Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Cóż, w tym protokole używamy miniaturowego mikroskopu do zbadania neuroaktywności w zakręcie zębatym hipokampa. Naszym celem jest zbadanie kodowania neuronów i reprezentacji przestrzennych w różnych stanach chorobowych. Uważam, że kluczowym wyzwaniem związanym z badaniem zakrętu zębatego in vivo jest uzyskanie wysokiej jakości danych obrazowych dotyczących wapnia.

To, czy różne wyrazy twarzy są zadowalające, czy soczewka GRIN jest wszczepiona we właściwym miejscu i takie szczegóły podczas całej operacji mają kluczowe znaczenie dla powodzenia badania. W tradycyjnej chirurgii obrazowania wapnia wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki GRIN są zwykle wykonywane jako oddzielne operacje. W naszym protokole połączyliśmy te dwa kroki w jedną procedurę, która nie tylko skraca czas oczekiwania, ale także zapewnia dokładne umieszczenie soczewki GRIN.

Nasze laboratorium wykorzystuje różne techniki mikroskopowe do badania neurodynamiki leżącej u podstaw funkcji poznawczych. Mamy nadzieję zrozumieć wzorce neuroaktywności, które wspierają procesy poznawcze, a łącząc modelowanie teoretyczne i manipulacje przyczynowe, mamy nadzieję przeanalizować procesy przepływu informacji i neuroobliczeń w mózgu. Na początek umieść znieczuloną mysz na aparacie stereotaktycznym.

Wykonaj ciągłe nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych i odetnij część skóry głowy, aby odsłonić powierzchnię czaszki. Wykonaj kraniotomię w określonym obszarze za pomocą mikrowiertła i ustaw cztery punkty jako granicę. Przerwij wiercenie, gdy tkanka mózgowa stanie się widoczna

Użyj panelu sterowania, aby ustawić wstrzykiwacz tak, aby wstrzykiwał 80 nanolitrów wirusa. Kliknij przycisk Wstrzyknij na panelu sterowania, aby wstrzyknąć wirusa do zakrętu zębatego z szybkością przepływu jednego nanolitra na sekundę. Aby zassać tkankę mózgową, obróć końcówkę igły blisko tkanki mózgowej i delikatnie dociśnij, aby ułatwić aspirację.

Podczas odsysania należy stale płukać zimną solą fizjologiczną, aby utrzymać wyraźny widok mózgu. Uważnie obserwuj cechy tkanki, aby monitorować głębokość aspiracji. Tkanka korowa jest bladoróżowa.

Ciało modzelowate pod spodem wygląda jak biała tkanka włóknista, a warstwa CA1 hipokampa jest ciemnoczerwona i szara. Przerwij ssanie, gdy powierzchnia tkanki stanie się gładka i odsłonięty zostanie duży obszar CA1. Przesuń uchwyt przymocowany do soczewki GRIN nad wywiercony otwór.

Gdy soczewka GRIN zetknie się z powierzchnią tkanki mózgowej, ustaw oś Z na zero. Włóż soczewkę GRIN do otworu na grzbietowej osi brzusznej minus 1.32 milimetra. Pozostaw uchwyt na pięć do 10 minut, a następnie podnieś uchwyt i spłucz otwór solą fizjologiczną.

Za pomocą igły nałóż żywicę ultrafioletową wokół soczewki GRIN. Oświetl obszar światłem ultrafioletowym przez 15 sekund, aby upewnić się, że żywica stanie się solidna. Ostrożnie wyjmij uchwyt z soczewki GRIN.

Przykryj całą odsłoniętą czaszkę żywicą ultrafioletową. Umieść płytę głowy na czaszce w odpowiedniej pozycji. Oświetl całą czaszkę i płytkę głowy światłem ultrafioletowym przez 15 sekund.

Zakryj odsłoniętą soczewkę GRIN nasadką ochronną wydrukowaną w 3D. Przymocuj nasadkę do płyty czołowej za pomocą M1.6. Włącz oprogramowanie sterujące mini oscyloskopem i kliknij Wybierz plik konfiguracyjny, a następnie wybierz VS code, a następnie pliki konfiguracyjne użytkownika.

Teraz kliknij Uruchom, a następnie przesuń przycisk zasilania LED, aby dostosować jasność. Przesuń przycisk regulacji ostrości, aby ustawić wartość bliską zeru. Przymocuj płytkę bazową do mini lunety i ponownie wyreguluj pozycję mini oscyloskopu, aby uzyskać pole widzenia o dobrej jakości obrazowania.

Ostrożnie nałóż pierwszą warstwę materiału bazowego protezy wokół płyty podstawy mini lunety. Gdy pierwsza warstwa cementu stwardnieje, nałóż drugą warstwę cementu od płyty podstawy do płyty głównej. Po stwardnieniu całego materiału podstawy protezy poluzuj dociskową i odłącz mini lunetę od płyty podstawy.

Umieść nasadkę płyty podstawy w płycie podstawy, aby chronić odsłoniętą soczewkę GRIN i dokręć dociskową. Po zobrazowaniu przekonwertuj dane obrazowania z formatu AVI na HDF5. Zastosuj niesztywną korekcję ruchu i próbkuj w dół film z korekcją ruchu.

Zastosuj ekstrakcję do danych próbki w dół, aby zidentyfikować sygnały pojedynczej komórki, a następnie zastosuj kontrolę komórek i ręcznie wybierz potencjalne komórki. Kliknij przycisk Zapisz dane przed zamknięciem okna sprawdzania komórki. Na koniec zapisz pliki danych.

W nieudanym obrazowaniu wapnia in vivo nie zaobserwowano żadnych aktywnych komórek w polu widzenia obrazowania. Udane obrazowanie wapnia in vivo wykazało mniej niż 10 aktywnych komórek bez widocznych naczyń krwionośnych, ponad 50 aktywnych komórek z widocznymi naczyniami krwionośnymi i setki aktywnych komórek z przezroczystymi naczyniami krwionośnymi. Wyekstrahowane pojedyncze komórki z udanego obrazowania wapnia in vivo nałożono na pole widzenia, pokazując reprezentatywne ślady wapnia.

Położenie ekspresji GCaMP6f i ślad soczewki GRIN zostały zweryfikowane w wycinku mózgu myszy.