Name: Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: Poznaj metodę oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe z wykorzystaniem fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów. Ta technika umożliwia charakterystykę ligaz, nukleaz i polimeraz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AW jest wspierany przez Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004). RS jest laureatem stypendium New Zealand Post Antarctic Scholarship. SG i UR dziękują Instytutowi Chemicznemu Uniwersytetu w Tromsø - Norweskiemu Uniwersytetowi Arktycznemu za wsparcie techniczne.

1. Projektowanie i zakup oligonukleotydów
UWAGA: Zaprojektuj jednoniciowe oligonukleotydy, które zostaną złożone i poddane hybrydyzacji w celu utworzenia pożądanych dupleksów. Jedna lub więcej nici w dupleksie musi posiadać grupę fluorescencyjną, aby umożliwić śledzenie przetwarzania oligonukleotydów przez badany enzym. Podstawowy zestaw sekwencji jednoniciowych, które można złożyć dla różnych zakresów aktywności, przedstawiono w Tabeli 1.
<ol>
	<li>Wprowadź specyficzne modyfikacje wymagane dla analizowanego enzymu, zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>W przypadku substratów dla ligazy DNA (Rycina 1): Złóż najprostszy substrat z trzech oligonukleotydów: fosforylowanej na końcu 5' nici donora (NL2), znakowanej FAM na końcu 5' nici akceptora (NL1) oraz nici komplementarnej, która łączy obie nici (NL3).
		<ol>
			<li>Upewnij się, że nici stanowiące koniec 5' ligowalnego nacięcia (nick) są fosforylowane przed przygotowaniem mieszaniny głównej substratu w kroku 2. Zamów tę modyfikację dla NL2 (zgodnie z Tabelą 1) lub zastosuj fosforylowanie enzymatyczne za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 po resuspensji oligonukleotydów.</li>
			<li>Uwzględnij fosforylowanie końcowe 5' dla NL6 i NL8, które stanowią komplement do pęknięć dwuniciowych przedstawionych na Rycynie 1A (NL6/NL7 oraz NL8/NL9), ponieważ najlepiej odwzorowuje to naturalny substrat powstający w wyniku działania endonukleazy restrykcyjnej. Użyj substratu z podwójnym znakowaniem, aby określić względny stopień ligacji dla złożonych konstrukcji wieloczęściowych (patrz krok 6).</li>
			<li>Zmodyfikuj nić komplementarną, aby uzyskać niedopasowania (NL10) i przerwy (NL11). 
			UWAGA: Warianty prostego substratu z nacięciem przedstawiono na Rycynie 1A. Można zastosować inne sekwencje, aby uzyskać jeszcze szerszy zakres niedopasowań lub dłuższe przerwy poprzez zmianę podkreślonej pozycji.</li>
			<li>Zastąp oligonukleotydy DNA oligonukleotydami RNA. 
			UWAGA: Warianty prostego substratu z nacięciem przedstawiono na Rycynie 1B. Szerszy zakres dupleksów DNA/RNA można wygenerować poprzez dodatkowe kombinacje zestawu bazowego podanego tutaj, aby stworzyć na przykład pęknięcia dwuniciowe zawierające zarówno RNA, jak i DNA. Przykład takiej modyfikacji podano w kroku 6 poniżej, gdzie zastosowano strategię podwójnego znakowania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku substratów dla polimerazy DNA: Złóż oligonukleotydy NL1 i NL3 wymienione w Tabeli 1, aby uzyskać prosty test elongacji primera. Badaj dodatkowe aspekty aktywności polimerazy, wprowadzając modyfikacje do nici NL1 (primer) lub NL3 (matryca).
		<ol>
			<li>Wprowadź analogi uszkodzonych zasad do oligonukleotydu NL3 przed pozycją 20, aby określić zdolność do omijania uszkodzeń w nici matrycy.</li>
			<li>Wprowadź analogi uszkodzonych zasad do oligonukleotydu NL1 w pozycji 20, aby określić zdolność do elongacji uszkodzonego primera.</li>
			<li>Użyj RNL1 lub RNL3 w dupleksie, aby zbadać elongację primera RNA lub wykorzystanie matrycy RNA.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku substratów dla nukleaz (Rycina 2): Złóż oligonukleotydy, aby uzyskać niwyczerpujący zakres substratów dwu- i jednoniciowych (Rycina 2Ai), a także zakres połączeń z tzw. „flaps” (flapped) i „splayed” (Rycina 2Aii) oraz substraty uszkodzone (Rycina 2B).
		<ol>
			<li>Aby zbadać aktywność rybonukleazy, iteracyjnie zastępuj NL1, NL2 i NL3 odpowiednio RNL1, RNL2 i RNL3. Użyj dodatkowych wersji RNA dla HJ5 i HJ6, aby dalej rozszerzyć ten zestaw.</li>
			<li>Użyj oligonukleotydów MD5, MD6 i MD9, które posiadają centralnie umieszczoną modyfikację naśladującą uszkodzenie oksydacyjne, abazyjny produkt pośredni naprawy lub produkt deaminacji (Rycina 2B). Substraty te pozwolą wykryć rozcięcie nici w tej pozycji. Znakuj komplementarną nić NL3 ortogonalnym fluoroforem, takim jak TAMRA, aby wykryć rozcięcie dwuniciowe (patrz krok 6).</li>
			<li>Zastosuj ortogonalne znakowanie komplementu, aby wykryć cięcie dwuniciowe w miejscach niedopasowań zarówno w nici sondy (NL5 i ND9), jak i w nici komplementarnej (MD10 i NL10).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamów syntetyczne oligonukleotydy zawierające odpowiednie fluorofory i inne modyfikacje u komercyjnego dostawcy. 
	UWAGA: Dla opisanych testów odpowiednia jest skala syntezy 100 nM oraz oczyszczanie metodą HPLC po syntezie.</li>
</ol>
2. Składanie i wyżarzanie dupleksów kwasów nukleinowych
<ol>
	<li>Resuspensja i rozcieńczanie oligonukleotydów
	<ol>
		<li>Przed otwarciem liofilizowane oligonukleotydy w probówkach 2 mL należy odwirować z maksymalną prędkością w wirówce nakładkowej przez 2-5 min, aby upewnić się, że kwasy nukleinowe znajdują się na dnie probówki.</li>
		<li>Przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 100 µM poprzez resuspensję oligonukleotydów w buforze TE (10 mM tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris), 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)). Należy upewnić się, że oligonukleotydy zostały całkowicie resuspendowane poprzez wielokrotne delikatne mieszanie w wortexie i krótkie odwirowanie z maksymalną prędkością.</li>
		<li>Przygotować roztwór zapasowy 10 µM poprzez rozcieńczenie aликwoty roztworu zapasowego buforem TE. Roztwór 10 µM rozcieńczyć wodą ultrapure (wodą MQ), aby przygotować roztwory robocze o stężeniach 0,5 µM, 0,7 µM lub 2,5 µM zgodnie z Tabelą 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i hybrydyzacja mieszanin reakcyjnych (master mix)
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaniny reakcyjne, korzystając z roztworów roboczych, zgodnie z kombinacjami podanymi w Tabeli 2 oraz objętościami wskazanymi w Tabeli 3. W przypadku standardowego testu ligazy DNA oraz większości pozostałych opisanych tutaj testów, końcowy skład buforu to 50 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 10 mM ditiotreitol (DTT) z 10 mM Mg jako kationem dwuwartościowym.</li>
		<li>Hybrydyzację oligonukleotydów przeprowadzić w probówce do PCR lub mikroprobówce, ogrzewając w 95 °C przez 5 min przy użyciu bloku grzejnego lub termocyklera. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 30 min (objętości &lt;1 mL) do 1 h (objętości &gt;1 mL). W przypadku dłuższych oligonukleotydów (&gt;40 nt) przeprowadzić wolniejsze chłodzenie, używając termocyklera z rampą obniżania temperatury od 95 °C do 25 °C w ciągu 45 min lub umieszczając probówkę z mieszaniną hybrydyzacyjną w 1 L zlewce z wrzącą wodą i pozostawiając do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez noc.</li>
		<li>Kofaktory nukleotydowe oraz pozostałe termolabilne składniki buforu dodać do mieszaniny master mix po ostygnięciu do temperatury pokojowej. Końcową mieszaninę reakcyjną wykorzystać bezpośrednio do testu poprzez dodanie enzymu (patrz krok 3 poniżej) lub przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Standardowe przygotowanie do analizy
<ol>
	<li>Przygotowanie i rozpoczęcie reakcji testowej
