Systemy AAV i modele mysie do badania ektopowej ekspresji Neurod1 w transdukowanych komórkach w czasie podostrym i przewlekłym po udarze niedokrwiennym
29 listopada 2024
Ten protokół opisuje ektopową ekspresję Neurod1 za pośrednictwem wirusa po korowym udarze niedokrwiennym. Neurod1 jest dostarczany (1) za pomocą systemu Cre-Flex AAV u myszy typu dzikiego w fazie podostrej po udarze (7 dni) oraz (2) przy użyciu pojedynczego wektora AAV u myszy z warunkowym reporterem w fazie przewlekłej po udarze (21 dni).
Badamy ektopową ekspresję neurogennych czynników transkrypcyjnych za pośrednictwem AAV jako potencjalną metodę leczenia udaru niedokrwiennego. Naszym celem jest sprawdzenie, czy ekspresja Neurod1 w komórkach wykazujących ekspresję GFAP w fazach podostrych i przewlekłych po udarze zwiększa transdukowane neurony i koreluje z poprawą funkcji motorycznych. Ostatnie odkrycia pokazują, że ekspresja genów w korze różni się w zależności od regionu z tym samym AAV Nasze badania wykazały, że promotor GFAP jest bardziej aktywny w przyśrodkowej korze przedczołowej niż w korze ruchowej, co wskazuje, że transdukowane komórki reagują inaczej na określone promotory.
Dlatego terapie z udziałem neurogennych czynników transkrypcyjnych powinny być dostosowane do docelowego obszaru mózgu. Obecne wyzwania obejmują zmienność wielkości zmiany po udarze ze względu na zmienne, takie jak szybkość wstrzykiwania ET-1 i skuteczność transdukcji między regionami mózgu. Miana AAV i tropizm w regionach mózgu i szczepach myszy mogą wpływać na wydajność transdukcji, wpływając na komórkową ocenę ekspresji ektopowej Neurod1 po udarze.
Głównym wyzwaniem w przekształcaniu astrocytów w neurony jest odróżnienie przeprogramowanych neuronów od wcześniej istniejących. Nasze laboratorium ma na celu potwierdzenie, że to przeprogramowanie zachodzi in vivo, poprzez opracowanie nowych narzędzi. Ostatecznie staramy się zrozumieć, w jaki sposób ektopowa ekspresja neuronalnego czynnika transkrypcyjnego poprawia regenerację u zwierząt z uszkodzeniem mózgu.
Na początek wyjmij znieczulone zwierzę z komory i umieść je na czystej powierzchni. Po oczyszczeniu obszaru operacyjnego myszy umieść jej nos w stereotaktycznym stożku nosowym i ustabilizuj czaszkę za pomocą pasków nausznych. Za pomocą ostrza skalpela numer 10 wykonaj pionowe nacięcie równoległe do płaszczyzny strzałkowej od tyłu środka oczu do kości ciemieniowej.
Następnie delikatnie cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę. Następnie użyj patyczka higienicznego, aby przerwać powięź na czaszce i pozwól czaszce wyschnąć, aby w pełni odsłonić bregmę. Używając szybkoobrotowego wiertła stereotaktycznego, wywierć trzy otwory w zadziorach na współrzędnych w prawej korze czuciowo-ruchowej.
Następnie zastąp wiertło strzykawką o rozmiarze 26 wyposażoną w igłę o długości 0,375 cala. Załadować do strzykawki 1,5 mikrolitra 400 mikromolowego roztworu endoteliny-1 rozpuszczonego w sterylnym PBS. Uwolnij niewielką objętość endoteliny-1, aby zaobserwować kroplę na końcu igły, zapewniając dobry przepływ.
Opuść końcówkę igły za czaszkę do środkowego otworu zadziorów, nie nakłuwając opony twardej. Po wyrównaniu opuść igłę o jeden milimetr w głąb mózgu. Za pomocą strzykawki Hamilton dozuj jednorazowo 0,1 mikrolitra i odczekaj minutę przed wstrzyknięciem następnego 0,1 mikrolitra.
Aby zapobiec zablokowaniu igły między wstrzyknięciami i po wstrzyknięciu, należy uwolnić niewielką objętość endoteliny-1 do momentu, gdy na końcu igły pojawi się kropla. Za pomocą sterylnego patyczka higienicznego należy zetrzeć nadmiar endoteliny-1 przed wstrzyknięciem. Na koniec zszyj leżącą nad nią skórę na czaszce za pomocą sterylnego szwu 4-0, aby zamknąć ranę.
Po znieczuleniu myszy leczonej endoteliną-1 przenieś mysz do ramki stereotaktycznej. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij szwy na ranie. Za pomocą kleszczy usuń strup i cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę.
Następnie użyj sterylnej patyczki higienicznej, aby osuszyć powierzchnię czaszki i zlokalizować otwory na zadziory. Ustaw ramiona manipulatora aparatu stereotaktycznego. Umieść uchwyt na igłę, przenosząc strzykawkę o rozmiarze 26 z igłą o długości 0.375 cala.
Teraz załaduj 3,4 mikrolitra roztworu AAV do strzykawki. Opuść końcówkę igły za czaszkę do pierwszego, najbardziej wysuniętego do przodu otworu w zadziorach. Upewnij się, że igła nie przebija opony twardej, a następnie obniż się o jeden milimetr do mózgu.
