Name: Badanie piroptozy metodą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do badania piroptozy w komórkach ptasich. Wykorzystuje ona podwójne barwienie przeciwciałami przeciwko fragmentowi N-końcowemu kurzego GSDME i jodkiem propidyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Jue Liu za jego życzliwą pomoc. Badanie to było wspierane przez granty z Narodowego Kluczowego Programu Badawczo-Rozwojowego Chin (nr 2022YFD1800300), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 32130105) oraz Funduszu Celowego na rzecz Systemu Badań nad Nowoczesnymi Technologiami Agro-Przemysłowymi (nr 2022YFD1800300), Narodowego Funduszu Nauk Przyrodniczych Chin (nr . CARS-40), Chiny.

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie komórek próbki
<ol>
	<li>Hodowla komórek DF-1 (nieśmiertelne fibroblasty zarodków kurzych) na płytkach sześciodołkowych (5 x 10,5 komórek na studzienkę) ze zmodyfikowanym podłożem Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 38 °C.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, wyrzuć pożywkę do hodowli komórek zawierającą surowicę, przemyj komórki trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie dodaj 2 ml pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy do każdej studzienki.</li>
	<li>Dodaj roztwór wirusa IBDV (zawierający obliczony MOI) do każdej studzienki i ustaw fałszywą kontrolę infekcji, dodając objętość DMEM równą objętości roztworu wirusa.</li>
	<li>Po 1 godzinie adsorpcji wirusa należy wyrzucić pożywkę hodowlaną, trzykrotnie przemyć komórki PBS, dodać 2 ml DMEM uzupełnionego 2% FBS do każdej studzienki i kontynuować hodowle komórkowe przez 24 godziny.</li>
	<li>24 godziny po zakażeniu IBDV należy przeprowadzić leczenie trypsyną (500 μl na dołek) przez 1 minutę, a następnie zneutralizować za pomocą DMEM uzupełnionego 10% FBS (2 ml na dołek). Następnie komórki muszą zostać pobrane w celu przygotowania zawiesin jednokomórkowych do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w PBS i delikatnie wirować probówki przez 3 s.</li>
	<li>Odwirować komórki zgodnie z opisem w kroku 1.6 (400 x g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C).</li>
	<li>Powtórz płukanie komórek zgodnie z opisem w kroku 1.7 i kroku 1.8.</li>
	<li>Wykonaj liczenie komórek za pomocą hemocytometru pod mikroskopem. Następnie ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości buforu barwiącego cytometrię przepływową (tak, aby końcowe stężenie komórek wynosiło 1 x 107 komórek/ml). Delikatnie wymieszaj zawiesiny.</li>
</ol>
2. Barwienie komórek w cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Dodać 100 μl zawiesin jednokomórkowych z kroku 1.10 do 5 ml okrągłodennych probówek z polistyrenu (12 mm × 75 mm). Przygotuj makiety komórek zakażonych i zakażonych IBDV do barwienia przeciwciałami anty-chGSDME-NT/CT i użyj normalnej mysiej IgG jako kontroli izotypu. W międzyczasie przygotuj ślepą próbę kontrolną i pojedyncze barwione probówki z komórkami zakażonymi IBDV.</li>
	<li>Dodaj 1 μg znakowanego Alexa Fluor 647 anty-chGSDME-NT McAb, anty-chGSDME-CT McAb lub normalnej mysiej IgG (jako kontroli izotypu) odpowiednio do probówek zakażonych IBDV i pozorowanych kontrolnych. Następnie delikatnie wiruj rurki przez 3 s.</li>
	<li>Inkubować wybarwione komórki w temperaturze 2-8 °C lub na lodzie przez 30 minut w ciemności. Delikatnie wiruj rurki co 10 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki 1 ml buforu barwiącego do cytometrii przepływowej przez odwirowanie w stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórzyć płukanie komórek zgodnie z opisem w kroku 2.4.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Wybarwić komórki grupy zakażonej IBDV i grupy pozorowanej zakażonej, a także probówek barwionych pojedynczym PI 10 μg/ml PI przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać 400 μl buforu barwiącego cytometrię przepływową do testu cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
3. Przeprowadzanie testu cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Włącz cytometr przepływowy, aby zainicjować instrument i uruchomić oprogramowanie.</li>
	<li>Rozpocznij od uruchomienia ślepej rurki kontrolnej, a następnie pojedynczych barwionych probówek, aby wyregulować parametry napięcia i kompensacji cytometru przepływowego. Wykorzystaj kanały fluorescencyjne FL3 i FL4, które emitują światło o długości fali 635 nm, do wykrywania odpowiednio fluoroforów PI i Alexa Fluor 647.</li>
	<li>Po skonfigurowaniu wszystkich parametrów uruchom sekwencyjnie wszystkie próbki.</li>
</ol>
4. Analiza danych cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przeanalizuj barwienie Alexa Fluor 647 każdej próbki na histogramie kanału FL4.</li>
	<li>Aby ocenić proporcję podwójnie dodatnich komórek w każdej próbce, użyj czterokwadrantowego wykresu punktowego FL3 / FL4.</li>
	<li>Ustaw progi dodatnie na podstawie podwójnie barwionych próbek kontrolnych IgG/PI w ramach kontroli izotypu, zapewniając, że odsetek komórek podwójnie dodatnich pozostaje poniżej 1%. Takie podejście ułatwia pomiar proporcji podwójnie dodatnich komórek we wszystkich próbkach.</li>
</ol>