	<ol>
		<li>W probówce do PCR połączyć 22.5 µL odpowiedniego roztworu głównego (master mix) substratu z 2.5 µL ligazy DNA lub innego badanego enzymu. Reakcje należy przeprowadzić w dubletach lub triplikatach, szczególnie w przypadku planowania analizy ilościowej wyników.</li>
		<li>W próbkach testowych należy uwzględnić kontrolę bez białka (sam bufor). W razie potrzeby na tym etapie dodać kontrole bez kofaktora. 
		UWAGA: Enzymy można przechowywać w temperaturze -20 °C w 50% v/v glicerolu, co umożliwia ich pobieranie bezpośrednio z roztworu. Przed dodaniem należy upewnić się, że roztwory enzymów z glicerolem zostały dobrze wymieszane, poprzez pipetowanie lub delikatne wirowanie w wortexie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Niezwłocznie przenieść próbki do termocyklera ustawionego na 25 °C i inkubować przez 30 min. Temperaturę i czas inkubacji należy dostosować do optymalnych warunków aktywności enzymu.</li>
	<li>Zatrzymać reakcje poprzez dodanie 5 µL barwnika do nakładania (95% formamid, 0.5 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), błękit bromofenolowy) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 min.</li>
</ol>
4. Analiza wyników testu
<ol>
	<li>Przygotuj żele PAGE z Tris-boranem-EDTA (TBE) i mocznikiem zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór stokowy zawierający 20% akryloamidu, 7 M mocznika oraz 1x TBE. Dla opisanego tutaj zestawu oligonukleotydów należy użyć roztworu akryloamidu/bis w stosunku 29:1 w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości.</li>
		<li>Aby przygotować jeden żel, połącz 10 mL 20% akryloamidu i 7 M roztworu mocznika z 100 µL APS (10 %) oraz 3 µL tetrametyloetylenodiaminy (TMED), a następnie odlej w formie do żeli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zastygnięciu żelu przeprowadź elektroforezę próbek na żelu TBE z mocznikiem w temperaturze 45 - 55 °C.
	<ol>
		<li>Przeprowadź wstępny przebieg żelu w buforze 1x TBE przez 30 min przy natężeniu 10 mA na żel z zastosowaniem zewnętrznego ogrzewania.</li>
		<li>Usuń nadmiar mocznika z dołków żelu, przepłukując je buforem 1x TBE za pomocą pipety Pasteura.</li>
		<li>Naniesienie 10 µL każdej z reakcji i prowadź elektroforezę przy 10 mA przez 1,0-1,5 h z zastosowaniem zewnętrznego ogrzewania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizuj żel na skanerze (imagerze), stosując odpowiednie ustawienia dla wybranego fluoroforu. Dla FAM użyj zestawu filtrów zapewniającego wzbudzenie/emisję przy 495/519 nm, który jest zapisany jako ustawienie fabryczne w większości skanerów.</li>
	<li>Ilościowo określ intensywność prążka produktu i substratu za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów dołączonego do skanera lub programu zewnętrznego, takiego jak ImageJ49,50, a następnie oblicz procentowy udział produktu, korzystając ze wzoru: 
	<img alt="Wzór na procenty: P/(P+S)×100; równanie służące do obliczania wydajności lub pomiaru stężenia." src="/files/ftp_upload/66930/66930eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	Gdzie P to zintegrowana wartość prążka produktu, a S to zintegrowana powierzchnia prążka substratu. W przypadku przykładu reakcji ligazy DNA prążek produktu znajduje się na poziomie 40 nukleotydów (nt), a prążek substratu na poziomie 20 nt.</li>
</ol>
5. Deadenylacja ligazy DNA w celu przetestowania specyficzności kofaktora
<ol>
	<li>Przygotowanie głównych mieszanin reakcyjnych (master mix)
	<ol>
		<li>Przygotować jeden zestaw master mix zawierający oligonukleotyd NL1 znakowany FAM, zgodnie z opisem w Tabeli 4. Przygotować drugi zestaw zawierający oligonukleotyd NL1 bez znacznika FAM, zgodnie z opisem w Tabeli 4.</li>
		<li>Oddzielnie podgrzać oba dupleksy DNA do 95 °C przez 5 min, a następnie chłodzić przez 30 min do 1 h w temperaturze 25 °C. Do żadnego z zestawów master mix nie dodawać kofaktora nukleotydowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Złożenie i zainicjowanie reakcji deadenylacji
	<ol>
		<li>Przygotować pojedynczą reakcję deadenylacji dla każdego testowanego typu/stężenia kofaktora, łącząc 10 µL nieznakowanego master mix z 2,5 µL enzymu ligazy.</li>
		<li>Przygotować dodatkowe probówki jako kontrolę bez kofaktora oraz kontrolę bez białka (w miejsce enzymu dodać 2,5 µL buforu).</li>
		<li>Inkubować reakcje w temperaturze odpowiadającej optymalnej aktywności enzymu przez 1-2 h. Czas inkubacji można wydłużyć, jeśli enzym nadal jest adenylowany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzenie reakcji ligacji z kofaktorem.
	<ol>
		<li>Dodać 10 µL znakowanego master mix oraz 2,5 µL wybranych kofaktorów nukleotydowych (np. ATP, NAD, ADP lub GTP) bezpośrednio do reakcji po deadenylacji (stężenie końcowe 0,1-1 mM).</li>
		<li>Do kontroli bez kofaktora nukleotydowego dodać 2,5 µL buforu reakcyjnego.</li>
		<li>Inkubować reakcje przez ten sam czas i w tej samej temperaturze, co w poprzednim etapie. Przerwać reakcję i przeprowadzić wizualizację zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Wykorzystanie substratów z podwójnym znakowaniem do ligacji z użyciem szyn (splinted ligation) lub montażu wieloelementowego
<ol>
	<li>Zaprojektuj i zamów oligonukleotyd z grupą fluorescencyjną, która posiada inne widmo wzbudzenia/emisji niż fluorofor użyty wcześniej.
	<ol>
		<li>W opisanej tutaj konfiguracji użyj oligonukleotydu NL2 (TAMRA) z 5-karboksy-tetrametylorodaminą (TAMRA) na końcu 3' (Tabela 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj master mix zgodnie z opisem poniżej.
	<ol>
		<li>Połącz składniki reakcji opisane w kroku 2, w tym ekwimolarne ilości wszystkich oligonukleotydów wykorzystanych w składaniu, a także bufor i kationy dwudoboczne.</li>
		<li>Przeprowadź hybrydyzację poprzez ogrzanie do 95 °C przez 5 min i schładzanie do 25 °C przez 30 min – 1 h. Dodaj kofaktor oraz enzym i inkubuj zgodnie z opisem w kroku 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadź analizę i obrazowanie próbek zgodnie z opisem w kroku 4, używając odpowiednich kanałów dla pary fluoroforów w substracie. W przypadku FAM i TAMRA są to kanały fluoresceiny (FITC) i tetrametylorodaminy (TRITC) dostępne w większości urządzeń do obrazowania.</li>
</ol>
7. Ocena wiązania DNA za pomocą testu przesunięcia mobilności elektroforetycznej (EMSA) na żelu natywnym
<ol>
	<li>Przygotować 10% natywny żel TBE PAGE zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Wymieszać 2,5 mL 40% akryloamidu, 1 mL 10x TBE, 100 µL 10% APS, 3 µL TMED oraz 6,5 mL wody MQ i odlać w formie do żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować reakcję wiązania zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Przygotować substrat do EMSA zgodnie z Tabelą 5, tak aby uwzględnić EDTA (10 mM) i pominąć jony metali.</li>
		<li>W probówce PCR połączyć 20 µL mieszaniny matki (master mix) substratu EMSA z 5 µL białka. Uwzględnić próbkę kontrolną bez białka. Inkubować przez 30 min w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić analizę za pomocą elektroforezy natywnej zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Do próbek dodać 5 µL 5x natywnego barwnika do nakładania (100 mM EDTA, 0,25% błękitu bromofenolowego, 25% v/v glicerolu i woda MQ do objętości 1 mL).</li>
		<li>Nanieść na przygotowany żel i prowadzić elektroforezę przy napięciu 60 V przez 2-3 h z chłodzeniem przez obieg wody, aż czoło barwnika znajdzie się kilka cm powyżej końca żelu.</li>
		<li>Zwizualizować i przeanalizować żele zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Assays for DNA Enzymes Using Synthetic Oligonucleotides

