Name: Wykorzystanie izolowanego modelu pracującego serca szczura do testowania strategii zachowania serca dawcy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj izolowany model pracującego serca szczura do testowania strategii zachowania serca dawcy. Ta metoda umożliwia ocenę czynnościową i poprawę wyników transplantacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisane tutaj badania zostały sfinansowane z grantów przyznanych P.S Macdonaldowi przez National Health and Medical Research Council Australia, St Vincent's Clinic Foundation oraz NSW Health Cardiovascular Research Capacity Senior Investigator Grant.

Wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (Australia). Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Instytutu Badań Medycznych Garvan (Sydney, Australia).
1. Przygotowanie buforu Krebs-Henseleit (KH)
<ol>
	<li>Przygotować 2 l 20-krotnego roztworu podstawowego buforu KH zawierającego 2,36 M NaCl, 0,094 M KCl, 0,024 M MgSO4, 0,024 M KH2PO4. Rozdzielić porcję do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przed eksperymentem przygotuj dwie 2-litrowe kolby Erlenmyera zawierające 1x bufor KH zawierający 1900 ml wody dejonizowanej, 100 ml 20x buforu podstawowego KH, 4,20 g NaHCO3 (25 mM) i 3,96 g glukozy (11 mM).
	<ol>
		<li>Umieścić kolby buforowe w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i sgazować roztwór karbogenem (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla, natężenie przepływu ustawione na 2 l/min) przez kamienie napowietrzające (wsuwany filtr wlotowy) przez 5 minut, a następnie dodać 2,8 ml 1 M CaCl2 (1,4 mM). Kontynuować bulgotanie roztworu przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem doświadczenia. Użycie kamienia napowietrzającego pomaga w równomiernym napowietrzeniu bufora.</li>
		<li>Umieść niewielką objętość (~50 ml) buforu w okrągłym metalowym naczyniu w temperaturze -20 °C, aby ostygł i utworzył warstwę mrożonego buforu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie obwodu perfuzji
<ol>
	<li>Upewnij się, że wszystkie rurki i szklane naczynia są czyste i nie ma widocznych narośli/zanieczyszczeń.</li>
	<li>Ustaw wysokości szklanych komór tak, aby odpowiadały wymaganym ciśnieniom perfuzji w oparciu o 1 cm H2O odpowiadające 1,36 mmHg: Langendorff - serce 100 cm (około 75 mmHg), obciążenie wstępne robocze bok do serca 15 cm (około 11 mmHg), komora od serca do obciążenia następczego 100 cm (około 75 mmHg).</li>
	<li>Rozpocznij cyrkulację gorącej wody wokół obwodu co najmniej 10 minut przed perfuzją serca.</li>
	<li>Umieść filtry z mikrofibry (1,2 μm) w uchwytach filtrów i mocno je zabezpiecz.</li>
	<li>Zalać obwód buforem KH, upewniając się, że całe powietrze zostało usunięte, i użyj rurki kontrolującej przepływ clamp, aby wyregulować przepływ po stronie Langendorffa (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A, B) do ~ 50 ml / min. Wolniejszy przepływ pozwala na łatwą kaniulację aorty i zapobiega przemieszczeniu się serca przed wiązaniem. Umieść termometr w obwodzie za pomocą złącza rurki w kształcie litery T, aby monitorować temperaturę bufora na poziomie ~37 °C.</li>
</ol>
3. Konfiguracja oprogramowania Lab Chart (analiza danych)
<ol>
	<li>Upewnij się, że Powerlab (system akwizycji danych) i przepływomierz są włączone i podłączone do komputera przed otwarciem oprogramowania do analizy danych.</li>
	<li>Otwórz nowy plik.</li>
	<li>Skonfiguruj zbieranie danych, wybierając menu rozwijane Ustawienia i wybierając Ustawienia kanału. Wybierz ciśnienie w aorcie, przepływ w aorcie i tętno (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Skonfiguruj każdy kanał z ustawieniami pokazanymi w Rysunek 2B.</li>
</ol>
4. Przygotowanie zwierzęcia do izolacji serca szczura
UWAGA: Metodologia izolacji i perfuzji serca szczura dla serc bez DBD i DCD do przechowywania statycznego w zimnej temperaturze jest opisana poniżej. Metody instrumentacji serca do obwodu perfuzyjnego są stosunkowo podobne, niezależnie od zastosowanej metody dawstwa. Różnice w protokole dawstwa serca szczura DBD i DCD występują przede wszystkim od momentu zastosowania znieczulenia zwierzęcia do momentu wycięcia serca od zwierzęcia.
<ol>
	<li>Zważ zwierzę, upewniając się, że jego waga wynosi >330 g. Idealny zakres wagowy dla samców szczurów to 330-420 g.</li>
	<li>Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (80 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Zapewnij odpowiednią płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego w oparciu o brak odruchu pedałowania (odruch szczypania palców) i odruchu mrugania oczami.</li>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej, zabezpieczając kończyny taśmą. Podawaj zwierzęciu tlen przez stożek nosowy.</li>
	<li>Miej metalowy pojemnik buforowy KH i mały metalowy pojemnik z lodem w stacji prosektoryjnej. Namocz gazę o wymiarach 7,5 cm x 7,5 cm w buforze KH i umieść ją na pojemniku z lodem.</li>
	<li>Po potwierdzeniu odpowiedniej płaszczyzny znieczulenia chirurgicznego, należy ogolić skórę w miejscu nacięcia chirurgicznego i oczyścić skórę środkami aseptycznymi, takimi jak betadyna lub 70% alkohol. Wykonaj boczne nacięcie w poprzek brzucha (laparotomia) i przesuń żołądek i jelita na bok, aby umożliwić dostęp do lewej żyły nerkowej. Wstrzyknąć 1500 j.m. heparyny i uciskać miejsce wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie. Odczekaj 1-2 minuty, aby heparyna zaczęła krążyć, zanim będziesz kontynuować pobieranie serca.</li>
	<li>Otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając klatkę piersiową po obu stronach i przecinając przeponę. Ostrożnie przytrzymaj i podnieś blok płuco-serce, przecinając wzdłuż aorty zstępującej, upewniając się, że łuk aorty pozostaje nienaruszony. Pozwoli to na zachowanie wystarczającej długości aorty do kaniulacji.</li>
	<li>Szczur jest poddawany eutanazji poprzez usunięcie serca i płuc pod narkozą. Zanurz blok płuco-serce w błocie pośniegowym buforowym KH, aby umożliwić zatrzymanie serca.</li>
</ol>
5. Kaniulacja serca do izolowanego działającego obwodu perfuzji serca
<ol>
	<li>Przenieś blok płuco-serce na gazę na lodzie. Wypreparuj nadmiar tłuszczu wokół aorty, przytnij aortę, aby pozostawić 3-5 mm długości do kaniulacji i wykonaj małe nacięcie ~1-2 mm w tętnicy płucnej. Umożliwi to drogę dla ścieków wieńcowych.</li>
	<li>Umieść przycięty blok płuco-serce (jeszcze na lodzie) bezpośrednio pod kaniulami. Wyreguluj przepływ od strony Langendorffa za pomocą rurki kontrolującej przepływ clamp, aby ułatwić kaniulację aorty. Ostrożnie nałóż aortę na lewą kaniulę, przytrzymaj ją czarnym zaciskiem i zawiąż jedwabnym szwem 2-0.</li>
	<li>Zwiększ przepływ z perfuzji Langendorffa, całkowicie otwierając zacisk rurki sterującej przepływem. Otwórz zacisk obciążenia następczego. Upewnij się, że z komory Langendorffa jest ciągły przepływ. Rozpocznij monitorowanie aktywności serca za pomocą oprogramowania. 
