Name: Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Poznaj metodę retrowirusowego celowania genów CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania komórek Th17 in vitro. Protokół umożliwia precyzyjną edycję genów w pierwotnych limfocytach T myszy transgenicznych Cas9.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dou Liu, Dongliang Xu i Pinpin Hou z głównego ośrodka Instytutu Terapii Immunologicznej w Szanghaju za ich wsparcie w korzystaniu z tych instrumentów. Praca ta była wspierana przez National Natural Science Foundation of China Grants 31930038, U21A20199, 32100718 i 32350007 (dla Linrong Lu); 32100718 (do Xuexiao Jin); Innowacyjny zespół badawczy renomowanych lokalnych uniwersytetów w Szanghaju SHSMU-ZLCX 20211600 (do Linrong Lu); Wewnętrzny program inkubacyjny RJTJ24-QN-076 (do Zejin Cui). <silna klasa="xfig">Rysunek 2 został przygotowany za pomocą Figdraw.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych, Szpital Renji, Szkoła Medyczna Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju i są zgodne z wytycznymi instytucji.
1. Produkcja retrowirusowa
<ol>
	<li> Przygotowanie konstruktu retrowirusowego
	<ol>
		<li>Użyj narzędzia CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public), aby zaprojektować sgRNA dla RORγt knockout8. Określ genom referencyjny jako mysi GRCm38 i wybierz sekwencję PAM jako NGG (dla SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) w oparciu o system prowadzący CRISPRko. Zweryfikuj nazwę genu docelowego lub inne formaty genów docelowych i prześlij prawidłowe dane wejściowe, aby uzyskać kandydatów na sgRNA. Ustawiając inne parametry na wartości domyślne, ustaw cel sgRNA na RORγt (Rorc, Gene ID: 19885), aby zakłócić różnicowanie Th17 i wybierz niecelujące sgRNA (skrót sgNT, sekwencja: GCGAGGTATTCGGCTCCGCGG) z mysich bibliotek GeCKO v2. 
		UWAGA: To narzędzie oferuje szereg klikalnych opcji projektowania przewodnikowych RNA, co pozwala na wygodne dostosowanie do określonych wymagań.
		<ol>
			<li>Wprowadź nazwę genu docelowego w polu wyszukiwania w kolumnie Szybkie wyszukiwanie genów. System wyświetli identyfikator genu i pełną nazwę genu docelowego, aby zapewnić dokładną selekcję. 
			UWAGA: Dostępne są dodatkowe opcje walidacji różnych docelowych formatów genów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wybierz jeden sgRNA ukierunkowany na sekwencję Rorc (skrót sgRorc) zgodnie z wysoką połączoną rangą i kolejnością wyboru, aby uniknąć niedocelowych dopasowań i zwiększyć skuteczność na celu (sekwencja sgRorc: GTCATCTGGGATCCACTACG). Zsyntetyzować dwa oligonukleotydy dla sgRorc i sgNT: dla oligo czołowego dołączyć sekwencję "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" na końcu 5' każdej sekwencji prowadzącej; W przypadku odwróconego oligo, należy dołączyć sekwencję "tttcgtcctttccacaagatatataaagc" na końcu 3' każdej sekwencji prowadzącej. 
		UWAGA: Zazwyczaj istnieje wiele opcji dla sekwencji sgRNA. Konieczne jest wybranie 2 lub 3 sekwencji sgRNA ukierunkowanych na ten sam genotyp, aby ocenić ich skuteczność nokautu. W naszych wstępnych eksperymentach do porównania wybrano dwa gRNA ukierunkowane na Rorc (sekwencja sgRNA1: GTCATCTGGGATCCACTACG; sekwencja sgRNA2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Wyniki eksperymentalne wskazują, że gRNA przedstawione w obecnej metodzie (sekwencja sgRNA1) wykazuje wyższą skuteczność nokautowania między tymi dwoma.</li>
		<li>Amplifikuj sekwencje kodujące sgRorc i sgNT za pomocą polimerazy DNA w PCR z powyższymi starterami i sklonuj je do wektora pMX-U6-MCS (między regionami promotora U6 a rusztowaniem gRNA) w ramce z białkiem fluorescencyjnym mCherry, odpowiednio9. Ustawić układ reakcyjny (50 μl) zgodnie z tabelą 1. Te startery składają się z sekwencji sgRNA (3'), która może wprowadzić sgRNA do wektora, oraz segmentu sekwencji wektorowej (5'), która może wzmocnić fragment wektora o pełnej długości. Dodatkowo zaprojektuj startery do przodu i do tyłu z zakładką około 18 pz w regionie sgRNA (ale nie w pełni zachodzącą na siebie), ułatwiając montaż zlinearyzowanego wektora klonowania podczas procesu ligacji. 
		UWAGA: Należy uzyskać zlinearyzowany fragment wektora w miejscu sekwencji sgRNA ze starterami metodą PCR o wielkości około 5,551 kd.</li>
		<li>Oczyść konstrukt za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i okrąż go za pomocą zestawu do klonowania. Użyj produktów rekombinacji do testów transformacji.</li>
		<li>Wybierz pojedyncze klony z płytek i zweryfikuj sekwencje kodujące sgRorc lub sgNT za pomocą sekwencjonowania pierwszej generacji, przy użyciu startera promotora U6 (sekwencja: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).</li>
		<li>Wybierz żądany pojedynczy klon do amplifikacji w bulionie LB. Ekstrakcja wysokiej jakości plazmidowego DNA z komórek bakteryjnych za pomocą zestawu plazmidów wolnych od endotoksyn. 
		UWAGA: Upewnij się, że roztwór plazmidu ma wysoką jakość. Zalecamy, aby stężenie roztworu plazmidu wynosiło co najmniej 1 μg/μL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek pakujących
	<ol>
		<li>Przygotować komórki Platinum-E (Plat-E) zgodnie z następującą procedurą: hodowla komórek Plat-E za pomocą zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (pożywka DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny w 10-centymetrowym naczyniu hodowlanym. W poniższym będzie on określany jako pożywka do hodowli komórkowych.br /
		UWAGA: Aby uzyskać odpowiednią wydajność transfekcji, zalecamy użycie komórek w logarytmicznej fazie wzrostu o liczbie pasażowej mniejszej niż 15</li>.