SEG i UR są pracownikami firmy ArcticZymes Technologies AS, która zajmuje się dystrybucją ligazy R2D. AW, ER-S i RS nie mają sprzecznych interesów.

Krytyczne kroki w protokole Projektowanie i zakup oligonukleotydów: Kupując oligonukleotydy do tworzenia dupleksu, należy wziąć pod uwagę projekt sekwencji. Zaleca się użycie narzędzia do analizatora oligonów do przewidywania właściwości sekwencji nukleotydowej, takich jak zawartość GC, temperatura topnienia, struktura drugorzędowa i potencjał dimeryzacji, przed zamówieniem57.
Montaż i wyżarzanie dupleksów kwasów nukleinowych: Podczas przygotowywania dupleksów RNA/RNA-DNA należy zachować ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazą, stosując odczynniki i wodę, które są wolne od RNaz lub dodając inhibitor RNAzy (o ile badany enzym sam w sobie nie jest RNAzą). Sprzęt, rękawice i miejsce na stole powinny być potraktowane roztworem do odkażania RNazy przed złożeniem mieszanek głównych, aby uniknąć degradacji oligonukleotydów58. Zapasy główne oligonukleotydów RNA mogą być tworzone w mniejszych partiach w przypadku zanieczyszczenia.
Ligazy DNA zawsze wymagają kofaktora nukleotydowego, ATP lub NAD, w końcowym stężeniu od 0,1 do 1 mM. Polimerazy DNA wymagają dNTP do syntezy nici, a te są zwykle dodawane w proporcjach równomolowych po 50 μM każdej. Podczas przygotowywania mieszanin wzorcowych dla dupleksów ligazy i polimerazy, kofaktory nukleotydowe, takie jak ATP, NAD i dNTP, muszą zostać dodane do mieszanki głównej po podgrzaniu mieszaniny i schłodzeniu do temperatury pokojowej, ponieważ są one wrażliwe na ciepło.
10-krotny bufor do wyżarzania oligonukleotydów wymaga dodania DTT, który ma krótki okres półtrwania i najlepiej przygotować go na świeżo lub zamrożonego przed użyciem. Mniejsze porcje bufora 10x mogą być przygotowywane z wyprzedzeniem i przechowywane w temperaturze 4 °C, z dodatkiem naziemnej telewizji cyfrowej przed użyciem.
Oligonukleotydy i mieszanki wzorcowe powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania, a znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy lub mieszaniny powinny być owinięte folią, aby zapobiec fotobieleniu fluoroforu. Aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania, które mogą zagrozić integralności oligonukleotydów, zaleca się przygotowanie i użycie mniejszych objętości (>1 ml).
Konfiguracja testu i analiza wyników: Włączenie kontroli ma zasadnicze znaczenie dla prawidłowej interpretacji wyników testu. Należy zastosować kontrolę bezbiałkową (substrat DNA z roztworem buforowym), aby upewnić się, że pozorna aktywność na substracie jest wynikiem działania enzymu. W przypadku nukleazy degradacja substratu egzogennego spowoduje pasma o niskiej masie cząsteczkowej lub drabinki w kontroli, podczas gdy w przypadku ligazy lub polimerazy niepełna denaturacja dupleksowa spowoduje kontrolę pasma o dużej masie cząsteczkowej. Pozytywna kontrola wielkości oczekiwanego produktu znajduje się w tabeli 2 i powinna zostać uwzględniona w celu sprawdzenia prawidłowego rozmiaru produktu.
Ważne parametry wpływające na udaną elektroforezę produktu testowego zostały opisane w poprzednim protokole59. Obejmują one zapewnienie, że procentowa zawartość akrylamidu jest odpowiednia do wielkości podłoża oraz użycie odpowiedniego barwnika obciążającego w zależności od wielkości podłoża i rodzaju żelu wymaganego do wizualizacji wyników. Barwnik śledzący błękit bromofenolowy ma przybliżoną wielkość 10-zasadowego oligonukleotydu i dlatego jest odpowiedni dla opisanego tutaj zestawu oligonukleotydów; Jeśli jednak pasmo barwnika nakłada się na produkt fluorescencyjny lub pasma substratu przy użyciu krótszych nukleotydów, barwnik śledzący można wymienić na ksylocyjanol, który działa wolniej60.
Aby zapewnić dobrą rozdzielczość pasm substratu/produktu, zbiornik żelu powinien być ogrzewany zewnętrznie za pomocą łaźni wodnej lub pod wysokim napięciem (np. 180 V). Wstępne działanie żeli mocznikowych PAGE przez co najmniej 30 minut i przepłukiwanie studzienek pipetą w celu usunięcia nadmiaru mocznika jest niezbędne do uzyskania ostrych, prostych pasm nadających się do oznaczania ilościowego.
W celu ilościowego określenia substratów i produktów zakres 20%-80% całego materiału powinien zostać przekształcony w produkt, aby umożliwić dokładną integrację pasków żelu fluorescencyjnego. W przypadku oznaczania nowego enzymu zaleca się przeprowadzenie gradientu stężeń białka, aby umożliwić wykonanie kolejnych pomiarów w tym zakresie. Wiele kamer fluorescencyjnych ma wbudowane funkcje integracji pasma, które można wykorzystać do tego celu. Jeśli używasz zewnętrznego programu, takiego jak ImageJ49, upewnij się, że obraz żelu jest eksportowany w wysokiej jakości w formacie tiff.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z techniką Projektowanie i zakup oligonukleotydów: Oligonukleotydy podane w tym protokole są użytecznymi punktami wyjścia i mogą być rozszerzane, zgodnie z sugestią w sekcji dotyczącej metod, poprzez zmianę sekwencji oligonukleotydów i wprowadzanie modyfikacji.
Standardowa konfiguracja testu i analiza wyników: Eksperymenty pilotażowe są niezbędne podczas testowania aktywności nowego enzymu, ponieważ optymalne warunki reakcji będą się różnić w zależności od różnych białek; Parametry podane w niniejszym protokole służą jedynie jako punkt wyjścia. Czynniki takie jak stężenie enzymu, temperatura reakcji, czas trwania inkubacji, kofaktor i skład buforu/pH mogą ulegać zmianom podczas mieszania wzorcowego i zespołu reakcji testu. Stężenia kofaktorów są szczególnie ważne, ponieważ nadmiar kofaktorów nukleotydowych lub jonów metali może być hamujący i zaleca się testowanie zakresu stężeń każdego z nich. W przypadku polimeraz DNA zalecane stężenia dNTP wahają się od 20 do 200 μM ogółem, jednak wysokie stężenia dNTP zmniejszają wierność61. Podobnie, ligazy polinukleotydowe są zwykle oznaczane z kofaktorem nukleotydów 0,1-1,0 mM, ale nadmierne stężenia powodują adenylan nagromadzonego DNA i hamowanie reakcji62.
