Name: Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj projektowanie i dostarczanie indukowalnych obwodów syntetycznych kontrolowanych tetracykliną w zakażeniach Leishmania major. Ta metoda umożliwia badanie eliminacji pasożyta i ekspresji cytokin w terapii immunometabolicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dyrektorowi Rady ds. Badań i Innowacji Biotechnologicznych - Narodowemu Centrum Nauk o Komórkach (BRIC-NCCS), Pune za wsparcie naszych badań oraz Ośrodkowi Bioinformatycznemu BRIC-NCCS.

Designing Tetracycline-Controlled Synthetic Circuits for Leishmaniasis Therapy

<ol><li>Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism%3A+Towards+a+better+understanding+the+mechanism+of+parasitic+infection+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity.</a> Front Immunol. 12, 661241(2021).</li>
<li>Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-metabolic+interactions+between+Leishmania+and+macrophage+host%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host.</a> Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).</li>
<li>Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-metabolic+profile+of+human+macrophages+after+Leishmania+and+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection.</a> PloS one. 14 (12), e0225588(2019).</li>
<li>Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+From+systems+biology+to+improve+knowledge+of+Leishmania+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infection+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance.</a> Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670(2021).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-metabolic+signaling+in+leishmaniasis%3A+insights+gained+from+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinfo+Adv%22%5BJournal%5D)">Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling.</a> Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125(2023).</li>
<li>Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+circuit+of+inositol+phosphorylceramide+synthase+in+Leishmania+a+chemical+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach.</a> J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+for+combating+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology for combating leishmaniasis.</a> Front Microbiol. 15, 1338749(2024).</li>
<li>Volpedo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+live+attenuated+centrin+gene-deleted+Leishmania+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates.</a> Pathogens. 11 (4), 431(2022).</li>
<li>Almeida, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis%3A+Immune+cells+crosstalk+in+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trop+Med+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization.</a> Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276(2023).</li>
<li>Duarte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+type+II+dehydrogenase+is+essential+for+parasite+viability+irrespective+of+the+presence+of+an+active+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118(2021).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+identifies+genes%2Fpathways+associated+with+experimental+resistance+to+paromomycin+in+Leishmania+donovani%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol+Drugs+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani.</a> Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).</li>
<li>Bolintineanu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+changes+in+tetracycline+repressor+binding+upon+mutations+in+the+tetracycline+operator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Eng+Data%22%5BJournal%5D)">Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator.</a> J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+circuit+for+buffering+gene+dosage+variation+between+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells.</a> Nat Comm. 12 (1), 4132(2021).</li>
<li>Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+the+design+of+synthetic+gene+networks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells.</a> FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Rabhi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+Leishmania+infected+mice+macrophages%3A+a+metabolic+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763(2012).</li>
<li>Renkema, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDHA+mutations+causing+a+multisystem+mitochondrial+disease%3A+novel+mutations+and+genetic+overlap+with+hereditary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Human+Gene%22%5BJournal%5D)">SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors.</a> Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+channelizing+protein-peptide+interactions+pipeline+for+host-parasite+paradigm+in+IL-10+and+IL-12+reciprocity+by+SHP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466(2022).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC+sequencing+identifies+sleepy+macrophages+during+reciprocity+of+cytokines+in+L.+major+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection.</a> Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823(2024).</li>
<li>Costello, A., Badran, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biological+circuits+within+an+orthogonal+central+dogma%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma.</a> Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).</li>
<li>Cooling, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+virtual+biological+parts%3A+a+repository+of+modular+modeling+components+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology.</a> Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).</li>
<li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+genetic+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Principles of genetic circuit design.</a> Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).</li>
<li>Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChan%2C+VW+%22The+effect+of+increasing+plasmid+size+on+transformation+efficiency+in+Escherichia+coli%22">The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli</a>. , (2002).</li>
<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Comm. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-dependent+metalloprotease+1+promotes+apoptosis+of+RAW264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+J+Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages.</a> Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).</li>
<li>Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+adenovirus+infection%3A+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells.</a> J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).</li>
<li>Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+RAW264.7+cells+with+a+luciferase+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene.</a> J Vis Exp. (100), (2015).</li>
<li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031(2021).</li>
<li>Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-On+systems+for+doxycycline-inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression.</a> Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).</li>
<li>De Boeck, J., Verfaillie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inducible+overexpression+systems%3A+how+to+induce+your+gene+of+interest+without+inducing+misinterpretations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations.</a> Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methoxyl+Aesculetin+abrogates+lipopolysaccharide-induced+inflammation+by+suppressing+MAPK+and+AP-1+pathways+in+RAW+264.7+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells.</a> Int J Mol Sci. 17 (3), 315(2016).</li>
<li>Tomiotto-Pellissier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+Leishmaniasis%3A+Broadening+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons.</a> Front Immunol. 9, 2529(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Uzyskane wyniki podkreślają efektywność rurociągu, który został wykorzystany do zaprojektowania i wdrożenia obwodu syntetycznego. Budowa tego syntetycznego obwodu była krokiem w kierunku rozwoju medycyny precyzyjnej dla chorób zakaźnych, takich jak leiszmanioza. Poprzez składanie części genetycznych in silico i symulację deterministyczną monitorowano wyróżniający się efekt modulacyjny systemu TetON. Efekt obwodu, w szczególności, mógł doprowadzić do wzajemnej bistabilnej ekspresji TetR i SDHA/GFP. Ekspresja SDHA była okresowa, co może wskazywać, że tylko w obecności doksycykliny jej ekspresja była zwiększona. Aby zaobserwować potencjalne zmiany we wzorcach wyrażeń w okresie, wybrano jednostkę czasu 100. Wyniki wskazują, że obwód syntetyczny wykazywał okresowe zachowanie dla TetR i SDHA/GFP, co prawdopodobnie można przypisać jego ortogonalnej naturze21. Kluczową rolę odegrało zebranie części genetycznych z rejestru części iGEM, ponieważ dostarczyło komponentów genetycznych niezbędnych do budowy obwodów syntetycznych22. Modułowe ułożenie części genetycznych jest niezbędne, ponieważ translacja i funkcjonowanie obwodu mogą zostać zakłócone, co może prowadzić do nieefektywnej ekspresji i efektu modulacyjnego w komórkach23.
Rozmiar wkładki obwodu syntetycznego wynosił około 1,3 kb, aby zapewnić, że rozmiar wektora nie jest zbyt duży, co może potencjalnie zmniejszyć wydajność transformacji24. Wybór odpowiedniego wektora jest krytycznym krokiem, ponieważ musi on posiadać części genetyczne, które są niezbędne do zwiększenia liczby kopii w systemie bakteryjnym i uzyskania kopii o wysokiej zawartości plazmidu, a jego maszyneria ekspresyjna musi dobrze dostosować się do systemu ssaków25. Wektor pEGFP-N1 jest dobrze scharakteryzowany w linii komórkowej RAW264.7 i posiada zwartą strukturę plazmidową z wielokrotnym miejscem klonowania26. Do izolacji plazmidu zastosowano standaryzowane laboratoryjnie roztwory buforowe, aby zapewnić produkcję wysoce skoncentrowanego i czystego plazmidu, co zostało zweryfikowane za pomocą estymacji spektrofotometrycznej i AGE. Wprowadzenie obwodu syntetycznego do wektora pEGFP-N1 zostało zweryfikowane poprzez trawienie restrykcyjne, a próbki przeanalizowano pod kątem AGE i sekwencjonowania. Wyniki AGE reprezentowały pasmo 1,3 kb wstawki, 4,7 kb pasmo wektora pEGFP-N1 i pasmo 6 kb całego obwodu syntetycznego. 
Przeprowadzono transfekcję z wykorzystaniem proporcji 1:1, 1:2 i 2:1 DNA: PEI, gdzie obserwowany stosunek 1:1 działał najlepiej bez naruszania morfologii komórki (dane nie pokazane). Zaleca się stosowanie stężenia G418 400 μg/ml - 1000 μg/ml do selekcji transfekowanych komórek27. Do selekcji transfekowanych komórek użyto 500 μg / ml G418, ponieważ skutecznie hamował wzrost komórek nietransfekowanych bez upośledzenia wzrostu komórek lub morfologii transfekowanych komórek (dane nie pokazane). Biorąc pod uwagę znaczenie fenotypu komórkowego w wydajności transfekcji, szczególnie w liniach komórkowych makrofagów, które mogą ulegać różnicowaniu i stawać się trudne do transfekcji, do transformacji wykorzystano niską liczbę pasaży linii komórkowej RAW264.728. Liczba pasaży komórkowych może być również krytycznym czynnikiem wpływającym na wydajność transfekcji. Duża liczba przejść może prowadzić do nieefektywnej transfekcji29. Dox jest preferowanym induktorem dla systemu indukcyjnego Tet-ON ze względu na wysoką skuteczność wiązania z TetR, korzystną dystrybucję w tkankach, niską toksyczność i okres półtrwania wynoszący 24 godziny30. Po transfekcji komórki indukowano dox przez 24 godziny i obserwowano ekspresję GFP. W przypadku ogniw RAW264.7 stężenie dox stosowane do indukcji obwodów syntetycznych wynosiło 1 μg/ml, co mieści się w zalecanym zakresie 1-2 μg/ml31 (dane nie pokazane). Jednak regulacja stężenia SDHA po indukcji nie była określona. Ogólnie rzecz biorąc, określenie i standaryzacja liczby pasaży komórkowych, DNA: stężenie PEI, stężenie markera selekcji transfekcji ssaków i stężenie indukcji doksycykliny są kluczowymi czynnikami w procesie transfekcji.
Po indukcji obwodu syntetycznego po zakażeniu w różnych punktach czasowych zaobserwowano znaczne zmniejszenie obciążenia pasożytami wewnątrzkomórkowymi. Porównanie obciążenia pasożytami między próbkami zakażonymi i IMTI wykazało mniejsze obciążenie komórek indukowanych przez obwód syntetyczny, co prawdopodobnie można przypisać ekspresji SDHA. Ponieważ ekspresja SDHA jest związana z produkcją NO, zaobserwowano, że komórki IMTI mają nieregularną i szorstką formę morfologiczną, która występuje w linii komórkowej RAW264.7, gdy wytwarzany jest NO32. Poziomy IL-10 i IL-12 po 6-godzinnym zakażeniu były najwyższe, ponieważ zgłoszono, że obie cytokiny są regulowane w górę w tym punkcie czasowym, który dalej ulega modyfikacji fenotypowej w celu wytworzenia IL-10 więcej niż IL-1219. Ponieważ poziomy IL-10 i IL-12 nie zmieniły się znacząco po transfekcji i w próbkach IMTI, przeprowadzono profilowanie cytokin w celu wykrycia odpowiedzi cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych. 
Poziomy ekspresji TNF-α, IFN-γ i TGF-β zidentyfikowano w 6-godzinnych próbkach infekcji, IMT i 24-godzinnych IMTI. Aby wyeliminować pasożyty wewnątrzkomórkowe, TNF-α i IFN-γ są zasadniczo niezbędne, ponieważ indukują wybuchy oksydacyjne poprzez produkcję NO. Spolaryzowane makrofagi M2 wyrażają TGF-β, który obniża cytokiny prozapalne33. 24-godzinna próbka IMTI wykazała zwiększoną ekspresję TNF-α i IFN-γ niż TGF-β, co sugeruje, że makrofagi po transfekcji i zakażeniu L. major mogły spolaryzować się do fenotypu eksprymującego cytokiny prozapalne. Badanie dostarcza zatem informacji na temat zmian fenotypowych wywołanych podczas transfekcji z obwodem syntetycznym i podkreśla dynamikę infekcji. Wpływ obwodów syntetycznych jako terapeutycznych może być badany, ponieważ ich indukcja znacznie zwiększyła ekspresję cytokin prozapalnych w porównaniu z cytokinami przeciwzapalnymi. W ten sposób badanie nie tylko ustaliło proces budowy i dostarczania obwodu syntetycznego, ale także wykazało jego potencjał terapeutyczny w modelu leiszmaniozy poprzez regulację w górę cytokin prozapalnych w komórkach gospodarza z leiszmanią.

