Badanie piroptozy metodą cytometrii przepływowej
31 maja 2024
Ten artykuł opisuje identyfikację komórek piropotycznych za pomocą cytometrii przepływowej po podwójnym barwieniu przeciwciałami przeciwko N-końcowemu fragmentowi kurczaka GSDME (chGSDME-NT) i jodkowi propidyny (PI).
Celem naszego zespołu badawczego jest ustalenie, czy komórki ptaków ulegają piroptozie podobnie jak komórki ssaków. Ponadto naszym celem jest określenie piroptozy za pomocą dokładniejszych i łatwiejszych środków. Wiele genów u gatunków ptaków znacznie różni się od tych u ssaków, co utrudnia wykorzystanie regionów powszechnie stosowanych w badaniach nad komórkami ssaków do badań nad śmiercią komórek ptasich.
W związku z tym badania nad śmiercią komórek ptasich są znacznie trudniejsze niż te na komórkach ludzkich lub mysich. Wykorzystujemy charakterystyczne pory błony plazmatycznej i komórki par piroptolijskie utworzone przez fragmenty żołądka w celu opracowania strategii opartej na celomaretrii przepływowej do oznaczania proptozy. Dzięki temu nowatorskiemu podejściu zaobserwowaliśmy prądy wytrzeszcza wywołanego chorobą kaletki maziowej w komórkach ptaków.
W przeciwieństwie do poprzednich metod, takich jak zachodnia krew lub kwasy AFA. Nasz protokół jest w stanie dokładnie określić ilościowo procent komórek piroptotycznych za pomocą dwóch parametrów jednocześnie, tworzenia błony plazmatycznej i pęknięcia błony plazmatycznej, co ułatwia różnicowanie komórek z piroptozą od innych form śmierci komórki. Aby rozpocząć hodowlę pięć razy po 10 do piątego DF, jedna komórka na studzienkę w sześciodołkowej płytce z DM EM uzupełnionym 10% FBS.
Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, wyrzuć surowicę zawierającą pożywkę do hodowli komórkowych. Po trzykrotnym umyciu komórek PBS, po godzinie wchłaniania wirusa, dodać dwa mililitry pożywki do hodowli komórek wolnej od surowicy, a następnie roztworu wirusa IBDV do każdego dołka. Umyj komórki PB S3 razy i inkubuj je przez 24 godziny z dwoma mililitrami DMEM uzupełnionymi o 2% FBS.
Dodaj 500 mikrolitrów trypsyny na studzienkę, a następnie dwa mililitry DMEM z 10% FBS po jednej minucie. Odwirować komórki i ostrożnie usunąć supernatant. Po ponownym wymieszaniu osadu komórkowego w PBS, delikatnie wiruj probówkę przez trzy sekundy i odwiruj komórki, jak opisano wcześniej.
Za pomocą hemocytometru pod mikroskopem policz komórki, aby ponownie zawiesić je w odpowiedniej objętości bufora barwiącego cytometrię przepływową i odwiruj zawiesinę, dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej z okrągłym dnem. Inkubować komórki zakażone IBDV i symulować komórki kontrolne z jednym mikrogramem odpowiedniego przeciwciała na lodzie przez 30 minut w ciemności. Delikatnie wiruj rurkę co 10 minut.
Umyj komórki jednym mililitrem buforu barwiącego do cytometrii przepływowej i odwiruj probówkę. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu do barwienia cytometrii przepływowej, a następnie inkubować komórki z 10 mikrogramami na mililitr jodku propidyny przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i dodać 400 mikrolitrów buforu barwiącego cytometrię przepływową do testu cytometrii przepływowej. Wykonać cytometrię przepływową z ślepą probówką kontrolną, a następnie pojedynczymi barwionymi probówkami, aby dostosować parametry napięcia i kompensacji przed uruchomieniem wszystkich próbek.
Cytometria przepływowa wykazała, że znaczna liczba komórek była dodatnia dla końcowych fragmentów N kurczaka Gasdermin E po zakażeniu IBDV, podczas gdy końcowe fragmenty C rozszczepionego kurczaka Gasdermin E były ledwo wykrywalne przez cytometrię przepływową przy użyciu barwienia antygenem na powierzchni błony. Populacja N-końcowych fragmentów podwójnie dodatnich komórek Gasdermin E i jodku propidyny kurczaka w komórkach zakażonych IBDV była znacznie większa niż w pozorowanych zakażonych kontrolach, co sugeruje, że ta część komórek zakażonych IBDV przechodziła piroptozę.
Przegląd
W niniejszym artykule badano, czy komórki ptaków ulegają piroptozie analogicznie do komórek ssaków, wykorzystując cytometrię przepływową do ich identyfikacji. W badaniu zastosowano podwójne barwienie przeciwciałami przeciwko fragmentowi N-końcowemu białka GSDME kurczaka oraz jodkiem propidyny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia ptaków
Wprowadzenie
- Badania nad śmiercią komórek ptaków są trudne ze względu na różnice genetyczne w stosunku do ssaków.