Standardowy protokół tutaj używa Mg jako kationu dwuwartościowego; jednak niektóre enzymy są bardziej aktywne z manganem (Mn) lub (Zn). Mieszanki wzorcowe zawierające Mn lub Zn należy przygotować z buforem o niższym pH (<7,5), a po podgrzaniu należy dodać metale. Mieszanki wzorcowe należy stosować tego samego dnia, aby uniknąć wytrącania się i hamowania aktywności enzymu.
Dodatki, w tym środki stłoczenia, takie jak glikol polietylenowy (PEG) lub stabilizatory, takie jak albumina surowicy bydlęcej, mogą być stosowane w celu zwiększenia aktywności niektórych enzymów63,64. Powinny one być dodawane po etapie wyżarzania ze względu na ich termoaplikowalność. Wszystkie odczynniki pochodzenia biologicznego powinny być klasy biologii molekularnej, aby uniknąć wprowadzania zanieczyszczających nukleaz.
Objętość buforu wygaszającego formamid stosowana w tym protokole jest odpowiednia dla podstawowego zestawu oligonukleotydów. Jednak w przypadku dłuższych oligonukleotydów objętość formamidu należy zwiększyć do poziomu od 10 μl do 20 μl, aby zapewnić całkowite oddzielenie nici, a reakcje hartowane można schładzać na lodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu elektroforezy.
W przypadku niektórych enzymów ścisłe wiązanie białka z substratem/produktem może wykluczać migrację oligonukleotydów do żelu podczas elektroforezy, zwłaszcza gdy enzym jest stosowany w wysokich stężeniach. Objawia się to brakiem pasm produktu/substratu na żelu i często nagromadzeniem materiału fluorescencyjnego (produktu i/lub substratu skompleksowanego z białkiem) w studzienkach. Aby rozbić te kompleksy, mieszaninę testową można poddać działaniu proteinazy K przed dodaniem buforu wygaszającego lub dodecylosiarczanu sodu (SDS) podczas hartowania.
Aktywność ligazy DNA wytwarza dwa dyskretne prążki, które są łatwe do ilościowego określenia. Możliwe jest zastosowanie tej samej metody do ilościowego określenia aktywności endonukleazy na podłożu uszkodzenia DNA, w przypadku gdy przewiduje się pojedynczy produkt 20 nukleotydów, lub testów EMSA, w których wyraźnie rozróżnia się stany związane/niezwiązane. Dokładna kwantyfikacja aktywności polimerazy i nukleazy procesowej jest trudna ze względu na integrację pasmową i ogólnie zaleca się stosowanie testów w czasie rzeczywistym za pomocą sond lub sygnalizatorów, jak opisano we wprowadzeniu.
De-adenylacja i specyficzność kofaktora ligazy DNA: Może być wymagana pewna optymalizacja tego protokołu w celu usunięcia całej aktywności tła, która następnie zostanie przywrócona przez dodanie kofaktora (kofaktorów) nukleotydów. Jeśli aktywność ligazy tła pozostaje po dedenylacji (postrzeganej jako ligacja w kontroli bez kofaktora), czas inkubacji etapu dedenylacji może zostać wydłużony lub stężenie ligazy może zostać zmniejszone. Upewnij się, że dupleks DNA bez etykiety jest bardziej skoncentrowany niż białko (> 4:1::substrate: białko). Jeśli dodanie kofaktora w obecności znakowanego DNA nie przywróci ligacji dla żadnego z badanych kofaktorów, możliwe jest, że enzym uległ denaturacji i etap deadenylacji powinien zostać skrócony. W przypadku nowej ligazy lub nowej partii rekombinowanego enzymu przydatne jest określenie zakresu ligacji tła z adenylowanym enzymem przy braku dodatkowych kofaktorów nukleotydowych. Wiąże się to z przeprowadzeniem kolejnej reakcji, w której jednocześnie inkubuje się 10 μl nieznakowanej mieszanki wzorcowej, 10 μl znakowanej mieszanki głównej i 2,5 μl świeżego enzymu, który nie został zdeadenylowany.
Używaj podłoży z podwójnym oznaczeniem: Protokół ten wymaga zaprojektowania i zakupu oligonukleotydu z ugrupowaniem fluorescencyjnym, który ma inne widmo wzbudzenia/emisji niż pierwotnie użyty fluorofor, a następnie złożenia go w dupleks, tak aby dwa ortogonalne fluorofory znakowały różne części substratu. W razie wątpliwości dostępnych jest wiele internetowych przeglądarek widmowych do sprawdzania widm wzbudzenia i emisji, na przykład FPbase Spectra Viewer i BD Spectrum Viewer, które można wykorzystać do sprawdzenia zarówno kompatybilności pary fluoroforów, jak i najbardziej odpowiednich ustawień imagera. Konkretne ustawienia używane do wizualizacji żelu będą zależeć od modelu wyczuwalnika i użytego fluoroforu. Złożony obraz zarejestruje sygnał z obu kanałów na pojedynczym żelu, a pasmo, w którym oba fluorofory są przymocowane do tego samego produktu, będzie wyświetlane jako kolor pośredni. Oddzielne obrazy z poszczególnych kanałów mogą być analizowane w celu ilościowego określenia zakresu podwiązania lub degradacji na różnie znakowanych pasmach.
Ograniczenia techniki Chociaż praca z podłożami znakowanymi fluorescencyjnie ma wiele zalet, takich jak niskie zagrożenie dla zdrowia, istnieją pewne ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę podczas pracy z tego typu oznakowanymi podłożami. Jednym z nich jest stosunkowo wysoki koszt zamówienia tych oligonukleotydów z etykietami fluoroforowymi lub modyfikacjami, takimi jak dodanie uszkodzonych zasad, w porównaniu z domieszkowaniem radioaktywnym. Innym jest to, że do wykrywania oznakowanych pasm wymagany jest specjalistyczny sprzęt i oprogramowanie do obrazowania. Jednak te cechy są teraz zawarte w większości nowych systemów wyobrażania sobie żeli. Należy również wziąć pod uwagę potencjał fluoroforów do zmiany właściwości wiązania docelowych białek interakcji. Fluoresceina i jej pochodna FAM są powszechnie używane do oznaczania oligonukleotydów i są wrażliwe na zmiany pH i wygaszanie zasad nukleotydowych65. Ograniczenia te należy dokładnie rozważyć przy podejmowaniu decyzji o rodzaju i rozmieszczeniu fluoroforów na oligonukleotydzie w przypadku projektowania dupleksowego.

