Name: Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia in vivo w komórkach ziarnistych zakrętu zębatego u myszy. Protokół łączy iniekcję wirusa z implantacją soczewki GRIN, poprawiając jakość danych o aktywności neuronalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Szanghajski Program Pilotażowy dla Badań Podstawowych - Fudan University 21TQ1400100 (22TQ019), Shanghai Municipal Science and Technology Major Project, the Lingang Laboratory (grant no. LG-QS-202203-09) oraz Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (32371036).

Real-Time Imaging for Neuron Activity in the Dentate Gyrus Cells of Mice 

<ol><li>Scoville, W. B., Milner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+recent+memory+after+bilateral+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).</li>
<li>Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+hippocampal+pathology+impairs+topographical+and+episodic+memory+but+not+visual+pattern+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching.</a> Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neurophysiological+approaches+in+the+study+of+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular neurophysiological approaches in the study of learning.</a> Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).</li>
<li>Zemla, R., Basu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal function in rodents.</a> Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).</li>
<li>Basu, J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corticohippocampal+circuit%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733(2015).</li>
<li>Gobbo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+signature+of+spatial+decision-making+during+navigation+by+freely+moving+rats+by+using+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119(2022).</li>
<li>Schuette, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabaergic+ca1+neurons+are+more+stable+following+context+changes+than+glutamatergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells.</a> Sci Rep. 12 (1), 10310(2022).</li>
<li>Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding%2C+consolidation%2C+and+retrieval+of+contextual+memory%3A+Differential+involvement+of+dorsal+ca3+and+ca1+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions.</a> Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).</li>
<li>Ognjanovski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Parvalbumin-expressing+interneurons+coordinate+hippocampal+network+dynamics+required+for+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation.</a> Nat Commun. 8, 16120(2017).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Yassa, M. A., Stark, C. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the hippocampus.</a> Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).</li>
<li>Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory.+Engram+cells+retain+memory+under+retrograde+amnesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia.</a> Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).</li>
<li>Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+investigations+into+the+role+of+histamine+in+the+dentate+gyrus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat.</a> Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).</li>
<li>Kim, S., Jung, D., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cell+maps+slowly+develop+via+competitive+learning+and+conjunctive+coding+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus.</a> Nat Commun. 11 (1), 4550(2020).</li>
<li>Danielson, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dentate+gyrus+mossy+cells+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice.</a> Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+gcamp6m%27s+ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m's ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0170934(2017).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normcorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInan%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2021).</li>
<li>Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+viral+injection+and+gradient-index+lens+implantation+for+deep+brain+in+vivo+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging.</a> J Vis Exp. (176), (2021).</li>
<li>Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-day+calcium+imaging+of+ca1+hippocampus+in+freely+moving+rats+reveals+a+high+preponderance+of+place+cells+with+consistent+place+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields.</a> J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).</li>
<li>Masala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+hippocampal+Ca2%2B+micro-waves+following+synapsin-dependent+adeno-associated+viral+expression+of+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniscope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Cholvin, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+spatial+representation+by+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 6227(2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Tutaj opisaliśmy procedurę obrazowania wapnia in vivo w DG myszy. Wierzymy, że protokół ten będzie przydatny dla badaczy dążących do zbadania funkcji DG w różnych procesach poznawczych, szczególnie w przypadkach, gdy interesująca jest genetycznie zidentyfikowana subpopulacja. Tutaj wyjaśniamy zalety naszego protokołu, kładąc nacisk na kilka kluczowych punktów w chirurgii i omawiamy ograniczenia tej metody.
Przetestowaliśmy różne procedury obrazowania DG na podstawie dostępnej literatury i zoptymalizowaliśmy procedury eksperymentalne zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Naszym zdaniem, następujące trzy kluczowe modyfikacje znacznie poprawiły wskaźnik sukcesu naszego protokołu. Po pierwsze, połączyliśmy wszystkie procedury chirurgiczne za jednym posiedzeniem, podczas gdy wiele badań obrazowania wapnia dla obszarów podkorowych wykonywało wstrzyknięcie wirusa i wszczepienie soczewki w dwóch oddzielnych operacjach. Kluczową zaletą naszego podejścia jest to, że ekspresja wirusa i regeneracja tkanki mózgowej zachodzą teraz w tym samym okresie, co skraca czas oczekiwania na przygotowanie myszy o połowę, który zwykle trwa21 miesięcy. Co więcej, oddzielne operacje wymagają dokładnej zmiany położenia myszy, ponieważ niewielkie przechylenia z niedopasowaniem w zakresie 100 μm doprowadzą do niepowodzenia zabiegu. Aby uniknąć zgubienia soczewki, niektóre grupy opracowały podejście, które mocuje miniskop do soczewki i próbowały zobaczyć ekspresję neuronalną czujnika podczas operacji implantacji. To obejście wymaga nietrywialnej inżynierii powszechnie używanego aparatu stereotaktycznego i jest skomplikowane w użyciu ze względu na tłumienie aktywności neuronów podczas znieczulenia. Nasza metoda nie wymaga zmiany położenia myszy, co znacznie skraca czas i stres związany z zabiegiem.
Drugim kluczowym punktem naszego podejścia jest to, że wielokrotnie wstrzykujemy niewielkie ilości wirusa do obszaru docelowego22. Prowadzi to do zakażenia większej liczby komórek. Co ważne, w porównaniu ze zwiększeniem ilości wirusa w pojedynczym miejscu wstrzyknięcia, podejście to przyniosło lepsze wyniki, ponieważ lokalizacje zakażonych komórek rozprzestrzeniały się równomiernie w całym polu widzenia. Inną powiązaną kluczową kwestią jest to, że rozcieńczenie miana wirusa poprawia jakość obrazowania wapnia. Z naszego doświadczenia wynika, że nadmierna ilość wirusa wiąże się z pojawieniem się falowych klastrów aktywności, co jest zgodne z poprzednim raportem23. Chociaż początkowo podejrzewaliśmy, że aspiracja tkanek może prowadzić do przedwczesnego usunięcia wirusa w miejscu wstrzyknięcia i niewystarczającej ekspresji, nie zaobserwowaliśmy takiego zjawiska, a nasz protokół generalnie przyniósł silne zakażenie regionu docelowego. W porównaniu z transgenicznymi myszami wykazującymi ekspresję GCaMP, podejście oparte na wirusie jest nieuchronnie mniej spójne, ale oferuje bardziej elastyczne zastosowanie, ponieważ nie wymaga skomplikowanej hodowli. Ponieważ jednak ekspresja GCaMP może rozlać się na sąsiednie struktury mózgu lub zostać nierównomiernie rozłożona w docelowym obszarze mózgu, dokładne badanie anatomicznych pozycji wirusa i soczewki z utrwalonej tkanki ma kluczowe znaczenie dla interpretacji wyników. Połączenie linii Cre specyficznych dla regionu lub typu komórki z zależną od Cre ekspresją GCaMP może poprawić specyficzność obrazowanych sygnałów.