Quantifying Pyroptosis in Infectious Bursal Disease Virus-Infected DF-1 Cells

<ol><li>He, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermin+D+is+an+executor+of+pyroptosis+and+is+required+for+interleukin-1%CE%B2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion.</a> Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+Gasdermin+D+for+non-canonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Angosto-Bazarra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+analyses+of+the+Dasdermin+family+suggest+conserved+roles+in+infection+response+despite+loss+of+pore-forming+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality.</a> BMC Biol. 20 (1), 9(2022).</li>
<li>De Schutter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punching+holes+in+cellular+membranes%3A+Biology+and+evolution+of+gasdermins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins.</a> Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).</li>
<li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermins%3A+Effectors+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li>
<li>Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+gasdermin+E+is+cleaved+by+caspase+1%2C+3%2C+and+7+and+induces+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis.</a> J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duck+gasdermin+E+is+a+substrate+of+caspase-3%2F-7+and+an+executioner+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis.</a> Front Immunol. 13, 1078526(2022).</li>
<li>Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+infectious+bursal+disease-the+past%2C+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future.</a> Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).</li>
<li>Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+infectious+bursal+disease+virus+consists+of+two+segments+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA.</a> J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).</li>
<li>Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbated+apoptosis+of+cells+infected+with+infectious+bursal+disease+virus+upon+exposure+to+interferon+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha.</a> J Virol. 92 (11), (2018).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+chicken+microRNA-16-5p+expression+in+DF-1+cells+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+enhances+IBDV-induced+apoptosis+and+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication.</a> J Virol. 94 (2), e01724(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+voltage-dependent+anion+channel+2+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptosis+in+host+cells+via+interaction+with+VP5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5.</a> J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).</li>
<li>Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+induces+apoptosis+in+chicken+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).</li>
<li>Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+cancer+cell+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring cancer cell pyroptosis.</a> Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-d+pore+and+its+morphology+is+different+from+mlkl+channel-mediated+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis.</a> Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisano skuteczną metodę badania piroptozy za pomocą cytometrii przepływowej, uzyskaną poprzez podwójne barwienie zakażonych komórek za pomocą anty-chGSDME-NT McAb i PI znakowanych Alexa Fluor 647. Podejście to można również zastosować do różnych typów komórek w celu odróżnienia piroptozy od innych typów śmierci komórki, takich jak apoptoza i martwica.