Postęp w medycynie całościowej, integracyjnej jest znaczącym ogniwem, które zostało zidentyfikowane między zmianami metabolicznymi w komórkach odpornościowych a ich zdolnością do modulowania fenotypu komórek odpornościowych w chorobach zakaźnych. Immunometabolizm oferuje nowe perspektywy dla wyjaśnienia patogenezy chorób zakaźnych występujących u ludzi. Co więcej, dostarcza obiecujących technik opracowywania szczepionek i leków, identyfikując nowe cele interwencji1. Przeprogramowanie metaboliczne komórek odpornościowych jest identyfikowane w różnych chorobach zakaźnych, w tym leiszmaniozie. Leishmania spp. jest odpowiedzialny za wywoływanie leiszmaniozy, z czego Leishmania major (L. major) powoduje leiszmaniozę skórną (CL). L. główne pasożyty wywierają znaczący wpływ na metabolizm komórek gospodarza, szczególnie w makrofagach, w celu proliferacji i przetrwania jako pasożyty wewnątrzkomórkowe2. Makrofagi mogą zazwyczaj polaryzować się na klasycznie aktywowane (M1) lub alternatywnie aktywowane (M2) podzbiory, w których komórki M1 mają wysokie wydzielanie cytokin prozapalnych i produkcję tlenku azotu (NO) poprzez metabolizm form azotu. Komórki M2 wykazują podwyższony poziom cytokin przeciwzapalnych i wykazują wysoką aktywność arginazy poprzez metabolizm azotu3. Tak więc oba fenotypy różnią się nie tylko odpowiedzią immunologiczną, ale także szlakami metabolicznymi.
Biologia systemowa leiszmaniozy ma na celu zidentyfikowanie celów molekularnych do projektowania nowych terapii poprzez projektowanie i rozwój leków. Rekonstrukcja sieci sygnałowych i szlaków metabolicznych pomaga w zrozumieniu leiszmaniozy jako modelu holistycznego i dostarcza informacji w celu identyfikacji głównego składnika napędzającego stan chorobowy. Modelowanie matematyczne jest jednym z najbardziej preferowanych stosowanych podejść analitycznych do zrozumienia złożoności leiszmaniozy4. Sieci immunometaboliczne i modele matematyczne umożliwiły identyfikację dehydrogenazy bursztynianowej (SDHA) jako kluczowego składnika fenotypu M1, który ulega ekspresji w celu wyeliminowania pasożyta5. Biologia syntetyczna ma zastosowanie w diagnostyce, opracowywaniu szczepionek i terapii leiszmaniozy. Metabolizm ukierunkowany na modulację odpowiedzi immunologicznej można osiągnąć za pomocą narzędzi biologii syntetycznej. Do modulacji syntazy fosforylowo-ceramidowej inozytolu, która reguluje metabolizm sfingolipidów i zmienia sygnalizację immunologiczną gospodarza, wykorzystano obwód genetyczny, który posiadał zachowanie bistabilne, aby syntetycznie dostroić wewnętrzną odporność L. major infection model6,7. W związku z tym systemy i biologia syntetyczna mogą stanowić opartą na modelach platformę inżynierii genetycznej dla rozwoju medycyny precyzyjnej w systemie modelowym Leishmania.
fenotyp M1 charakteryzuje się ekspresją immuno-metabolicznych sieci sygnalizacyjnych, w których produkcja cytokin zapalnych i szlaków metabolicznych synergistycznie zwiększa eliminację pasożytów. Polaryzacja M1 oznacza wytwarzanie cytokin prozapalnych, takich jak interleukina-12 (IL-12), interferon-gamma (IFN-γ) i czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α). Szlaki metaboliczne, które są wysoko wzbogacone w fenotyp M1, obejmują glikolizę, szlak pentozofosforanowy i skrócony cykl kwasów trikarboksylowych (cykl TCA)5. Skrócony cykl TCA kieruje maszynerią eliminacji pasożytów poprzez zwiększone poziomy bursztynianu i cytrynianu, które kierują produkcją NO3. Akumulacja bursztynianu przez SDHA prowadzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego indukowanego hipoksją czynnika 1-alfa (HIF-1α), który indukuje produkcję IL-1β8. W fenotypie M2 obserwuje się utlenianie kwasów tłuszczowych, wzrost wykorzystania glutaminy i zwiększoną fosforylację oksydacyjną glukozy wraz z produkcją cytokin przeciwzapalnych, takich jak interleukina-10 (IL-10), transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β), interleukina-4 (IL-4) i interleukina-13 (IL-13)3. M2 charakteryzuje się wydłużonymi mitochondriami, co prowadzi do zwiększenia wydajności wytwarzania energii. Wykorzystują kwasy tłuszczowe, glukozę i glutaminę jako substraty do napędzania cyklu TCA, generując w ten sposób ATP poprzez fosforylację oksydacyjną z większą szybkością, aby promować wzrost i proliferację pasożytów9. Enzym SDHA odpowiedzialny za akumulację bursztynianu poprzez skrócony TCA może nie tylko promować produkcję NO, ale także inicjować zależne od bursztynianu zużycie tlenu poprzez transport elektronów10. W makrofagach zakażonych Leishmania, SDHA jest regulowane w dół 2,17-krotnie, co wskazuje, że oddychanie tlenowe może być również obniżone11. Aby zwiększyć spożycie bursztynianu w celu indukowania prozapalnej produkcji NO za pośrednictwem cytokin i promowania eliminacji pasożytów, niezbędna jest ekspresja SDHA.
Syntetyczny obwód oferuje precyzyjnie ukierunkowane terapie, które mogą zmienić chory system w celu osiągnięcia bistabilnej oscylacji, która może przywrócić zdrowy fenotyp na poziomie czasoprzestrzennym. Syntetyczne dostarczanie i ekspresja obwodu sprawiają, że system jest dynamiczny i wytrzymały. Jednym z kluczowych czynników przyczyniających się do postępu biologii syntetycznej jest zdolność do łączenia części i elementów genetycznych w sposób modułowy, aby umożliwić generowanie skomplikowanych architektur i dostosowanych funkcjonalności12. Ograniczenia związane z tradycyjnymi technikami ekspresji pobudziły pojawienie się indukowanych obwodów syntezy plazmidu opartych na operonach tetracyklinowych, umożliwiając w ten sposób szybką ocenę plazmidu i łatwe dostarczanie do różnych typów komórek13. Białko represorowe reagujące na tetracyklinę (TetR), gdy występuje jako dimer, wykazuje silne powinowactwo wiązania do operonu tet (TetO), skutecznie hamując transkrypcję. Jednak w wyniku interakcji jego liganda, doksycykliny (dox), TetR ulega zmianie strukturalnej, w wyniku której dochodzi do dysocjacji od TetO, co w konsekwencji umożliwia niezakłócony przebieg transkrypcji. Ten obwód może wykazywać kontrolę translacji białek14. W związku z tym, dzięki zdefiniowanej metodologii, zaprojektowany obwód syntetyczny indukowalnego plazmidu opartego na operonach tetracyklinowych był w stanie wyrazić SDHA w wektorze pEGFP-N1. Ocena wydajności transformacji obwodu i jego wydajności dostarczyła informacji na temat kompetencji w zakresie dostarczania. Poprzez trawienie restrykcyjne wektora potwierdzono określenie skuteczności klonowania. Ponadto zaobserwowano transfekowaną linię komórkową mysich makrofagów RAW264.7 pochodzącą z makrofagów otrzewnowych myszy Balb / c pod kątem ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) zależnej od dawki doksycykliny w transfekowanych komórkach. Dodatkowo, efekt eliminacji pasożytów w transfekowanych komórkach został potwierdzony ekspresją obwodu syntetycznego. Ponadto zaobserwowano indukcję i ekspresję cytokin prozapalnych, co było ukierunkowane na zwiększenie punktu czasowego infekcji w komórkach transfekowanych i indukowanych w obwodzie syntetycznym, co było bezpośrednio związane z funkcjonowaniem obwodu syntetycznego.