Trzecim kluczowym punktem naszego protokołu jest to, że podczas implantacji soczewki powtórzyliśmy zakładanie soczewki i płukanie kilka razy, aby upewnić się, że w obszarze implantacji nie pozostały resztki krwi. Jest to kluczowa operacja ułatwiająca regenerację tkanek i poprawiająca wskaźnik powodzenia zabiegu. Chociaż dokładny mechanizm nie jest znany, spekulujemy, że wprowadzenie soczewki nieuchronnie spowoduje pewne uszkodzenie tkanki, a etap płukania usunie krwawienie związane z tym uszkodzeniem. W przeciwnym razie krwawienie związane z wkłuciem może zająć dużo czasu, zanim mózg się oczyści, co zwiększa prawdopodobieństwo miejscowego zapalenia i infiltracji makrofagów, co obniżyłoby jakość optyczną. Ponadto przy współrzędnych, które podaliśmy w tym protokole, stwierdziliśmy, że umieszczenie soczewki nieco bliżej szwu strzałkowego zwykle skutkuje zwiększoną liczbą widocznych komórek, chociaż ważne jest, aby unikać przebijania do trzeciej komory. Udostępniliśmy również listę typowych problemów, aby ułatwić rozwiązywanie problemów na tym etapie (Tabela 1).
Mysz musi zostać przeszkolona do noszenia manekina miniskopu przed eksperymentami behawioralnymi, aby zminimalizować wpływ dodatkowego ciężaru na głowę. Zazwyczaj szkolenie to odbywa się ~3 dni, a każda sesja trwa 20 minut. Podczas eksperymentów behawioralnych należy regularnie monitorować kondycję fizyczną myszy. Na wydajność behawioralną myszy duży wpływ będzie miało jej zdrowie.
Protokół ten zawiera kilka ograniczeń. Po pierwsze, należy zauważyć, że obrazowanie wapnia jest substytutem aktywności neuronalnej, na którą może wpływać ekspresja czujników. Metody obrazowania jednofotonowego przy użyciu miniskopu mogą prowadzić do nakładania się sygnałów z sąsiednich komórek, które wymagają wymieszania z późniejszej analizy. Ponadto nasz protokół obejmuje inwazyjne operacje. Fragment tkanki mózgowej jest usuwany na etapie implantacji soczewki GRIN, zwykle obejmujący część regionu CA1, korę zaśledzionową i asocjacyjną korę wzrokową. Jest to konieczne ze względu na ograniczenie głębokości obrazowania zapewnianej przez oświetlenie jednofotonowe. W naszych obserwacjach nie zauważyliśmy żadnych widocznych deficytów behawioralnych u myszy po zabiegu chirurgicznym, ani w ich ogólnych, nieograniczonych zachowaniach, ani w uczeniu się zadań liniowych (rysunek uzupełniający S1). Alternatywnie, zastosowanie zautomatyzowanych narzędzi chirurgicznych do odsysania tkanki mózgowej może zmniejszyć liczbę błędów związanych z operacjami ręcznymi, zwiększając w ten sposób precyzję zabiegu chirurgicznego24. Co więcej, nasze dane obrazowe dotyczące wapnia ogólnie dały normalną dynamikę wapnia. Wpływ na bardziej złożone funkcje poznawcze wymaga dalszej charakterystyki. Alternatywna metoda wprowadzania soczewek bez aspiracji tkankowej została opisana przed25 rokiem życia. Osiąga się to poprzez wykonanie nacięcia w tkance mózgowej wzdłuż drogi planowanego wprowadzenia i umieszczenie soczewki bezpośrednio przez otwór. Z naszego doświadczenia wynika, że takie podejście prowadzi do fałdowania lub innych deformacji tkanki mózgowej wzdłuż drogi wprowadzania, co nadal może być inwazyjne. Duża zmienność deformacji sprawia, że podejście to jest mniej wiarygodne niż opisany przez nas protokół. Innym potencjalnym zastrzeżeniem naszego protokołu jest to, że na wydajność behawioralną myszy nieznacznie wpływa kabel koncentryczny, który łączy miniskop i skrzynkę akwizycji danych (DAQ) miniskopu. Dzieje się tak nie tylko ze względu na zwijanie się drutów po wielu zwojach, ale także dlatego, że drut może rozpraszać mysz podczas zadania. Użycie bezprzewodowego miniskopu26 skutecznie rozwiązałoby ten problem. 
Pomimo istniejących ograniczeń uważamy, że ta metodologia może być bardzo korzystna dla naukowców zainteresowanych wykorzystaniem obrazowania wapnia in vivo do badania wzorców aktywności neuronalnej w zakręcie zębatym hipokampa. Na przykład to podejście do obrazowania wapnia in vivo można zastosować do badania komórek miejsca specyficznie w obszarze zakrętu zębatego. Umożliwiłoby to zbadanie, w jaki sposób komórki miejsca kodują informacje w różnych obszarach mózgu10,27. Nasza walidacja wskazuje, że protokół ten jest dość powtarzalny, z wysokimi wskaźnikami sukcesu i może być stosowany do różnych obszarów mózgu.

