Identyfikacja produktów naturalnych pod kontrolą biologiczną za pomocą chromatografii cienkowarstwowej - bioautografia bezpośrednia

W ciągu ostatnich dwóch dekad w branży rolniczej znacznie wzrosła liczba badań nad odkryciem alternatyw dla syntetycznych pestycydów. Badając naturalne produkty wytwarzane przez bioaktywne mikroorganizmy glebowe, nasz zespół przewiduje odkrycie nowych biopestycydów, które już istnieją w środowisku. Chromatografia cienkowarstwowa z bezpośrednią bioautografią lub TLC-DB jest stosowana przede wszystkim do określania bioaktywności ekstraktów roślinnych przeciwko chorobotwórczym bakteriom i grzybom.

W tym filmie ekstrakty bakteryjne są oznaczane bez konieczności wywoływania zarodnikowania patogenu, co pozwala na badanie szerszego zakresu patogenów. TLC-DB będzie nadal jednym z narzędzi, których używamy, aby skupić się na odkrywaniu nowych naturalnych produktów do kontroli biologicznej. Przyniesie to korzyści sektorom rolnictwa i rolno-spożywczym oraz pomoże złagodzić oporność, jaką patogeny rozwijają na pestycydy stosowane w handlu.

Aby rozpocząć, za pomocą pipety, umieść pięć mikrolitrów każdego ekstraktu w odległości dwóch centymetrów od siebie na kropkach zaznaczonych na dolnej linii chromatografii cienkowarstwowej lub płytki TLC. Pozostaw plamy do wyschnięcia na płytce TLC i powtarzaj, aż na płytkę zostanie załadowanych około pięciu miligramów każdego ekstraktu. Przygotować jeden lub dwa roztwory dichlorometanu i metanolu w zbiorniku do wywoływania TLC.

Umieścić płytkę TLC w zbiorniku do wywoływania i rozwijać ją, aż rozpuszczalnik osiągnie linię oznaczoną dwa centymetry od górnej części płytki. Po rozwinięciu wyjmij płytkę TLC ze zbiornika Natychmiast wykryj pozytywne kontrolki w kropkach nad linią rozpuszczalnika. Umieść płytkę w pudełku na płytki TLC sterylizowane etanolem, zanim cały rozpuszczalnik wyparuje.

Zeskrob matę grzybni z pięciu płytek patogenów za pomocą sterylnej metalowej szpatułki, a następnie przenieś ją do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Po dodaniu 25 mililitrów bulionu z dekstrozy ziemniaczanej wzbogaconego agarem, dodaj sterylne szklane kulki do probówki i wiruj przez pięć minut, aby rozbić matę grzybni. Po zamontowaniu opryskiwacza chromatograficznego w okapie podłącz rurkę, a następnie podłącz przepływomierz do zestawu.

Przenieść zawiesinę grzybni do rozpylacza chromatograficznego za pomocą sterylnej strzykawki z końcówką igły, aby upewnić się, że duże kawałki grzybni nie zatykają rozpylacza. Umieść wcześniej opracowane płytki TLC na sterylnych ręcznikach papierowych w okapie z przepływem laminarnym, aby zmniejszyć kontakt dłoni z płytką podczas nakładania zawiesiny podłoża. Podłączyć próbkę patogenu do zmontowanego opryskiwacza i nałożyć trzy warstwy zawiesiny na płytkę TLC, pozwalając płytce całkowicie wyschnąć między aplikacjami.

Następnie przygotuj zestaw do inkubacji, dodając 50 mililitrów sterylnej wody do wysterylizowanego plastikowego pudełka na płytki. Umieść w nim cztery płytki Petriego, aby można było usiąść na płytce TLC. Umieść również wysterylizowane złożone arkusze celulozy lub bibułę filtracyjną po obu stronach pudełka, aby zatrzymać wilgoć.

Umieścić wypełnioną płytkę do oznaczania na czterech pustych szalkach Petriego w pudełku. Inkubować test przez trzy dni do jednego tygodnia lub do momentu, gdy równa warstwa grzybni wyrośnie na płytce, z wyjątkiem okolic kontroli pozytywnych i strefy inhibicji. Następnie za pomocą metalowej łyżki zeskrob krzemionkę ze stref inhibicji i umieść ją w probówkach do mikrowirówek.

Dodaj 500 mikrolitrów metanolu do każdej probówki i wiruj, aby wyekstrahować metabolity z krzemionki. Odwirować probówki w celu osadzenia krzemionki i przenieść supernatant do fiolek do chromatografii cieczowej w celu analizy. Obrazowanie w świetle ultrafioletowym wykazało oddzielenie metabolitów na płytce TLC.

Po inkubacji patogen wydawał się rosnąć równomiernie na całej płytce, z wyjątkiem kontroli pozytywnych i stref inhibicji.