	UWAGA: jeśli wartość przepływu w aorty na wyświetlaczu przepływomierza wynosi <10 ml/min, upewnij się, że arteriotomia płucna ma wystarczający rozmiar. Niski ślad/wartość przepływu w aortze może również wskazywać, że kaniula aorty została wprowadzona zbyt daleko.</li>
	<li>Wyreguluj blok płuco-serce tak, aby przednia powierzchnia płuc była skierowana w stronę operatora. Zawiąż lewy płat płuca jedwabnym szwem 2-0 i odetnij nadmiar lewej tkanki płucnej. Zawiąż pozostałe płaty płuc jednym ruchem jedwabnym szwem 2-0 i przetnij tkankę. Obróć serce tak, aby związane płuca były skierowane do tyłu.</li>
	<li>Za pomocą małych nożyczek Vannas odetnij 2-3 mm krawędź uszka lewego przedsionka, upewniając się, że uzyskano mały otwór w przedsionkach. Ostrożnie kaniuluj lewy uszek przedsionkowy do lewej kaniuli, przytrzymaj go czarnym zaciskiem i zawiąż jedwabnym szwem 2-0. <silna klasa="xfig">Rysunek 3A pokazuje rozmieszczenie obu kaniul.</li>
	<li>Wyreguluj płaszcz wodny komory serca tak, aby serce znajdowało się pośrodku komory.</li>
	<li>Otwórz przetwornik ciśnienia na powietrze i wyzeruj przetwornik ciśnienia w oprogramowaniu, wybierając menu rozwijane Ciśnienie aorty > Bridge Amp > Zero. Kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Perfuzja serca w trybie Langendorffa przez 10 minut. Upewnij się, że przepływ w aortze Langendoffa wynosi 10-20 ml/min (idealnie 20 ml/min).</li>
	<li>Przed przełączeniem trybu pracy należy upewnić się, że kamień napowietrzający (wsuwany filtr wlotowy) ze zbiornika buforowego Langendorff KH jest umieszczony w roboczym zbiorniku buforowym KH.</li>
	<li>Przełącz serce w tryb pracy, zamykając duży zacisk prowadzący do kaniuli aortalnej i otwierając przepływ prowadzący do uszka lewego przedsionka. Otwórz kran trójdrożny prowadzący od działającego perfuzatu. Przenieść wspólny przewód powrotny (zabierając bufor KH z powrotem do zbiornika) ze zbiornika Langendorff do zbiornika roboczego.</li>
	<li>Płuczkę serca w trybie roboczym przez 15 minut. Wartości przepływu w aortze muszą wynosić >30 ml/min pod koniec 15-minutowej perfuzji. Gdy serce się ustabilizuje, zacznij rejestrować dane w oprogramowaniu do analizy danych.</li>
	<li>Zmierz ścieki wieńcowe (przepływ wieńcowy) po 1 min, 5 minutach, 10 minutach i 15 minutach 
	UWAGA: Wartości przepływu wieńcowego powinny wynosić od 10 do 20 ml/min. Przepływ wieńcowy większy niż 22 ml / min na ogół wskazuje na nieszczelność pochodzącą z niezawiązanego naczynia płucnego. Tętno powinno wynosić od 200 do 300 uderzeń na minutę. Ścieki wieńcowe można pobrać do dalszej analizy markerów uszkodzenia tkanek (np. troponiny-I, uwalniania dehydrogenazy mleczanowej).</li>
</ol>
6. Podawanie kardioplegii w celu zimnego statycznego przechowywania serca
<ol>
	<li>Napełnij komorę kardioplegii (umieszczoną na wysokości 60 cm, aby uzyskać ciśnienie perfuzyjne około 40 mmHg) 50 ml wyznaczonego roztworu konserwującego serce (z suplementacją lub bez).</li>
	<li>Opuść płaszcz wodny i zamknij kran trójdrożny po stronie trybu pracy.</li>
	<li>Zatrzymaj przepływ w kierunku lewej kaniuli przedsionkowej, zamykając zacisk.</li>
	<li>Otwórz przepływ do kaniuli aortalnej.</li>
	<li>Zamknąć zacisk od strony Langendoffa i na obciążeniu następczym.</li>
	<li>Otwórz zacisk z linii kardioplegii i wypłucz 15 ml kardioplegii z przewodu ciśnieniowego. Zamknij kran na przewodzie ciśnieniowym.</li>
	<li>Pozwól, aby serce zostało przepłukane kardioplegią przez kaniulę aortalną i zbierz ścieki wieńcowe. Uruchom kardioplegię przez 3 minuty i zapisz objętość podanej kardioplegii.</li>
	<li>Zatrzymaj rejestrowanie danych w oprogramowaniu i zapisz plik.</li>
	<li>Po 3 minutach zamknij zacisk kardioplegii i mały niebieski zacisk prowadzący do kaniuli aortalnej.</li>
	<li>Umieść zacisk buldoga na kaniuli aortalnej i drugi zacisk buldoga na lewej kaniuli. Odłącz blok kaniuli serca od obwodu i umieść go w zlewce zawierającej kardioplegię w pojemniku na lód (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B, C).</li>
	<li>Przechowuj serce w lodówce przez 6 godzin (lub żądany czas przechowywania w chłodni).</li>
</ol>
7. Reperfuzja serca po przechowywaniu w niskiej temperaturze
<ol>
	<li>Przygotować bufor KH zgodnie z punktem 1.</li>
	<li>Zalać obwód perfuzyjny zgodnie z sekcją 2.</li>
	<li>Otwórz zapisany plik z perfuzji linii bazowej.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij blok kaniuli serca z pojemnika na lód i przymocuj go do obwodu perfuzyjnego. Przed ponownym podłączeniem kaniuli aortalnej użyj strzykawki 18 G wypełnionej buforem KH, aby usunąć powietrze z kaniuli. Najpierw podłącz kaniulę aortalną, otwórz rurkę clamp po stronie Langendorffa i upewnij się, że rurka obciążenia wtórnego clamp jest otwarty.</li>
	<li>Podłącz ponownie lewą kaniulę przedsionkową, upewniając się, że powietrze zostało usunięte z kaniuli przed podłączeniem do obwodu perfuzyjnego. Trzymaj stronę roboczą clamp zamknięty, aż nadejdzie czas przełączenia z Langendorff w tryb pracy.</li>
	<li>Perfuzja serca w trybie Langendorffa przez 15 minut. Upewnij się, że rejestracja danych rozpoczęła się na początku reperfuzji Langendorffa.</li>
	<li>Przed przełączeniem w tryb pracy należy umieścić oba bulgoczące kamienie w buforze KH, otworzyć 3-kierunkowy kran po stronie roboczej i przenieść wspólny przewód powrotny do zbiornika roboczego.</li>
	<li>Zamknij biały zacisk Langendorffa, otwórz biały zacisk po stronie roboczej i wykonuj płuczkę serca przez 30 minut. Zmierz i zbierz ścieki wieńcowe w wyznaczonych punktach czasowych do dalszej analizy (np. markery uszkodzenia serca). Upewnij się, że zatrzymałeś i ponownie uruchomiłeś nagrywanie oprogramowania, aby rozpocząć nowy segment (lub alternatywnie dodać komentarz).</li>
	<li>Po około 15 minutach reperfuzji w trybie pracy zamknij kran trójdrożny.</li>
	<li>Pod koniec reperfuzji zapisz plik danych, zatrzymaj przepływ przez obwód i odłącz blok serca. Pobrać próbki z lewej komory do przetwarzania histologicznego i/lub zamrozić je na zatrzask do przyszłych badań (np. ekstrakcji białka do badań western blot).</li>
	<li>Wyjmij filtry z uchwytów filtrów, opróżnij bufor z obwodu i dwukrotnie przepłucz 5 l wody destylowanej. 
	UWAGA: Chociaż nie jest to konieczne, pomaga podgrzać wodę destylowaną w dużym pojemniku w łaźni wodnej.</li>
</ol>
8. Analiza funkcjonalnego odzyskiwania
<ol>
	<li>Otwórz plik LabChart.</li>
	<li>Podświetl region, w którym trwa co najmniej 30 sekund nagrywania, a następnie kliknij polecenie > Dodaj zaznaczenie danych LUB Wielokrotne dodawanie do danych. Spowoduje to dodanie żądanych parametrów do pliku DataPad w oprogramowaniu.</li>
	<li>Wybierz menu rozwijane Okno > DataPad.</li>
	<li>Zaznacz i skopiuj wartości odzyskiwania z DataPad do arkusza kalkulacyjnego w celu funkcjonalnej analizy odzyskiwania. Oblicz odzysk funkcjonalny jako procent odpowiedniej wartości bazowej1,6,7.</li>
</ol>