		<li>Podziel pełną płytkę 10 cm komórek Plat-E (~2,6 × 107 komórek) w odpowiednim stosunku do nowej 10 cm szalki 1 dzień przed transfekcją, aby osiągnąć zlewność komórek około 80% następnego dnia, co jest optymalnym warunkiem do transfekcji. Przeprowadzić pasażowanie komórek dla nowej 10 cm szalki w stosunku 1:3 (nasiona ~ 8 ×10 6 komórek w nowym 10 cm naczyniu dzień przed transfekcją). 
		UWAGA: Współczynnik podziału zależy od warunków wzrostu komórek, przy czym wyższą wydajność transfekcji można osiągnąć w komórkach wykazujących silny wzrost. Wykonujemy pasażowanie komórek dla 10 cm naczynia w proporcji 1:3. W przypadku różnych naczyń do hodowli komórkowych, takich jak szalka o średnicy 6 cm, zalecamy wysianie 1,5 × 106 komórek Plat-E dzień przed transfekcją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja
	<ol>
		<li>Na godzinę przed transfekcją należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowych 8 ml zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej 5% FBS, ale bez penicyliny-streptomycyny, ponieważ może to zakłócać działanie odczynnika do transfekcji. Przed użyciem podgrzać zredukowaną pożywkę serum do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę transfekcyjną zawierającą mieszaninę 1 i mieszaninę 2: mieszanina 1 zawiera 18 μg plazmidowego DNA (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) i 6 μg ekotropowego wektora retrowirusowego pCL (pCL-Eco) w 1 000 μl zredukowanej pożywki surowicy. Mieszanina 2 zawiera 48 μl odczynnika do transfekcji w 1 000 μl zredukowanej pożywki surowicy. Dodaj mix 2 kropla po kropli do mieszanki 1 i delikatnie i dokładnie wymieszaj. Inkubować kompleks przez 15-20 minut w temperaturze 20-25 °C.</li>
		<li>Ostrożnie wlej mieszaninę do komórek Plat-E, delikatnie obracając płytkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w temperaturze poniżej 5% CO2 przez 6–12 godzin.</li>
		<li>Zastąp pożywkę 10 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych i kontynuuj inkubację komórek w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
		<li>Oceń skuteczność transfekcji w komórkach Plat-E, wykrywając znacznik wektora retrowirusowego, służący jako proxy, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Silny sygnał fluorescencji mCherry (fluorescencja dodatnia przekracza 80%) wykryto w znacznej części komórek Plat-E transfekowanych wektorem pMX-U6-MCS, co wskazuje na udaną transfekcję.</li>
		<li>Zebrać supernatant kultury zawierający wirusa i odwirować w stężeniu 1 500 × g przez 10 minut w celu usunięcia fragmentów komórek. Podwielokrotnić supernatant wirusa 1 ml na fiolkę i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Filtracja jest alternatywną metodą usuwania resztek komórek. Zalecamy stosowanie filtra strzykawkowego o wielkości porów 0,45 μm i membranie polieterosulfonowej (PES), aby zminimalizować zatrzymywanie cząstek wirusa na membranie filtracyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zakażenie retrowirusowe aktywowanych limfocytów T CD4 + i różnicowanie Th17
<ol>
	<li>Przygotowanie i aktywacja pierwotnych naiwnych limfocytów T CD4 +
	<ol>
		<li>Pokryj każdą studzienkę 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej 2 μg/ml anty-CD3e i 4 μg/ml anty-CD28 w sterylnych 500 μl PBS, owiń płytkę parafilmem, aby zapobiec parowaniu i zanieczyszczeniu, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 4 °C przez noc (lub 37 °C przez 1-2 godziny przed posiewem limfocytów T CD4+) w dniu poprzedzającym wyizolowanie naiwnych limfocytów T CD4+. 
UWAGA: Ten krok jest potrzebny do przeprowadzenia stymulacji płytki dla mysich limfocytów T przed wykonaniem transdukcji wirusa.</li>
		<li>Następnego dnia poddać eutanazji 6-8-tygodniowe myszy z ekspresją Cas9 (myszy R26-CAG-Cas9) przez uduszenie CO2 i wysterylizować je 70% etanolem.</li>
		<li>Zbierz śledzionę myszy i umieść ją w PBS z 2% FBS i 100 μM EDTA (bufor FACS).</li>
		<li>Zmielić śledzionę ze sterylizowanym mielonym szkłem (matowa strona) w buforze FACS, homogenizować tkankę do zawiesiny jednokomórkowej i przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe 70 μm do probówki o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Pamiętaj, aby delikatnie i konsekwentnie zmielić chusteczkę, aby była wilgotna. Gwałtowne mielenie tkanki może dramatycznie wpłynąć na przeżycie komórek.</li>
		<li>Obracać zawiesinę komórek śledziony o masie 800 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 2 ml buforu do lizy krwinek czerwonych. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut, a następnie dodaj bufor FACS, aby osiągnąć całkowitą objętość 15 ml. Odwirować splenocyty w stężeniu 800 × g przez 5 minut.</li>
		<li>Ponownie zawiesić splenocyty i przefiltrować je przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm. Dostosuj końcową objętość do 1 ml w celu izolacji limfocytów T CD4 +.</li>
		<li>Wyizoluj limfocyty T CD4 + za pomocą dostępnych w handlu zestawów odczynników, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji.</li>
		<li>Oznaczyć limfocyty T CD4 + mieszaniną przeciwciał fluorescencyjnych (CD4, CD25, CD44 i CD62L) w temperaturze 4 °C przez 30 minut, przemyć komórki buforem FACS i wyizolować naiwne limfocyty T CD4 + za pomocą sortera komórek przepływowych. Spowoduje to uzyskanie limfocytów T CD4 + CD25-CD62Lo wysokiej zawartościCD44i niskiej naiwności.</li>
		<li>Usunąć supernatant stymulacyjny związany z płytką z 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (przygotowanej w kroku 2.1.1) i przepłukać każdą studzienkę dwukrotnie 500 μl PBS. Płytka 1 x 106 naiwnych limfocytów T CD4 + w 1 ml pożywki do hodowli limfocytów w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli komórek. Inkubować komórki w inkubatorze komórkowym. 