Poprzednie badania wykazały, że hipokamp jest strukturą mózgu niezbędną do przetwarzania i odzyskiwania wspomnień1,2. Od lat pięćdziesiątych XX wieku obwody neuronalne hipokampa u gryzoni są przedmiotem badań nad tworzeniem, przechowywaniem i odzyskiwaniem pamięci3. Struktury anatomiczne w hipokampie obejmują podregiony zakrętu zębatego (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 i subiculum4. Między tymi podregionami istnieją złożone połączenia dwukierunkowe, z których DG, CA1 i CA3 tworzą wyraźny obwód trisynaptyczny, który składa się z komórek ziarnistych i komórek piramidalnych5. Obwód ten otrzymuje swój główny sygnał wejściowy z kory śródwęchowej (EC) i jest klasycznym modelem do badania plastyczności synaptycznej. Wcześniejsze badania in vivo nad funkcją hipokampa koncentrowały się głównie na klasie CA1<sup="xref">6,7 ze względu na łatwiejszy dostęp. Podczas gdy neurony CA1 odgrywają ważną rolę w tworzeniu, konsolidacji i odzyskiwaniu pamięci, szczególnie w komórkach pamięci przestrzennej, inne podregiony hipokampa są również niezbędne8,9. W szczególności niedawne badania uwypukliły funkcje DG w tworzeniu pamięci. Komórki miejsca w DG zostały uznane za bardziej stabilne niż te w CA110, a ich działania odzwierciedlają informacje kontekstowe11. Co więcej, zależne od aktywności znakowanie komórek ziarnistych DG może być reaktywowane w celu wywołania zachowań związanych z pamięcią12. W związku z tym, aby lepiej zrozumieć kodowanie informacji w DG, kluczowe znaczenie ma zbadanie działań podregionu DG w czasie, gdy zwierzę wykonuje zadania zależne od pamięci.
Wcześniejsze badania działalności DG najczęściej wykorzystywały elektrofizjologię in vivo13. Technika ta ma jednak pewne wady: po pierwsze, w nagraniach elektrycznych może być trudno bezpośrednio zidentyfikować różne typy komórek, które generują sygnał. Zarejestrowane sygnały pochodzą zarówno z komórek hamujących, jak i pobudzających. W związku z tym wymagane są dalsze metody przetwarzania danych, aby oddzielić te dwa typy komórek. Co więcej, trudno jest połączyć inne informacje o typach komórek, takie jak podgrupy specyficzne dla projekcji lub etykietowanie zależne od aktywności, z nagraniami elektrycznymi. Ponadto, ze względu na anatomiczną morfologię DG, elektrody rejestrujące są często wszczepiane w kierunku ortogonalnym, co znacznie ogranicza liczbę neuronów, które można zarejestrować. W związku z tym w przypadku nagrań elektrycznych trudno jest osiągnąć monitorowanie setek pojedynczych neuronów ze struktury DG w tej samej klasie animal<sup="xref">14.
Uzupełniającą techniką rejestrowania aktywności neuronów w DG jest użycie obrazowania wapnia in vivo15. Jony wapnia mają fundamentalne znaczenie dla procesów sygnalizacji komórkowej w organizmach, odgrywając kluczową rolę w wielu funkcjach fizjologicznych, zwłaszcza w układzie nerwowym ssaków. Kiedy neurony są aktywne, wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia gwałtownie wzrasta, co odzwierciedla dynamiczną naturę aktywności neuronalnej i transmisji sygnałów. Dlatego rejestrowanie w czasie rzeczywistym zmian wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia w neuronach dostarcza ważnych informacji na temat mechanizmów kodowania neuronalnego.
Technologia obrazowania wapnia wykorzystuje specjalistyczne barwniki fluorescencyjne lub genetycznie modyfikowane wskaźniki wapnia (GECI) do monitorowania stężenia jonów wapnia w neuronach poprzez wykrywanie zmian w intensywności fluorescencji, które następnie mogą być rejestrowane przez obrazowanie mikroskopowe16. Powszechnie stosuje się rodzinę genów wskaźnikowych wapnia GCaMP, obejmującą sekwencje białka zielonej fluorescencji (GFP), kalmoduliny i polipeptydu M13. GCaMP może emitować zieloną fluorescencję, gdy wiąże się z jonami wapnia17, co pozwala na rejestrowanie fluktuacji zielonej fluorescencji za pomocą obrazowania18. Dodatkowo, aby uzyskać wyraźne obrazy docelowego obszaru mózgu, soczewka Gradient Index (soczewka GRIN) jest zwykle wszczepiana powyżej obszaru zainteresowania. Soczewka GRIN umożliwia obrazowanie głębokiego obszaru mózgu, do którego nie można uzyskać dostępu bezpośrednio z powierzchni.
Ta technika jest stosunkowo łatwa do połączenia z innymi narzędziami genetycznymi do oznaczania różnych typów komórek. Co więcej, ponieważ płaszczyzna obrazowania jest równoległa do orientacji komórek w DG, setki neuronów są dostępne do obrazowania przy każdej udanej operacji. W tej pracy przedstawiamy kompletny i szczegółowy protokół chirurgiczny obrazowania wapnia in vivo w zakręcie zębatym u myszy (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Procedura obejmuje dwie główne operacje. Pierwszym z nich jest wstrzyknięcie wirusa AAV-CaMKIIα-GCaMP6f do DG. Drugą operacją jest wszczepienie soczewki GRIN powyżej miejsca wstrzyknięcia wirusa. Te dwie procedury są przeprowadzane na tym samym posiedzeniu. Po rekonwalescencji po tych operacjach następnym krokiem jest sprawdzenie jakości obrazowania za pomocą zminiaturyzowanych mikroskopów (miniskopów). Jeśli pole obrazowania ma setki aktywnych komórek, kolejną procedurą jest przymocowanie płytki podstawy miniskopu do czaszki myszy za pomocą cementu dentystycznego; Mysz może być następnie używana do eksperymentów obrazowych. Przedstawiamy również proces wstępnego przetwarzania oparty na MATLAB, który usprawnia analizę zebranych danych dotyczących wapnia.