Piroptoza, zapalny rodzaj zaprogramowanej śmierci komórki, zależny głównie od indukowanego przez Gasdermin (GSDM) tworzenia porów błony plazmatycznej przez D u ssaków 1,2,3, była tradycyjnie oceniana za pomocą metod takich jak uwalnianie LDH 6,15, cechy morfologiczne16 i wykrywanie fragmentów GSDM-NT / GSDM-CT za pomocą testów Western Blot lub IFA17. Jednak żadna z tych metod nie określa dokładnie procentowo komórek piroptotycznych. W badaniu tym wykorzystano charakterystyczne pory błony plazmatycznej w komórkach piroptotycznych utworzonych przez fragmenty GSDM-NT w celu opracowania strategii opartej na cytometrii przepływowej do ich oznaczania.
Gdy komórki zostały podwójnie wybarwione chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 i PI, a następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w kanałach fluorescencyjnych FL3 i FL4, piroptozę można było dostrzec za pomocą dwóch parametrów jednocześnie: barwienia chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 wskazującego na tworzenie się porów błony plazmatycznej przez N-końcowy fragment rozszczepionego chGSDME oraz barwienie PI wskazujące na pęknięcie błony plazmatycznej. Dane pokazują, że odsetek podwójnie dodatnich komórek chGSDME-NT / PI w komórkach zakażonych IBDV (około 33%) był znacznie wyższy niż w kontrolach zakażonych pozorami (P < 0,001).
Metoda eksperymentalna wymaga kilku względów, aby zapewnić dokładność i niezawodność. Po pierwsze, każda probówka z próbką używana do analizy przepływu powinna zawierać nie mniej niż 1 x 106 komórek, aby zachować precyzję analizy przepływu. Biorąc pod uwagę wiele etapów mycia w protokole, zaleca się odpowiednie zwiększenie początkowej liczby komórek w każdej probówce na kroku 2.1, na przykład do 2 x 106 komórek. Bardzo ważne jest, aby obchodzić się z myciem i przenoszeniem komórek z najwyższą ostrożnością, aby uniknąć niezamierzonego zakłócenia integralności komórek. Ponadto należy pamiętać, że gęstość komórek, stężenie przeciwciał i czas trwania operacji mogą wpływać na optymalne ustawienia parametrów. Dlatego konieczne jest dostosowanie parametrów i ustawień cytometru przepływowego w oparciu o określone warunki eksperymentalne. W tym badaniu zastosowano następujące parametry: FSC AmpGain ustawiono na 1,40, a napięcie SSC ustawiono na 490 V. Bramka na wykresie FSC/SSC została ustawiona tak, aby obejmowała wszystkie populacje komórek do późniejszej analizy FL3/4-kanałowej. Napięcia fluorescencji ustawiono na 600 V dla kanału FL3 (PI) i 600 V dla kanału FL4 (Alexa Fluor 647). Kompensacja została ustawiona na 38,0% między kanałami FL4 i FL3. Natężenie przepływu zostało ustawione na 200 zdarzeń/s, z progiem zdarzenia ustawionym na 10 000.
Dzięki nowatorskiemu podejściu znacznie poczyniono postępy w zrozumieniu roli piroptozy za pośrednictwem GSDME w odpowiedzi gospodarza na infekcje chorobotwórcze u kurcząt oraz mechanizmów leżących u jej podstaw. Dzięki zastosowaniu specyficznych przeciwciał byliśmy w stanie zbadać tworzące pory chGSDME-NT za pomocą cytometrii przepływowej, odróżniając komórki piroptotyczne od innych i ułatwiając określenie proporcji komórek poddawanych piroptozie. W rezultacie, metoda ta oferuje wyraźną przewagę nad testami Western Blot lub IFA w wykrywaniu komórek piroptotycznych.
Jednak ograniczenie tego protokołu polega na wykorzystaniu N-końcowego fragmentu GSDME kurczaka w komórkach zakażonych IBDV jako modelu eksperymentalnego do badania piroptozy. Niemniej jednak badanie to jest pierwszym udanym zastosowaniem cytometrii przepływowej do określania piroptozy.
Podsumowując, opisana tutaj metoda cytometrii przepływowej do badania piroptozy ma ogromny potencjał w zakresie pogłębiania naszego zrozumienia mechanizmów stojących za piroptozą zarówno u ssaków, jak i ptaków. Metoda ta jest skutecznym narzędziem, które przyczynia się do badań nad śmiercią komórek w naukach przyrodniczych.