		UWAGA: Pożywka do hodowli limfocytów zawiera 10% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM HEPES i 50 μM β-ME w pożywce RPMI 1640.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażenie retrowirusowe
	<ol>
		<li>Po 18-24 godzinach zbierz każdą studzienkę aktywowanych komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Odwirować przy sile 800 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml mieszaniny infekcyjnej (10 μg/ml bromku heksadimetryny, 10 mM HEPES w supernatance wirusa) i dodać 1 ml mieszaniny do nowego dołka na 48-dołkowej płytce do hodowli komórkowej. W międzyczasie zachowaj wystarczającą liczbę komórek jako negatywną (nietransdukowaną) kontrolę. 
		UWAGA: Możliwe jest posiadanie mniej niż 1 x 106 aktywowanych naiwnych limfocytów T CD4 + na studzienkę, ale nie zaleca się używania mniej niż 0,5 x 106 komórek na studzienkę. Ponadto żadne komórki nie powinny być wysiewane w dołkach obwodowych 48-dołkowej płytki hodowlanej.</li>
		<li>Owinąć płytkę parafilmem i odwirować przy 800 x g przez 90 minut w temperaturze 32 °C. Ustawić przyspieszanie i zwalnianie na poziomie 3. Po odwirowaniu usunąć parafilm, inkubować komórki w inkubatorze przez 4 godziny i kontynuować etapy różnicowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie zakażonych komórek w komórki Th17
	<ol>
		<li>Przygotuj komórki prezentujące antygen (APC) podczas infekcji retrowirusowej. Najpierw uzyskaj splenocyty od myszy typu dzikiego, postępując zgodnie z instrukcjami z kroków 2.1.2 do 2.1.4. Zawiesić splenocyty za pomocą 1 ml pożywki do hodowli limfocytów z 50 μg/ml mitomycyny w probówce o pojemności 15 ml. Inkubować splenocyty w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
		<li>Godzinę później dodać PBS do oznaczenia 15 ml, aby umyć splenocyty, odwirować przy 800 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić splenocyty z 1 ml pożywki do hodowli limfocytów i policzyć liczbę komórek. Ogniwa APC zostały przygotowane z sukcesem.</li>
		<li>Po 4 godzinach inkubacji komórek (jak w kroku 2.2.3) zebrać transdukowane limfocyty T CD4+ w probówkach o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 800 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić zakażone komórki w 600 μl PBS w celu przemycia. Wirować przy 800 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Umieścić 0,5 × 106 transdukowanych limfocytów T CD4 + w 1 ml pożywki do hodowli limfocytów z 1,5 x 106 komórkami APC w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli komórek. Suplement z 2 μg/ml anty-CD3e, 2 μg/ml anty-CD28 i koktajlem różnicowania komórek Th17, który zawiera 10 μg/ml anty-IFNγ, 10 μg/ml anty-IL-12/IL23 p40, 10 μg/ml anty-IL4, 2,5-3 ng/ml hTGF-β i 20-30 ng/ml IL-6. Hoduj komórki przez 2 dni.</li>
		<li>Zebrać każdą studzienkę komórek do probówek o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 800 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Odświeżyć nowy 1 ml pożywki do hodowli limfocytów tylko za pomocą 3 ng/ml TGF-β i 30 ng/ml IL-6. Umieść komórki w nowym dołku z 24-dołkową płytką do hodowli komórkowej na przedłużony okres hodowli. Przeanalizuj komórki 2 dni po zmianie pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ocena efektywności transdukcji i wyników różnicowania
<ol>
	<li>Po dwóch dniach zmiany pożywki zebrać komórki i odwirować przy 800 × g przez 5 minut, a następnie odrzucić supernatant. Traktować zróżnicowane komórki 50 ng/ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA), 500 ng/ml jonomycyny i 5 μg/ml brefeldyny A w 500 μl pożywki do hodowli limfocytów w nowym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 4 godziny. Pobrać połowę komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej i poddać drugiej połowie komórek lizie bufor do ekstrakcji RNA do analizy qPCR.</li>
	<li>Do analizy metodą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Zbierz komórki do probówek o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 ml buforu FACS do probówek i odwirować w stężeniu 800 × g przez 5 minut w celu przemycia komórek.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy mieszaniną przeciwciał fluorescencyjnych (CD4 i barwnik do utrwalania żywotności w 100 μl PBS) i barwić komórki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Przemyć komórki 300 μl PBS i utrwalić je 300 μl 2% formaldehydu buforowanego fosforanem (FA) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 60 minut.</li>
		<li>Godzinę później przemyć komórki PBS, ponownie zawiesić je 600 μl 1x buforu permeabilizacyjnego i odwirować przy 800 × g przez 5 minut.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant i zabarwić anty-IL-17A w 100 μl 1x buforu permeabilizacji przez 60 minut w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia przemyj komórki 1x buforem permeabilizacji i ponownie zawieś je w 200 μl PBS. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej10. Zapoznaj się z sekcją Reprezentatywne wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku analizy qPCR należy wyekstrahować RNA zgodnie z instrukcjami zestawu do ekstrakcji RNA. Odwrotna transkrypcja RNA do cDNA w celu przechowywania lub późniejszej analizy qPCR. Projekt tych starterów powinien być zgodny z ogólnymi zasadami projektowania starterów qPCR, a jednocześnie być ukierunkowany na region obejmujący oczekiwane miejsce indel, w którym nastąpiło rozszczepienie za pośrednictwem gRNA. Jakiekolwiek zmniejszenie wydajności wzmocnienia lub utrata sygnału w tym miejscu może służyć jako wskaźnik udanego nokautu. Startery qPCR są następujące: 
	Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT. 
	IL17a F: TCAGCGTGTCCAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.</li>
</ol>