<table><tbody><tr><td>200 &mu; L uniwersalne końcówki do pipet</td><td>Pipety Transcat</td><td>1030-260-000-9</td><td>Do usuwania igły z krwią i solą fizjologiczną</td></tr><tr><td>25 G luer lock (prebentowane końcówki dozujące)</td><td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>Do usuwania tkanki mózgowej</td></tr><tr><td>Wydrukowana w 3D nasadka ochronna</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Aby chronić soczewkę GRIN 75</td></tr><tr><td>% etanolu</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co., Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>Do dezynfekcji i czyszczenia powierzchni soczewki GRIN</td></tr><tr><td>Wirus AAV2/9-CaMKII&alpha;-GCaMP6f</td><td>Brain Case</td><td>BC-0083</td><td>Do wstrzykiwania wirusa</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 wersja 22.1</td><td>Do rysowania figur</td></tr><tr><td>Anestezjologiczna pompa powietrza</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-30</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące kamerą</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td> <td>Do rejestrowania danych behawioralnych</td></tr><tr><td>Uchwyty kaniuli/ceramicznej skuwki (uchwyt soczewki GRIN)</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68214</td><td>Do trzymania soczewki GRIN</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>W celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego myszy&nbsp;</td></tr><tr><td>koncentryczny</td><td>Otwórz ephys</td><td>CW8251</td><td>Do połączenia miniskopu i miniskopu DAQ box</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus Life Science&nbsp;</td><td>FV3000</td><td>Do obserwacji wycinków mózgu</td></tr><tr><td>Wacik bawełniany</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co., Ltd</td><td>20202140438</td><td>Do dezynfekcji</td></tr><tr><td>Dostosowana płyta czołowa</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY NIE DOTYCZY</td><td>Do trzymania myszy na kierownicy</td></tr><tr><td>Niestandardowy uchwyt płyty czołowej</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY</td> Nie dotyczy <td>Do trzymania płyty głównej myszy</td></tr><tr><td>Podstawy protezy (samoutwardzalne)</td> <td>New Centry Dental</td><td>430205</td><td>Do mocowania miniskopu</td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Veet</td><td>ASIN : B001DUUPQ0</td><td>Do usuwania włosów myszy</td></tr><tr><td>Pulpit cyfrowy stereotaktyczny w strumencie, SGL M</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68803</td><td>Do wstrzykiwania wirusa i implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Aby zapobiec pooperacyjnemu zapaleniu myszy</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>Do obserwacji warunków podczas operacji</td></tr><tr><td>Kanister z filtrem gazu, duży, opakowanie 6 sztuk</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Soczewka GRIN</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>Do implantacji soczewki GRIN</td></tr><tr><td>Soczewka</td> <td>GRINInFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>Do implantacji soczewek GRIN</td></tr><tr><td>Indukcyjna mysz komorowa (15 cm x 10 cm x 10 cm)</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>V100</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Kamera przemysłowa</td><td>Daheng Imaging</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>Do pozyskiwania danych behawioralnych</td></tr><tr><td>Środek dezynfekujący Jodophor</td><td>Qingdao Hainuo Innovi Disinfection Technology Co., Ltd</td><td>8861F6DFC92A</td><td>Do dezynfekcji</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-22-10</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Probówka do pobierania próbek płynnych (mikropipeta ze szklanymi kapilarnami do Nanoject III)</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Do wstrzykiwania wirusa</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>Do analizy danych</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>78001</td><td>Do kraniotomii</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>Do wyciągania probówki do pobierania próbek cieczy</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Do wstrzykiwań wirusowych</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ Software</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>Do rejestrowania danych obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Skrzynka do akwizycji danych miniskopu (DAQ) (V3.3)</td><td>Otwórz ephys</td><td>V3.3</td><td>Aby uzyskać dane obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>Do obrazowania wapnia in vivo</td></tr><tr><td>Płyta podstawy miniskopu V4 (Wariant 2)</td><td>Open ephys</td><td>Wariant 2</td><td>Do trzymania miniskopu</td></tr><tr><td>nanoject III Programowalny wtryskiwacz nanolitrowy</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>Do wstrzykiwań wirusowych</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Cisen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>H37022025</td><td>Aby oczy były wilgotne</td></tr><tr><td>Probówka do PCR</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>Do rozcieńczania wirusa</td></tr><tr><td>Komputer osobisty (ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>Do rejestrowania danych obrazowania wapnia i danych behawioralnych</td></tr><tr><td>Koło do biegania</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co., Ltd</td><td>NA-H115</td><td>Do trzymania myszy podczas mocowania płyty podstawy</td></tr><tr><td>Śrubokręt (M1.6)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td><td>60902</td><td>Aby odkręcić M1.6</td></tr><tr><td>Śrubokręt (dociskowe)</td><td>Greenery (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td><td>S2</td><td>Do odkręcenia dociskowych</td></tr><tr><td>Śruba ustalająca</td><td>TBD</td><td>2-56 śruba ustalająca stożek</td><td>Do mocowania miniskopu do płyty podstawy</td></tr><tr><td>Maszyna do znieczulenia małych zwierząt</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R500</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Sterylna strzykawka</td><td>Jiangsu Great Wall Medical Equipment Co., LTD</td><td>20163140236</td><td>Do płukania krwi</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>S14016-13</td><td>Do odcinania włosów i skóry głowy</td></tr><tr><td>Regulator temperatury ThermoStar, podkładka 69025 w zestawie.</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>69027</td><td>Aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia</td></tr><tr><td>Ultra cienkie kleszcze</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>F11020-11</td><td>Do usuwania resztek kostnych i opony twardej</td></tr><tr><td>USB 3.0</td><td>Otwórz ephys</td><td>Nie dotyczy</td><td>Aby podłączyć skrzynkę DAQ miniskopu i komputerową lampę</td></tr><tr><td>UV</td><td>Jinshida</td><td>66105854002</td><td>Aby zamocować soczewkę GRIN na czaszce</td></tr><tr><td>Żywica UV (klej utwardzany światłem)</td><td>Loctite</td><td>32268</td><td>Aby zamocować soczewkę GRIN na czaszce</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>Aby usunąć krew, sól fizjologiczną i tkankę mózgową</td></tr></tbody></table>

obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Podejścia czasu rzeczywistego są zazwyczaj potrzebne w badaniach nad uczeniem się i pamięcią, a obrazowanie wapnia in vivo daje możliwość zbadania aktywności neuronalnej u obudzonych zwierząt podczas zadań behawioralnych. Ponieważ hipokamp jest ściśle związany z pamięcią epizodyczną i przestrzenną, stał się istotnym regionem mózgu w badaniach w tej dziedzinie. W ostatnich badaniach komórki engramowe i komórki miejsca badano, rejestrując aktywność neuronalną w regionie CA1 hipokampa za pomocą miniaturowego mikroskopu u myszy podczas wykonywania zadań behawioralnych, w tym na otwartym polu i toru liniowego. Chociaż zakręt zębaty jest kolejnym ważnym regionem hipokampa, rzadko był badany za pomocą obrazowania in vivo ze względu na jego większą głębokość i trudność w obrazowaniu. W tym protokole szczegółowo przedstawiamy proces obrazowania wapnia, w tym sposób wstrzykiwania wirusa, wszczepienia soczewki GRIN (Gradient-index) i dołączenia płytki bazowej do obrazowania zakrętu zębatego hipokampa. Dalej opisujemy, jak wstępnie przetworzyć dane obrazowania wapnia za pomocą MATLAB. Ponadto badania innych głębokich obszarów mózgu, które wymagają obrazowania, mogą odnieść korzyści z tej metody.