Wszystkie formy życia wymagają enzymów przetwarzających kwasy nukleinowe do przeprowadzenia podstawowych procesów biologicznych, w tym replikacji, transkrypcji i naprawy DNA. Kluczowymi funkcjami enzymatycznymi tych szlaków są polimerazy, które generują kopie cząsteczek RNA/DNA, ligazy, które łączą substraty polinukleotydowe, nukleazy, które je degradują, oraz helikazy i topoizomerazy, które topią dupleksy kwasów nukleinowych lub zmieniają ich topologię1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Ponadto wiele z tych enzymów dostarcza niezbędnych narzędzi molekularnych do zastosowań takich jak klonowanie, diagnostyka i sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości11,12,13,14,15.
Cechy funkcjonalne, kinetyka i specyficzność substratów tych enzymów mogą być określone za pomocą znakowanych substratów DNA/RNA wytwarzanych przez wyżarzanie oligonukleotydów. Śledzenie substratów i produktów tradycyjnie odbywało się poprzez wprowadzenie znacznika radioaktywnego (32P) na końcu nici 5', który można następnie wykryć za pomocą kliszy fotograficznej lub systemu obrazowania luminoforowego16,17. Podczas gdy znakowane radioizotopowo substraty oferują korzyści w postaci zwiększonej czułości eksperymentalnej i nie zmieniają właściwości chemicznych nukleotydu, potencjalne zagrożenia dla zdrowia wynikające z pracy z radioizotopami zachęciły do opracowania nieradioaktywnego znakowania kwasami nukleinowymi, aby zapewnić bezpieczniejszą alternatywę dla wykrywania DNA i RNA18,19,20. Wśród nich detekcja fluorescencji, w tym bezpośrednia detekcja fluorescencji, fluorescencja czasowo-rozdzielcza oraz testy transferu energii/wygaszania fluorescencji, wyróżniają się jako najbardziej wszechstronne21,22,23,24. Szeroka gama fluoroforów umożliwia różne projekty substratów DNA/RNA z unikalnymi reporterami na każdym oligonukleotydzie25. Dodatkowo, stabilność fluoroforów, w porównaniu z radioizotopami, pozwala użytkownikom na produkcję i zachowanie znacznych ilości fluorescencyjnie znakowanych substratów DNA19. Te znakowane fluoroforem substraty mogą być inkubowane z interesującym białkiem, wraz z różnymi kombinacjami kofaktorów metali i nukleotydów, w celu analizy aktywności wiązania i/lub enzymu. Wizualizację wiązania lub aktywności można zaobserwować za pomocą różnych kanałów barwnika fluoroforowego z systemem obrazowania żelowego. Ponieważ tylko fluorescencyjnie znakowane oligonukleotydy będą widoczne przy użyciu tej techniki, każdy wzrost lub spadek rozmiaru znakowanego oligonukleotydu będzie łatwy do prześledzenia. Żele można również później zabarwić barwnikami barwiącymi kwasy nukleinowe, aby uwidocznić wszystkie prążki DNA obecne na żelu.
Ligazy kwasu polinukleinowego to enzymy, które łączą fragmenty DNA/RNA, katalizując uszczelnianie pęknięć poprzez tworzenie wiązania fosfodiestrowego między 5' fosforylowanymi końcami DNA a 3' OH DNA. Można je podzielić na dwie grupy w zależności od wymagań dotyczących substratu nukleotydowego. Wysoce konserwatywne ligazy zależne od NAD znajdują się we wszystkich bakteriach26, podczas gdy strukturalnie zróżnicowane enzymy zależne od ATP można zidentyfikować we wszystkich domenach życia8,27. Ligazy DNA odgrywają ważną rolę w przetwarzaniu fragmentów Okazaki podczas replikacji, a także biorą udział w różnych szlakach naprawy DNA, takich jak naprawa nukleotydów i wycięć zasad, poprzez uszczelnianie spontanicznych nacięć i nacięć, które pozostają po naprawie8,10. Różne ligazy DNA wykazują różne zdolności do łączenia różnych konformacji pęknięć DNA, w tym nacięć w dupleksie, pęknięć dwuniciowych, niedopasowań i luk, a także hybryd RNA i DNA28,29,30. Różnorodna gama zligawalnych substratów może być łączona przez wyżarzanie oligonukleotydów fosforanem 5' w celu wytworzenia zestawionych końców 5' i 3' w dupleksie kwasu nukleinowego31,32,33. Najczęstszą metodą analizy jest rozdzielczość mocznika PAGE w formacie testu punktu końcowego; Jednak ostatnie innowacje obejmują zastosowanie elektroforezy w żelu kapilarnym, która umożliwia wysoką przepustowość34, profilowanie spektrometryczne mas35, a także jednorodny molekularny test nawigacyjny, który umożliwia monitorowanie z rozdzielczością czasową36.
Pierwszym krokiem w reakcji ligacji jest adenylacja enzymu ligazy przez trifosforan adenozyny (ATP) lub dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD), w wyniku czego powstaje pośredni enzym kowalencyjny. Drugim etapem reakcji jest adenylacja substratu kwasu nukleinowego na końcu 5' miejsca nacięcia, po której następuje ligacja nici nacięcia kwasu nukleinowego. Wiele enzymów ligazowych, które ulegają rekombinacyjnej ekspresji w E. coli, jest oczyszczanych w postaci adenylowanej i dlatego są w stanie z powodzeniem ligować kwasy nukleinowe bez dodawania kofaktora nukleotydowego. Utrudnia to określenie, jaki konkretny typ kofaktora nukleotydowego są potrzebne do ligacji kwasów nukleinowych. Oprócz opisu testów oceniających aktywność ligazy DNA, przedstawiono również metodę wiarygodnego określania użycia kofaktora poprzez deadenylację enzymu przy użyciu nieznakowanych substratów.
Nukleazy to duża i zróżnicowana grupa enzymów modyfikujących DNA/RNA oraz katalitycznych RNA, które rozszczepiają wiązania fosfodiestrowe między kwasami nukleinowymi37. Funkcje enzymów nukleazy są wymagane w replikacji, naprawie i przetwarzaniu DNA i można je sklasyfikować według ich specyficzności cukrowej dla DNA, RNA lub obu. Endonukleazy hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w nici DNA/RNA, podczas gdy egzonukleazy hydrolizują nici DNA/RNA po jednym nukleotydzie na raz od końca 3' lub 5' i mogą to robić od końca 3' do 5' lub od 5' do 3' klasy DNA38.
Podczas gdy wiele białek nukleazy jest niespecyficznych i może brać udział w wielu procesach, inne są wysoce specyficzne dla określonej sekwencji lub uszkodzenia DNA6,39,40. Nukleazy specyficzne dla sekwencji są wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań biotechnologicznych, takich jak klonowanie, mutageneza i edycja genomu. Popularnymi nukleazami do tych zastosowań są nukleazy restrykcyjne41, nukleazy palców cynkowych42, nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji, a ostatnio nukleazy CRISPR sterowane przez RNA43. Ostatnio zidentyfikowano nukleazy specyficzne dla uszkodzeń, takie jak nukleaza EndoMS, która ma swoistość dla niedopasowań w DNA dzięki specyficznej dla niedopasowania domenie nukleazy podobnej do RecB5,44. Historycznie rzecz biorąc, testy aktywności nukleazy były wykonywane jako testy nieciągłe z substratami znakowanymi radioaktywnie; Jednak oprócz innych wad, nie pozwalają one na identyfikację miejsca, które jest cięte przez białko nukleazy, co jest możliwe przy użyciu substratów znakowanych fluorescencyjnie45,46. Niedawno opracowano ciągłe testy nukleazy, które działają przy użyciu różnych barwników DNA, które oddziałują z DNA w różnych stanach; na przykład, emitując silniejszy sygnał fluorescencyjny podczas interakcji z dsDNA niż w stanie niezwiązanym lub wiążąc się specyficznie z krótkimi RNAs47. Inne ciągłe testy nukleazy wykorzystują spinki do włosów DNA z grupą fluoroforową na końcu 5' i wygaszaczem na końcu 3', dzięki czemu fluorescencja wzrasta wraz z degradacją oligonukleotydu w wyniku oddzielenia fluoroforu i wygaszacza48. Podczas gdy testy te pozwalają scharakteryzować kinetykę białek rozkładających DNA, wymagają one wcześniejszej wiedzy na temat funkcji i substratu enzymu, a także ograniczają się do enzymów, które zmieniają konformację DNA, powodując różnicę w wiązaniu barwnika. Z tego powodu testy punktów końcowych, które rozwiązują poszczególne produkty nukleazy, są nadal pożądane, aby zapewnić wgląd w modyfikacje DNA spowodowane aktywnością białka.
Tutaj przedstawiono szczegółową procedurę projektowania fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów DNA/RNA, które mogą być mieszane i dopasowywane w celu wygenerowania substratów do testowania aktywności nowych enzymów nukleazowych, polimerazowych i ligazowych. Walidacja tego podstawowego zestawu sekwencji oligonukleotydowych upraszcza projektowanie eksperymentów i ułatwia ekonomiczne profilowanie szerokiego zakresu funkcji enzymatycznych bez konieczności zakupu dużej liczby substratów na zamówienie. Przedstawiono szczegółową procedurę przeprowadzania standardowego testu enzymatycznego przetwarzania DNA z tymi substratami, na przykładzie aktywności ligazy DNA i opisano modyfikacje do oznaczania i analizy enzymów nukleazy i polimerazy. Ponadto podano zmodyfikowany test do określenia swoistości kofaktora enzymu ligazy DNA z dużą dokładnością, a podwójnie znakowane sondy są używane do oceny montażu ligacji wieloskładnikowych. Na koniec omówiono modyfikacje podstawowego formatu testu, aby umożliwić jego wykorzystanie do określenia interakcji białko-DNA z tymi samymi substratami za pomocą testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA).