- Piroptoza jest formą programowanej śmierci komórki charakteryzującą się obecnością porów w błonie plazmatycznej.
- Zrozumienie piroptozy u ptaków może dostarczyć informacji na temat mechanizmów śmierci komórkowej.
- Istniejące metody badania śmierci komórek ssaków nie mają bezpośredniego zastosowania do komórek ptaków.
Cel badania
- Ustalenie, czy komórki ptaków wykazują piroptozę podobną do komórek ssaków.
- Opracowanie dokładniejszej i prostszej metody identyfikacji komórek piroptotycznych.
- Pogłębienie zrozumienia mechanizmów śmierci komórek ptaków.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do identyfikacji komórek.
- Podwójne barwienie przeciwciałami przeciwko chGSDME-NT oraz jodkiem propidium.
- Obserwacja cech charakterystycznych dla komórek w stanie pyroptozy.
- Analiza pyroptozy indukowanej przez wirus zakaźnej bursyty w komórkach ptasich.
Główne wyniki
- Identyfikacja komórek pyroptotycznych u gatunków ptaków.
- Skuteczne zastosowanie cytometrii przepływowej w badaniach śmierci komórkowej ptaków.
- Wykazanie pyroptozy indukowanej przez chorobę kalakową zakaźną.
- Ustanowienie nowego podejścia do badania pyroptozy u ptaków.
Wnioski
- Komórki ptaków mogą ulegać piroptozie w sposób podobny do komórek ssaków.
- Opracowana metoda stanowi niezawodne narzędzie do identyfikacji komórek piroptotycznych.
- Niniejsze badanie przyczynia się do zrozumienia mechanizmów śmierci komórek ptaków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa identyfikacja piroptozy w komórkach ptaków z wykorzystaniem cytometrii przepływowej pozwala wypełnić istotną lukę w rozróżnianiu zapalnej śmierci komórkowej od innych jej form, szczególnie w przypadkach, gdy dywergencja genetyczna ogranicza możliwość przenoszenia testów między gatunkami. To dwuparametrowe podejście zwiększa pewność prognostyczną w analizie ścieżek śmierci komórkowej, wspierając wczesne odkrycia i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach i rozwoju produktów biologicznych oraz szczepionek. Metoda ta umożliwia podejmowanie solidnych decyzji portfelowych poprzez wyjaśnienie mechanizmów śmierci komórkowej w istotnych dla danej choroby modelach ptaków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę szlaków piroptozy w systemach niemammalnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez odróżnienie piroptozy od innych form śmierci komórkowej.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do interwencji specyficznych dla danych szlaków w modelach chorób ptaków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów komórek ptasich do późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i ilościowe wyniki dzięki dwuparametrycznej cytometrii przepływowej.
- Umożliwia wiarygodną ocenę związków lub interwencji ukierunkowanych na piroptozę.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami ptasimi istotnymi dla danej choroby w kontekście opracowywania translacyjnych biomarkerów.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w badaniach weterynaryjnych i zoonotycznych.
- Zapewnia mechanistyczną redukcję ryzyka przy wyborze kandydatów w programach ukierunkowanych na ptaki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta dwuparametrowa metoda cytometrii przepływowej jest stosowana na wczesnych etapach odkryć i opracowywania testów, stanowiąc pomost między walidacją celu a wyborem modelu przedklinicznego w badaniach nad śmiercią komórek ptaków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków piroptozy w genetycznie zróżnicowanych systemach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość analizy i powtarzalność ilościowego badania śmierci komórek.
- Analityka: Umożliwia pomiary z wykorzystaniem podwójnego markera (chGSDME-NT i PI) w celu porównania sposobów śmierci komórek.
- Badania translacyjne: Pozwala na dopasowanie do istotnych dla danej choroby modeli ptasich w celu zachowania ciągłości biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do kwantyfikacji śmierci komórek w ramach programów badawczych dotyczących ptaków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechaniczną w analizie szlaków śmierci komórkowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje ilościowe określanie piroptozy w układach ptasich.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfelach ukierunkowanych na ptaki.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój modeli chorób i interwencji u ptaków.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu cytometrii przepływowej oraz biologii komórek ptaków.
- Konieczny jest dostęp do zwalidowanych przeciwciał oraz infrastruktury analitycznej do cytometrii.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności analizy dwuparametrowej.
- Może być wymagana adaptacja dla innych gatunków ptaków lub typów komórek, w zależności od dywergencji genetycznej.
- Zależność od dostępności linii komórkowych oraz modeli wirusowych istotnych dla danej choroby.
