Zastosowanie barkodowania DNA do identyfikacji roślin leczniczych

Moje badania mają na celu wykorzystanie mocy technologii kodów kreskowych DNA w celu zwiększenia dokładności i skuteczności identyfikacji roślin medycznych, przyczyniając się w ten sposób do perswazji i zrównoważonego wykorzystania ich cennych zasobów naturalnych. Technologia kodów kreskowych DNA znalazła szersze zastosowania, takie jak kontrola jakości poprzez monitorowanie lub ocena ochrony gatunków i różnorodności biologicznej. Mielenie i amplifikacja o wysokiej przepustowości są połączone z transmisją DNA w celu identyfikacji gatunków, co połączyło zastosowanie identyfikacji ziół na podstawie barkodowania DNA i ujawniło błąd kodowania kreskowego DNA w przeszłości.

Obecnie brakuje kompleksowych wytycznych dotyczących identyfikacji roślin leczniczych, a nasz proces może dostarczyć szczegółowych odniesień. Podstawowe pytanie badawcze dla naszego laboratorium w przyszłości, w którym ludzie integrują technologię kodów kreskowych DNA z technologiami w naszych dziedzinach w celu poszerzenia zastosowań i innowacji technologicznych. Na początek weź 100 miligramów świeżej tkanki lub 20 miligramów wysuszonej na powietrzu tkanki i umieść ją w dwumililitrowej probówce wirówkowej.

Umieść dwa pięciomilimetrowe koraliki ze stali nierdzewnej w probówce wirówkowej i przenieś ją do wysokowydajnego młynka do tkanek, pracującego z częstotliwością 60 Hz przez 60 sekund. W celu ekstrakcji DNA dodać do próbki 800 mikrolitrów wstępnie schłodzonego buforu do izolacji jądrowej i umieścić ją w mieszalniku wirowym na pięć minut. Następnie umieść próbkę w wirówce i wiruj w temperaturze 13 780G przez 10 minut.

Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant. Następnie dodaj 600 mikrolitrów buforu P1, a następnie pięć mikrolitrów RNazy A do próbki. Po wirowaniu inkubować próbki w łaźni wodnej w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny, odwracając probówki dwa do trzech razy podczas inkubacji.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu P2, dokładnie wymieszaj i umieść próbkę na lodzie na 15 minut. Następnie odwirować w temperaturze 13 780G przez 10 minut. Ostrożnie zassać supernatant do kolumny filtracyjnej AF i odwirować go przy 13,780G przez dwie minuty.

Przenieś dolny filtrat do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Po obliczeniu objętości filtratu dodać do próbki 1,5-krotność objętości buforu P3 i natychmiast wstrząsnąć, aby wymieszać próbkę. Dodać 650 mikrolitrów przygotowanej mieszaniny do kolumny absorpcyjnej i inkubować przez pięć minut.

Następnie odwirować w temperaturze 13 780G przez 30 do 60 sekund. Ponownie dodać otrzymany filtrat do kolumny absorpcyjnej. Odwirować i wyrzucić odpadowy płyn.

Przemyć kolumnę dwukrotnie 600 mikrolitrami roztworu płuczącego WB. Po odwirowaniu wyrzucić odpadową ciecz, a następnie umieścić kolumnę absorpcyjną w pustej probówce zbiorczej. Po odwirowaniu próbki w temperaturze 13,780G przez dwie minuty, pozostawić ją w temperaturze pokojowej w celu odparowania resztkowego etanolu. Przenieś kolumnę absorpcyjną do czystej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i dodaj 45 mikrolitrów wysterylizowanej wody dejonizowanej podgrzanej do 65 stopni Celsjusza do środka membrany adsorpcyjnej.

Pięć minut później odwiruj probówkę o sile 13 780 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie użyj spektrofotometru. Oznaczyć stężenie DNA w przefiltrowanym roztworze.

Współczynniki absorbancji OD260 do OD280 wahały się od 1,8 do 1,84, a ilość DNA przekraczała 100 nanogramów na mikrolitr, co potwierdza dobrą jakość wyekstrahowanego DNA Na początek wyekstrahuj DNA z tkanki roślinnej i określ stężenie DNA. Ustaw reakcję po dodaniu wszystkich wymaganych składników do probówki wirówkowej o pojemności 0,2 mililitra. Po amplifikacji startera załadować trzy mikrolitry produktu PCR i dwa mikrolitry markera DNA o liczbie 5 000 par zasad do dołków żelu agarozowego.

Ustaw napięcie na 120 woltów, prąd na 400 miliamperów i uruchom elektroforezę na 40 minut. Korzystaj z wszechstronnego systemu analizy obrazu żelu, aby przeglądać i analizować wyniki żelu. Po przepuszczeniu próbki przez jednostkę sekwencjonowania wybierz opcję Utwórz nowy projekt i kliknij przycisk OK, aby przejść do strony głównej oprogramowania.

W menu Plik wybierz opcję Importuj i dodaj próbki, wybierz plik formatu śledzenia sekwencji i zaimportuj go jako plik do przetworzenia w niezmontowanych próbkach. Wybierz Następnie przejdź do pozycji Zestaw zaawansowany i wybierz pozycję Złóż w grupach. Gdy pojawi się okno dialogowe z monitem o zdefiniowanie nazw, zmodyfikuj nazwę pliku w sekcji definiowania części o nazwie próbki i kliknij przycisk Złóż, aby wyświetlić sekwencję wyrównania.

Wybierz pozycję Przejdź, a następnie wybierz pozycję Sekwencja wyszukiwania i kliknij przycisk OK, aby znaleźć pasującą sekwencję. Wybierz, a następnie wybierz usuń, aby usunąć regiony 5.8S i 28S wraz z sekwencjami o niskiej jakości. Wyeksportuj dane wyjściowe z połączonymi sekwencjami w celu dopasowania.

Wybierz wyszukiwanie BLAST przy użyciu bazy danych nukleotydów w NCBI. Wybierz narzędzie do identyfikacji gatunku i specyficzny starter ITS2 odpowiadający globalnej bazie danych genomu Farmakopei, pobierz sekwencje trzech gatunków arcydzięgla i jednego gatunku Peucedanum praeruptorum jako grupę zewnętrzną z NCBI. Przeanalizuj te sekwencje wraz z uzyskanymi sekwencjami wynikowymi.

Następnie kliknij Plik. Wybierz opcję Otwórz plik lub sesję, aby zaimportować plik, a pojawi się okno dialogowe. Wybierz linię, a następnie DNA i wybierz linię CLUSTALW w celu porównania sekwencji.

Przejdź do filogenezy i kliknij Skonstruuj drzewo łączenia sąsiadów testowych, aby wygenerować drzewo filogenetyczne. Wyniki elektroforezy żelowej wykazały pojedyncze przezroczyste prążki około 500 par zasad dla próbek AS1, AS2 i AS3, bez prążków w kontroli ujemnej, co wskazuje na pomyślną amplifikację wyekstrahowanego DNA. Wyniki sekwencjonowania zidentyfikowały Angelica sinensis ze 100% podobieństwem sekwencji za pomocą BLAST, dopasowując wyniki z bazy danych GPGD.

W analizie filogenetycznej sekwencje splicingowe grupowały się z Angelica sinensis OR879715.1, z wartością wsparcia bootstrap wynoszącą 100, co dowodzi identyfikacji jako Angelica sinensis.