Piroptoza to zapalny rodzaj zaprogramowanej śmierci komórki, który zależy głównie od tworzenia porów błony plazmatycznej przez Gasdermin (GSDM) D u ssaków1,2,3. Ze względu na genetyczny niedobór GSDMD u kurcząt4,5, mechanizm piroptozy u kurcząt pozostaje nieuchwytny. Rodzina Gasdermin obejmuje konserwatywne białka, w tym GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME i DFNB593,6. Badania wykazały, że GSDME od ryb teleost i kaczek jest rozszczepiany przez kaspazę-1/3/7 lub kaspazę-3/7 w celu wywołania pyroptotycznej śmierci komórki7,8. Jednak rola piroptozy za pośrednictwem GSDME w odpowiedzi gospodarza na infekcje chorobotwórcze u kurcząt pozostaje niewyjaśniona.
Zakaźna choroba kaletki maziowej (IBD) to ostra, wysoce zaraźliwa i immunosupresyjna choroba drobiu wywoływana przez IBDV9. IBDV, bezotoczkowy dwusegmentowy wirus dwuniciowego (ds) RNA, należy do rodzaju Avibirnavirus z rodziny Birnaviridae10. Wcześniejsze badania przeprowadzone przez innych i nasze laboratorium wykazały, że zakażenie IBDV indukuje śmierć komórek gospodarza różnymi szlakami11,12,13,14. Wcześniejsze odkrycia wykazały, że zakażenie IBDV wyzwala uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH), wskaźnika śmierci komórek litycznych6,15, co sugeruje, że zakażenie IBDV indukuje śmierć komórek litycznych w komórkach gospodarza. Ponadto dane pokazują, że komórki zakażone IBDV wykazują cechy morfologiczne pyroptotycznej śmierci komórki, w tym pęcznienie komórek z dużymi pęcherzykami wydmuchiwanymi z błony plazmatycznej i dodatnie barwienie jodku propidyny (PI), co sugeruje, że zakażenie IBDV indukuje piroptozę w komórkach.
Biorąc pod uwagę, że tworzenie porów błonowych w komórkach piroptotycznych przez N-końcowy fragment rozszczepionego GSDM (GSDM-NT) jest cechą charakterystyczną piroptozy, teoretycznie, komórki piropotyczne mogłyby być wykryte za pomocą cytometrii przepływowej, badając GSDM-NT na błonie komórkowej za pomocą specyficznych przeciwciał. W ptasich komórkach piroptotycznych N-końcowy fragment Gasderminy E kurczaka (chGSDME-NT) tworzy pory błonowe, umożliwiając jodkowi propidyny (PI) przejście i wiązanie DNA. W ten sposób proporcję komórek piroptotycznych można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej, odróżniając w ten sposób piroptozę od innych form śmierci komórki, takich jak apoptoza i martwica. Nie opisano jednak metody badania komórek piroptotycznych za pomocą cytometrii przepływowej. W tym badaniu komórki DF-1 zostały zakażone IBDV i przeprowadzono cytometrię przepływową w celu zbadania komórek piroskoptotycznych przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (McAb) przeciwko fragmentowi chGSDME-NT (związanego z błoną) i barwieniu PI. Co zaskakujące, komórki piropotyczne zostały skutecznie wykryte za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto można określić ilościowo proporcję komórek piroptotycznych. Odkrycia te stanowią potężny i skuteczny sposób określania piroptozy.
Ten artykuł opisuje metodę badania pirotoksyny w komórkach zakażonych IBDV za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu barwienia anty-chGSDME-NT McAb i PI. Metodę tę można również rozszerzyć na inne komórki zakażone patogenami i zastosować do badania różnych typów komórek z piroptozą, odróżniając je od innych form śmierci komórki.