Optimization of Donor Heart Preservation Using a Working Rat Heart Perfusion Model

<ol><li>Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardio-protective+signalling+by+glyceryl+trinitrate+and+cariporide+in+a+model+of+donor+heart+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung+Circ%22%5BJournal%5D)">Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation.</a> Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).</li>
<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+preservation+of+the+rat+heart+after+prolonged+hypothermic+ischemia+with+erythropoietin-supplemented+Celsior+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Enhanced preservation of the rat heart after prolonged hypothermic ischemia with erythropoietin-supplemented Celsior solution.</a> J Heart Lung Transplant. 32 (6), 633-640 (2013).</li>
<li>Chew, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+of+donation+after+circulatory+death+heart+transplantation+in+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia.</a> J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).</li>
<li>Dhital, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+heart+transplantation+with+distant+procurement+and+ex-vivo+preservation+of+donor+hearts+after+circulatory+death%3A+a+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series.</a> Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).</li>
<li>Joshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+from+DCD+donors+in+Australia%3A+Lessons+learned+from+the+first+74+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation from DCD donors in Australia: Lessons learned from the first 74 cases.</a> Transplantation. 107 (2), 361-371 (2023).</li>
<li>Villanueva, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recovery+after+dantrolene-supplementation+of+cold+stored+hearts+using+an+ex+vivo+isolated+working+rat+heart+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional recovery after dantrolene-supplementation of cold stored hearts using an ex vivo isolated working rat heart model.</a> PLoS One. 13 (10), e205850(2018).</li>
<li>Villanueva, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardioprotective+potential+of+the+sodium-glucose+cotransporter+2+inhibitor+empagliflozin+in+donor+heart+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">The cardioprotective potential of the sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor empagliflozin in donor heart preservation.</a> J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1151-1153 (2020).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+the+STAT3+pathway+in+the+cardioprotective+efficacy+of+zoniporide+in+a+model+of+myocardial+preservation+-+the+rat+isolated+working+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Critical role of the STAT3 pathway in the cardioprotective efficacy of zoniporide in a model of myocardial preservation - the rat isolated working heart.</a> Br J Pharmacol. 162 (3), 633-647 (2011).</li>
<li>Cropper, J. R., Hicks, M., Ryan, J. B., Macdonald, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardioprotection+by+cariporide+after+prolonged+hypothermic+storage+of+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Cardioprotection by cariporide after prolonged hypothermic storage of the isolated working rat heart.</a> J Heart Lung Transplant. 22 (8), 929-936 (2003).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+functional+recovery+of+the+heart+donated+after+circulatory+death+determination+with+antemortem+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Enhanced functional recovery of the heart donated after circulatory death determination with antemortem heparin.</a> J Heart Lung Transplant. 39 (6), 607-609 (2020).</li>
<li>Villanueva, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+increasing+donor+age+on+myocardial+ischemic+tolerance+in+a+rodent+model+of+donation+after+circulatory+death%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Direct%22%5BJournal%5D)">The effect of increasing donor age on myocardial ischemic tolerance in a rodent model of donation after circulatory death.</a> Transplant Direct. 7 (6), e699(2021).</li>
<li>Kumarasinghe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+heart+function+from+older+donors+using+pharmacologic+conditioning+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Improved heart function from older donors using pharmacologic conditioning strategies.</a> J Heart Lung Transplant. 35 (5), 636-646 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Biorąc pod uwagę wrażliwy charakter podstawowej funkcji serca, należy zachować ostrożność, aby utrzymać zestaw do perfuzji w czystości i z kompatybilnymi komponentami. Na przykład należy użyć odpowiedniej rurki PVC. Niektóre materiały rurek, takie jak silikon, mogą przyczyniać się do zmniejszenia przepływu i kurczliwości aorty, co może być spowodowane utratą tlenu przez rurkę. Chociaż na rynku dostępne są izolowane działające obwody perfuzji serca szczura, większość z nich jest używana głównie do perfuzji Langendorffa. Ogólnie rzecz biorąc, pomiary funkcjonalne można uzyskać w modelu perfuzji Langendoffa poprzez wprowadzenie cewnika balonowego do lewej komory w celu uzyskania pomiarów ciśnienia rozkurczowego lewej komory (LVDP). Jednak możliwość pomiaru surowego przepływu aorty i pojemności minutowej serca w systemie perfuzyjnym Langendoffa nie jest możliwa. Główną zaletą protokołu IWRH jest możliwość uzyskania pomiarów funkcjonalnych przepływu z aorty i rzutu serca bez konieczności dodatkowych interwencji serca (tj. cewnika balonowego). Istnieją komercyjne opcje działającego systemu perfuzji serca szczura i chociaż można je dostosować do indywidualnych wymagań badania, systemy te mogą być kosztowne.
W protokole znajdują się krytyczne kroki mające na celu zapewnienie optymalnej wyjściowej funkcji serca gryzonia podczas perfuzji. Przygotowanie roztworów buforowych KHB nie powinno być starsze niż 4 tygodnie. Podczas zalewania obwód perfuzyjny musi być wolny od pęcherzyków powietrza. Należy zachować ostrożność podczas kaniulacji uszka lewego przedsionka. Nadmierne obchodzenie się z tkanką może zwiększyć ryzyko rozdarcia, a także może przyczynić się do funkcjonalnej drażliwości serca.
Jakość działania obwodu perfuzyjnego IWRH można ogólnie określić na podstawie odczytów wyjściowych uzyskanych w sercach (AF > 30 ml / min, CF ~ 20 ml / min). Dalsze badania kontroli jakości w modelu CSS można przeprowadzić poprzez zatrzymanie i przechowywanie serca w roztworze konserwującym Celsior uzupełnionym 1 μmol/l zoniporide plus 0,1 mg/ml triazotanu glicerolu. Serca zatrzymane preparatem Celsior uzupełnione trójazotanem glicerolu i zoniporydem gwarantują natychmiastowy powrót do reperfuzji Langendorffa i ostateczny powrót funkcjonalny na poziomie 40-60% po 6 godzinach przechowywania w chłodni. W razie wątpliwości, czy platforma działa dobrze, ta suplementacja kontroli jakości jest przydatna do przetestowania.
Metody wykorzystania serc gryzoni pozyskanych w drodze dawstwa po śmierci krążeniowej zostały opisane wcześniej10,11. Krótko mówiąc, szczury są znieczulane, tętnica szyjna jest kaniulowana i uzyskuje się odczyty ciśnienia. Heparyna (500 j.m.) jest wstrzykiwana przez kaniulę tętnicy szyjnej. Tchawica jest podwiązana, aby zainicjować odłączenie aparatury podtrzymującej życie. Po osiągnięciu wymaganego czasu ciepłego niedokrwienia serce można wyciąć i wprowadzić do obwodu perfuzyjnego. W celu podania roztworu konserwującego do serca DCD, 60 ml roztworu konserwującego przepłukuje się przez aortę (~20 ml / min) przez przewód ciśnieniowy w obwodzie. Naczynia płucne są wiązane, płuca są preparowane, wprowadzana jest lewa kaniula, a następnie 40 ml roztworu konserwującego jest przepłukiwane przez przewód ciśnieniowy. Serce jest następnie perfundowane zgodnie z powyższym protokołem. Odzyskiwanie funkcjonalne jest traktowane jako surowa wartość hemodynamiki funkcjonalnej, a analiza statystyczna jest przeprowadzana poprzez porównanie wartości z tymi sercami, które były operowane pozorami (jednak bez DCD przepłukanego na platformie).
Metody wykorzystania serc gryzoni pozyskanych po śmierci mózgu zostały już wcześniej opisane12. Krótko mówiąc, zwierzęta są znieczulane, intubowane i wentylowane, z monitorowaniem hemodynamicznym zgodnie z protokołem gryzoni DCD. W czaszce skroniowo-ciemieniowej wykonuje się otwór na zadzior, a cewnik do embolektomii 3F umieszcza się podtwardówkowo. Fałszywe kontrolki mają otwory na zadziory, ale nie wprowadzają cewnika. Balon jest napełniany 0,3 ml wody przez 2 minuty i utrzymywany napompowany przez 1 godzinę. Po 1 godzinie obserwacji hemodynamicznej serca są eksplantowane i umieszczane na izolowanym działającym obwodzie perfuzji serca, rejestrowane są pomiary podstawowe, podawana jest kardioplegia, a serca są przechowywane w zimnym miejscu, jak opisano powyżej.
Głównym ograniczeniem korzystania z obwodu perfuzyjnego IWRH jest brak możliwości użycia buforu perfuzyjnego opartego na krwi do krążenia w systemie. Niemożliwe byłoby pozyskanie wystarczającej ilości krwi gryzoni, aby dodać ją do perfuzatu; Dlatego perfuzja krwi nie jest możliwa. Alternatywne modele, takie jak heterotopowy przeszczep serca u gryzoni lub badania ortotopowego przeszczepu serca na dużych zwierzętach, prawdopodobnie będą musiały zostać przeprowadzone w celu zbadania wpływu perfuzji krwi. Jednak te alternatywne metody wymagają specjalistycznej wiedzy w zakresie umiejętności mikrochirurgicznych i/lub dużych placówek chirurgicznych zwierząt oraz doświadczonych anestezjologów, perfuzjonistów i kardiochirurgów.