Rysunek 1 przedstawia schemat procedury eksperymentalnej, obejmujący iniekcję wirusa, implantację soczewki GRIN, mocowanie płytki bazowej, obrazowanie wapnia in vivo za pomocą miniskopu oraz przetwarzanie danych. Zazwyczaj cała procedura trwa 1 miesiąc. Rysunek 2 przedstawia przykładowe procedury iniekcji wirusa, w tym rozmieszczenie otworu wiertniczego w czaszce oraz stan tkanki mózgowej przed implantacją soczewki GRIN.
Rysunek 3 przedstawia proces usuwania tkanki mózgowej, który jest kluczowy dla powodzenia tej operacji. W miarę odsysania tkanki widoczne stają się poszczególne jej warstwy. Etap odsysania można zakończyć po zaobserwowaniu szarej, odblaskowej warstwy.
Rysunek 4 przedstawia procedurę implantacji soczewki GRIN, w tym wprowadzanie soczewki GRIN, mocowanie płytki głowowej do czaszki oraz przykrywanie soczewki GRIN dostosowaną nasadką. Jakość obrazowania w obrazowaniu wapnia in vivo zależy od powodzenia wstrzyknięcia wirusa oraz implantacji soczewki GRIN.
Rycina 5 przedstawia cztery rodzaje wyników z in vivo wapńobrazowanie Rysunek 5A jest wynikiem negatywnym; w polu widzenia obrazowania nie zaobserwowano aktywnych komórek. Rycina 5B-D są pomyślnymi wynikami. Rycina 5B zawiera mniej niż 10 aktywnych komórek, lecz nie występują w nim wyraźne naczynia krwionośne. Rycina 5C posiada więcej niż 50 aktywnych komórek oraz widoczne naczynia krwionośne. W Rycina 5Dw polu widzenia obrazowania znajduje się setki aktywnych komórek; jednocześnie zaobserwowano wyraźne naczynia krwionośne. Wysokiej jakości in vivo obrazowanie wapnia zazwyczaj obejmuje setki aktywowanych komórek. Przyjmuje się, że liczba mniej niż dwunastu aktywowanych komórek jest niewystarczająca dla uzyskania optymalnych wyników obrazowania. Zazwyczaj liczba komórek koreluje z średnicą soczewki GRIN, a także z obszarem mózgu. Większa średnica soczewki GRIN oraz położenie obszaru mózgu bliżej strony grzbietowej zwiększają prawdopodobieństwo zaobserwowania większej liczby aktywnych komórek. Należy również zaznaczyć, że im większa średnica soczewki GRIN, tym większe uszkodzenia mózgu myszy; dlatego kluczowy jest wybór odpowiedniego rozmiaru. Implantacja soczewki GRIN o średnicy 1 mm nie wpływa na zdolność zwierzęcia do nabycia zachowania w torze liniowym (Rycina uzupełniająca S1).
Dane behawioralne oraz dane z obrazowania wapnia są zazwyczaj przetwarzane oddzielnie. Dane behawioralne myszy mogą być etykietowane ręcznie lub przetwarzane przy użyciu otwartoźródłowego oprogramowania analitycznego. Dane z obrazowania wapnia są przetwarzane przy użyciu NoRMCorre (Non-Rigid Motion Correction) oraz EXTRACT w programie MATLAB. Rysunek 6 przedstawia wyodrębnione pojedyncze komórki nałożone na pole widzenia oraz pięć reprezentatywnych śladów wapniowych z pomyślnego pomiaru obrazowania wapnia in vivo. Reprezentatywny film z surowymi danymi znajduje się w Supplementary Video S1.
Weryfikacja, czy implantacja soczewki GRIN oraz wstrzyknięcie wirusa odbyły się w zamierzonym obszarze mózgu, jest ostatnim i bardzo ważnym krokiem dla interpretacji danych. Rysunek 7 przedstawia przekrój mózgu myszy ukazujący miejsce ekspresji GCaMP6f (region fluorescencji zielonej) oraz tor implantacji soczewki GRIN.