<table><tbody><tr><td>5 ml okrągłodenna probówka z polistyrenu (12 i 75 mm)</td><td>Corning Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Zestawy</td> do znakowania przeciwciał Corning <td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-CT McAb</td><td>SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, Chiny)</td> <td>EU0228</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-NT McAb</td><td>SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, Chiny)</td><td>EU0227</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie CellQuest</td><td>Inkubator BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do zamrażania kriogenicznego</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0193-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do barwienia cytometrii przepływowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Qiu-jing Odczynnik biochemiczny i Instrument Company (Szanghaj, Chiny)</td><td>Szczep</td> YX-JSB52 <td></td></tr><tr><td>IBDV Lx</td><td>Szczep IBDV Lx został uprzejmie dostarczony przez dr Jue Liu, Pekińską Akademię Rolnictwa i Leśnictwa w Pekinie, Chiny</td>Mikroskop odwrócony Chongqing Photoelectric Instrument Company XDS-1B Normalna mysz IgG Santa Cruz Biotechnology sc-2025 Sól fizjologiczna w buforze fosforanowym (PBS)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>M& C&nbsp; Technologia genowa</td><td>CC017</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA, 0,25%</td> <td>M& C&nbsp; Technologia genowa</td><td>CC008</td><td></td></tr><tr><td>Oscylator wirowy</td><td>MIULAB</td><td>MIX-28+</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie piroptozy metodą cytometrii przepływowej

Examination of Pyroptosis by Flow Cytometry

Piroptoza to rodzaj zapalny programowanej śmierci komórki, głównie spowodowany tworzeniem porów błony komórkowej przez N-koniec generowany z rozszczepionych białek z rodziny Gasdermin (GSDM). Badanie GSDM-NT przyczepionego do błony metodą Western Blot jest najczęściej stosowaną metodą oceny piroptozy. Jednak za pomocą tej metody trudno jest odróżnić komórki z piroptozą od innych form śmierci komórki. W tym badaniu komórki DF-1 zakażone wirusem zakaźnej choroby kaletki maziowej (IBDV) wykorzystano jako model do ilościowego określenia proporcji komórek poddawanych piroptozie za pomocą cytometrii przepływowej, wykorzystując specyficzne przeciwciała przeciwko N-końcowemu fragmentowi barwienia kurczaka GSDME (chGSDME-NT) i jodku propidyny (PI). Komórki chGSDME-NT-dodatnie były łatwo wykrywalne za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu przeciwciał anty-chGSDME-NT znakowanych Alexa Fluor 647. Co więcej, odsetek podwójnie dodatnich komórek chGSDME-NT / PI w komórkach zakażonych IBDV (około 33%) był znacznie większy niż w kontrolach zakażonych pozorami (P < 0,001). Wyniki te wskazują, że badanie chGSDME-NT związanego z błoną za pomocą cytometrii przepływowej jest skutecznym podejściem do określania komórek piroptotycznych wśród komórek przechodzących śmierć komórkową.