Na sukces przeszczepu serca może mieć duży wpływ metoda konserwacji serca dawcy. Serca dawców są poddawane unieruchomieniom niedokrwiennym podczas procesu pobierania, transportu i przeszczepiania narządów. Stopień uszkodzenia niedokrwiennego narządu dawcy można złagodzić, wybierając odpowiednią strategię zachowania serca dawcy. Przechowywanie statyczne w chłodni (CSS) pozostaje najbardziej wykonalną i powszechną metodą konserwacji serca dawcy; jednak CSS niekoniecznie musi być najlepszą opcją dla wszystkich ścieżek dawstwa serca. Na przykład serca pozyskane za pośrednictwem szlaku dawstwa po śmierci krążeniowej (DCD) są utrzymywane i oceniane pod kątem żywotności za pomocą normotermicznej perfuzji maszynowej, podczas gdy serca pozyskane za pośrednictwem ścieżki dawstwa po śmierci mózgu (DBD) mogą być konserwowane za pomocą CSS lub hipotermicznej perfuzji maszynowej. Innym ważnym wyznacznikiem zastosowanej strategii konserwacji jest ilość ciepłego niedokrwienia (w przypadku DCD) lub zimnego niedokrwienia (w przypadku DBD), na które narażone jest serce podczas pobierania i transportu narządów.
Wiele ośrodków stosuje dodatkowe farmakologiczne uzupełnienie roztworu do konserwacji serca w celu zwiększenia tolerancji niedokrwiennej i poprawy funkcji serca po przeszczepie. Badania na gryzoniach przeprowadzone w naszym laboratorium wykazały, że suplementacja kardioplegii erytropoetyną i trójazotanem glicerolu była w stanie znacznie poprawić regenerację funkcji serca po długotrwałym przechowywaniu serca dawcy w chłodni1,2. Badania te następnie przeszły do badań nad zachowaniem serca dawcy na świniach i dostarczyły podstaw przedklinicznych, które doprowadziły do włączenia erytropoetyny i trójazotanu glicerolu do roztworu kardioplegii serc pobranych za pośrednictwem szlaku DCD z wykorzystaniem normotermicznej perfuzji maszynowej3,4,5. Obecnie suplementacja erytropoetyną i trójazotanem glicerolu jest również stosowana w australijskich oddziałach transplantacyjnych do klinicznych pobrań serca DBD z udziałem CSS. Ogólnym celem opisanego poniżej protokołu perfuzji izolowanego pracującego serca szczura (IWRH) jest przetestowanie strategii zachowania serca dawcy w warunkach laboratoryjnych i przetestowanie ich skuteczności w zachowaniu funkcji serca dawcy po reperfuzji. Opisany izolowany protokół pracy serca szczura jest stosowany od ponad dwóch dekad w naszym laboratorium i okazał się niezwykle przydatny w badaniach przesiewowych pod kątem potencjalnych suplementów i/lub strategii, które mogą poprawić zachowanie serca dawcy2,7,8,9.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml bezbarwna probówka Eppendorffa, 1000 w opakowaniu</td><td>Bio Strategy Pty Ltd</td><td>0030.125.150</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centów/probówki (S) Rękaw/25 PP ctn/500</td><td>Sigma-aldrich Pty Ltd</td><td>CLS430791-500ea</td> Zestaw przetworników/<td></td></tr><tr><td>BP</td><td>ADInstruments</td><td>MLT1199</td><td>Data Acquisition</td></tr><tr><td>Bridge Amp</td><td>ADInstruments</td><td>FE221</td><td>Akwizycja danych</td></tr><tr><td>Carbogen 555G2</td><td>BOC</td><td>BOC002</td><td></td></tr><tr><td>Termometr Checktemp1</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI98509</td><td>Zacisk do budowy przyponu</td></tr><tr><td>1/4-7/16 PK 12</td><td>Thomas Scientific</td><td>2848Y40</td><td>Zacisk do budowy przyponu</td></tr><tr><td>z trzpieniem przedłużającym Med.</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847T08</td><td>Zacisk do budowy wiertni</td></tr><tr><td>z trzpieniem przedłużającym Sm.</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847T02</td><td>Klipsy do budowy platformy</td></tr><tr><td>, naczynie, 60 g Spójne ciśnieniowo</td><td>Scientific</td><td>14121</td><td>Sprzęt chirurgiczny</td></tr><tr><td>Zamknięte złącze</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847E25</td><td>Rig Construction</td></tr><tr><td>Covidien Sofsilk 2-0 wstępnie przycięty 45 cm pudełko z 24</td><td>specjalistycznymi artykułami medycznymi</td><td>S195</td><td>Chirurgiczne materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>Wykonany na zamówienie odgazowywacz z płaszczem 250 ml</td><td>Niestandardowe dmuchane szkło Pty Ltd</td><td>N/A</td><td>Rig Construction</td></tr><tr><td>Custom Made 750 mL Reservoir</td><td>Custom Blown Glassware Pty Ltd</td><td>N/A</td><td>Rig Construction</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza Bezwodna SigmaUltra</td><td>Sigma-aldrich Pty Ltd</td><td>G7528-1Kg</td><td>Aby wykonać dwukanałową konsolę bufora Krebs</td></tr><tr><td></td><td>ADInstruments</td><td>TS402</td><td>Akwizycja danych</td></tr><tr><td>Kolby Erlenmyera 2 L&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr Mikrofibra typ GF/C włókno szklane 47 mm, 100</td><td>Bio-strategy Pty Ltd</td><td>1822047</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, 15 cm, 0,3 mm, CRVD</td><td>Coherent Scientific</td><td>14114</td><td>Sprzęt chirurgiczny Zaciski</td></tr> z <tr><td>czterema bolcami z długim ramieniem 9 mm x 115 mm do trzymania przedmiotów o średnicy 2-70 mm. Powlekany winylem</td><td>Met-App Australia Pty Ltd</td><td>1352</td><td></td></tr><tr><td>Cyrkulator grzejnika budowlanego. Cyfrowe sterowanie półprzewodnikowe. (1020 watów/240 woltów)</td><td>Thermoline Scientific</td><td>TU3</td><td>Rig Construction</td></tr><tr><td>Heparyna 5000 U/5 mL pudełko 50 Pfizer 02112115</td><td>Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd</td><td>1258693</td><td>Drugs</td></tr><tr><td>Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL</td><td>Cenvet Australia Pty Ltd</td><td>X5010</td><td>Anaesthetic</td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Coherent Scientific&nbsp;</td><td>CS-WPI-14117</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 100 mg/50 ml</td><td>Provet (NSW) Pty Ltd</td><td>KETAI1</td><td>Znieczulający</td></tr><tr><td>siarczan magnezu siedmiowodny AR 500 g Chemsupply</td><td>Bio Strategy Pty Ltd</td><td>MA048-500g</td><td>Do produkcji krebs</td></tr><tr><td>Buffer męski/żeński adapter zawiasowy</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847V08</td><td>Konstrukcja platformy</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Łatwa w ładowaniu głowica do rur precyzyjnych, PPS, wirnik</td> <td>CRSJohn Morris</td><td>1015164</td><td>Rig Construction</td></tr><tr><td>Nożyczki Metzenbaum, zakrzywione 11,5 cm</td><td>Coherent Scientific</td><td>WPI-501748</td><td>Sprzęt chirurgiczny</td></tr><tr><td>Nożyczki Metzenbaum, 14,5 cm proste</td><td>Coherent Scientific</td><td>WPI-501252</td><td>Sprzęt montażowy do sprzętu chirurgicznego</td></tr><tr><td>F/2-HEADS SS</td><td>John Morris</td><td>1014414</td><td>montażowe do głowic pomp</td></tr><tr><td>Łącznik otwarty</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847E05</td><td>Budowa platformy</td></tr><tr><td>Paraformadehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Przetwarzanie próbek</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (AnalaR NORMAPUR) 500 g</td><td>VWR Chemicals&nbsp;</td><td>26764.26</td><td>Do produkcji jednozasadowego fosforanu potasu buforu Krebsa</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td><td>P5379-500g</td><td>Aby wykonać Krebs Buffer</td></tr><tr><td>Powerlab 2/26, 2-kanałowy rejestrator + oprogramowanie Labchart</td><td>ADInstruments</td><td>ML826</td><td>Sprzęt komputerowy i oprogramowanie</td></tr><tr><td>Precyzyjny czujnik przepływu XN Inline, 3,2 mm (1/8") ID ME4PXN-KR37 XF</td><td>ADInstruments</td><td>ME4PXN</td><td>Skalpel do budowy platform</td></tr><tr><td>z rękojeścią jednorazowy #11 pkt/10</td><td>BSN Medical (Aust) Pty Ltd</td><td>73252-36</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka silikonowa do Swinnex 47 mm 5 / PK</td><td>Merck Millipore</td><td>SX0004701</td><td>Rig Construction</td></tr><tr><td>Silikonowy O-ring 5-329 10/PK</td><td>Merck Millipore</td><td>XX1104707</td><td>Rig Construction</td></tr><tr><td>Pojedynczy zacisk biurety</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847T32</td><td>Konstrukcja platformy</td></tr><tr><td>Wsuwany wlot filtra Wielkość porów 10 i mikro; m (bubbler)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>59277</td><td>Rig Construction</td></tr><tr><td>Sm. 360 Łącznik obrotowy</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847E35</td><td>Konstrukcja wiertni</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td><td>S6297 - 250g</td><td>Do produkcji Krebs Buffer</td></tr><tr><td>Swinnex Filter Holder, 47 mm</td><td>Merck Millipore</td><td>SX0004700</td><td>Rig Construction</td></tr><tr><td>strzykawki 1 mL pudełko/100</td><td>Becton Dickinson Pty Ltd</td><td>302100</td><td></td></tr> Trzy <tr><td>zaciski bolcowe o średnicy 9 mm x długim ramieniu 125 mm i podwójnej do trzymania 5-80 mm</td><td>Met-App Australia Pty Ltd</td><td>1356</td> Moduł przepływomierza <td>rurowego do budowy platform</td></tr><tr><td>TS410</td><td>ADInstruments</td><td>TS410</td><td>Rurka do akwizycji danych</td></tr><tr><td>PVC 6,35 mm ID x 9,52 mm OD 50ft Rolka 15,24 m, przezroczysta, bez ftalanów DEHP, klasa spożywcza spełnia REAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL 8701-0600</td><td>Budowa platformy</td></tr><tr><td>Rurka PVC 7,94 mm ID x 11,1 mm OD 50 stóp Rolka 15,24 m, przezroczysta, bez ftalanów DEHP, dopuszczona do kontaktu z żywnością REAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL 8701-0900</td><td>Rurka do budowy wiertni</td></tr><tr><td>PVC 9,52 mm ID x 12,7 mm OD 100ft Rolka</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL 8701-4120</td><td>Nożyczki do budowy platform</td></tr><tr><td>Vannas, 8,5 cm, proste, ostrza 7 mm</td><td>Spójne naukowe</td><td>WPI-500-086</td><td>Sprzęt</td></tr> <tr><td>chirurgicznyŁaźnia wodna 30 litrów z tacą podwieszaną</td><td>Thermoline Scientific</td><td>TLWB-30</td><td>Rig Construction</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie izolowanego modelu pracującego serca szczura do testowania strategii zachowania serca dawcy

