Elektroporacja na bazie porowatego podłoża z monitorowaniem transepitelalnej impedancji elektrycznej

Nasze badania koncentrują się na poprawie elektroporacji porowatych podłoży. Badania wykazały znaczne korzyści płynące z wykorzystania mikro i nanokanałów do lokalizacji elektroporacji, ale nadal istnieją pytania, na które należy odpowiedzieć, zwłaszcza w odniesieniu do monitorowania i charakteryzowania efektów na pośrednich etapach procesu. Niektóre z najnowszych osiągnięć obejmują wykorzystanie monitorowania impedancji elektrycznej nabłonka trans, a także wykorzystanie elektroporacji opartej na nanokanałach do tworzenia egzosomów lub pomiaru napięcia w błonach komórkowych.

Eksperymenty PSCP nadal w dużym stopniu opierają się na obrazowaniu fluorescencyjnym przed i po w celu określenia wyników dostarczania i żywotności komórek. Ponadto wiele badań opartych na PSCP podaje parametry impulsowe, a bardzo niewiele badań przeprowadzono w celu zweryfikowania optymalnych parametrów dla popularnych typów komórek. Podstawową luką badawczą, którą się zajmujemy, jest brak raportowania na temat wpływu PSEP na etapie regeneracji komórek.

Jednak nasza analiza pomiarów TEEI powiązała zmianę TEEI z żywotnością i wydajnością dostarczania, co pozwoliło nam również zidentyfikować optymalne parametry przebiegu PSEP. Naszym głównym celem w przyszłości będzie zidentyfikowanie mechanizmów powodujących wzrost TEEI. Idealnie byłoby, gdyby te odkrycia pomogły nam dostroić proces PSEP, aby zapewnić jeszcze bardziej efektywną realizację.

Aby rozpocząć powlekanie fibronektyną, wybierz 12 wkładek i dwie płytki 24-dołkowe. Umieść wkładki w jednej płytce dołkowej, tworząc dwa rzędy po sześć. Przygotuj jeden mikrogram na mililitr roztworu fibronektyny, mieszając 52 mikrolitry roztworu podstawowego fibronektyny i 1,2 mililitra PBS w probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Rozprowadzić 100 mikrolitrów roztworu fibronektyny do każdej wkładki. Inkubować wkładki w płytce studzienkowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po inkubacji usuń nadmiar roztworu fibronektyny z każdej wkładki.

Umyj wkładki dwukrotnie, dodając do każdej wkładki 100 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej. Usuń wodę w tej samej kolejności, w jakiej została dodana, aby zapewnić stały czas mycia między wkładkami. Teraz umyj wkładki 100 mikrolitrami pożywki do hodowli komórkowych, a następnie wyjmij pożywkę z wkładek.

Następnie wysiew, 200 mikrolitrów A na zawiesinę 31 komórek do wkładek do kontroli ujemnej pipetować 200 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do wkładek. Za pomocą markera permanentnego narysuj linię dzielącą drugą płytkę studzienkową na dwie kolumny o szerokości trzech dołków. Podziel każdą kolumnę na wiersze.

Oznacz każdy region w siatce odpowiednimi parametrami. Dodaj jeden mililitr pożywki do hodowli komórkowych do każdej studzienki. Przenieść wkładki z płytki przygotowawczej do odpowiedniego miejsca na oznakowanej płytce doświadczalnej i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin.

Aby rozpocząć, należy odpipetować 1,5 mililitra roztworu jodku perydu o stężeniu 0,1 miligrama na mililitr do każdej studzienki w układzie elektrod. Umieść wkładkę w każdej studzience w układzie elektrod, dopasowując nóżki wkładki do rowków wyrównujących, tak aby wkładka była zlicowana z górną powierzchnią studni. Przykręć płytkę drukowaną górnej elektrody do górnej części studzienek matrycy elektrod i podłącz matrycę elektrod do elektroporacji podłoża porowatego lub urządzenia PSEP.

Umieść zestaw elektrod w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu zrównoważenia temperatury. Kliknij menu rozwijane obok membrany w lewym górnym rogu lepkiego i kliknij 400 nanometrowe GBO. Po prawej stronie lepkości wpisz jeden w polu edycji po impulsie, czasie, czasie, minucie.

Teraz kliknij przycisk uruchamiania i wprowadź odpowiednie nazwy dla dołków od pierwszego do trzeciego i od czwartego do sześciu, gdy zostaniesz o to poproszony, a następnie kliknij w porządku, aby rozpocząć eksperyment. Po godzinie wyjmij matrycę elektrod z inkubatora i przenieś wkładki z powrotem do pierwotnych miejsc na płytce doświadczalnej. Wymieszaj dwa mikrolitry gospodarza 33342 i pięć mikrolitrów wapnia AM ze 123 mikrolitrami pożywki do hodowli komórkowych w probówce o pojemności 200 mikrolitrów.

Delikatnie odpipetować 10 mikrolitrów roztworu barwienia do każdej wkładki impulsowej i umieścić wkładki z powrotem w inkubatorze na pięć minut, przenieść płytkę dołka do uchwytu płytki mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem o 5-krotnym powiększeniu. Obraz z wykorzystaniem jasnego pola i fluorescencji każdej plamy. Odpipetować 1,5 mililitra pożywki do hodowli komórek do każdego dołka w układzie elektrod.

Umieść wkładki próbek komórek w dołkach od pierwszego do trzeciego, a wkładki kontrolne w studzienkach od czterech do sześciu, dopasowując nóżki wkładki do rowków wyrównujących. Przykręć płytkę drukowaną górnej elektrody do górnej części dołków matrycy elektrod i podłącz matrycę elektrod do urządzenia PSEP. Umieść zestaw elektrod w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu zrównoważenia temperatury.

Kliknij menu rozwijane obok membrany w lewym górnym rogu lepkiego i kliknij GBO 400 nanometrów. Teraz kliknij przycisk uruchamiania i wprowadź odpowiednie nazwy dla dołków od pierwszego do trzeciego i od czwartego do sześciu, gdy zostaniesz o to poproszony, a następnie kliknij w porządku, aby rozpocząć eksperyment. Po godzinie wyjmij matrycę elektrod z inkubatora i przenieś wkładki z powrotem do pierwotnych miejsc w płytce studzienki doświadczalnej.

Po przygotowaniu gospodarza 32342, wapnia AM i jodku propydyny w pożywce do hodowli komórkowych wymieszaj i delikatnie odpipetuj 10 mikrolitrów roztworu barwienia do każdej wkładki po impulsie i umieść wkładki z powrotem w inkubatorze na pięć minut. Na obrazie mikroskopu fluorescencyjnego próbka komórki wstawia się za pomocą jasnego pola i fluorescencji każdej barwie, zoptymalizowana zdrowa krzywa nie wykazała spadku poniżej linii podstawowej, a największy wzrost TEEI po obrazowaniu PSEP monowarstwy komórki ujawnił znikomą śmierć komórki i zdrową, w pełni płynną monowarstwę komórkową. Zoptymalizowane dane w złej kondycji skutkowały zmniejszoną odpowiedzią TEEI.

Obrazowanie po PSEP wykazało prawie zerową śmierć komórek i zmniejszoną wydajność dostarczania ze względu na mniejszą liczbę komórek w monowarstwie. Zastosowanie niezoptymalizowanych przebiegów spowodowało znaczne zmniejszenie odpowiedzi TEEI, co wskazuje na znaczną śmierć komórki i zmniejszoną wydajność dostarczania.