chGSDME-NT na błonie komórkowej komórek DF-1 zainfekowanych IBDV można było łatwo wykryć za pomocą cytometrii przepływowej 
Jedną z najważniejszych cech komórek pyroptotycznych jest tworzenie porów błonowych przez fragmenty GSDM-NT powstające w wyniku rozszczepienia gazderminy. W związku z tym komórki pyroptotyczne mogłyby teoretycznie zostać wykryte za pomocą cytometrii przepływowej poprzez badanie obecności GSDM-NT na błonach komórkowych przy użyciu specyficznych przeciwciał. W związku z tym zainfekowano komórki DF-1 wirusem IBDV, a komórki pyroptotyczne badano za pomocą cytometrii przepływowej z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych anty-chGSDME-NT znakowanych Alexa Fluor 647 oraz barwienia PI. Po infekcji IBDV za pomocą cytometrii przepływowej wykryto znaczną liczbę komórek pozytywnych pod kątem chGSDME-NT (Rysunek 1). W przeciwieństwie do nich, kontrole pozornie zainfekowane lub komórki barwione izotypowym przeciwciałem kontrolnym IgG wykazały minimalną liczbę komórek pozytywnych dla Alexa Fluor 647. Wyniki te demonstrują skuteczne i specyficzne wykrywanie chGSDME-NT związanego z błoną za pomocą cytometrii przepływowej. Warto zauważyć, że ponieważ fragmenty C-końcowe rozszczepionej chGSDME (chGSDME-CT) pozostawały w cytoplazmie, a nie ulegały translokacji do błony komórkowej tak jak chGSDME-NT, fragmenty chGSDME-CT były niemal niewykrywalne w cytometrii przepływowej przy zastosowaniu barwienia antygenów powierzchniowych błony, co było zgodne z faktem, że pyroptoza wiązała się z obecnością fragmentów chGSDME-NT związanych z błoną.
Pyroptozę w komórkach DF-1 można określić za pomocą cytometrii przepływowej, stosując podwójne barwienie komórek przeciwciałem monoklonalnym (McAb) anty-chGSDME-NT znakowanym fluoresceiną oraz jodem propidium (PI) 
Po podwójnym zabarwieniu komórek przeciwciałem McAb anty-chGSDME-NT znakowanym Alexa Fluor 647 oraz PI, a następnie analizie cytometrycznej w kanałach fluorescencji FL3 i FL4, komórki pyroptotyczne można było zidentyfikować na podstawie pozytywnego barwienia na chGSDME-NT i PI. Jak pokazano na Ryc. 2A,B, w testach cytometrii przepływowej wykryto znaczną liczbę komórek chGSDME-NT dodatnich po zakażeniu IBDV, a proporcja komórek podwójnie dodatnich chGSDME-NT/PI w komórkach zakażonych IBDV (około 33%) była istotnie większa niż w kontrolach zakażonych pozornie (P &lt; 0.001), co sugeruje, że tworzenie porów błonowych przez chGSDME-NT było zsynchronizowane z rozpadem błon komórkowych, powodując tym samym śmierć pyroptotyczną tych komórek zakażonych IBDV. Dane te wyraźnie pokazują, że zakażenie IBDV indukuje pyroptozę zależną od chGSDME w komórkach gospodarza. Z kolei komórki pojedynczo dodatnie dla PI mogą reprezentować inne formy śmierci komórkowej indukowane przez zakażenie IBDV. Zatem badanie tworzącego pory chGSDME-NT za pomocą cytometrii przepływowej stanowi cenną metodę odróżniania komórek pyroptotycznych od komórek przechodzących inne formy śmierci komórkowej.
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej, histogram barwienia komórek z użyciem Alexa Fluor 647, porównanie przeciwciał." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Analiza komórek z związanym chGSDME-NT za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki DF-1 poddano infekcji pozorowanej lub zainfekowano IBDV z MOI równym 1. Po 24 h od infekcji komórki zebrano i zabarwiono przeciwciałami monoklonalnymi (McAb) przeciwko chGSDME-NT / chGSDME-CT znakowanymi Alexa Fluor 647 lub kontrolnym IgG izotypowym, a następnie przeanalizowano metodą cytometrii przepływowej. Pozytywne barwienie na chGSDME-NT w badaniu cytometrycznym wskazało na komórki z chGSDME-NT związanym z błoną podczas pyroptozy indukowanej przez IBDV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna, badanie komórek w procesie piroptozy, wykres i wykres kropkowy, chGSDME, IBDV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Badanie piroptozy metodą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem podwójnego barwienia chGSDME-NT i PI. (A) Analiza kropkowa (dot-plot) komórek w procesie piroptozy metodą cytometrii przepływowej. Komórki DF-1 zainfekowano IBDV przy MOI równym 1. 24 h po infekcji komórki zebrano, zabarwiono przeciwciałami monoklonalnymi anty-chGSDME-NT /anty-chGSDME-CT znakowanymi Alexa Fluor 647 oraz PI, a następnie poddano analizie cytometrycznej. (B) Przedstawiono i przeanalizowano statystycznie odsetek komórek w procesie piroptozy dla każdej grupy z punktu (A). Do analizy istotności statystycznej zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji (Two-way ANOVA). Dane reprezentują trzy niezależne eksperymenty i zostały przedstawione jako średnie ± SD. ***P &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten artykuł opisuje identyfikację komórek piropotycznych za pomocą cytometrii przepływowej po podwójnym barwieniu przeciwciałami przeciwko N-końcowemu fragmentowi kurczaka GSDME (chGSDME-NT) i jodkowi propidyny (PI).