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; L końcówki</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X bufor restrykcyjny</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Ograniczenie trawienia</td></tr><tr><td>końcówki</td><td>1 ml Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>1 ml probówka</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L końcówki</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>Kolba 25cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>barwienie jądrowe</td></tr><tr><td>probówka 50 ml</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Talerze 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt Cyjan/Pomarańczowy Bufor ładujący</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>Ładowanie próbek do</td></tr> dolnej <tr><td>płyty szkiełka nakrywkowego AGE 96</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>Do obrazowania konfokalnego i transfekcji</td></tr><tr><td>96-dołkowa mikro płytka testowa dołki płaskie Tarson</td><td></td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>Do montażu</td></tr><tr><td>elektroforezy w żelu agarozowym</td><td>AGE GeNei</td><td>93</td><td>Dla AGE</td></tr><tr><td>Bakteryjny przepływ laminarny</td><td>ESCO Nauki przyrodnicze</td><td>2120765</td><td>Do przemiany</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>Przygotowanie buforu / odczynnika</td></tr><tr><td>Laminarny przepływ powietrza do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Skrobak</td><td>komórkowy Genetix</td><td>90020</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Rozsiewacz komórek</td><td>Fischer Scientific</td><td>12822775</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do probówek 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>EP5404000537</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do 50 ml sokoła</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Chlorofrom</td><td>Fischer Scientific</td><td>67-66-3</td> Do inkubatora CO2 <td>do izolacji RNA</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>3110</td><td>Do kuwety</td></tr> <tr><td></td><td>do hodowli komórkowychEppendorf</td><td>6138000018</td><td>Oznaczanie stężenia plazmidu</td></tr><tr><td>Obrazownik żelowy CYTIVA IQ 500</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>Dla AGE</td></tr><tr><td>DEPC TREATED H2O 1000 ML</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>Do izolacji RNA</td></tr><tr><td>Doksycyklina</td><td>Merck</td><td>33429</td><td>Do indukcji transfekowanych komórek</td></tr><tr><td>Suchy blok grzewczy</td><td>Labnet</td><td></td><td>Do transformacji i inaktywacji enzymów restrykcyjnych</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle</td><td>Krajowe centrum nauk</td><td></td> o <td>komórkach Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>Bufor / Preparat odczynnikowy</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>Dla AGE</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Fischer Scientific</td><td>12635</td><td>Bufor / Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Mikroskop jasnego pola</td><td>Evos ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td> <td>do budowy obwodu syntetycznego</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>16000-044</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FV31S-SW</td><td>Olypmus</td><td></td><td>Akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>1563411</td><td>do transfekcji</td></tr><tr><td>Metoda montażu Gibsona do klonowania</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>Budowa obwodu syntetycznego</td></tr><tr><td>Pryzmat Graphpad</td><td></td><td></td><td>Analiza statystyczna</td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4368814</td><td>do syntezy cDNA</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>13825</td><td>Bufor / Preparat odczynnikowy</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>Do transformacji i selekcji kolonii</td></tr><tr><td>Rosół Luria Bertini</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td>Do hodowli E.coli</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>Bufor / Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Micro Filt Pionowy mikrofilt</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>z laminarnym przepływem powietrzaMicroAmp Fast 8-rurkowy pasek, 0,1 ml</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td><td>Do qRT-PCR</td></tr><tr><td>Optyczne paski MicroAmp z 8 nasadkami</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4323032</td><td>Do qRT-PCR</td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>LG</td><td>MC-7649DW</td><td>Dla AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 (IFN-&gamma;)</td><td>Sondy ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Sondy Taqman</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Sondy Taqman</td></tr><tr><td>Mysz Zestaw ELISA IL-10</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td>Do myszy ELISA</td></tr><tr><td>Zestaw ELISA IL-12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td><td>Dla ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky z ekranem dotykowym + &mu; Płyta opadająca</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td><td>Do mieszalników mikropłytek ELISA</td></tr><tr><td>MX-M 96-dołkowy mieszalnik płytkowy do kultur komórkowych Regulowany 0-1500 obr./min Wytrząsarka laboratoryjna Mieszadło</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narodowe Centrum Biotechnologii Informacyjne</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td><td>do budowy obwodu syntetycznego</td></tr><tr><td>Komora Neubauera</td><td>Marienfeld superior</td><td>640010</td><td>Dla liczby komórek</td></tr><tr><td>Niewentylowana 25cm2 flask</td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Do hodowli pasożytów</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Biodesign</td><td>1QIA</td><td>Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3</td><td>oprogramowanie Olypmus</td><td></td><td>Przetwarzanie obrazu</td></tr><tr><td>Olympus FV 3000</td><td>Olympus</td><td></td><td>Do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Pożywka OPTI-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>do transfekcji</td></tr><tr><td>Wektor pEGFP-N1 sklonowany za pomocą obwodu syntetycznego</td><td>Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>ThermoFischer</td><td>15070063</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Polietylenimina</td><td>MERCK</td><td>764965</td><td>do transfekcji</td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Fischer Scientific</td><td>YBP364500</td><td>Bufor / Preparat odczynnikowy</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP366</td><td>Bufor / Preparat odczynnikowy</td></tr><tr><td>Fosforan potasu monobasic</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Bufor / Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>Dla AGE</td></tr><tr><td>Rejestr standardowych części biologicznych</td><td>https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td>do budowy obwodu syntetycznego</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>Takara</td><td>38220090</td><td>Do izolacji</td></tr><tr><td>RNA RNaza</td><td>A ThermoFischer Scientific</td><td>12091021</td><td>Bufor / Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Narodowe Centrum Nauki</td><td></td> o Komórkach <td>Do hodowli pasożytów</td></tr><tr><td>Inkubator Shaker</td><td>REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>Do hodowli E.coli</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Qualigens</td><td>Q27605</td><td>Bufor / Preparat odczynnikowy</td></tr><tr><td>Dodecyl siarczanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Bufor / Preparat odczynnikowy</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fischer Scientific</td><td>15895</td><td>Bufor / Preparat odczynnikowy</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>Bufor / odczynnik przygotowanie</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Szacowanie stężenia plazmidu</td></tr><tr><td>Spin win</td><td>Trason</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>System Real Time PCR StepOne plus</td><td>Technologie życia</td><td>272006777</td><td>Dla qRT-PCR</td></tr><tr><td>Oprogramowanie StepOne w wersji 2.3</td><td>Life Dla</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), bez AmpErase UNG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>Tinker cell</td><td></td><td></td><td>Budowa i symulacja obwodów syntetycznych</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus Drabinka DNA</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>Dla AGE</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris (hydroksymetyloaminometanu</td>) <td>Himedia</td><td>MB029</td><td>Bufor / Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Tris-acetate-EDTA</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>Bufor / Przygotowanie odczynnika</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr></tbody></table>

obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

Immunometabolizm jest kluczowym czynnikiem wpływającym na postęp leiszmaniozy. Podejście oparte na biologii syntetycznej przyciągnęło znaczną uwagę jako krok w kierunku interwencji terapeutycznej ukierunkowanej na czynniki związane z gospodarzem, które napędzają leiszmaniozę. Biologia syntetyczna pociąga za sobą inżynierię komponentów genetycznych w sposób ortogonalny i modułowy w celu precyzyjnej modulacji systemów biologicznych, nadając komórkom nowe funkcje. W prezentowanym badaniu wyjaśnienie systematycznego procesu rozwoju indukowalnego obwodu syntetycznego opartego na sterowaniu tetracykliną (TetON) miało na celu dostarczenie dehydrogenazy bursztynianowej jako środka terapeutycznego ułatwiającego eliminację wewnątrzkomórkowych pasożytów Leishmania. Przedstawiony protokół opisuje projektowanie obwodu syntetycznego i jego późniejszą walidację. Proponowana strategia koncentruje się również na włączeniu obwodów syntetycznych do szkieletu plazmidu jako nośnika transportowego. Ponadto w liniach komórkowych mysich makrofagów zastosowano maszynerię dostarczającą nanocząstki na bazie polipleksów do dostarczania obwodów syntetycznych bez uszczerbku dla morfologii komórki. Standaryzacja metody została przeprowadzona w celu selekcji transfekowanych komórek i wyznaczenia optymalnego stężenia indukcji dla ekspresji obwodu syntetycznego. Obserwacje wskazują na wyraźne zmniejszenie obciążenia pasożytami wewnątrzkomórkowymi w transfekowanych komórkach w porównaniu z komórkami zakażonymi. Cytokiny prozapalne ulegały ekspresji po zakażeniu w komórkach transfekowanych i indukowanych obwodem syntetycznym jako mechanizm sprzyjający eliminacji pasożytów. Podkreśla to, że metoda oparta na biologii syntetycznej jest skutecznym podejściem w leczeniu leiszmaniozy, ponieważ jest ukierunkowana na czynniki gospodarza związane z postępem choroby.