Using an Isolated Working Rat Heart Model to Test Donor Heart Preservation Strategies

Optymalizacja rozwiązań do konserwacji serca dawcy odegrała kluczową rolę w zmniejszeniu uszkodzeń niedokrwienno-reperfuzyjnych w sercach dawców podczas pobierania narządów, transportu i przeszczepów. Wcześniejsze prace z naszego laboratorium wykazały, że dodanie trójazotanu glicerolu i erytropoetyny do roztworów konserwujących serce dawcy może znacznie poprawić regenerację funkcji serca po długotrwałym przechowywaniu w chłodni i po śmierci krążeniowej serca. Ten protokół suplementacji został wdrożony do użytku klinicznego na oddziałach transplantacyjnych w Australii, Belgii i Wielkiej Brytanii. W tym miejscu przedstawiamy protokół testowania strategii suplementacji przy użyciu izolowanego ex vivo obwodu perfuzji pracującego serca szczura (IWRH). Korzystając z tej metodologii, strategie suplementacji mogą być testowane w kontekście długotrwałego przechowywania statycznego w niskiej temperaturze, dawstwa po śmierci mózgu i dawstwa po śmierci krążeniowej w celu zachowania serca dawcy. Odzyskanie funkcji serca, mierzone przepływem aortalnym, przepływem wieńcowym, rzutem serca, ciśnieniem tętna i częstością akcji serca, można wykorzystać do określenia, czy określona strategia zachowania może zminimalizować uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne serca dawcy.