Badanie piroptozy metodą cytometrii przepływowej

Pyroptosis is an inflammatory type of programmed cell death predominantly driven by the formation of plasma membrane pores by the N-terminus generated ...

Celem naszego zespołu badawczego jest ustalenie, czy komórki ptaków ulegają piroptozie podobnie jak komórki ssaków. Ponadto naszym celem jest określenie piroptozy za pomocą dokładniejszych i łatwiejszych środków. Wiele genów u gatunków ptaków znacznie różni się od tych u ssaków, co utrudnia wykorzystanie regionów powszechnie stosowanych w badaniach nad komórkami ssaków do badań nad śmiercią komórek ptasich.W związku z tym badania nad śmiercią komórek ptasich są znacznie trudniejsze niż te na komórkach ludzkich lub mysich. Wykorzystujemy charakterystyczne pory błony plazmatycznej i komórki par piroptolijskie utworzone przez fragmenty żołądka w celu opracowania strategii opartej na celomaretrii przepływowej do oznaczania proptozy. Dzięki temu nowatorskiemu podejściu zaobserwowaliśmy prądy wytrzeszcza wywołanego chorobą kaletki maziowej w komórkach ptaków.W przeciwieństwie do poprzednich metod, takich jak zachodnia krew lub kwasy AFA. Nasz protokół jest w stanie dokładnie określić ilościowo procent komórek piroptotycznych za pomocą dwóch parametrów jednocześnie, tworzenia błony plazmatycznej i pęknięcia błony plazmatycznej, co ułatwia różnicowanie komórek z piroptozą od innych form śmierci komórki. Aby rozpocząć hodowlę pięć razy po 10 do piątego DF, jedna komórka na studzienkę w sześciodołkowej płytce z DM EM uzupełnionym 10% FBS.Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, wyrzuć surowicę zawierającą pożywkę do hodowli komórkowych. Po trzykrotnym umyciu komórek PBS, po godzinie wchłaniania wirusa, dodać dwa mililitry pożywki do hodowli komórek wolnej od surowicy, a następnie roztworu wirusa IBDV do każdego dołka. Umyj komórki PB S3 razy i inkubuj je przez 24 godziny z dwoma mililitrami DMEM uzupełnionymi o 2% FBS.Dodaj 500 mikrolitrów trypsyny na studzienkę, a następnie dwa mililitry DMEM z 10% FBS po jednej minucie. Odwirować komórki i ostrożnie usunąć supernatant. Po ponownym wymieszaniu osadu komórkowego w PBS, delikatnie wiruj probówkę przez trzy sekundy i odwiruj komórki, jak opisano wcześniej.Za pomocą hemocytometru pod mikroskopem policz komórki, aby ponownie zawiesić je w odpowiedniej objętości bufora barwiącego cytometrię przepływową i odwiruj zawiesinę, dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej z okrągłym dnem. Inkubować komórki zakażone IBDV i symulować komórki kontrolne z jednym mikrogramem odpowiedniego przeciwciała na lodzie przez 30 minut w ciemności. Delikatnie wiruj rurkę co 10 minut.Umyj komórki jednym mililitrem buforu barwiącego do cytometrii przepływowej i odwiruj probówkę. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu do barwienia cytometrii przepływowej, a następnie inkubować komórki z 10 mikrogramami na mililitr jodku propidyny przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i dodać 400 mikrolitrów buforu barwiącego cytometrię przepływową do testu cytometrii przepływowej. Wykonać cytometrię przepływową z ślepą probówką kontrolną, a następnie pojedynczymi barwionymi probówkami, aby dostosować parametry napięcia i kompensacji przed uruchomieniem wszystkich próbek.Cytometria przepływowa wykazała, że znaczna liczba komórek była dodatnia dla końcowych fragmentów N kurczaka Gasdermin E po zakażeniu IBDV, podczas gdy końcowe fragmenty C rozszczepionego kurczaka Gasdermin E były ledwo wykrywalne przez cytometrię przepływową przy użyciu barwienia antygenem na powierzchni błony. Populacja N-końcowych fragmentów podwójnie dodatnich komórek Gasdermin E i jodku propidyny kurczaka w komórkach zakażonych IBDV była znacznie większa niż w pozorowanych zakażonych kontrolach, co sugeruje, że ta część komórek zakażonych IBDV przechodziła piroptozę.