Retroviral Transduction of Guide RNA for Gene Editing in Th17 Differentiation

<ol><li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th+17+cells+in+development%3A%3A+An+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Patel, D. D., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cell+pathway+in+human+immunity%3A+Lessons+from+genetics+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions.</a> Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+Th17+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgrna+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+t-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of t-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SAMHD1+restriction+by+flow+cytometry+in+human+myeloid+U937+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells.</a> J Vis Exp. (172), (2021).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+A+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+cas9+rna-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+helper+T+cells+as+a+genetic+approach+to+study+mechanisms+controlling+their+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function.</a> J Vis Exp. (117), e54698(2016).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+Rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+Size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters.</a> BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J Vis Exp. (44), 2307(2010).</li>
</ol>

Autorzy stwierdzają, że nie ma konfliktu interesów.

Edycja genomu CRISPR/Cas9 poprzez dostarczanie retrowirusowe jest solidną metodą badania ról pomocniczych limfocytów T. Protokół ten oferuje szybkie i skuteczne podejście do badania określonych genów zaangażowanych w różnicowanie i funkcję Th17. Aby osiągnąć optymalne wyniki, należy dokładnie wykonać kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, w celu zwiększenia skuteczności nokautu genów, gRNA powinny być starannie wyselekcjonowane. Biorąc pod uwagę ryzyko efektów off-target w edycji genów CRISPR/Cas9, rozsądne jest wybranie 2-3 gRNA z wysokimi wynikami, jak określono w sekcji 1.1.1 protokołu, do dalszych eksperymentów11,12. Po drugie, wysokie miano wirusa jest niezbędne do udanej infekcji. Właściwa konserwacja linii komórek pakujących Plat-E ma kluczowe znaczenie. Komórki powinny osiągnąć około 80% konfluencji w dniu transfekcji, ponieważ zarówno nieodpowiednia, jak i nadmierna liczba komórek może pogorszyć miano wirusa. Jeśli komórki Plat-E są niedostępne, kotransfekcja ludzkich embrionalnych komórek 293T nerki z wektorem pCL-Eco może również wytwarzać wysokie miana wirusa13,14. Utrzymanie wysokiego stężenia plazmidu wynoszącego co najmniej 1 μg/μl jest ważne dla osiągnięcia wysokiego miana wirusa. Konieczne jest zebranie zawiesiny wirusa, zanim zmieni kolor na cytrynowożółty, ponieważ wirus wykazuje wrażliwość na zmiany pH. Dlatego pH pożywki hodowlanej powinno być dokładnie regulowane w odpowiednim zakresie. Wirus powinien być przechowywany w temperaturze -80 ºC w celu zachowania jego integralności i chroniony przed powtarzającymi się cyklami zamrażania i rozmrażania15.
Po trzecie, aby osiągnąć wysoką skuteczność infekcji, komórki pierwotne muszą być odpowiednio aktywowane. Niewystarczająca aktywacja komórkowa znacząco pogarsza skuteczność infekcji wirusowych16. Przed infekcją wirusową stan aktywacji limfocytów T należy potwierdzić pod mikroskopem, ponieważ aktywowane komórki wykazują znacznie większy rozmiar niż komórki inaktywowane. Warto zauważyć, że nasz protokół różnicowania Th17 został specjalnie zoptymalizowany dla myszy C57BL/6, więc może być konieczne dostosowanie dla innych szczepów myszy. Po czwarte, aby osiągnąć pożądane wyniki różnicowania Th17, kluczowe jest utrzymanie optymalnych warunków komórkowych. Podczas infekcji wirowej ważne jest, aby umieścić komórki w studzienkach w pobliżu środka, aby pomóc w utrzymaniu żywotności komórek. Po zakażeniu wirowym inkubacja komórek przez 4 godziny (krok protokołu 2.2.4) ma kluczowe znaczenie dla ich regeneracji. Ponadto podczas przenoszenia komórek ważne jest delikatne pipetowanie dla utrzymania ich żywotności. Różne warunki stymulacji mogą wpływać na różnicowanie Th17. W tym eksperymencie włączenie komórek prezentujących antygen do systemu różnicowania znacznie zwiększyło efektywność różnicowania w porównaniu ze stymulacją płytkową anty-CD3e i anty-CD28. Wreszcie, ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie użyte cytokiny pozostają funkcjonalne podczas transportu i przechowywania. Cytokiny mogą szybko stracić stabilność w powtarzających się cyklach zamrażania i rozmrażania lub niewłaściwych roztworach do rozpuszczania. Leczenie zimnem i równe podwielokrotności są konieczne, aby cytokiny zachowały funkcje podczas wszystkich procedur.
Ten protokół generowania specyficznych komórek Th17 z nokautem genu ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, trudno jest osiągnąć pełną wydajność transdukcji w pierwotnych mysich limfocytach T. Niektóre komórki mogą nie ulec zamierzonemu nokautowi genu podczas różnicowania Th17. Po drugie, pierwotne limfocyty T mają ograniczoną długość życia in vitro. Po około tygodniu komórki te mają tendencję do obumierania, co stanowi wyzwanie dla kolejnych eksperymentów. Po trzecie, nasz protokół opiera się na transgenicznych myszach Cas9, a kiedy próbowaliśmy włączyć sekwencję Cas9 do plazmidu rdzeniowego, spowodowało to znaczne zmniejszenie miana wirusa. Wreszcie, zauważamy, że protokół ten nie jest odpowiedni do analizy funkcji genów zaangażowanych we wczesnych stadiach naiwnej aktywacji limfocytów T CD4 + , ponieważ komórki te muszą być aktywowane przed transdukcją retrowirusową.
Pomimo swoich ograniczeń, protokół ten został z powodzeniem zastosowany w różnych badaniach, ułatwiając eksplorację kluczowych regulatorów genetycznych zaangażowanych w różnicowanie Th17. Umożliwia ocenę zmian w efektywności różnicowania Th17 po nokautowaniu genów docelowych w aktywowanych limfocytach T. Ponadto protokół ten jest odpowiedni do oceny innych aspektów funkcji komórek Th17, w tym proliferacji komórek, przeżycia, stabilności czynnika transkrypcyjnego, wydzielania cytokin i odpowiedzi immunologicznych. Co więcej, nasze laboratorium wykazało jego skuteczność w transdukcji retrowirusowej i różnicowaniu indukowanych limfocytów T regulatorowych (iTreg). Chociaż nie wszystkie typy limfocytów T zostały przetestowane, protokół ten może mieć również zastosowanie w innych podzbiorach, takich jak limfocyty T Th1, Th2 i CD8 + . Ogólnie rzecz biorąc, technika ta służy jako cenne narzędzie do przeprowadzania nokautów genów w komórkach odpornościowych, oferując znaczny potencjał w odkrywaniu krytycznych sygnałów genetycznych, które regulują funkcje odpornościowe.