Układ elementów genetycznych tworzących obwód syntetyczny do ekspresji tego obwodu przedstawiono na (Rysunku 1A). Odpowiednie elementy zostały sklonowane w wektorze pEGFP-N1 w sposób ortogonalny i modułowy, co przedstawiono na Rysunku 1B. Symulacja obwodu syntetycznego ujawniła dynamikę oscylacyjną zarówno dla SDHA, jak i represora tetracykliny. Obserwacja ta sugeruje wzajemny wzorzec ekspresji charakteryzujący się okresowymi funkcjami falowymi. Wzrost stężenia SDHA można przypisać indukcji doksycykliną, podczas gdy ekspresja TetR może wynikać ze spadku poziomu doksycykliny (Rysunek 1C). Biorąc pod uwagę indukowalną oscylacyjną ekspresję SDHA i TetR zaobserwowaną in silico, opracowano i wdrożono strategię dostarczenia obwodu syntetycznego za pomocą plazmidowego wektora pEGFP-N1.
Części iGEM zidentyfikowane na potrzeby badania obejmowały odpowiednio: BBa_K1493803 dla TetO, BBa_K4344028 dla sekwencji Kozaka, BBa_C0040 dla TetR oraz BBa_K1537016 dla P2A. Numer dostępu NCBI dla SDHA to NM_025848. Komponenty te zostały złożone w celu skonstruowania syntetycznego obwodu TetON indukowanego doksycykliną, o łącznej długości 1317 par zasad (Supplementary File 1). Ponieważ TetO pełni funkcję elementu regulacyjnego DNA, jego sekwencja nie została przetłumaczona. Do walidacji translacji in silico wybrano sekwencję znajdującą się za sekwencją Kozaka, rozciągającą się od 5' TetR do końca 3' P2A, umieszczoną za SDHA. Obserwacje wykazały brak wewnętrznych kodonów stop, co zapewnia nieprzerwaną translację wzdłuż całej długości sekwencji (Supplementary File 2). Elementy regulacyjne obwodu syntetycznego o długości 1317 bp zostały wstawione między miejsca restrykcyjne NotI i XhoI, znajdujące się w pozycji 5' powyżej EGFP (Figure 1B). Wyniki sekwencjonowania potwierdzają, że sekwencja wstawki została sklonowana w plazmidzie (Supplementary File 3).
Wprowadzenie obwodu immunometabolicznego do szczepu E. coli DH5α doprowadziło do wzrostu przekształconych kolonii wykazujących odporność na kanamycynę, antybiotyk zastosowany jako marker selekcyjny podczas transformacji bakteryjnej. Duża liczba przekształconych kolonii na płytce selekcyjnej wskazuje, że komórki kompetentne wykazały wysoki potencjał transformacyjny, co świadczy o efektywności zastosowanego protokołu transformacji (Rycina 1D).
Pojedynczą kolonię wyizolowano i zaszczepiono w 10 mL pożywki LB z dodatkiem kanamycyny w celu izolacji plazmidu. Wydajność plazmidu uzyskaną z 10 mL hodowli przedstawiono w Tabeli 1. W procedurze tej zastosowano standardową metodę izolacji plazmidów. Roztwory buforowe przygotowano świeżo w dniu poprzedzającym izolację plazmidu, a warunki inkubacji zoptymalizowano w celu maksymalizacji wydajności plazmidu. Uzyskane stężenie plazmidu przekroczyło 1 µg/µL, a stosunki 260/280 oraz 260/230 przekroczyły odpowiednio 1,8 i 2,0. Wyniki te wskazują, że wyizolowane plazmidy charakteryzowały się wysoką czystością i były wolne od zanieczyszczeń, takich jak białka, EDTA, węglowodany i fenol.
Oceniono przesunięcie mobilności elektroforetycznej dla wyizolowanego obwodu syntetycznego. Trawienie restrykcyjne przeprowadzono przy użyciu enzymów restrykcyjnych NotI i XhoI, ponieważ były to miejsca restrykcyjne, w których wstawiono obwód syntetyczny. Na 1% żelu agarozowym zaobserwowano dwa prążki: jeden w pobliżu 1500 bp i drugi pomiędzy 4 kb a 5 kb. Biorąc pod uwagę, że rozmiar wstawki wynosi 1317 bp, prążek przy 1500 bp prawdopodobnie odpowiada wstawce. Wektor pEGFP-N1 ma rozmiar 4,7 kb. Zatem przyjmuje się, że prążek w pobliżu 5 kb jest wektorem pEGFP-N1. W konsekwencji wyciągnięto wniosek, że w wektorze dostawczym znajdował się kompletny i nienaruszony obwód syntetyczny. Dodatkowo, dla nietrawionego, nienaruszonego obwodu syntetycznego wykryto prążek o wielkości około 6 kb, co wskazuje, że wektor pEGFP-N1 zawiera wstawkę o rozmiarze blisko 1,3 kb w obrębie wektora plazmidowego (Rycina 1E).
<img alt="Schemat syntetycznego obwodu genowego z mapą plazmidu, szalkami z kulturami bakterii, elektroforezą w żelu i wykresem danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Projektowanie i walidacja syntetycznego obwodu. (A) Przedstawienie syntetycznych obwodów poprzez zestawienie części genetycznych i komponentów regulacyjnych. (B) Wykres symulacji deterministycznej pokazujący okresową ekspresję SDHA i TetR w ciągu 100 jednostek czasu. (C) Kolonie E. coli DH5α po transformacji syntetycznym obwodem, oporne na kanamycynę. Jednostką jest 100 jednostek czasu, ponieważ jest to symulacja deterministyczna. (D) Elektroforeza w żelu agarozowym intaktowanego oraz trawionego enzymami restrykcyjnymi NotI i XhoI syntetycznego obwodu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stężenie plazmidu (μg/mL)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wydajność konstrukcji syntetycznego obwodu otrzymanej po izolacji plazmidu. Tabela przedstawia stężenie plazmidu w µg/mL oraz ich stosunki 260/280 i 260/230.