Wyniki perfuzji wyjściowej pozwolą określić, czy początkowy eksperyment (przed przechowywaniem) zakończył się powodzeniem. Przepływ w aorcie podczas trybu Langendorffa powinien wynosić od 14 do 22 mL/min. Przepływ w trybie Langendorffa jest wyświetlany na przepływomierzu jako wartość ujemna ze względu na retrogradną perfuzję aorty. Przykład akceptowalnego zapisu w trybie Langendorffa przedstawiono na Rysunku 4A.
Po przełączeniu w tryb pracy, przepływ aortalny powinien wynosić co najmniej 30 mL/min po ustabilizowaniu pracy serca. Prawidłowe jest, jeśli przepływ początkowo wzrośnie do około 50 mL/min, następnie spadnie do około 25 mL/min, a po chwili powróci do stabilnego poziomu bazowego przepływu aortalnego. Po osiągnięciu satysfakcjonujących parametrów bazowych (AF &gt; 30 mL/min, CF 10-20 mL/min, HR 200-300 bpm) serce można przechowywać. Przykład poprawnego zapisu bazowego przedstawiono na Rysunku 4B.
W zależności od testowanego roztworu konserwującego, niektóre serca nie wykażą dobrej regeneracji po przedłużonym zimnym przechowywaniu statycznym, mimo doskonałych wartości wyjściowych. Przykład zapisu wskazującego na słabą regenerację w trybie pracy przedstawiono na Rysunku 4C.
Końcową regenerację funkcjonalną przepływu aorty można obliczyć na podstawie końcowego odczytu przepływu aortalnego jako procentu wartości bazowej. Na przykład, jeśli bazowy AF serca wynosił 40 mL/min, a AF pod koniec reperfuzji po zimnym przechowywaniu statycznym wynosił 20 mL/min, regeneracja AF dla tego serca wyniosła 50%. Przykład takiej reprezentacji danych przedstawiono na Rysunku 5.
<img alt="Układ perfuzji serca w aparacie Langendorffa wraz ze schematem systemu; pozycja izolowanego serca do analizy przepływu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66910/66910fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obwód perfuzji pracującego serca. (A) Zdjęcie obwodu perfuzji izolowanego pracującego serca szczura. Czerwona ramka wskazuje miejsce, w którym znajduje się izolowane serce. (B) Schemat obwodu perfuzji izolowanego pracującego serca wskazujący kierunek przepływu buforu KH w obwodzie dla perfuzji w trybie Langendorffa (linia przerywana) i w trybie pracującym (linia ciągła). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66910/66910fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat interfejsu ustawień kanałów z konfiguracją filtra cyfrowego do analizy danych ciśnienia aortalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66910/66910fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Konfiguracja oprogramowania LabChart. (A) Konfiguracja Ustawień kanałów dla ciśnienia aortalnego, przepływu aortalnego oraz częstości akcji serca. (B) Przykład szablonu LabChart skonfigurowanego z trzema kanałami. Okna po prawej stronie pokazują konfigurację każdego pojedynczego kanału. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66910/66910fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ równowagi statycznej z modelem anatomicznym serca, systemem zawieszenia i aparatem zaciskowym. Schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66910/66910fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Kanulacja i kardioplegia. (A) Kanulacja serca przed umieszczeniem w komorze z płaszczem wodnym. Lewą kanulę wprowadzono do aorty, a prawą kanulę do lewej komory poprzezt uszeczkę lewego przedsionka. Naczynia płucne zostały podwiązane, a tkanka płuc wypreparowana. (B) Po podaniu kardioplegii serce zostaje umieszczone w zlewce zawierającej roztwór kardioplegiczny. Kanule zostały zaklemowane zaciskami typu bulldog przed odłączeniem od zestawu. (C) Przykład serc umieszczonych w pojemniku z lodem w celu przedłużonego przechowywania w niskiej temperaturze. Tutaj dwa serca zostały zabezpieczone do reperfuzji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66910/66910fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zapisy kardiologiczne w trybie Langendorffa i trybie pracy; dane eksperymentalne; analiza funkcji serca; wyniki regeneracji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66910/66910fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykłady zapisów z programu LabChart. Zapisy ciśnienia (wykres czerwony), przepływu aortalnego (wykres niebieski) i częstotliwości akcji serca (wykres zielony) dla serca z (A) prawidłowym zapisem w trybie Langendorffa, (B) prawidłową regeneracją podczas reperfuzji w trybie pracy, (C) słabą regeneracją podczas reperfuzji w trybie pracy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66910/66910fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe wpływu zoniporydu na parametry kardiologiczne; analiza danych dotyczące przepływu aortalnego, przepływu wieńcowego, rzutu serca i tętna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66910/66910fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne wykresy powrotu do sprawności funkcjonalnej. (A) przepływ aortalny, (B) przepływ wieńcowy, (C) rzut serca i (D) tętno. Rysunek został wykorzystany za zgodą Gao et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66910/66910fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisujemy protokół ex vivo izolowanego działania na szczurzym sercu, aby przetestować strategie zachowania serca dawcy. W artykule opisano protokół stosowania w statycznym przechowywaniu serc dawców gryzoni w chłodniach; Jednak protokół może być również stosowany w przypadku serc dawców uzyskanych po dawstwie po śmierci krążeniowej i śmierci mózgu.

Wykorzystanie izolowanego modelu pracującego serca szczura do testowania strategii zachowania serca dawcy

Optimization of donor heart preservation solutions has played a key role in reducing ischemia-reperfusion injury in donor hearts during organ retrieval, ...