Komórki Th17, unikalny podzbiór komórek pomocniczych T CD4+, są niezbędne do zwalczania zewnątrzkomórkowych bakterii i grzybów oraz odgrywają znaczącą rolę w różnych chorobach autoimmunologicznych1,2,3. Pojawiające się dowody sugerują, że komórki Th17 wykazują niejednorodność, funkcjonując zarówno w warunkach patogennych, jak i niepatogennych, na które wpływ mają czynniki środowiskowe i genetyczne. Wyjaśnienie procesów regulacyjnych, które kontrolują różnicowanie komórek Th17, plastyczność i heterogeniczność, ma kluczowe znaczenie dla rozwoju bardziej skutecznych strategii immunoterapeutycznych.
Genetycznie modyfikowane zwierzęta były szeroko wykorzystywane do odkrywania kluczowych regulatorów różnicowania i funkcji komórek Th17. Wykorzystanie genetycznie modyfikowanych zwierząt wiąże się z całkowitą manipulacją in vivo, zapewniając autentyczność i systematyczne badanie ich roli w warunkach fizjologicznych lub modelach chorób. Niemniej jednak wysokoprzepustowe badania przesiewowe z tym podejściem są w dużej mierze niepraktyczne. Testy polaryzacji in vitro stanowią alternatywę dla badania różnicowania komórek Th17. Wykazano, że interleukina 6 (IL-6) w połączeniu z transformującym czynnikiem wzrostu β1 (TGFβ1) sprzyja rozwojowi niepatogennych komórek Th17, podczas gdy IL-6, IL-1β i IL-23 są zaangażowane w napędzanie różnicowania patogennych komórek Th17 (pTh17)4,5.
Pojawienie się technologii CRISPR/Cas9 ułatwiło precyzyjną edycję genomu na określonych podstawach. W połączeniu z transdukcją retrowirusową, podejście to zapewnia silną, wydajną i ekonomiczną metodę genetyczną do badań przesiewowych i funkcjonalnego badania potencjalnych regulatorów w komórkach Th176,7. W tym badaniu udoskonaliliśmy procedurę transdukcji retrowirusowej w systemie polaryzacji Th17. Korzystając z systemu retrowirusowego, zainfekowaliśmy wstępnie ustalone aktywowane naiwne limfocyty T z ekspresją Cas9 od myszy. Komórki transdukowano za pomocą konstruktów przewodnika RNA (gRNA) napędzanych przez promotor U6, wraz z genami kodującymi fluorescencyjne białka reporterowe pod kontrolą promotora EF1a, aby ułatwić nokaut genu docelowego. Następnie transdukowane limfocyty T hodowano w określonych warunkach cytokin w celu wywołania różnicowania w komórki Th17. Warto zauważyć, że wyeliminowanie RoRγt znacznie zmniejszyło produkcję IL-17A w porównaniu z grupą kontrolną. Skuteczność tego systemu zależy od zoptymalizowanych warunków produkcji i transdukcji retrowirusa dla aktywowanych pierwotnych limfocytów T, zapewniając szybkie i praktyczne podejście do badania określonych genów w różnicowaniu i funkcji Th17.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>Solarbio</td><td>E1170</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie do hodowli komórek i tkanek</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010100</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes (wolne kwasy, sterylne)</td><td>Solarbio</td><td>H1090</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowych i tkankowych</td><td>NEST</td><td>702002</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych i tkankowych</td><td>NEST</td><td>748002</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin Roztwór (1,000x)</td><td>BioLegend</td><td>420601</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD4 Brilliant Violet 650 (RM4-5)</td><td>Przeciwciało</td> monoklonalne BioLegend <td>100546</td><td></td></tr><tr><td>CD3e (145-2C11), klasa funkcjonalna, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>16-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD44 (IM7), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0441-83</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD62L (L-Selectin) (MEL-14), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0621-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (40 &mu; m)</td> <td>biosharp</td><td>BS-40-CS</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek (70 &mu; m)</td><td><a name="ZASIĘG! Wirówka B14">biosharp</a></td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>EPPENDORF</td><td>5425&nbsp; R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q411-02</td><td></td></tr><tr><td>Jednoetapowy zestaw do klonowania ClonExpress II</td><td>Vazyme</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; Competent Cells</td><td>Sangon Biotech</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L110KJ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mysz CD4 + Zestaw do izolacji komórek T</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660</td><td>Invitrogen</td><td>65-0864-18</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Mini zestaw plazmidowy II</td><td>TIANGEN</td><td>DP118-02</td><td></td></tr><tr><td>ExFect Odczynnik do transfekcji</td><td>Vazyme</td><td>T101-01</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, Premium Plus</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>FITC Przeciwciało przeciw mysiej IL-17A (TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506907</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Macklin</td><td>F864792</td><td></td></tr><tr><td>HiScript IV RT SuperMix do qPCR?+wycieraczka gDNA?</td><td>Vazyme</td><td>R423-01</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Beyotime</td><td>S1672</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Maokang Biotechnology</td><td>7/7/1950</td><td></td></tr><tr><td>Mysz GRCm38</td><td></td><td>NCBI RefSeq v.108.20200622</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM Obniżona surowica Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>obniżona surowica</td></tr> Pacific <tr><td>Blue anty-mysie przeciwciało CD4 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>100531</tr><tr><td>PE/Cyjanina7 przeciwciało anty-mysie CD25 (PC61)</td><td>BioLegend</td><td>102015</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyjanine7 anty-mysie przeciwciało CD4 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PMA/TPA&nbsp;</td>Myszy <td>Beyotime</td><td>S1819</td><td></td></tr><tr><td>R26-CAG-Cas9&nbsp;</td><td>Centrum Organizmów Modelowych w Szanghaju</td><td>Nr kat. NM-KI-00120</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane ludzkie białko TGF-beta 1 (z ekspresją CHO), CF</td><td>R& D Systems</td><td>11409-BH</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-6</td><td>PeproTech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek badawczych</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Research Cell Sorter</td><td>SONY</td><td>MA900</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L210KJ</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler System PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Oczyszczone przeciwciało przeciw myszom CD28 (37.51)</td><td>BioLegend</td><td>102121</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Oczyszczone przeciwciało przeciw myszom IFN-&gamma; Przeciwciało (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505847</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Oczyszczone przeciwciało przeciw mysiej IL-4 (11B11)</td><td>BioLegend</td><td>504135</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Oczyszczone przeciwciało przeciw mysim IL-12/IL-23 p40 (C17.8)</td><td>BioLegend</td><td>505309</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol (50 mM)</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr></tbody></table>

retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem crispr/cas9 w badaniu różnicowania th17 in vitro

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T, które wytwarzają IL-17A, znane jako komórki Th17, odgrywają kluczową rolę w obronie immunologicznej i są związane z zaburzeniami autoimmunologicznymi. Limfocyty T CD4 mogą być stymulowane antygenami i dobrze zdefiniowanymi koktajlami cytokin in vitro, aby naśladować różnicowanie komórek Th17 in vivo. Przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad mechanizmami regulacji różnicowania Th17 przy użyciu testu polaryzacji Th17 in vitro.
Konwencjonalne metody polaryzacji Th17 zazwyczaj polegają na pozyskiwaniu naiwnych limfocytów T CD4 od genetycznie modyfikowanych myszy w celu zbadania wpływu określonych genów na różnicowanie i funkcję Th17. Metody te mogą być czasochłonne i kosztowne, a wpływ na nie mogą mieć czynniki zewnętrzne komórek zwierząt nokautujących. Tak więc protokół wykorzystujący retrowirusową transdukcję przewodnikowego RNA w celu wprowadzenia nokautu genu w pierwotnych mysich limfocytach T CRISPR / Cas9 służy jako bardzo przydatne podejście alternatywne. W artykule przedstawiono protokół różnicowania naiwnych pierwotnych limfocytów T w komórki Th17 po retrowirusowym celowaniu genowym, a także późniejsze metody analizy cytometrii przepływowej do oznaczania skuteczności infekcji i różnicowania.