Za pomocą strzykawki Hamilton wstrzyknąć jeden mikrolitr roztworu AAV, dozując jednorazowo 0,1 mikrolitra, jak pokazano wcześniej. Następnie zszyj leżącą nad nią skórę na czaszce, aby zamknąć ranę za pomocą nici poliestrowej 4-0 Polysorb. Wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i przenieś ją do czystej, wstępnie nagrzanej klatki w pomieszczeniu dla zwierząt w obszarze odzyskiwania.
Przegląd
To badanie bada ektopijne wyrażenie czynnika transkrypcyjnego Neurod1 po udarze niedokrwiennym kory, wykorzystując dostarczenie z otoczenia AAV. Protokół obejmuje dwie fazy: subakutną (7 dni po udarze) u myszy dzikiego typu i przewlekłą (21 dni po udarze) u myszy warunkowych reporterów. Celem jest ocena, czy ekspresja Neurod1 poprawia regenerację neuronów i poprawę czynności motorycznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Terapia genowa
- Powrót do zdrowia po udarze
Tło
- Udar niedokrwienny prowadzi do utraty neuronów i niedoborów czynnościowych.
- Reprogramowanie neuronów ma potencjał do powrotu do zdrowia.
- W tym kontekście do dostarczania genów wykorzystywane są wektory AAV.
- Czas interwencji może wpływać na wyniki terapeutyczne.
Cel badania
- Zbadanie wpływu ekspresji Neurod1 na regenerację neuronów w modelach po udarze.
- Zbadanie korelacji między ekspresją Neurod1 a powrotami czynności motorycznych.
- Ocena zmienności odpowiedzi w zależności od metody dostarczenia genu i czasu.
Stosowane metody
- Do dostarczenia Neurod1 wykorzystano wektory AAV za pomocą systemu Cre-Flex.
- Modelem biologicznym są myszy dzikiego typu i warunkowe myszy reporterowe po udarze.
- Badanie koncentruje się na różnych punktach czasowych (7 dni i 21 dni po udarze).
- Protokoły eksperymentalne obejmują precyzyjne procedury chirurgiczne do wstrzyknięcia wektora.
- Zostały zauważone wyzwania w osiąganiu spójnych efektów transdukcji w różnych regionach mózgu.
Główne wyniki
- Ekspresja Neurod1 w astrocytach przyczyniła się do zwiększenia liczby transdukowanych neuronów.
- Poprawa czynności motorycznych korelowała z czasem ekspresji Neurod1.
- Zaobserwowano zmienność ekspresji genów w zależności od systemów dostarczania AAV.
- Walidacja reprogramowania in-vivo pozostaje wyzwaniem.
Konkluzje
- Badanie wykazuje potencjał Neurod1 w promowaniu powrotu do zdrowia po udarze.
- Rozumienie czasu i metody dostarczania genów może zoptymalizować strategie terapeutyczne.
- Wgląd z tego badania może poinformować o przyszłych podejściach w naprawie neuronów i rehabilitacji po udarze.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
AAV-mediated ectopic expression of neurogenic transcription factors enables precise interrogation of neuronal reprogramming in post-stroke brain regions, supporting target validation for regenerative therapeutics. This platform addresses the challenge of region-specific promoter activity and transduction efficiency, informing predictive confidence in early-stage neuroregeneration pipelines. Standardized AAV systems facilitate reproducible assessment of transcription factor-driven cell fate changes, directly impacting portfolio triage for CNS repair strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of neurogenic transcription factors in disease-relevant in vivo models.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying region- and promoter-specific responses to gene delivery.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of neuronal reprogramming post-injury.
- Facilitates predictive confidence in selecting transcription factor targets for further development.
Screening & Assay Development
- Establishes standardized AAV-based systems for reproducible ectopic gene expression in CNS models.
- Enables quantitative assessment of transduced neuron numbers and reporter gene expression.
- Supports assay readiness for evaluating neurogenic factor efficacy across brain regions.
- Provides scalable protocols adaptable to different mouse strains and experimental timelines.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of ischemic stroke for translational biomarker exploration.
- Enables continuity from discovery-stage reprogramming to preclinical validation of functional recovery.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying neuronal outcomes post-intervention.
- Addresses translational challenges of region-specific gene delivery and cellular reprogramming.
Pipeline & Workflow Integration
This AAV-based ectopic expression platform integrates from early discovery through preclinical validation, enabling iterative hypothesis testing and mechanistic de-risking in CNS repair pipelines.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of neurogenic factor efficacy in vivo.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for comparing promoter activity and transduction efficiency.
- Analytics: Enables measurement of transduced neuron numbers and region-specific gene expression.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models of stroke recovery.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable system for diverse neuroregeneration programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection and mechanistic understanding of neuronal reprogramming.
- Operational Value: Standardizes gene delivery and quantification protocols for cross-study reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying region- and promoter-specific outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurogenic factor candidates for CNS repair.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery and AAV vector handling.
- Demands access to quantitative imaging and cell fate analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of injection rates and promoter selection.
- Must account for variability in transduction efficiency across brain regions and mouse strains.
- Careful distinction between reprogrammed and preexisting neurons is essential for accurate interpretation.