W komórkach kontrolnych i zakażonych obserwowana intensywność fluorescencji GFP była niska. Jednakże stwierdzono, że transfekcja syntetycznego obwodu w stosunku plazmidu do PEI 1:1 z dodatkiem 500 µg/mL G418 oraz indukcja za pomocą 1 µg/µL dox powoduje wysoką ekspresję GFP w komórkach IMT. W komórkach IMTI po 6 h ekspresja GFP była również znacznie wyższa, choć niższa niż w próbce IMT (Rysunek 2A,B). Ponadto zaobserwowano wzrost ekspresji GFP w próbkach IMTI po 12 h, 18 h i 24 h. Wzrost ten może wynikać z wydłużenia czasu zakażenia, co mogło wywołać silniejsze zmiany metaboliczne w makrofagach wywołane przez pasożyta rezydentnego17. Wewnątrzkomórkowe poziomy SDHA mogą ulec zmianie w wyniku wydłużenia czasu zakażenia18. Ponieważ do tych próbek IMTI dodano dox, poziomy SDHA w syntetycznych obwodach mogły wzrosnąć, co doprowadziło do zwiększenia ekspresji SDHA.
Barwienie DAPI wykonano w celu określenia liczby pasożytów rezydujących w makrofagach. W makrofagach zainfekowanych L. major po 6 h zaobserwowana liczba pasożytów wewnątrzkomórkowych wynosiła 6 komórek na makrofag, co jest wartością wyższą w porównaniu z próbką IMTI po 6 h, w której stwierdzono 1-2 pasożyty wewnątrzkomórkowe na makrofag. Po transfekcji i indukcji doksycykliną zaobserwowano znaczną redukcję ładunku pasożytów wewnątrzkomórkowych w różnych punktach czasowych infekcji (Ryc. 2C). Obserwacje sugerują, że syntetyczne obwody mogły wywołać efekt eliminacji pasożytów poprzez stymulację ekspresji SDHA.
<img alt="Analiza infekcji komórek RAW264.7; mikroskopia fluorescencyjna, wykres słupkowy intensywności; kanały DAPI, 488nm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Konfokalna mikroskopia skaningowa. Obrazy próbek kontrolnej, zainfekowanej, IMT oraz IMTI. (A) Analiza ekspresji GFP we wszystkich próbkach eksperymentalnych z paskiem skali 50 µm dla próbek kontrolnej, zainfekowanej po 6 h oraz IMT, 20 µm dla IMTI po 6 h, 10 µm dla IMTI po 12 h, 18 h IMTI oraz 24 h IMTI odpowiednio. Wykorzystane kanały to DIC, DAPI, GFP oraz obrazy scalone ze wszystkich kanałów. (B) Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z testem korekcji Tukeya dla wszystkich próbek eksperymentalnych (n=3) pod kątem ekspresji GFP (za istotne uznano p < 0.05). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. (C) Analiza jednoczynnikową ANOVA z testem korekcji Tukeya dla obciążenia pasożytniczego w 100 komórkach makrofagów dla próbek z punktu (A) (n=3) (za istotne uznano p < 0.05). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Oznaczenie poziomów IL-10 i IL-12 w pożywce wszystkich próbek wykazało, że stężenia IL-10 i IL-12 były najwyższe 6 h po infekcji, z obniżeniem poziomów cytokin po 24 h infekcji. Nie stwierdzono istotnej różnicy w poziomach IL-10 i IL-12 po transfekcji i indukcji obwodów syntetycznych. Odnotowano również nieistotną różnicę w poziomach IL-10 i IL-12 w próbkach w punkcie czasowym IMTI (Rycina 3). Wcześniej wykazano, że próbka zainfekowana przez 6 h wykazuje ekspresję IL-10 i IL-1219,20; zaobserwowanie nieistotnej różnicy w poziomach IL-10 i IL-12 skłoniło nas do zbadania wpływu obwodu syntetycznego na inne cytokiny.
<img alt="Wykres słupkowy poziomów IL-10 i IL-12; analiza stężenia cytokin; p-value&lt;0.0001." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Analiza ELISA dla IL-10 i IL-12 w celu określenia poziomów ich sekrecji w pożywkach z różnych próbek. Próbki (n=2) obejmują grupę kontrolną, próbki zainfekowane przez 6 h, zainfekowane przez 24 h, IMT, IMTI 6 h, IMTI 12 h, IMTI 18 h oraz IMTI 24 h. Przeprowadzono analizę dwukierunkową ANOVA z testem korekcji Tukeya (za istotne uznano p &lt; .05). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Analiza poziomów transkrypcji TNF-α, IFN-γ i TGF-β w próbkach zainfekowanych po 6 h, IMT oraz IMTI po 24 h wykazała, że w próbce IMTI po 24 h zaobserwowano istotny wzrost poziomu TNF-α do 2,5-krotności w porównaniu do próbek zainfekowanych i IMT (Rycina 4). W próbce IMTI po 24 h odnotowano 35-krotny wzrost poziomu IFN-γ w porównaniu do próbek zainfekowanych i IMT. Poziomy TGF-β, mimo istotnej nadekspresji do 1,5-krotności w próbce IMTI po 24 h, wykazały niższą względną zmianę krotności w porównaniu z TNF-α i IFN-γ, co sugeruje, że cytokiny prozapalne ulegają znaczącej nadekspresji w próbce IMTI po 24 h.
<img alt="Wykres słupkowy porównujący względne zmiany krotności dla TNF-α, IFN-γ i TGF-β dla różnych rodzajów infekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Analiza cytokin metodą qRT-PCR. (A) TNF-α, (B) IFN-γ oraz (C) TGF-β dla próbek po 6 h infekcji, IMT oraz 24 h IMTI (n=2). Przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem korekcji Tukeya (p &lt; 0,05 uznano za istotne). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1: Sekwencja nukleotydowa elementów genetycznych złożonych w celu utworzenia syntetycznego obwodu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Przetłumaczona sekwencja syntetycznego obwodu ekspresującego TetR, P2A i SDHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Wynik sekwencjonowania sklonowanego syntetycznego obwodu w plazmidzie pEGFP-N1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Tutaj przedstawiono protokół projektowania, konstruowania i dostarczania sterowanego tetracykliną indukowalnego obwodu syntetycznego. Wpływ obwodów syntetycznych na eliminację pasożytów i ekspresję cytokin można badać poprzez kanalizację prezentowanego rurociągu. Protokół ten jest istotny dla naukowców badających syntetyczne terapie oparte na obwodach w chorobach zakaźnych.

Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

Biologia systemowa oferuje wgląd w sieci biologiczne i mechanizmy w modelach infekcji, podczas gdy biologia syntetyczna umożliwia precyzyjną terapię. Badamy immunometabolizm w głównym zakażeniu Leishmania i potencjał obwodów biosyntetycznych w rozwiązywaniu choroby, rewolucjonizując immunoterapeutykę. W ostatnich latach biologia syntetyczna okazała się bardzo obiecująca w kierunku opracowania nowszych i skutecznych strategii zwalczania leiszmaniozy.Niektóre z najnowszych osiągnięć dotyczą inżynierii syntetycznych cytokin, bistabilnego obwodu syntetycznego CRISPR-Cas9 oraz syntetycznych peptydów jako środków terapeutycznych. Nasz protokół jest ukierunkowany na białko gospodarza, które jest modulowane przez pasożyta w celu jego przetrwania. W ten sposób badamy wpływ na obwód nie tylko na pasożyta, ale także na żywiciela.Ponadto badaliśmy wpływ obwodu syntetycznego na adresowanie funkcji ortogonalności i modularności po dostarczeniu do hosta. Aby rozpocząć, na komputerze otwórz oprogramowanie TinkerCell i kliknij kartę części. Wybierz komponent promotora CMV z biblioteki i umieść go na płótnie, aby symbolizować promotor wirusa cytomegalii w obwodzie syntetycznym.Następnie pobierz miejsce wiązania represora analogicznie do operatora tetracykliny i umieść je obok promotora na płótnie, integrując się z promotorem CMV. Przeciągnij i upuść wewnętrzne miejsca wejścia rybosomów i region kodujący na płótno, integrując je z istniejącymi komponentami genetycznymi. Zmień nazwę regionu kodującego na represor reagujący na tetracyklinę.Połącz te elementy genetyczne, aby ułatwić budowę części syntetycznych. Włączyć obszar dystansowy rozszczepiany przez teschowirusa świń 12A na płótnie. Wprowadź dodatkowy region kodujący, dehydrogenazę bursztynianową lub SDHA, reprezentujący gen będący przedmiotem zainteresowania w syntetycznym konstrukcie i integrujący go z innymi pierwiastkami.W sąsiedztwie regionu kodującego SDHA zintegruj inny region dystansowy, który można rozszczepić przez proteazę komórkową teschowirusa świń 12A. Wprowadź region kodujący reprezentujący gen reporterowy i oznacz go jako GFP do konstruktu. Obok GFP dołącz terminator.Aby zweryfikować powstanie funkcjonalnego obwodu genetycznego, kliknij dowolną część obwodu. Po kliknięciu obwód zmienia kolor na czerwony. Na karcie reakcji przypisz szybkości regulacyjne do represora reagującego na tetracyklinę, SDHA i GFP, aby określić reakcję translacji w obwodzie syntetycznym.Dodaj małą cząsteczkę z zakładki części i nazwij ją doksycykliną. Aby przypisać funkcję falową do doksycykliny, na karcie części i połączenia wybierz wejście, a następnie kliknij wejście falowe. W zakładce reakcja kliknij reakcję na represje.Przeciągnij i upuść szybkość reakcji na płótnie między represorem reagującym na dox a tetracykliną. Aby ustawić kinetykę reakcji między represorem reagującym na dox i tetracyklinę, kliknij dwukrotnie ikonę funkcji falowej na dox i dostosuj doksycyklinę.sin. amplituda do 10.Aby zaimplementować transkrypcyjną reakcję regulacyjną między białkiem represorowym reagującym na tetracyklinę a miejscem wiązania represora, wybierz reakcję z zakładki reakcji i umieść ją na płótnie między represorem reagującym na tetracyklinę a operatorem tetracykliny. Kliknij dwukrotnie każdy składnik i reakcję, aby ustawić początkowe stężenie i parametr do symulacji. Kliknij symulację, wybierz deterministyczny i zasymuluj obwód dla 100 jednostek czasu.Dostosuj wykres symulacji z panelu sterowania i obserwuj wzorzec wykresu dla SDHA i białek represyjnych reagujących na tetracykliny. Otwórz rejestr standardowych części biologicznych, a następnie kliknij szukaj i wprowadź nazwę komponentu genetycznego. Aby uzyskać sekwencję nukleotydową promotora CMV, kliknij na pobierz sekwencję części i zapisz plik jako plik tekstowy.Aby uzyskać sekwencję kodującą białko SDHA, otwórz NCBI i wybierz nukleotyd z listy rozwijanej obok okna wyszukiwania. Wpisz dehydrogenazę bursztynianową i Mus musculus i poszukaj sekwencji nukleotydów. Kliknij opcję CDS, aby uzyskać sekwencję kodowania SDHA i zapisać sekwencję w pliku tekstowym.Sekwencyjnie scal sekwencję nukleotydową wszystkich genetycznych części regulatorowych w jednym pliku. Dodaj kodon start ATG zaraz po sekwencji Kozaka i usuń wewnętrzne kodony stop, aby uniknąć tworzenia powstających polipeptydów. Otwórz stronę Expasy i wklej sekwencję nukleotydów.Kliknij opcję przetłumaczenia sekwencji, a następnie wybierz pięć pierwszych trzech pierwszych klatek pierwszy i usuń kodony stop. Na początek hoduj komórki RAW264.7 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia 90% konfluencji. Przygotować następujące próbki, aby określić efekt eliminacji pasożytów przez indukowany obwód syntetyczny.Zeskrob komórki RAW264.7 z kolby o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze kompletnego podłoża DMEM. Przenieś 10 mikrolitrów zawieszonej zawiesiny komórek do probówki o pojemności 100 mikrolitrów.Dodaj 10 mikrolitrów 0,5% błękitu trypanowego do komórek i dobrze wymieszaj. Załaduj 10 mikrolitrów mieszanki komórek i błękitu trypanowego na szkiełko komory do liczenia komórek i pobierz liczbę komórek z czterech komór. Płytkę dwa razy 10 do potęgi czterech komórek na studzienkę na 96-dołkowej płytce z dnem szkiełka nakrywkowego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.Aby przygotować sześciogodzinną zakażoną próbkę, odwiruj jeden mililitr promastigotów Leishmania major w fazie stacjonarnej w temperaturze 7, 273G przez 10 minut i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach kompletnej pożywki DMEM. Po przeliczeniu dodaj dwa razy 10 do potęgi pięciu promastigotów L.major w 96-dołkowej płytce z dnem szkiełka nakrywkowego. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć godzin.Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie PBS. Aby przygotować próbki IMT i IMTI, hoduj dwa razy 10 do potęgi pięciu promastigotów L.major przez 6, 12, 18 i 24 godziny. W 1,5-mililitrowej probówce dodaj 24 mikrolitry zredukowanej pożywki surowicy i jeden mikrogram syntetycznego plazmidu obwodowego.Do innej 1,5-mililitrowej probówki dodaj 24 mikrolitry zredukowanej pożywki surowicy i jeden mikrolitr polietylenininy lub PEI. Dobrze mieszam, pipetując co najmniej 10 razy i inkubuję w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Przenieś mieszaninę PEI do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej DNA i dobrze wymieszaj.Inkubuj probówkę przez 10 minut. Wyrzuć pożywkę z dołków na dolnej płycie szkiełka pokrywowego z 96 dołkami i umyj komórki trzykrotnie PBS. Za pomocą pipety dodaj kroplami mieszaninę DNA-PEI do komórek i delikatnie potrząśnij płytką.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny. Następnie dodaj do komórek 200 mikrolitrów świeżej zredukowanej pożywki surowicy, delikatnie potrząśnij płytką i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia wyrzuć pożywkę.Po dwukrotnym umyciu komórek PBS, dodać do komórek kompletną pożywkę DMEM zawierającą genetycynę i doksycyklinę i inkubować przez 24 godziny. Symulacja obwodu syntetycznego ujawniła dynamikę oscylacyjną zarówno w SDHA, jak i w represorze tetracykliny. Wprowadzenie obwodu syntetycznego do Escherichia coli DH5-alpha spowodowało, że przekształcone kolonie wykazywały oporność na kanamycynę, co wskazuje na efektywną transformację.Transfekcja z obwodem syntetycznym i indukcja doksycykliną znacznie zwiększyła ekspresję GFP w komórkach IMT w czasie. Po transfekcji i indukcji doksycykliny zaobserwowano znaczne zmniejszenie wewnątrzkomórkowego obciążenia pasożytami w zakażonych makrofagach. Poziomy cytokin interleukiny 10 i interleukiny 12 były najwyższe po sześciu godzinach od zakażenia, bez znaczącej różnicy obserwowanej po transfekcji i indukcji obwodów syntetycznych.W 24-godzinnej próbce IMTI zaobserwowano znaczny wzrost czynnika martwicy nowotworu alfa, interferonu gamma i transformującego czynnika wzrostu beta, co wskazuje na zwiększenie cytokiny prozapalnej.