<table><tbody><tr><td>30% Akrylamid/Bis Roztwór (29:1)</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>Adenozynotrifosforan (ATP)</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boran</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Wiele dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System elektroforezy z kąpielą z wodą obiegową</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie fluorescencji, np. iBright FL1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32752</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Wiele dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System odlewania żelu</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td>Inne jony metali mogą być preferowane w zależności od badanego białka</td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (1,5 ml)</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety i końcówki</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td>1 mL, 0,2 mL, 0,02 mL, 0,002 ml</td></tr><tr><td>Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+)</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>NA</td><td>Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,&nbsp; Genscript i inni również dostarczają te</td></tr><tr><td>pipety pastwiskowe</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler PCR</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki PCR</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAse away</td><td>ThermoFisher</td><td>7002PK</td><td>Potrzebne tylko podczas pracy z oligonukleotydami</td></tr><tr><td>RNA RNase AWAY</td><td>Merck</td><td>83931-250ML</td><td>Środek powierzchniowo czynny do usuwania RNAzy zanieczyszczenie powierzchni</td></tr><tr><td>Woda wolna od RNAza</td><td>New England Biolabs</td><td>B1500L</td><td>Potrzebne tylko podczas pracy z oligonukleotydami RNA</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SUPERaza IN: inhibitor RNazy</td>: <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td>Inhibitor RNAzy, o szerokim spektrum działania, (na bazie białka)</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Może to być używane do barwienia żeli i wizualizacji nieoznakowanych oligonukleotydów</td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TMED)</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris, czyli tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta (Milli-Q)Mocznik</td> <td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