examination-of-pyroptosis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy metodę opartą na cytometrii przepływowej do badania rozwoju limfocytów T in vivo z wykorzystaniem myszy modyfikowanych genetycznie na tle typu dzikiego lub transgenicznych pod kątem receptora limfocytów T.

Badanie pozytywnej i negatywnej selekcji w grasicy metodą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Przedstawiono generowanie ortotopowego szczurzego modelu międzybłoniaka opłucnej przez wszczepienie komórek międzybłoniaka II-45 do jamy opłucnej szczurów o usposobieniu immunologicznym. Opisano również metodę cytometrii przepływowej do analizy siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych u tych zwierząt z próbki krwi o objętości 25 μl.

Implantacja ortotopowa i monitorowanie obwodowych komórek odpornościowych w modelu międzybłoniaka syngenicznego szczura II-45

Przedstawiona tutaj jest prosta metoda izolacji i analizy metodą cytometrii przepływowej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej naciekającej glejak, która dostarcza zależnych od czasu danych ilościowych na temat liczby i statusu aktywacji komórek odpornościowych wchodzących do wczesnego mikrośrodowiska guza mózgu.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa jednojądrzastych komórek krwi obwodowej naciekających glejaka

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Apoptozę można scharakteryzować za pomocą analizy cytometrycznej wczesnych i późnych biomarkerów apoptozy. Linię komórkową raka szyjki macicy, SiHa, analizowano pod kątem biomarkerów apoptozy po leczeniu aktynomycyną D przy użyciu laboratoryjnego cytometru przepływowego.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D

Ten protokół opisuje skuteczną metodę dysocjacji plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki i późniejszą charakterystykę podzbiorów komórkowych na standardowych platformach cytometrycznych przepływu.

Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej

Zawartość wodoronadtlenku lipidów stanowi najczęściej używany wskaźnik śmierci komórek ferroptotycznych. W artykule przedstawiono krok po kroku analizę zawartości wodoronadtlenku lipidów w komórkach po indukcji ferroptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Ujawnienie ferroptotycznego fenotypu rdzeniaka zarodkowego

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do badania piroptozy w komórkach ptasich. Wykorzystuje ona podwójne barwienie przeciwciałami przeciwko fragmentowi N-końcowemu kurzego GSDME i jodkiem propidyny.

Badanie piroptozy metodą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów