Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

Biologia systemowa oferuje wgląd w sieci biologiczne i mechanizmy w modelach infekcji, podczas gdy biologia syntetyczna umożliwia precyzyjną terapię. Badamy immunometabolizm w głównym zakażeniu Leishmania i potencjał obwodów biosyntetycznych w rozwiązywaniu choroby, rewolucjonizując immunoterapeutykę. W ostatnich latach biologia syntetyczna okazała się bardzo obiecująca w kierunku opracowania nowszych i skutecznych strategii zwalczania leiszmaniozy.

Niektóre z najnowszych osiągnięć dotyczą inżynierii syntetycznych cytokin, bistabilnego obwodu syntetycznego CRISPR-Cas9 oraz syntetycznych peptydów jako środków terapeutycznych. Nasz protokół jest ukierunkowany na białko gospodarza, które jest modulowane przez pasożyta w celu jego przetrwania. W ten sposób badamy wpływ na obwód nie tylko na pasożyta, ale także na żywiciela.

Ponadto badaliśmy wpływ obwodu syntetycznego na adresowanie funkcji ortogonalności i modularności po dostarczeniu do hosta. Aby rozpocząć, na komputerze otwórz oprogramowanie TinkerCell i kliknij kartę części. Wybierz komponent promotora CMV z biblioteki i umieść go na płótnie, aby symbolizować promotor wirusa cytomegalii w obwodzie syntetycznym.

Następnie pobierz miejsce wiązania represora analogicznie do operatora tetracykliny i umieść je obok promotora na płótnie, integrując się z promotorem CMV. Przeciągnij i upuść wewnętrzne miejsca wejścia rybosomów i region kodujący na płótno, integrując je z istniejącymi komponentami genetycznymi. Zmień nazwę regionu kodującego na represor reagujący na tetracyklinę.

Połącz te elementy genetyczne, aby ułatwić budowę części syntetycznych. Włączyć obszar dystansowy rozszczepiany przez teschowirusa świń 12A na płótnie. Wprowadź dodatkowy region kodujący, dehydrogenazę bursztynianową lub SDHA, reprezentujący gen będący przedmiotem zainteresowania w syntetycznym konstrukcie i integrujący go z innymi pierwiastkami.

W sąsiedztwie regionu kodującego SDHA zintegruj inny region dystansowy, który można rozszczepić przez proteazę komórkową teschowirusa świń 12A. Wprowadź region kodujący reprezentujący gen reporterowy i oznacz go jako GFP do konstruktu. Obok GFP dołącz terminator.

Aby zweryfikować powstanie funkcjonalnego obwodu genetycznego, kliknij dowolną część obwodu. Po kliknięciu obwód zmienia kolor na czerwony. Na karcie reakcji przypisz szybkości regulacyjne do represora reagującego na tetracyklinę, SDHA i GFP, aby określić reakcję translacji w obwodzie syntetycznym.

Dodaj małą cząsteczkę z zakładki części i nazwij ją doksycykliną. Aby przypisać funkcję falową do doksycykliny, na karcie części i połączenia wybierz wejście, a następnie kliknij wejście falowe. W zakładce reakcja kliknij reakcję na represje.

Przeciągnij i upuść szybkość reakcji na płótnie między represorem reagującym na dox a tetracykliną. Aby ustawić kinetykę reakcji między represorem reagującym na dox i tetracyklinę, kliknij dwukrotnie ikonę funkcji falowej na dox i dostosuj doksycyklinę.sin. amplituda do 10.

Aby zaimplementować transkrypcyjną reakcję regulacyjną między białkiem represorowym reagującym na tetracyklinę a miejscem wiązania represora, wybierz reakcję z zakładki reakcji i umieść ją na płótnie między represorem reagującym na tetracyklinę a operatorem tetracykliny. Kliknij dwukrotnie każdy składnik i reakcję, aby ustawić początkowe stężenie i parametr do symulacji. Kliknij symulację, wybierz deterministyczny i zasymuluj obwód dla 100 jednostek czasu.

Dostosuj wykres symulacji z panelu sterowania i obserwuj wzorzec wykresu dla SDHA i białek represyjnych reagujących na tetracykliny. Otwórz rejestr standardowych części biologicznych, a następnie kliknij szukaj i wprowadź nazwę komponentu genetycznego. Aby uzyskać sekwencję nukleotydową promotora CMV, kliknij na pobierz sekwencję części i zapisz plik jako plik tekstowy.

Aby uzyskać sekwencję kodującą białko SDHA, otwórz NCBI i wybierz nukleotyd z listy rozwijanej obok okna wyszukiwania. Wpisz dehydrogenazę bursztynianową i Mus musculus i poszukaj sekwencji nukleotydów. Kliknij opcję CDS, aby uzyskać sekwencję kodowania SDHA i zapisać sekwencję w pliku tekstowym.

Sekwencyjnie scal sekwencję nukleotydową wszystkich genetycznych części regulatorowych w jednym pliku. Dodaj kodon start ATG zaraz po sekwencji Kozaka i usuń wewnętrzne kodony stop, aby uniknąć tworzenia powstających polipeptydów. Otwórz stronę Expasy i wklej sekwencję nukleotydów.

Kliknij opcję przetłumaczenia sekwencji, a następnie wybierz pięć pierwszych trzech pierwszych klatek pierwszy i usuń kodony stop. Na początek hoduj komórki RAW264.7 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia 90% konfluencji. Przygotować następujące próbki, aby określić efekt eliminacji pasożytów przez indukowany obwód syntetyczny.

Zeskrob komórki RAW264.7 z kolby o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze kompletnego podłoża DMEM. Przenieś 10 mikrolitrów zawieszonej zawiesiny komórek do probówki o pojemności 100 mikrolitrów.

Dodaj 10 mikrolitrów 0,5% błękitu trypanowego do komórek i dobrze wymieszaj. Załaduj 10 mikrolitrów mieszanki komórek i błękitu trypanowego na szkiełko komory do liczenia komórek i pobierz liczbę komórek z czterech komór. Płytkę dwa razy 10 do potęgi czterech komórek na studzienkę na 96-dołkowej płytce z dnem szkiełka nakrywkowego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.

Aby przygotować sześciogodzinną zakażoną próbkę, odwiruj jeden mililitr promastigotów Leishmania major w fazie stacjonarnej w temperaturze 7, 273G przez 10 minut i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach kompletnej pożywki DMEM. Po przeliczeniu dodaj dwa razy 10 do potęgi pięciu promastigotów L.major w 96-dołkowej płytce z dnem szkiełka nakrywkowego. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez sześć godzin.

Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie PBS. Aby przygotować próbki IMT i IMTI, hoduj dwa razy 10 do potęgi pięciu promastigotów L.major przez 6, 12, 18 i 24 godziny. W 1,5-mililitrowej probówce dodaj 24 mikrolitry zredukowanej pożywki surowicy i jeden mikrogram syntetycznego plazmidu obwodowego.

Do innej 1,5-mililitrowej probówki dodaj 24 mikrolitry zredukowanej pożywki surowicy i jeden mikrolitr polietylenininy lub PEI. Dobrze mieszam, pipetując co najmniej 10 razy i inkubuję w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Przenieś mieszaninę PEI do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej DNA i dobrze wymieszaj.

Inkubuj probówkę przez 10 minut. Wyrzuć pożywkę z dołków na dolnej płycie szkiełka pokrywowego z 96 dołkami i umyj komórki trzykrotnie PBS. Za pomocą pipety dodaj kroplami mieszaninę DNA-PEI do komórek i delikatnie potrząśnij płytką.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy godziny. Następnie dodaj do komórek 200 mikrolitrów świeżej zredukowanej pożywki surowicy, delikatnie potrząśnij płytką i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia wyrzuć pożywkę.

Po dwukrotnym umyciu komórek PBS, dodać do komórek kompletną pożywkę DMEM zawierającą genetycynę i doksycyklinę i inkubować przez 24 godziny. Symulacja obwodu syntetycznego ujawniła dynamikę oscylacyjną zarówno w SDHA, jak i w represorze tetracykliny. Wprowadzenie obwodu syntetycznego do Escherichia coli DH5-alpha spowodowało, że przekształcone kolonie wykazywały oporność na kanamycynę, co wskazuje na efektywną transformację.

Transfekcja z obwodem syntetycznym i indukcja doksycykliną znacznie zwiększyła ekspresję GFP w komórkach IMT w czasie. Po transfekcji i indukcji doksycykliny zaobserwowano znaczne zmniejszenie wewnątrzkomórkowego obciążenia pasożytami w zakażonych makrofagach. Poziomy cytokin interleukiny 10 i interleukiny 12 były najwyższe po sześciu godzinach od zakażenia, bez znaczącej różnicy obserwowanej po transfekcji i indukcji obwodów syntetycznych.

W 24-godzinnej próbce IMTI zaobserwowano znaczny wzrost czynnika martwicy nowotworu alfa, interferonu gamma i transformującego czynnika wzrostu beta, co wskazuje na zwiększenie cytokiny prozapalnej.