Dostępność szeregu modyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów od komercyjnych dostawców pozwoliła na opracowanie zaawansowanych testów do charakteryzowania różnych właściwości enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, które mogą być uruchamiane w dowolnym standardowym laboratorium biologii molekularnej. Zastosowanie etykiet fluorescencyjnych sprawiło, że metody te stały się dostępne dla badaczy dysponujących standardowym sprzętem do elektroforezy PAGE i obrazownikiem fluorescencyjnym, bez użycia materiałów radioaktywnych lub bez konieczności korzystania z laboratorium przeznaczonego do przechowywania i przygotowywania materiałów radioaktywnych, tj. Hot Lab. Opcjonalne dodanie standardowych modyfikacji, takich jak fosforylacja, może uprościć konfigurację testu, podczas gdy specyficzne włączenie zmodyfikowanych nukleotydów, które naśladują uszkodzenia DNA lub produkty pośrednie, może być wykorzystane do zbadania określonych aspektów zachowania enzymu. W tym miejscu zademonstrowano projektowanie i wykonanie testów w celu zbadania kilku aspektów przetwarzania DNA przez enzymy przy użyciu dostępnych na rynku syntetycznych oligonukleotydów. Obejmują one zdolność ligaz do łączenia się lub nukleaz do degradacji różnych struktur hybrydowych DNA i RNA, zróżnicowane wykorzystanie kofaktorów przez ligazę DNA oraz ocenę zdolności enzymów do wiązania DNA. Omówiono czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas projektowania syntetycznych substratów nukleotydowych, a także przedstawiono podstawowy zestaw oligonukleotydów, które można wykorzystać do szeregu testów ligaz kwasów nukleinowych, polimerazy i enzymów nukleazy.

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to ...