W badaniu sklonowano sekwencje kodujące sgRNA celującego w Rorc oraz sgRNA niecelujące do wektora pMX-U6-MCS z fluorescencyjnym białkiem mCherry (Rysunek 1A,B). Produkcja retrowirusów została przeprowadzona zgodnie z protokołem przedstawionym na Rysunku 2. Transfekcję rozpoczęto w dniu 0, a zbiór retrowirusów nastąpił w dniu 2. Wydajność transfekcji można sprawdzić, mierząc intensywność fluorescencji mCherry (Rysunek 1C). Przed zbiorem wirusa wyizolowano i aktywowano naiwne limfocyty T CD4+. Tak aktywowane limfocyty T CD4+ zainfekowano metodą spin-infekcji, a następnie kontynuowano etapy różnicowania zgodnie z opisem. Na koniec wydajność transdukcji oraz wyniki różnicowania oceniono za pomocą analizy cytometrii przepływowej i analizy qPCR.
Rysunek 3 przedstawia strategię bramkowania zastosowaną do sortowania naiwnych limfocytów T CD4+ . Po wybraniu głównej populacji komórek oraz komórek pojedynczych (jak pokazano w dwóch pierwszych bramkach na Rysunku 3), bramkowano komórki FVD- CD4+, aby odróżnić limfocyty T CD4 spolaryzowane do komórek Th17 od APC. Ostatecznie poziom IL-17A produkowanego przez limfocyty T CD4 reprezentuje wydajność różnicowania Th17, co wskazuje na wydajność nokautu. Procent komórek mCherry-dodatnich odzwierciedla wydajność infekcji retrowirusowej, natomiast wydajność nokautu jest wskazywana przez procent komórek IL-17A-dodatnich. Aby zwiększyć żywotność komórek i zminimalizować czas sortowania, splenocyty wzbogacono przy użyciu zestawu do izolacji limfocytów T CD4+ myszy, co pozwoliło uzyskać wydajność wzbogacenia przekraczającą 90%.
Wydajność infekcji retrowirusowej, wskazywana przez obecność komórek mCherry-dodatnich, wynosi zazwyczaj około 40% (Rysunek 4A). Choć wydajność infekcji można zwiększyć poprzez zagęszczenie wirusa, podejście to odbywa się kosztem wydłużenia czasu trwania eksperymentu i wyższych kosztów. W naszych badaniach zainfekowane komórki hodowane bez koktajlu różnicującego komórki Th17 służyły jako ujemna kontrola różnicowania Th17, oznaczona jako Th0. Jako kontrolę dodatnią zastosowano niecelujące sgRNA, określone jako sgNT. Do edycji genów wykorzystano gRNA celujące w gen RORγt (sgRNA-Rorc), co znacząco obniżyło wydajność różnicowania Th17 (Rysunek 4A). Interwencja ta doprowadziła również do istotnego spadku poziomów ekspresji Rorc oraz IL-17a (Rysunek 4B).
<img alt="Schematy DNA plazmidowego i ekspresja mCherry w transfekowanych komórkach PhaT-E; eksperyment wizualizacji genów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przykład sgRNA podklonowanego do wektora retrowirusowego oraz wydajność transfekcji. Jako konstrukt wyjściowy zastosowano wektor pMX-U6-MCS. Rusztowanie (scaffold) gRNA wraz z sekwencjami sgRNA (część pomarańczowa) nakierowanymi na (A) sekwencję kontrolną (scrambled) oraz (B) Rorc, zostały wstawione w regionie downstream względem promotora U6 (część zielona jako sekcja do sekwencjonowania z primerami U6). Położenia primerów zawierających sgRNA oraz miejsc wiązania primerów do sekwencjonowania są zaznaczone poniżej kolistego wektora. Pełne nazwy skrótów na plazmidzie są następujące. Skróty: AmpR = oporność na ampicylinę, karbenycylinę i pokrewne antybiotyki; LTR = długa powtórka końcowa (long terminal repeat); MMLVψ = sygnał pakowania wirusa białaczki mysiej Moloneya; gag = ucięty gen gag wirusa białaczki mysiej Moloneya (MMLV), pozbawiony kodonu start. (C) Obrazowanie mikroskopowe mCherry w komórkach Plat-E transfekowanych DNA plazmidowym. Pasek skali: 500 px. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu transfekcji; aktywacja limfocytów T, infekcja wirusowa, analiza FACS w celu różnicowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczna ilustracja protokołu. Dzień przed transfekcją należy dostosować gęstość komórek Plat-E do odpowiedniego zakresu. Następnego dnia (dzień 0) należy przeprowadzić transfekcję i wymienić medium po 12 h. W dniu 1 należy wyizolować i aktywować naiwne limfocyty T z myszy wykazujących ekspresję Cas9. Następnie (dzień 2) należy zebrać nadsącz z hodowli zawierający wirusy i połączyć go z aktywowanymi limfocytami T w celu transdukcji retrowirusowej. Zainfekowane komórki są następnie różnicowane w komórki Th17 przez 3–4 dni i analizowane za pomocą FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej, od limfocytów do naiwnych limfocytów T, wykresy FSC vs SSC, proces bramkowania komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Strategia bramkowania dla sortowania naiwnych limfocytów T CD4. Barwienie powierzchniowe przeprowadzono na wzbogaconych limfocytach T CD4 w celu oznakowania CD4, CD25, CD44 i CD62L. Zastosowano następującą strategię bramkowania: początkowo limfocyty wyznaczono na podstawie parametrów rozproszenia światła w przód (forward scatter) i rozproszenia bocznego (side scatter). Następnie, przy użyciu FSC-H i FSC-W, zidentyfikowano pojedyncze komórki. Komórki CD4+CD25- wyznaczono w celu wykluczenia limfocytów T regulatorowych (Tregs). Na koniec zidentyfikowano naiwne limfocyty T CD44lowCD62Lhigh. Izolowane naiwne limfocyty T CD4+ zebrano do dalszych eksperymentów. Skróty: FSC = forward scatter; SSC = side scatter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schematy cytometrii przepływowej, wykres; analiza ekspresji genów; różnicowanie komórek Th17, mCherry, Rorc." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przykład udanej transdukcji aktywowanych limfocytów T i różnicowania Th17. (A) Efektywność różnicowania Th17 jest znacząco zmniejszona po edycji za pomocą gRNA RORγt (bramkowanie populacji mCherry+ IL-17a+). (B) Względna ekspresja mRNA Rorγt i IL-17a w komórkach Th0 (komórki zainfekowane hodowane bez koktajlu do różnicowania komórek Th17), sgNT (niespecyficzne sgRNA) oraz sgRNA-Rorc (sgRNA celujące w gen RORγt). ***p &lt; 0,001 (nieparzysty dwustronny test t Studenta; dane przedstawiono jako średnia ± SEM).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Komponenty reakcji PCR</td>
			<td colspan="4">Program PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Objętość (μL)</td>
			<td>Krok</td>
			<td>Temp.</td>
			<td>Czas</td>
			<td>Cykl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 × Phanta Mix (Dye Plus)</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>3 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O20</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>95 ºC</td>
			<td>15 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter-F (10 μM)</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>56 ºC</td>
			<td>15 s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Starter-R (10 μM)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td rowspan="2">72 ºC</td>
			<td rowspan="2">5 min 30 s</td>
			<td>Przejdź do kroku 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 ×</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matryca (~30 ng)</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>72 ºC</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>12 ºC</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Składniki reakcji PCR oraz program PCR dla konstrukcji wektora gRNA.