<img alt="Proces obrazowania mózgu: wstrzyknięcie wirusa, implantacja soczewki GRIN, testy behawioralne, schemat przetwarzania danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat procedur wstrzykiwania wirusa i implantacji soczewki GRIN. (A) Wstrzyknięcie wirusa AAV-CaMKIIα-GCaMP6f do zakrętu zębatego. (B) Implantacja soczewki GRIN powyżej zakrętu zębatego. (C) Kontrola jakości obrazowania po operacji. (D) Mocowanie płytki podstawy miniskopu po weryfikacji. (E) Oś czasu i przebieg całego protokołu. Skrót: GRIN = Gradient index. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Stereotaktyczny zestaw do gryzoni i pozycjonowanie mózgu z prętami usznymi oraz mikropipetą do precyzyjnego celowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywny widok chirurgiczny podczas wstrzykiwania wirusa. (A) Umieszczenie myszy w aparacie stereotaktycznym. (B) Wyznaczenie obszaru implantacji soczewki GRIN (region czarny). (C) Kraniotomia w obszarze docelowym. (D) Wstrzykiwanie 240 nL wirusa do zakrętu zębatego. (E) Usunięcie mikropipety po wstrzyknięciu. (F) Usunięcie kory i części tkanki mózgowej obszaru CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Sekwencja eksperymentu biopsji tkankowej; proces ekstrakcji chirurgicznej; analiza mikroskopowa w dużym powiększeniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentacyjny widok chirurgiczny podczas aspiracji tkanki mózgowej. (A) Obszar zaznaczony czarnym markerem jest szlifowany za pomocą mikrowiertarki, pozostawiając (B) częściowo odsłoniętą tkankę kory. Lewa część ukazuje odsłoniętą korę, a prawa jest przykryta oponą twardą i tkanką czaszki. (C) Reprezentacyjny obraz podczas aspiracji tkanki kory mózgu. Tkanka pozostaje bladoróżowa. (D) W polu widzenia widoczna jest istota biała, zaznaczona białą strzałką. (E) Dalsze odsysanie ujawniło ciemnoszarą, czerwonawą, odblaskową powierzchnię pod istotą białą. Przyjmuje się, że obszar ten (czarna strzałka) jest powierzchnią CA1 i odsysanie nie powinno sięgać głębiej. (F) Po kilkukrotnym płukaniu solą fizjologiczną w tym obszarze nie jest już widoczne krwawienie. Na wszystkich panelach gwiazdki oznaczają narzędzia chirurgiczne: tępy igłowy kaniulę 30 G do soli fizjologicznej oraz tępą igłę 25 G do aspiracji tkanki mózgowej. Paski skali = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Instalacja soczewki GRIN u gryzonia do badań optycznych, przedstawiająca konfigurację i komponenty, takie jak płytka głowowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykładowa procedura implantacji soczewki GRIN i mocowania płytki podstawowej. (A) Implantacja soczewki GRIN do tkanki mózgowej przy użyciu uchwytu do soczewek GRIN. (B) Przymocowanie soczewki GRIN w odpowiednim miejscu za pomocą żywicy UV; część odblaskowa reprezentuje żywicę UV. (C) Mocowanie płytki głowowej do czaszki myszy przy użyciu żywicy UV. (D) Przykrycie soczewki GRIN wydrukowaną w technologii 3D osłoną ochronną. (E) Kontrola jakości zabiegu chirurgicznego. Miniskop został unieruchomiony za pomocą uchwytu. (F) Nałożenie materiałów na bazę protezy wokół płytki podstawowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe ekspresji GCaMP6f i naczyń krwionośnych w badaniu obrazowania biologicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Pomyślne i niepomyślne wyniki obrazowania. (A) Niepomyślny wynik obrazowania wapnia in vivo. W panelu A nie ma aktywnych komórek, a w wielu obszarach widoczne są ciemne plamy krwi, wskazane czarnymi strzałkami. (B-D) Pomyślne wyniki obrazowania wapnia in vivo. (B) Obserwuje się mniej niż 10 aktywnych komórek, ale w polu obrazowania nie występują istotne naczynia krwionośne. (C) Obserwuje się ponad 50 aktywnych komórek i istotne naczynia krwionośne. (D) Obserwuje się setki aktywnych komórek i bardziej wyraźne naczynia krwionośne. Przerywane okręgi reprezentują pole widzenia obrazowania. Zielone strzałki wskazują komórki wykazujące ekspresję GCaMP6f. Czerwone strzałki wskazują naczynia krwionośne. Paski skali = 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza aktywności neuronalnej z wykorzystaniem miniaturowej mikroskopii u myszy; obejmuje obrazowanie komórek, sygnały, ścieżkę ruchu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Reprezentatywne dane z obrazowania wapnia in vivo u myszy biegającej po liniowej bieżni. (A) Pole widzenia obrazowania rejestrowane przez miniskop, całkowita liczba komórek = 227. (B) Reprezentatywne przebiegi sygnałów wapniowych. Lokalizacja komórek została zaznaczona tym samym kolorem co w części A. (C) Zadanie behawioralne: Liniowa bieżnia z nagrodami w postaci wody na obu końcach. (D) Reprezentatywny wynik analizy behawioralnej aktywności myszy; całkowity czas = 100 s. Niebieskie linie pionowe wskazują punkty czasowe zachowań lizania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza aktywności neuronalnej, mikroskopia fluorescencyjna, znakowanie DAPI i GCaMP6f, przekrój mózgu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Przekroje tkanki mózgowej myszy po zabiegu chirurgicznym. (A,B) Dwa przykłady tkanek mózgowych myszy. Przerywane obszary prostokątne wskazują drogę implantacji soczewki GRIN. Zakrzywione linie reprezentują zakręt zębaty w hipokampie. Paski skali = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Problem</td>
			<td>Możliwa przyczyna</td>
			<td>Roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pole obrazowania jest ciemne lub czarne.</td>
			<td>Na dolnej powierzchni soczewki GRIN znajduje się znaczna ilość pozostałości krwi.</td>
			<td>Przed implantacją soczewki GRIN powierzchnię pola operacyjnego należy stale płukać roztworem soli fizjologicznej, aż do całkowitego ustąpienia widocznego krwawienia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">W polu obrazowania widoczne są wyraźnie naczynia krwionośne, jednak nie stwierdzono dostrzegalnej aktywności neuronalnej.</td>
			<td>1. Ekspresja wirusa była suboptimalna lub słaba.</td>
			<td>1. Zaleca się sprawdzenie następujących kwestii:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Lokalizacja zaobserwowanej ekspresji wirusa nie pokrywa się z miejscem implantacji soczewki GRIN (zazwyczaj miejsce implantacji soczewki GRIN jest zbyt płytkie w stosunku do pożądanego obszaru).</td>