immunometabolic-circuits-infection-for-advancing-host-directed

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Monocyty są integralnymi składnikami ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego, który polega na metabolizmie glikolitycznym po aktywacji. Opisujemy protokół cytometrii przepływowej do pomiaru ekspresji transportera glukozy i wychwytu glukozy przez całkowite monocyty i subpopulacje monocytów w świeżej krwi pełnej.

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

Ten protokół opisuje, jak zaszczepić myszy C57BL/6J szczepem EGD Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) i zmierzyć odpowiedzi interferonu γ (IFN-γ) przez komórki NK (natural killer), limfocyty T (NKT) i adaptacyjne limfocyty T po zakażeniu. Protokół ten opisuje również, w jaki sposób przeprowadzać badania przeżycia u myszy po zakażeniu zmodyfikowaną dawką LD50 patogenu.

Eksperymentalne zakażenie Listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza

Ten protokół opisuje szczegółowy proces generowania i charakterystyki ex vivo wirusów onkolitycznych do ekspresji immunomodulatorów, używając jako przykładu wirusów odry kodujących bispecyficzne aktywatory limfocytów T. Zastosowanie i adaptacja do innych platform wektorowych i transgenów przyspieszy rozwój nowych immunowirusoterapeutyków do translacji klinicznej.

Paramyksowirusy w immunomodulacji ukierunkowanej na nowotwór: projektowanie i ocena ex vivo

Opisujemy ludzką komórkę jednojądrzastą krwi obwodowej (PBMC) — humanizowany model myszy ksenoprzeszczepu do translacyjnych badań immunoonkologicznych. Protokół ten może służyć jako ogólna wskazówka do ustanawiania i charakteryzowania podobnych modeli oceny terapii I-O.

Humanizowany model ksenoprzeszczepu z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) do badań immunoonkologicznych translacyjnych (I-O)

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Testy immunologiczne oparte na krwi pełnej dostarczają łatwego i zasobooszczędnego narzędzia do analizy odporności specyficznej dla antygenu do celów diagnostycznych i badawczych. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół oparty na krwi pełnej z podwójną kostymulacją do kompleksowej analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe, w tym wersję o małej objętości dla pacjentów pediatrycznych i małych zwierząt.

Test krwi pełnej z podwójną kostymulacją do specyficznej dla antygenu analizy odporności gospodarza na patogeny grzybowe i wirusowe

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

Poznaj projektowanie i dostarczanie indukowalnych obwodów syntetycznych kontrolowanych tetracykliną w zakażeniach Leishmania major. Ta metoda umożliwia badanie eliminacji pasożyta i ekspresji cytokin w terapii immunometabolicznej.

Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

Przeglądaj więcej filmów