę na lewej kaniuli. Przytrzymaj go czarnym zaciskiem i zawiąż jedwabnym szwem 2-0.
Całkowicie otwórz zacisk rurki kontroli przepływu, aby zwiększyć przepływ z perfuzji Langendorffa. Następnie otwórz zacisk obciążenia następczego. Rozpocznij monitorowanie aktywności serca za pomocą oprogramowania.
Wyreguluj blok płuco-serce tak, aby przednia powierzchnia płuc była skierowana w stronę operatora. Zawiąż lewy płat płuca jedwabnym szwem 2-0. Zawiąż pozostałe płaty płuc za jednym zamachem za pomocą jedwabnego szwu 2-0.
Następnie obróć serce tak, aby związane płuca były skierowane do tyłu. Za pomocą małych nożyczek Vannas przytnij dwu- lub trzymilimetrowy odcinek uszka lewego przedsionka, aby utworzyć mały otwór w przedsionkach. Ostrożnie kaniuluj uszek lewego przedsionka do lewej kaniuli.
Przytrzymaj go czarnym zaciskiem i zawiąż jedwabnym szwem 2-0. Wyreguluj płaszcz wodny komory serca tak, aby serce znajdowało się pośrodku komory. Teraz otwórz przetwornik ciśnienia na powietrze.
Wybierz ciśnienie w aorcie w oprogramowaniu, a następnie kliknij wzmacniacz mostkowy, a następnie zero i OK, aby wyzerować przetwornik ciśnienia. Perfuzja serca w trybie Langendorffa przez 10 minut. Następnie przenieść kamień napowietrzający ze zbiornika buforowego Langendorff Krebs-Henseleit do działającego zbiornika buforowego Krebs-Henseleit.
Otwórz kran trójdrożny prowadzący od działającego perfuzatu. Zamknij duży zacisk prowadzący do kaniuli aortalnej i otwórz przepływ prowadzący do uszka lewego przedsionka, aby przełączyć się w tryb pracy. Wykonuj płuczki w trybie pracy przez 15 minut.
Napełnij komorę kardioplegii 50 mililitrami wyznaczonego roztworu do konserwacji serca. Opuść płaszcz wodny i zamknij kran trójdrożny po stronie trybu pracy. Zamknij zacisk, aby zatrzymać przepływ w kierunku lewej kaniuli przedsionkowej.
Następnie otwórz przepływ do kaniuli aortalnej. Teraz zamknij zacisk od strony Langendorffa i na obciążeniu następczym. Otwórz zacisk z linii kardioplegii.
Wypłukać 15 mililitrów roztworu kardioplegii z przewodu ciśnieniowego. Przepłucz serce kardioplegią przez kaniulę aorty i zbierz ścieki wieńcowe. Po trzech minutach zamknij zacisk kardioplegii i mały niebieski zacisk prowadzący do kaniuli aortalnej.
Umieść zacisk buldoga na kaniuli aortalnej i drugi zacisk buldoga na lewej kaniuli. Odłącz blok kaniuli serca od obwodu i umieść go w zlewce zawierającej kardioplegię w pojemniku na lód. Aby ponownie wykonać fuzję serca po przechowywaniu w niskiej temperaturze, należy ostrożnie przymocować blok płuco-serce po przechowywaniu w chłodni do obwodu perfuzyjnego.
Użyj strzykawki o rozmiarze 18 wypełnionej buforem Krebs-Henseleit, aby usunąć powietrze z kaniuli. Najpierw podłącz kaniulę aortalną, a następnie otwórz zacisk rurki po stronie Langendorffa. Podłącz ponownie lewą kaniulę i upewnij się, że powietrze zostało usunięte z kaniuli przed podłączeniem jej do obwodu perfuzyjnego.
Trzymaj stronę roboczą clamp zamknięty, aż nadejdzie czas przełączenia z Langendorff w tryb pracy. Przepływ aorty od 14 do 22 mililitrów na minutę skutkował dobrym przepływem Langendorffa. Po przełączeniu w tryb pracy przepływ z aorty wynoszący co najmniej 30 mililitrów na minutę ułatwiał przechowywanie serca Pomimo dobrych wyników wyjściowych, niektóre serca nie przyniosły dobrej regeneracji po długotrwałym przechowywaniu statycznym w niskich temperaturach.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół izolowanego, pracującego serca szczura ex vivo, opracowany w celu oceny strategii konserwacji serca dawcy. Protokół ten ma zastosowanie zarówno do statycznego przechowywania w zimnie, jak i do serc dawców pobranych po śmierci krążeniowej lub śmierci mózgowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia serca
- Biologia transplantacji
- Techniki konserwacji
Wprowadzenie
- Konserwacja serca dawcy ma kluczowe znaczenie dla sukcesu transplantacji.
