Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Moja grupa badawcza była bardzo zainteresowana enzymami biorącymi udział w replikacji i naprawie DNA. W szczególności badamy enzymy z mikroorganizmów ekstremofilnych, a także z patogenów, ponieważ chcemy zrozumieć, w jaki sposób te enzymy pozwalają tym organizmom przetrwać wyzwania środowiskowe. Interesują nas zarówno biologiczne funkcje enzymów, jak i ich biotechnologiczne zastosowania.

Dużo pracujemy z ligazami DNA i RNA, a ostatnio ustaliliśmy rolę minimalnego rodzaju ligazy DNA, która wydaje się być transportowana na zewnątrz komórki bakteryjnej. Ustaliliśmy, że odgrywa to rolę w tworzeniu biofilmu u patogenu Neisseria gonorrhoeae. Wraz z naszymi współpracownikami z ArcticZymes scharakteryzowaliśmy nową ligazę RNA do DNA, która jest w stanie przyłączyć adaptery DNA do obu końców fragmentu RNA.

Nasi współpracownicy z ArcticZymes, którzy również przyczynili się do powstania tego protokołu, charakteryzują różne enzymy metabolizujące DNA i RNA, które mają potencjalne zastosowania w biologii molekularnej. Używają więc tego typu protokołu jako pierwszego kroku do zrozumienia spektrum działania tych enzymów i porównania ich z tym, co jest już dostępne na rynku. Protokół stanowi łatwiejszą i bezpieczniejszą alternatywę dla enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe SA w porównaniu z użyciem substratów znakowanych radioaktywnie.

Znakowane fluorescencyjnie substraty DNA lub RNA sprawiają, że nasze podejście jest bardziej wydajne, ponieważ możemy mieszać i dopasowywać oligonukleotydy, aby uzyskać różne substraty. W tej chwili skupiamy się na zrozumieniu biologicznej funkcji niektórych nowych nukleaz, które odkryliśmy w genomie środowiska Antarktydy. Te nukleazy mają homologi w innych ekstremofilnych organizmach, więc próbujemy zrozumieć, jaką rolę odgrywają w umożliwianiu przetrwania tym mikrobom.

Jesteśmy również bardzo zainteresowani aktywnością niektórych z naszych nowych enzymów na nienaturalnych analogach kwasów nukleinowych i ich potencjalnymi zastosowaniami w ramach zestawu narzędzi biologii molekularnej z nienaturalnymi substratami DNA i RNA Na początek odwiruj liofilizowaną probówkę zawierającą oligonukleotyd z pełną prędkością w wirówce stołowej przez dwie do pięciu minut. Ponownie zawiesić oligonukleotydy w buforze TE, aby przygotować główny zapas 100 mikromolów i delikatnie zawirować probówkę. Rozcieńczyć podwielokrotność głównego produktu wyjściowego buforem TE, aby przygotować 10-mikromolowy materiał wyjściowy i przygotować główną mieszankę reakcyjną.

Po dozowaniu mieszanki do wymaganych probówek, wyżarzaj oligonukleotydy w termocyklerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Pozwól rurce ostygnąć do temperatury pokojowej przez 30 minut do jednej godziny. Następnie dodaj kofaktory nukleotydowe i inne wrażliwe na ciepło składniki buforowe do mieszanki głównej.

W razie potrzeby przechowuj mieszankę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Połącz 22,5 mikrolitra głównej mieszanki substratu z 2,5 mikrolitrami ligazy DNA w probówce PCR. Natychmiast umieść probówki reakcyjne w maszynie do PCR w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 30 minut.

Aby wygasić reakcję, dodaj pięć mikrolitrów barwnika ładującego i inkubuj w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Na początek przygotuj zapas 20% akrylamidu, siedmiu molowych moczników i jednego roztworu XTBE. Na jeden żel połącz 10 mililitrów roztworu akrylamidu i mocznika ze 100 mikrolitrami 10% nadsiarczanu amonu i trzema mikrolitrami tetrametyloetylenodiaminy i wlej do odlewu żelowego.

Po zestaleniu się żelu należy go wstępnie uruchomić w jednym buforze XTBE przez 30 minut przy natężeniu 10 miliamperów na żel z zewnętrznym ogrzewaniem. Za pomocą pipety do pastwisk przepłucz jeden XTBE do studzienek żelowych, aby usunąć mocznik dostępowy. Załaduj 10 mikrolitrów każdej reakcji i uruchom przez jedną do 1,5 godziny w temperaturze od 45 do 55 stopni Celsjusza.

Zwizualizuj żel z prawidłowymi ustawieniami dla wybranego fluoroforu. Na koniec określ ilościowo intensywność pasma produktu i podłoża za pomocą obrazu J i oblicz zawartość procentową produktu, korzystając ze wzoru. Aktywność ligazy DNA doprowadziła do wzrostu wielkości oligonukleotydów z 20 nukleotydów do 40 nukleotydów obserwowanych na żelu mocznikowym.

Bakteryjna ligaza DNA ligowała zarówno nacięcia, jak i niedopasowane substraty DNA i może wykorzystywać zarówno magnez, jak i mangan do aktywności ligacji z preferencją dla magnezu.