Moja grupa badawcza była bardzo zainteresowana enzymami biorącymi udział w replikacji i naprawie DNA. W szczególności badamy enzymy z mikroorganizmów ekstremofilnych, a także z patogenów, ponieważ chcemy zrozumieć, w jaki sposób te enzymy pozwalają tym organizmom przetrwać wyzwania środowiskowe. Interesują nas zarówno biologiczne funkcje enzymów, jak i ich biotechnologiczne zastosowania.Dużo pracujemy z ligazami DNA i RNA, a ostatnio ustaliliśmy rolę minimalnego rodzaju ligazy DNA, która wydaje się być transportowana na zewnątrz komórki bakteryjnej. Ustaliliśmy, że odgrywa to rolę w tworzeniu biofilmu u patogenu Neisseria gonorrhoeae. Wraz z naszymi współpracownikami z ArcticZymes scharakteryzowaliśmy nową ligazę RNA do DNA, która jest w stanie przyłączyć adaptery DNA do obu końców fragmentu RNA.Nasi współpracownicy z ArcticZymes, którzy również przyczynili się do powstania tego protokołu, charakteryzują różne enzymy metabolizujące DNA i RNA, które mają potencjalne zastosowania w biologii molekularnej. Używają więc tego typu protokołu jako pierwszego kroku do zrozumienia spektrum działania tych enzymów i porównania ich z tym, co jest już dostępne na rynku. Protokół stanowi łatwiejszą i bezpieczniejszą alternatywę dla enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe SA w porównaniu z użyciem substratów znakowanych radioaktywnie.Znakowane fluorescencyjnie substraty DNA lub RNA sprawiają, że nasze podejście jest bardziej wydajne, ponieważ możemy mieszać i dopasowywać oligonukleotydy, aby uzyskać różne substraty. W tej chwili skupiamy się na zrozumieniu biologicznej funkcji niektórych nowych nukleaz, które odkryliśmy w genomie środowiska Antarktydy. Te nukleazy mają homologi w innych ekstremofilnych organizmach, więc próbujemy zrozumieć, jaką rolę odgrywają w umożliwianiu przetrwania tym mikrobom.Jesteśmy również bardzo zainteresowani aktywnością niektórych z naszych nowych enzymów na nienaturalnych analogach kwasów nukleinowych i ich potencjalnymi zastosowaniami w ramach zestawu narzędzi biologii molekularnej z nienaturalnymi substratami DNA i RNA Na początek odwiruj liofilizowaną probówkę zawierającą oligonukleotyd z pełną prędkością w wirówce stołowej przez dwie do pięciu minut. Ponownie zawiesić oligonukleotydy w buforze TE, aby przygotować główny zapas 100 mikromolów i delikatnie zawirować probówkę. Rozcieńczyć podwielokrotność głównego produktu wyjściowego buforem TE, aby przygotować 10-mikromolowy materiał wyjściowy i przygotować główną mieszankę reakcyjną.Po dozowaniu mieszanki do wymaganych probówek, wyżarzaj oligonukleotydy w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Pozwól rurce ostygnąć do temperatury pokojowej przez 30 minut do jednej godziny. Następnie dodaj kofaktory nukleotydowe i inne wrażliwe na ciepło składniki buforowe do mieszanki głównej.W razie potrzeby przechowuj mieszankę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Połącz 22,5 mikrolitra głównej mieszanki substratu z 2,5 mikrolitrami ligazy DNA w probówce PCR. Natychmiast umieść probówki reakcyjne w maszynie do PCR w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 30 minut.Aby wygasić reakcję, dodaj pięć mikrolitrów barwnika ładującego i inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Na początek przygotuj zapas 20% akrylamidu, siedmiu molowych moczników i jednego roztworu XTBE. Na jeden żel połącz 10 mililitrów roztworu akrylamidu i mocznika ze 100 mikrolitrami 10% nadsiarczanu amonu i trzema mikrolitrami tetrametyloetylenodiaminy i wlej do odlewu żelowego.Po zestaleniu się żelu należy go wstępnie uruchomić w jednym buforze XTBE przez 30 minut przy natężeniu 10 miliamperów na żel z zewnętrznym ogrzewaniem. Za pomocą pipety do pastwisk przepłucz jeden XTBE do studzienek żelowych, aby usunąć mocznik dostępowy. Załaduj 10 mikrolitrów każdej reakcji i uruchom przez jedną do 1,5 godziny w temperaturze od 45 do 55 stopni Celsjusza.Zwizualizuj żel z prawidłowymi ustawieniami dla wybranego fluoroforu. Na koniec określ ilościowo intensywność pasma produktu i podłoża za pomocą obrazu J i oblicz zawartość procentową produktu, korzystając ze wzoru. Aktywność ligazy DNA doprowadziła do wzrostu wielkości oligonukleotydów z 20 nukleotydów do 40 nukleotydów obserwowanych na żelu mocznikowym.Bakteryjna ligaza DNA ligowała zarówno nacięcia, jak i niedopasowane substraty DNA i może wykorzystywać zarówno magnez, jak i mangan do aktywności ligacji z preferencją dla magnezu.

using-modified-synthetic-oligonucleotides-to-assay-nucleic-acid

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Protokół opisany tutaj ma na celu wyjaśnienie i skrócenie licznych przeszkód na drodze skomplikowanej drogi prowadzącej do zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów. W związku z tym protokół ten ułatwia zarówno syntezę tych aktywowanych elementów budulcowych, jak i ich dostępność do praktycznych zastosowań.

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

DNA i białka są specjalnie znakowane sekwencyjnie grupami reporterowymi o powinowactwie lub fluorescencyjnym za pomocą metylotransferaz DNA lub białek oraz analogów syntetycznych kofaktorów. W zależności od specyficzności kofaktora enzymów, do jedno- lub dwuetapowego znakowania stosuje się azyrydynę lub podwójnie aktywowane analogi kofaktorów.

Specyficzne sekwencyjnie znakowanie kwasów nukleinowych i białek za pomocą metylotransferaz i analogów kofaktorów

Ten protokół opisuje charakterystykę syntezy modyfikowanego DNA przez polimerazę DNA poprzez obserwację zmian w DNA znakowanym fluorescencyjnie w bliskiej podczerwieni za pomocą elektroforezy żelowej i obrazowania żelowego. Żele akrylamidowe są używane do obrazowania w wysokiej rozdzielczości separacji krótkich kwasów nukleinowych, które migrują z różną szybkością w zależności od wielkości.

Test aktywności polimerazy DNA przy użyciu znakowanego fluorescencyjnie DNA w bliskiej podczerwieni wizualizowanego za pomocą elektroforezy w żelu akrylowym

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego jednoetapowego oczyszczania aktywnej, nieoznakowanej, ludzkiej translokacji 10-jedenaście (TET2) 5-metylocytozynowej dioksygenazy za pomocą chromatografii jonowymiennej i jej testu opartego na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS).

Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2

Testy aktywności oparte na NMR zostały opracowane w celu identyfikacji i scharakteryzowania inhibitorów dwóch nukleozydowych enzymów rybohydrolazy. Przedstawiono protokoły dla początkowych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do oznaczania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów przesiewowych licznika rozcieńczeń skokowych oraz testów w całych komórkach E. coli.

Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

Zmieniona aktywność nukleazy jest związana z różnymi schorzeniami ludzkimi, co potwierdza jej potencjał jako biomarkera. Modułowa i łatwa do wdrożenia metodologia badań przesiewowych przedstawiona w tym artykule pozwala na wybór konkretnych sond kwasów nukleinowych do wykorzystania aktywności nukleazy jako biomarkera choroby.

Kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Kwasy nukleinowe są powszechnymi analitami do oceny systemów biologicznych; jednak stronniczość wynikająca z manipulacji enzymatycznych może budzić niepokój. W tym miejscu opisano metodę bezznacznikowego wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą polianiliny. Ta czuła, ekonomiczna technologia czujników może rozróżniać różnice między pojedynczymi nukleotydami między cząsteczkami.

Czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny

Poznaj metodę oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe z wykorzystaniem fluorescencyjnie znakowanych oligonukleotydów. Ta technika umożliwia charakterystykę ligaz, nukleaz i polimeraz.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Przeglądaj więcej filmów