- Obecne strategie mogą nie optymalizować powrotu funkcji po przeszczepieniu.
- Izolowane modele pracującego serca umożliwiają pomiary funkcjonalne.
- Zrozumienie metod konserwacji może poprawić wyniki kliniczne.
Cel badania
- W celu przetestowania strategii suplementacji w procesie konserwacji serca dawcy.
- W celu poprawy regeneracji funkcjonalnej po przechowywaniu w niskiej temperaturze lub niedokrwieniu na ciepło.
- W celu oceny skuteczności azotanu gliceryny i erytropoetyny w roztworach do konserwacji.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie układu do perfuzji izolowanego serca szczura.
- Ocena przepływu w aorcie i rzutu serca.
- Porównanie z aktualnymi klinicznymi strategiami konserwacji.
- Przeniesienie wyników do badań nad przeszczepem serca świni.
Główne wyniki
- Zidentyfikowano skuteczne strategie konserwacji serc dawców.
- Wykazano wskaźniki regeneracji funkcjonalnej z wykorzystaniem modelu izolowanego serca.
- Przedstawiono uzasadnienie dla dalszych badań na większych modelach zwierzęcych.
- Wskazano zalety protokołów izolowanego pracującego serca.
Wnioski
- Protokół izolowanego pracującego serca szczura jest cennym narzędziem do testowania strategii konserwacji.
- Wyniki mogą prowadzić do poprawy efektów transplantacji serca.
- Wskazane są dalsze badania w celu walidacji wyników w warunkach klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna konserwacja serca dawcy jest krytycznym punktem zwrotnym w procesie transplantacji, bezpośrednio wpływając na żywotność przeszczepu i wyniki pooperacyjne. Model izolowanego, pracującego serca szczura umożliwia rygorystyczną, ilościową ocenę strategii konserwacji, co zwiększa pewność prognostyczną przed przejściem do badań na dużych zwierzętach lub badań klinicznych. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji w zakresie portfolio poprzez ograniczanie ryzyka związanego z mechanizmami biologicznymi leżącymi u podstaw uszkodzenia reperfuzyjnego.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną analizę składników roztworu konserwującego w kontrolowanym systemie ex vivo.
- Wspiera biologiczne ograniczanie ryzyka poprzez izolację zmiennych wpływających na regenerację funkcji serca.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do potencjalnych strategii konserwacji przed przejściem do fazy translacyjnej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowaną platformę do ilościowej oceny rzutu serca, przepływu w aorcie oraz powiązanych parametrów.
- Umożliwia powtarzalną, zestandaryzowaną ocenę wielu formulacji konserwujących.
- Wspiera przygotowanie testów do późniejszego screeningu związków lub protokołów w badaniach nad transplantologią.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgadza punkty końcowe regeneracji funkcjonalnej z klinicznie istotnymi efektami transplantacji.
- Łączy odkrycia z etapu badań podstawowych z przedklinicznymi modelami na dużych zwierzętach, wspierając ciągłość translacyjną.
- Umożliwia dostosowanie strategii konserwacji do poziomu ryzyka w procesie wdrażania ich do praktyki klinicznej.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ten model ex vivo stanowi ogniwo łączące wczesną fazę odkryć z walidacją przedkliniczną, pełniąc funkcję krytycznego filtra dla strategii konserwacji kandydatów przed rozpoczęciem kosztownych badań na dużych zwierzętach lub badań klinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu strategii suplementacji na uszkodzenia reperfuzyjne.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników do analizy porównawczej roztworów konserwujących.
- Analityka: Umożliwia pomiar przepływu aortalnego, rzutu serca i innych punktów końcowych funkcji w celu podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań.
- Badania translacyjne: Stanowi pomost mechanistyczny do przedklinicznych i klinicznych badań nad transplantacją.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, zestandaryzowaną platformę do ciągłej optymalizacji protokołów konserwacji narządów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną co do skuteczności strategii konserwacji i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność ocen odzyskiwania funkcji.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez priorytetyzację wyłącznie zwalidowanych strategii do dalszego rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów do konserwacji serc donora.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu fizjologii serca oraz technik perfuzji ex vivo.
- Wymaga specjalistycznej aparatury perfuzyjnej oraz możliwości pomiaru funkcji w czasie rzeczywistym.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów i procesów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych układów organów lub gatunków może wymagać modyfikacji protokołu.
- Zmienność w zakresie regeneracji funkcjonalnej musi zostać uwzględniona w projekcie doświadczalnym i interpretacji wyników.