W naszych badaniach wykorzystujemy izolowany obwód perfuzji serca szczura do testowania strategii suplementacji w celu zachowania serca dawcy. Naszym celem jest zidentyfikowanie strategii konserwacji, które mogą poprawić funkcjonalną regenerację serc dawców po długich okresach przechowywania w niskiej temperaturze lub długich okresach ciepłego niedokrwienia po oddaniu po śmierci krążeniowej. Izolowany protokół pracy serca szczura został wykorzystany do wstępnego przetestowania obecnej klinicznej strategii zachowania serca dawcy polegającej na zastosowaniu trójazotanu glicerolu i erytropoetyny w roztworze do konserwacji serca.Stanowiło to uzasadnienie do przeprowadzenia testów w badaniu przeszczepu serca u świń przed przejściem do kliniki. Zaletą stosowania izolowanego działającego protokołu perfuzji serca szczura w porównaniu z technikami perfuzji Langendorffa jest możliwość uzyskania funkcjonalnych pomiarów serca, takich jak przepływ aortalny i pojemność minutowa serca. Na początek umieść znieczulonego szczura w pozycji leżącej.Zabezpiecz kończyny zwierzęcia taśmą, a następnie przymocuj stożek nosowy nad zwierzęciem, aby podać tlen. Namocz sterylną gazę w pojemniku z buforem Krebs-Henseleit. Namoczoną gazę połóż na lodzie.Po wykonaniu bocznego nacięcia w poprzek brzucha przesuń żołądek i jelita, aby umożliwić dostęp do lewej żyły nerkowej. Wstrzyknąć heparynę i uciskać miejsce wstrzyknięcia, aż krwawienie ustanie. Po pozostawieniu heparyny w krążeniu przez kilka minut, przeciąć klatkę piersiową po obu stronach i w poprzek przepony, aby całkowicie otworzyć jamę klatki piersiowej.Ostrożnie podnieś blok płuca serca i przetnij wzdłuż aorty zstępującej, utrzymując nienaruszony łuk aorty. Przenieś blok płuco-serce do bufora lodowego Krebsa-Henseleita, aby zatrzymać serce. Na początek umieść świeżo wycięty blok płuco-serce szczura na płachcie gazy nad lodem.Wypreparuj nadmiar tłuszczu wokół aorty, a następnie przytnij aortę, pozostawiając około trzech do pięciu milimetrów na kaniulację. Wykonaj nacięcie o długości od jednego do dwóch milimetrów w tętnicy płucnej. Umieść przycięty blok płuco-serce na lodzie bezpośrednio pod kaniulami.Następnie użyj zacisku rurki kontrolującej przepływ, aby wyregulować przepływ od strony Langendorffa do kaniulacji aorty. Ostrożnie kaniuluj aortę na lewej kaniuli. Przytrzymaj go czarnym zaciskiem i zawiąż jedwabnym szwem 2-0.Całkowicie otwórz zacisk rurki kontroli przepływu, aby zwiększyć przepływ z perfuzji Langendorffa. Następnie otwórz zacisk obciążenia następczego. Rozpocznij monitorowanie aktywności serca za pomocą oprogramowania.Wyreguluj blok płuco-serce tak, aby przednia powierzchnia płuc była skierowana w stronę operatora. Zawiąż lewy płat płuca jedwabnym szwem 2-0. Zawiąż pozostałe płaty płuc za jednym zamachem za pomocą jedwabnego szwu 2-0.Następnie obróć serce tak, aby związane płuca były skierowane do tyłu. Za pomocą małych nożyczek Vannas przytnij dwu- lub trzymilimetrowy odcinek uszka lewego przedsionka, aby utworzyć mały otwór w przedsionkach. Ostrożnie kaniuluj uszek lewego przedsionka do lewej kaniuli.Przytrzymaj go czarnym zaciskiem i zawiąż jedwabnym szwem 2-0. Wyreguluj płaszcz wodny komory serca tak, aby serce znajdowało się pośrodku komory. Teraz otwórz przetwornik ciśnienia na powietrze.Wybierz ciśnienie w aorcie w oprogramowaniu, a następnie kliknij wzmacniacz mostkowy, a następnie zero i OK, aby wyzerować przetwornik ciśnienia. Perfuzja serca w trybie Langendorffa przez 10 minut. Następnie przenieść kamień napowietrzający ze zbiornika buforowego Langendorff Krebs-Henseleit do działającego zbiornika buforowego Krebs-Henseleit.Otwórz kran trójdrożny prowadzący od działającego perfuzatu. Zamknij duży zacisk prowadzący do kaniuli aortalnej i otwórz przepływ prowadzący do uszka lewego przedsionka, aby przełączyć się w tryb pracy. Wykonuj płuczki w trybie pracy przez 15 minut.Napełnij komorę kardioplegii 50 mililitrami wyznaczonego roztworu do konserwacji serca. Opuść płaszcz wodny i zamknij kran trójdrożny po stronie trybu pracy. Zamknij zacisk, aby zatrzymać przepływ w kierunku lewej kaniuli przedsionkowej.Następnie otwórz przepływ do kaniuli aortalnej. Teraz zamknij zacisk od strony Langendorffa i na obciążeniu następczym. Otwórz zacisk z linii kardioplegii.Wypłukać 15 mililitrów roztworu kardioplegii z przewodu ciśnieniowego. Przepłucz serce kardioplegią przez kaniulę aorty i zbierz ścieki wieńcowe. Po trzech minutach zamknij zacisk kardioplegii i mały niebieski zacisk prowadzący do kaniuli aortalnej.Umieść zacisk buldoga na kaniuli aortalnej i drugi zacisk buldoga na lewej kaniuli. Odłącz blok kaniuli serca od obwodu i umieść go w zlewce zawierającej kardioplegię w pojemniku na lód. Aby ponownie wykonać fuzję serca po przechowywaniu w niskiej temperaturze, należy ostrożnie przymocować blok płuco-serce po przechowywaniu w chłodni do obwodu perfuzyjnego.Użyj strzykawki o rozmiarze 18 wypełnionej buforem Krebs-Henseleit, aby usunąć powietrze z kaniuli. Najpierw podłącz kaniulę aortalną, a następnie otwórz zacisk rurki po stronie Langendorffa. Podłącz ponownie lewą kaniulę i upewnij się, że powietrze zostało usunięte z kaniuli przed podłączeniem jej do obwodu perfuzyjnego.Trzymaj stronę roboczą clamp zamknięty, aż nadejdzie czas przełączenia z Langendorff w tryb pracy. Przepływ aorty od 14 do 22 mililitrów na minutę skutkował dobrym przepływem Langendorffa. Po przełączeniu w tryb pracy przepływ z aorty wynoszący co najmniej 30 mililitrów na minutę ułatwiał przechowywanie serca Pomimo dobrych wyników wyjściowych, niektóre serca nie przyniosły dobrej regeneracji po długotrwałym przechowywaniu statycznym w niskich temperaturach.

