Optymalizacja zbierania łez u myszy do analizy mRNA i białek

Jesteśmy zainteresowani zbadaniem możliwości wyizolowania biomolekuł, takich jak białka, DNA, RNA z łez myszy, podobnie jak to zrobiono u ludzi. Pozwoliłoby nam to na opracowanie prostej i efektywnej metodologii do wykorzystania w naukowych badaniach podstawowych. U ludzi zastosowano różnorodny zakres technologii w celu rozwikłania składu molekularnego łez, takich jak testy immunologiczne, takie jak analiza Western blot, a także spektrometria mas.

Analizy te utorowały drogę do opracowania bioczujników zdolnych do identyfikacji konkretnych cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania. Opracowaliśmy optymalną metodologię pozyskiwania znacznej objętości łez od myszy, ułatwiając ich analizę molekularną w laboratoriach nauk podstawowych. Protokół ten ułatwia identyfikację różnych białek i informacyjnego RNA będących przedmiotem zainteresowania.

Badania nad biomarkerami obecnymi w płynnej biopsji oka są dostępne w miejscu publicznym, podobnie jak obecnie. Niezależnie od tego, czy chodzi o choroby oczu, takie jak retinopatia cukrzycowa, czy choroby ogólnoustrojowe, takie jak choroba Alzheimera lub Parkinsona, minimalnie inwazyjna próbka, film łzowy, stwarza możliwość postawienia diagnozy. Jak doniesiono u ludzi, odpowiedzieliśmy na kolejne pytanie dotyczące naszego modelu lustrzanego.

Łzy odzwierciedlają zmiany molekularne, które pojawiają się w tych chorobach, te łzy zawierają biomolekuły, które można znaleźć w innych płynnych biopsjach, takich jak krew lub ślina. Na początek przygotuj podstawowy roztwór pilokarpiny przy użyciu sterylnej wody. Następnie przytnij paski testowe Schirmera do długości pięciu milimetrów.

Następnie przygotuj 250 mikrolitrów sterylnej wody z inhibitorem proteazy. Zważ każdą mysz indywidualnie, aby obliczyć odpowiednią dawkę zabiegów. Aby stymulować produkcję łez za pomocą sześciomilimetrowej strzykawki insulinowej, należy podać dootrzewnowo 30 miligramów na kilogram pilokarpiny.

W celu zebrania łez umieść koniec każdego fragmentu paska Schirmera na środku dolnej powieki za pomocą pęsety. Trzymaj go na miejscu, aż poziom osiągnie limit paska, a następnie wymień pasek. Następnie umieść fragmenty paska Schirmera w sterylnych probówkach na lodzie, aby uniknąć degradacji składników.

Zacznij od użycia fragmentów paska Schirmera, aby zebrać łzę. Umieść te paski w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 600 mikrolitrów zawierającej 20 mikrolitrów sterylnej wody z inhibitorem proteazy i odwiruj przy 600 G przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą 7,5-centymetrowej igły wtryskiwacza ze stali nierdzewnej przebij końcówkę rurki o pojemności 600 mikrolitrów zawierającej próbkę.

Przenieś tę przebitą probówkę do nowej wysterylizowanej probówki o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj próbki w temperaturze 12 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby odzyskać objętość rozcieńczonych łez. Połączyć supernatant odzyskany ze wszystkich próbek, aby utworzyć pulę białkową o objętości około 200 mikrolitrów. Podgrzewaj próbki białek w temperaturze 99 stopni Celsjusza przez cztery minuty, aby zdenaturować białka.

Krótko zmieszać próbki, aby wymieszać składniki. Następnie załaduj 30 mikrogramów ilościowej zawartości białka z każdej próbki do żelu stronicowego 10% SDS i uruchom próbki pod napięciem 90 woltów przez dwie godziny przy użyciu standardowej metody. Po elektroforezie przykryj żel roztworem barwiącym i inkubuj przez 30 minut, aby wybarwić białka.

Następnie kilkakrotnie spłucz żel roztworem odbarwiającym, aż tło stanie się czyste i widoczne będą pasma białkowe. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu dokumentacji żelu. Analiza strony SDS Kumas Eat Total Protein Extract ujawniła wzorce ekspresji białek w całkowitej siatkówce i łzach.

Po zebraniu łez myszy za pomocą fragmentów pasków Schirmera, umieść paski w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 600 mikrolitrów zawierającej 20 mikrolitrów sterylnej wody. Nakłuć końcówkę probówki zawierającej próbkę i przenieść ją do nowej wysterylizowanej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Odwirować probówkę o stężeniu 2 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyciągnij próbki, aby uzyskać całkowitą objętość około 22 mikrolitrów supernatantu na mysz. Umieść probówki na suchym lodzie, aby zapobiec degradacji biomolekuł. Następnie dodaj 200 mikrolitrów jednofazowego roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny.

Homogenizować przez pipetowanie i odstawić mieszaninę na pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 40 mikrolitrów chloroformu. Wirować przez 15 sekund i inkubować mieszaninę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie odwirować w temperaturze 10 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra, nie naruszając interfazy. Następnie dodaj 0,5 mikrolitra glikogenu do 100 mikrolitrów izopropanolu i wymieszaj pipetując.

Pozostaw mieszaninę na 10 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie odwirować w temperaturze 10 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Szybko zdekantować supernatant.

Dodaj 200 mikrolitrów zimnego 75% etanolu i przekręć rurkę, aby ponownie zawiesić osad RNA. Wirować w temperaturze 8 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu etanolu i wysuszeniu probówki przez 20 do 30 minut, dodaj 20 mikrolitrów wody wolnej od RNaz i ponownie zawieś granulkę.

Następnie zmierz gęstość optyczną w spektrofotometrze mikroobjętościowym przy 260 i 280 nanometrach, aby ocenić czystość RNA. Aby zsyntetyzować CDNA z TRNA, dodaj od 10 do 5 000 nanogramów RNA. Wymieszaj go z jednym mikrolitrem oligo DT i do 12 mikrolitrów wody wolnej od RNazy.

Wirować w temperaturze 500 G przez 30 sekund i inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj do mieszaniny cztery mikrolitry buforu reakcyjnego, jeden mikrolitr inhibitora RNazy, dwa mikrolitry mieszanki DNTP i jeden mikrolitr odwrotnej transkryptazy. Po odwirowaniu rurki inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 60 minut.

Następnie inkubować w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby zakończyć reakcję. Użyj pokazanego tutaj programu i starterów dla cyklu QPCR. Wykonaj analizę krzywej topnienia, aby sprawdzić obecność dimerów starterów lub niespecyficznych amplikonów w reakcji.

QPCR ujawnił wartości CT między 20 a 24, co stanowi odpowiedni zakres dla początkowej ilości docelowego mRNA w próbce. Jednak analiza krzywej topnienia sugerowała niską obecność docelowego mRNA. Żel 2% agarozowy potwierdził obecność amplikonów w oczekiwanej wielkości.