Przedstawiamy protokół retrowirusowej transdukcji przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T od transgenicznych myszy Cas9, zapewniając efektywną alternatywę dla edycji genów w badaniu różnicowania Th17.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

Badanie to zapewnia standardowy protokół badania różnicowania komórek Th17, podzbioru limfocytów T pomocniczych, które odgrywają kluczową rolę w odpowiedziach immunologicznych. Poprzez retrowirusową transdukcję przewodnikowego RNA do pierwotnych limfocytów T z transgenicznych myszy Cas9, naukowcy mogą badać szczególną funkcję genów w regulacji różnicowania Th17. W badaniu tym wykorzystano technologię CRISPR-Cas9 do precyzyjnej edycji genów i transdukcji retrowirusowej w celu skutecznego celowania w określone geny w pierwotnych limfocytach T.Cytometria przepływowa służy do oceny wydajności transdukcji i monitorowania różnicowania komórek. Polaryzacja Th17 in vitro jest przeprowadzana w celu stymulacji różnicowania limfocytów T CT4+. Nasze badania mają na celu wypełnienie luk w zrozumieniu, w jaki sposób określone geny regulują różnicowanie Th17.Używamy CRISPR-Cas9 wraz z transdukcją retrowirusową, która stanowi szybszą i bardziej opłacalną alternatywę dla tradycyjnych modeli myszy z nokautem. Nasz protokół nie tylko szczegółowo opisuje transdukcję retrowirusową limfocytów T CD4, ale także zapewnia obszerny przewodnik po naszych sekwencjach treningowych sgRNA i budowie plazmidów, co jest pomijane w innych protokołach. W tym artykule przedstawiono każdy etap procesu eksperymentalnego, zapewniając, że inni badacze mogą łatwo powielić metodologię.Aby rozpocząć, użyj narzędzia CRISPick, aby zaprojektować pojedynczy przewodnik RNA dla nokautu ROR Gamma T. Ustaw genom referencyjny na Mouse GRCM 38 i określ sekwencję PAM jako NGG, w oparciu o system przewodnika CRISPRko. Wprowadź nazwę genu docelowego w polu wyszukiwania w kolumnie Szybkie wyszukiwanie genów.Sprawdź, czy system wyświetla prawidłowy identyfikator genu i pełną nazwę genu docelowego, aby zapewnić dokładny wybór. Wybierz jeden przewodnik RNA ukierunkowany na sekwencję RORC w oparciu o wysoką połączoną rangę i kolejność wyboru, aby zminimalizować dopasowania poza celem i zwiększyć skuteczność na celu. Wybierz sekwencję RNA z pojedynczym przewodnikiem, która nie jest ukierunkowana, z bibliotek Mouse Gecko V2.Amplifikuj sekwencje kodujące RORC z pojedynczym przewodnikiem i pojedynczym przewodnikiem bez celu przy użyciu polimerazy DNA w PCR ze starterami zaprojektowanymi dla regionów pojedynczego przewodnika RNA i sekwencji wektorowej. Sklonuj amplifikowane sekwencje do wektora PMXU 6MCS, umieszczając je między promotorem U6 a rusztowaniem prowadzącym RNA w ramce z białkiem fluorescencyjnym mCherry. Następnie skonfiguruj program PCR do budowy wektorów.Na dzień przed transfekcją wysiewaj około osiem razy 10 do mocy sześciu komórek Plat-E w 10-centymetrowym naczyniu zawierającym DMEM uzupełnionym 10% FBS, penicyliną i streptomycyną. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla, aż komórki osiągną 80% konfluencji. Na godzinę przed transfekcją zastąp pożywkę do hodowli komórkowych ośmioma mililitrami ciepłej zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej, zawierającej 5% FBS, ale bez penicyliny lub streptomycyny.Przygotuj transfekcję Mix 1 i Mix 2. Kropla po kropli dodaj Mix 2 do Mix 1 i delikatnie wymieszaj. Inkubować mieszaninę przez 15 do 20 minut w temperaturze od 20 do 25 stopni Celsjusza.Delikatnie obracając płytką, dodawaj mieszaninę transfekcji kropla po kropli do komórek Plat-E. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć do dwunastu godzin. Po inkubacji zastąp pożywkę 10 mililitrami świeżej pożywki do hodowli komórkowych i kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 48 godzin.Oceń skuteczność transfekcji w komórkach Plat-E, wykrywając znacznik wektora retrowirusowego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Następnie odwirować supernatant kultury zawierający wirusa w temperaturze 1,500 G przez 10 minut, aby usunąć fragmenty komórek. Porcjować supernatant zawierający wirusa do jednomililitrowych fiolek.Na początek pokryj każdą studzienkę 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej dwoma mikrogramami na mililitr Anti CD3 Epsilon i czterema mikrogramami na mililitr Anti CD28 w 500 mikrolitrach PBS. Zawiń płytkę w Parafilm i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po pobraniu śledziony myszy zmiel ją w buforze FACS przy użyciu wysterylizowanego zmielonego szkła w celu homogenizacji tkanki do zawiesiny pojedynczej komórki.Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki. Wiruj zawiesinę komórek śledziony w temperaturze 800 G przez pięć minut i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach buforu do lizy krwinek czerwonych. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na pięć minut.Następnie dodaj bufor FACS, aby osiągnąć całkowitą objętość 15 mililitrów. Po odwirowaniu ponownie zawieś splenocyty w buforze FACS i przefiltruj je przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Dostosuj końcową objętość do jednego mililitra za pomocą buforu FACS i wyizoluj komórki CD4 + T za pomocą dostępnych w handlu zestawów odczynników, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.Oznacz limfocyty T CD4 + mieszaniną przeciwciał fluorescencyjnych. Po umyciu wybarwionych komórek buforem FACS wyizoluj naiwne komórki T CD4 + za pomocą sortera komórek przepływowych. Teraz, po usunięciu supernatantu stymulacyjnego związanego z płytką, przepłucz dwukrotnie każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 500 mikrolitrami PBS.Płytkę jeden razy 10 do mocy sześciu naiwnych limfocytów T CD4 + w jednym mililitrze pożywki do hodowli limfocytów w każdym dołku i inkubować przez 18 do 24 godzin. Następnego dnia zbierz aktywowane komórki do 1,5 mililitrowej probówki i wiruj w temperaturze 800G przez pięć minut. Zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze mieszaniny infekcyjnej i dodać jeden mililitr mieszaniny do dołków 48-dołkowej płytki.Owinąć płytkę Parafilmem i odwirować w temperaturze 800 G przez 90 minut w temperaturze 32 stopni Celsjusza, z przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na trzy. Po odwirowaniu usuń Parafilm i inkubuj komórki przez cztery godziny. Aby przygotować komórki prezentujące antygen lub APC, ponownie zawiesić splenocyty w jednym mililitrze pożywki hodowlanej limfocytów zawierającej 50 mikrogramów na mililitr mitomycyny w 15-mililitrowej probówce.Inkubuj splenocyty w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez godzinę. Następnie dodaj PBS do oznaczenia 15 mililitrów i wiruj w temperaturze 800G przez pięć minut. Ponownie zawiesić splenocyty w jednym mililitrze pożywki do hodowli limfocytów i policzyć liczbę komórek na maszynie do liczenia komórek.Po zakażeniu retrowirusowym odwirować transdukowane limfocyty T CD4 + w 1,5 mililitrowych probówkach i ponownie zawiesić zakażone komórki w 600 mikrolitrach PBS. Umieścić 0,5 razy 10 do mocy sześciu transdukowanych komórek T CD4 + w jednym mililitrze pożywki do hodowli limfocytów z 1,5 razy 10 do mocy sześciu komórek APC w studzience 24-dołkowej płytki do hodowli komórek. Suplement zawiera dwa mikrogramy na mililitr Anti CD3 Epsilon, dwa mikrogramy na mililitr Anti CD28 i koktajl różnicujący Th17.Hoduj komórki przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po dwóch dniach odwirować zawiesinę komórkową w 1,5 mililitrowych probówkach i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki do hodowli limfocytów zawierającej trzy nanogramy na mililitr TGF Beta i 30 nanogramów na mililitr interleukiny 6. Przenieś komórki do dołków 24-dołkowej płytki na dwa dni.Potraktuj zróżnicowane komórki 50 nanogramami na mililitr PMA, 500 nanogramami na mililitr jonomycyny i pięcioma mikrogramami na mililitr brefeldenu A w 500 mikrolitrach pożywki do hodowli limfocytów w nowej studzience na 24-dołkowej płytce. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Zbierz leczone komórki do 1,5 mililitrowych probówek zawierających jeden mililitr buforu FACS.Po odwirowaniu wybarwić komórki PBS zawierającym fluorescencyjną mieszaninę przeciwciał w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Umyj wybarwione komórki 300 mikrolitrami PBS przed utrwaleniem ich 300 mikrolitrami formaldehydu buforowanego 2% fosforanem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut. Po umyciu komórek PBS ponownie zawieś je w 600 mikrolitrach buforu permeabilacyjnego i odwiruj w temperaturze 800G przez pięć minut.Wybarwić komórki przeciwciałem anty-interleukiny 17A w 100 mikrolitrach buforu permeabilizacji przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Skuteczność infekcji retrowirusowej, na którą wskazują komórki mCherry-dodatnie, wynosiła około 40%Skuteczność różnicowania Th17 była znacznie zmniejszona w komórkach traktowanych pojedynczym przewodnikiem RNA ukierunkowanym na gen ROR Gamma T. Poziomy ekspresji RORC i interleukiny 17A były znacznie zmniejszone w komórkach traktowanych pojedynczym przewodnikiem RNA RORC.