using-an-isolated-working-rat-heart-model-to-test-donor-heart

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje technikę ex situ do konserwacji izolowanego serca świni poprzez perfuzję za pomocą natlenionego, bogatego w składniki odżywcze roztworu perfuzatu. Technika ta pozwala na kompleksową ocenę wydolności serca w warunkach fizjologicznych.

Perfuzja serca ex situ: technika zachowania izolowanej funkcji serca świni

Większość badań z udziałem aparatu Langendorffa wykorzystuje małe modele zwierzęce ze względu na zwiększoną złożoność systemów dla większych ssaków. Opisujemy system Langendorffa dla dużych modeli zwierzęcych, który pozwala na zastosowanie go u różnych gatunków, w tym ludzi, i stosunkowo łatwe pozyskiwanie danych.

Izolowany działający system serca dla dużych modeli zwierzęcych

Izolowane modele pracującego serca mogą być używane do pomiaru wpływu warunków obciążenia, tętna i leków na wydajność mięśnia sercowego i zużycie tlenu. Opisano metody przygotowania modelu pracy lewego serca gryzonia, który pozwala na badanie wydolności skurczowej i rozkurczowej oraz zużycia tlenu w różnych warunkach.

Model pracującego serca gryzoni do badania wydajności mięśnia sercowego i zużycia tlenu

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Ten protokół pokazuje proste i elastyczne podejście do oceny nowych czynników kondycjonujących lub strategii zwiększających wykonalność dawstwa serca po śmierci krążeniowej.

Przedkliniczny model dawstwa serca po śmierci krążeniowej

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Opisujemy model heterotopowego przeszczepu serca w jamie brzusznej u szczurów, sugerując modyfikacje obecnych strategii, które prowadzą do uproszczonego podejścia chirurgicznego. Dodatkowo opisujemy nowatorski model odrzucania przeszczepu poprzez wstrzyknięcie do ucha ważnych komórek mięśnia sercowego, co pozwala na dalsze analizy immunologiczne przeszczepu u szczurów.

Model immunologiczny do heterotopowego przeszczepu komórek serca i mięśnia sercowego u szczurów

Protokół opisuje model dawstwa dużych zwierząt (świń) po śmierci krążeniowej, po którym następuje normotermiczna perfuzja regionalna klatki piersiowej i brzucha, która ściśle symuluje scenariusz kliniczny w transplantacji serca i może potencjalnie ułatwić badania i strategie terapeutyczne.

Wielkozwierzęcy model dawstwa po śmierci krążeniowej i regionalnej perfuzji normomicznej do oceny serca

Tutaj prezentujemy protokół oceny heterotopowo wszczepionego serca po normotermicznym zachowaniu ex situ w modelu szczurzym.

Szczurzy model normomicznego heterotopowego przeszczepu serca z perfuzją ex-situ

Protokół tutaj opisuje model przeszczepu serca o wysokiej jakości wieprzowinki po oddaniu serca po śmierci krążeniowej, wykorzystujący perfuzję przeszczepu ex vivo .

Model o wysokiej wierności wieprzi ortotopowej transplantacji serca po oddaniu po śmierci krążenia

Poznaj izolowany model pracującego serca szczura do testowania strategii zachowania serca dawcy. Ta metoda umożliwia ocenę czynnościową i poprawę wyników transplantacji.

Wykorzystanie izolowanego modelu pracującego serca szczura do testowania strategii zachowania serca dawcy

Przeglądaj więcej filmów