			<td>a. Należy upewnić się, że warunki przechowywania wirusa są odpowiednie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>b. Zweryfikuj, czy miejsce iniekcji wirusa jest prawidłowe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>c. Potwierdź, że stężenie wirusa jest odpowiednie.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2. Podczas kolejnego zabiegu chirurgicznego głębokość implantacji soczewki GRIN można odpowiednio zwiększyć, a dokładną głębokość należy starannie odnotować przy każdym przeprowadzeniu eksperymentu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Pole obrazowania wykazuje pewne regionalne wzorce aktywności neuronalnej, jednak na poziomie pojedynczych komórek nie obserwuje się wyraźnie widocznej aktywności.</td>
			<td>1. Objętość wstrzykniętego wirusa była zbyt wysoka.</td>
			<td>1. Rozcieńczyć wirusa lub zmniejszyć objętość wstrzykiwanego wirusa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Lokalizacja ekspresji wirusa nie pokrywa się z położeniem soczewki GRIN (zazwyczaj soczewka GRIN jest implantowana na mniejszej głębokości niż optymalna pozycja dla ekspresji wirusa).</td>
			<td>2. Podczas kolejnego zabiegu chirurgicznego głębokość implantacji soczewki GRIN można odpowiednio zwiększyć; dokładną głębokość należy starannie odnotowywać przy każdym przeprowadzeniu eksperymentu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W polu obrazowania znajdują się niektóre komórki, które przez cały czas utrzymują stały, silny sygnał fluorescencyjny, a intensywność tej fluorescencji nie ulega zmianie.</td>
			<td>Wirus jest nadekspresowany w pojedynczej komórce.</td>
			<td>Rozcieńczyć wirusa lub zmniejszyć objętość iniekcji wirusa.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Tabela rozwiązywania problemów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Rysunek dodatkowy S1: Prawidłowe nabywanie zadania pamięci przestrzennej przez myszy, które przeszły operację.Wykres przedstawia kwantyfikację liczby ukończonych prób w 20 min sesji każdego dnia. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. N = 3 myszy w grupie z operacją i 4 w grupie bez operacji. Do porównania statystycznego zastosowano dwuczynnikową analizę wariancji (two-way ANOVA). Skrót: ns = brak istotności statystycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Wideo uzupełniające S1: Reprezentatywne surowe dane z obrazowania wapnia w DG.Wideo to demonstruje aktywność wapniową w okresie 5 min. Wideo jest odtwarzane z prędkością 10x prędkości oryginalnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Projekt płytki mocującej. Plik ten zawiera rysunek 2D projektu płytki mocującej. Produkcja płytki mocującej polega na wycięciu stali nierdzewnej zgodnie z rysunkiem. Dwa małe otwory w bocznym pasku powinny zostać nagwintowane gwintem M1.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Projekt wydrukowanej w technologii 3D nakładki ochronnej.Plik ten zawiera g-kod warstw nakładki ochronnej, który można wykorzystać w drukarce 3D. W niniejszym protokole jako surowiec do druku zastosowano plastik z kwasu polimlekowego. Małe otwory po bokach odpowiadają położeniu otworów gwintowanych w płytce głowowej, co umożliwia montaż. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający 3: Konstrukcja uchwytu miniscope.Plik ten zawiera g-code warstw uchwytu miniscope, który można wykorzystać w drukarce 3D. Cylindryczny otwór służy do montażu w uchwycie stereotaktycznym za pomocą śruby M4. Otwory boczne są przeznaczone do dodania śrub dociskowych, jednak uchwyt można stosować również bez tej funkcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający 4: Kod sterujący Arduino oraz skrypty do wstępnego przetwarzania surowych filmów z obrazowania wapnia.Plik ten zawiera skrypty do sterowania Arduino oraz kod do wstępnego przetwarzania danych z obrazowania wapnia. Kod Arduino steruje konfiguracją behawioralną, w której mysz uczy się lizać w celu otrzymania nagrody w postaci wody na naprzemiennych końcach toru liniowego. Po opanowaniu zadania myszy będą wielokrotnie biegać w przód i w tył po torze. Kod do wstępnego przetwarzania obrazowania wapnia wykonuje konwersję formatu plików, korekcję ruchu, przestrzenną redukcję próbkowania oraz ekstrakcję sygnału komórkowego z danych zebranych za pomocą miniskopu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Zakręt zębaty hipokampa pełni podstawowe i odrębne funkcje w uczeniu się i pamięci. Protokół ten opisuje zestaw solidnych i skutecznych procedur obrazowania in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym u swobodnie poruszających się myszy.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

Cóż, w tym protokole używamy miniaturowego mikroskopu do zbadania neuroaktywności w zakręcie zębatym hipokampa. Naszym celem jest zbadanie kodowania neuronów i reprezentacji przestrzennych w różnych stanach chorobowych. Uważam, że kluczowym wyzwaniem związanym z badaniem zakrętu zębatego in vivo jest uzyskanie wysokiej jakości danych obrazowych dotyczących wapnia.To, czy różne wyrazy twarzy są zadowalające, czy soczewka GRIN jest wszczepiona we właściwym miejscu i takie szczegóły podczas całej operacji mają kluczowe znaczenie dla powodzenia badania. W tradycyjnej chirurgii obrazowania wapnia wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki GRIN są zwykle wykonywane jako oddzielne operacje. W naszym protokole połączyliśmy te dwa kroki w jedną procedurę, która nie tylko skraca czas oczekiwania, ale także zapewnia dokładne umieszczenie soczewki GRIN.Nasze laboratorium wykorzystuje różne techniki mikroskopowe do badania neurodynamiki leżącej u podstaw funkcji poznawczych. Mamy nadzieję zrozumieć wzorce neuroaktywności, które wspierają procesy poznawcze, a łącząc modelowanie teoretyczne i manipulacje przyczynowe, mamy nadzieję przeanalizować procesy przepływu informacji i neuroobliczeń w mózgu. Na początek umieść znieczuloną mysz na aparacie stereotaktycznym.Wykonaj ciągłe nacięcie wzdłuż linii środkowej skóry głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych i odetnij część skóry głowy, aby odsłonić powierzchnię czaszki. Wykonaj kraniotomię w określonym obszarze za pomocą mikrowiertła i ustaw cztery punkty jako granicę. Przerwij wiercenie, gdy tkanka mózgowa stanie się widoczna.Użyj panelu sterowania, aby ustawić wstrzykiwacz tak, aby wstrzykiwał 80 nanolitrów wirusa. Kliknij przycisk Wstrzyknij na panelu sterowania, aby wstrzyknąć wirusa do zakrętu zębatego z szybkością przepływu jednego nanolitra na sekundę. Aby zassać tkankę mózgową, obróć końcówkę igły blisko tkanki mózgowej i delikatnie dociśnij, aby ułatwić aspirację.Podczas odsysania należy stale płukać zimną solą fizjologiczną, aby utrzymać wyraźny widok mózgu. Uważnie obserwuj cechy tkanki, aby monitorować głębokość aspiracji. Tkanka korowa jest bladoróżowa.Ciało modzelowate pod spodem wygląda jak biała tkanka włóknista, a warstwa CA1 hipokampa jest ciemnoczerwona i szara. Przerwij ssanie, gdy powierzchnia tkanki stanie się gładka i odsłonięty zostanie duży obszar CA1. Przesuń uchwyt przymocowany do soczewki GRIN nad wywiercony otwór.Gdy soczewka GRIN zetknie się z powierzchnią tkanki mózgowej, ustaw oś Z na zero. Włóż soczewkę GRIN do otworu na grzbietowej osi brzusznej minus 1.32 milimetra. Pozostaw uchwyt na pięć do 10 minut, a następnie podnieś uchwyt i spłucz otwór solą fizjologiczną.Za pomocą igły nałóż żywicę ultrafioletową wokół soczewki GRIN. Oświetl obszar światłem ultrafioletowym przez 15 sekund, aby upewnić się, że żywica stanie się solidna. Ostrożnie wyjmij uchwyt z soczewki GRIN.Przykryj całą odsłoniętą czaszkę żywicą ultrafioletową. Umieść płytę głowy na czaszce w odpowiedniej pozycji. Oświetl całą czaszkę i płytkę głowy światłem ultrafioletowym przez 15 sekund.Zakryj odsłoniętą soczewkę GRIN nasadką ochronną wydrukowaną w 3D. Przymocuj nasadkę do płyty czołowej za pomocą M1.6. Włącz oprogramowanie sterujące mini oscyloskopem i kliknij Wybierz plik konfiguracyjny, a następnie wybierz VS code, a następnie pliki konfiguracyjne użytkownika.Teraz kliknij Uruchom, a następnie przesuń przycisk zasilania LED, aby dostosować jasność. Przesuń przycisk regulacji ostrości, aby ustawić wartość bliską zeru. Przymocuj płytkę bazową do mini lunety i ponownie wyreguluj pozycję mini oscyloskopu, aby uzyskać pole widzenia o dobrej jakości obrazowania.Ostrożnie nałóż pierwszą warstwę materiału bazowego protezy wokół płyty podstawy mini lunety. Gdy pierwsza warstwa cementu stwardnieje, nałóż drugą warstwę cementu od płyty podstawy do płyty głównej. Po stwardnieniu całego materiału podstawy protezy poluzuj dociskową i odłącz mini lunetę od płyty podstawy.Umieść nasadkę płyty podstawy w płycie podstawy, aby chronić odsłoniętą soczewkę GRIN i dokręć dociskową. Po zobrazowaniu przekonwertuj dane obrazowania z formatu AVI na HDF5. Zastosuj niesztywną korekcję ruchu i próbkuj w dół film z korekcją ruchu.Zastosuj ekstrakcję do danych próbki w dół, aby zidentyfikować sygnały pojedynczej komórki, a następnie zastosuj kontrolę komórek i ręcznie wybierz potencjalne komórki. Kliknij przycisk Zapisz dane przed zamknięciem okna sprawdzania komórki. Na koniec zapisz pliki danych.W nieudanym obrazowaniu wapnia in vivo nie zaobserwowano żadnych aktywnych komórek w polu widzenia obrazowania. Udane obrazowanie wapnia in vivo wykazało mniej niż 10 aktywnych komórek bez widocznych naczyń krwionośnych, ponad 50 aktywnych komórek z widocznymi naczyniami krwionośnymi i setki aktywnych komórek z przezroczystymi naczyniami krwionośnymi. Wyekstrahowane pojedyncze komórki z udanego obrazowania wapnia in vivo nałożono na pole widzenia, pokazując reprezentatywne ślady wapnia.Położenie ekspresji GCaMP6f i ślad soczewki GRIN zostały zweryfikowane w wycinku mózgu myszy.

in-vivo-calcium-imaging-granule-cells-dentate-gyrus-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Źródło: Shannonhouse, J., et al. In vivo Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego. J. Vis. Exp. (2023). Film przedstawia technikę obrazowania wapnia in vivo w celu monitorowania aktywności neuronalnej w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) myszy transgenicznej. Neurony DRG wyrażają wskaźnik wapnia, który zwiększa intensywność fluorescencji po związaniu się z wapniem. Bodźce mechaniczne lub termiczne...

Obrazowanie in vivo wapnia zespołów neuronalnych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego myszy

Źródło: Calvo-Rodríguez, et al. Obrazowanie fluorescencyjne i bioluminescencyjne subkomórkowego Ca2+ w starzejących się neuronach hipokampa. J. vis. exp. (2015).  Ten film demonstruje zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego do pomiaru poziomu cytozolowego wapnia w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów. Porównując młode i starzejące się neurony, podkreśla, w jaki sposób zwiększona gęstość kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu L i przedłużona aktywacja w starzejących...

Obrazowanie wapnia in vitro w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo to potężna technika do badania dynamiki neuronów i mikroobwodów u swobodnie zachowujących się myszy. Protokół ten opisuje wykonywanie operacji mózgu w celu uzyskania dobrego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniskopu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Obecny protokół opisuje obrazowanie wapnia in vivo do pomiaru odpowiedzi zespołów neuronów DRG lędźwiowych-6 na bodźce somatyczne i trzewne. Można dokonać dokładnych porównań między neuronami reagującymi na różne bodźce. Protokół ten jest cenny w badaniu mechanizmów bólu trzewnego i stymulacji somatycznej, takich jak akupunktura.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe reakcji neuronów zwojów korzenia grzbietowego na bodźce somatyczne i trzewne

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Poznaj metodę obrazowania wapnia in vivo w komórkach ziarnistych zakrętu zębatego u myszy. Protokół łączy iniekcję wirusa z implantacją soczewki GRIN, poprawiając jakość danych o aktywności neuronalnej.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Przeglądaj więcej filmów