retroviral-crisprcas9-mediated-gene-targeting-for-study-th17

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Wiele eksperymentalnych systemów zostało wykorzystanych do zrozumienia mechanizmów regulujących rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano podejście genetyczne wykorzystujące transdukcję retrowirusową, które jest ekonomiczne, efektywne czasowo, a co najważniejsze, bardzo pouczające w identyfikacji szlaków regulacyjnych.

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Elektroporacja nowej generacji to skuteczna metoda transfekcji ludzkich komórek Th17 z małymi RNA w celu zmiany ekspresji genów i zachowania komórek.

Transfekcja małego RNA w pierwotnych ludzkich komórkach Th17 za pomocą elektroporacji nowej generacji

Prezentujemy proces inżynierii genomu do generowania nowych modeli in vitro dla zakażenia HIV-1, które podsumowują integrację prowirusową w wybranych miejscach genomu. Ukierunkowanie na osoby zgłaszające pochodzące od wirusa HIV jest ułatwione dzięki manipulacji genomem specyficznej dla danego miejsca za pośrednictwem CRISPR-Cas9. Dostępne są szczegółowe protokoły generowania klonów pojedynczych komórek, badań przesiewowych i weryfikacji prawidłowego celowania.

Inżynieria genomu oparta na CRISPR-Cas9 do generowania modeli reporterowych Jurkat dla zakażenia HIV-1 z wybranymi miejscami integracji prowirusa

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Ten protokół opisuje różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4+ w patogenne komórki Th17 in vitro. W szczególności, w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrowej cytometrii przepływowej, można uzyskać 90% czystość patogennych komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu tej metody różnicowania.

Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 + w patogenne komórki Th17 u myszy

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Poznaj metodę retrowirusowego celowania genów CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania komórek Th17 in vitro. Protokół umożliwia precyzyjną edycję genów w pierwotnych limfocytach T myszy transgenicznych Cas9.

Retrowirusowe celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w badaniu różnicowania Th17 in vitro

Przeglądaj więcej filmów