Name: Obrazowanie molekularne organoidów ludzkiego mózgu za pomocą spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj obrazowanie masowe organoidów mózgu w celu szczegółowej analizy metabolitów. Ta metoda umożliwia badanie neurogenezy i identyfikację potencjalnych celów terapeutycznych w zaburzeniach rozwoju nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Maletic-Savatic, szczególnie Danielle Mendonca, doktorantce, za pomocne dyskusje i komentarze na temat tej pracy, a także Baylor College of Medicine Advanced Technology Core wsparcie NMR i Drug Metabolism Core. Prace te były częściowo wspierane przez granty z Narodowego Instytutu Zdrowia Psychicznego (1R01MH130356 dla M.M.S.), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R61/R33HD099995 dla F. L.), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development of the National Institutes of Health (P50HD103555) na korzystanie z obiektu Microscopy Core. placówka Pathology Core oraz placówka Human Disease Cellular Models Core. Ponadto praca ta została częściowo sfinansowana z funduszy federalnych z Instytutu Badań Translacyjnych ds. Zdrowia Kosmicznego za pośrednictwem NASA Cooperative Agreement NNX16AO69A, grantu RAD01013 (M.M.S), NASA w ramach kontraktu 80ARC023CA004 zatytułowanego "MORPH: Multi-Organ Repair Post Hypoxia" (M.M.S.) oraz Autism Speaks (G.C.), Nagroda Pilotażowa Fundacji Simonsa (M.M.S.)oraz Cynthia i Antony Petrello 
Uposażenie (M.M.S.).

Ogólne przepełnienie protokołu jest przedstawione w Rysunek 1. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie sekcji organoidów mózgowych
<ol>
	<li>Przygotuj organoidy mózgowe (o wielkości 2-3 mm, gdy osiągną 30-60 dni w hodowli) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami23,24 i zbierz je w wybranym czasie, używając końcówek o szerokim otworze.
	<ol>
		<li>Przygotowane organoidy przemyć trzykrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco bez CaCl2 i MgCl2 w temperaturze pokojowej w celu przepłukania pożywki, a następnie bardzo szybko wodą destylowaną o temperaturze pokojowej w celu wypłukania wszelkich soli z DPBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 10% roztwór żelatyny z zimnej skóry ryby, mieszając i podgrzewając żelatynę (10 mg w 100 ml DPBS) w temperaturze 70-80 °C przez 2 godziny, następnie przenieść roztwór do inkubatora o temperaturze 37 °C na 30 minut w celu usunięcia pęcherzyków i wyrównać do temperatury inkubatora, w którym hodowano organoidy. 
	UWAGA: Zaleca się przygotowanie żelatyny na świeżo do każdego eksperymentu, ale w razie potrzeby można ją stosować do 1 tygodnia (przechowywać w temperaturze 4 °C). Żelatyna zestala się w temperaturze pokojowej i musi zostać podgrzana przed użyciem jako roztwór do zatapiania, aby stała się płynna.</li>
	<li>Przygwoźdź organoid w środku plastikowej formy (25 mm x 20 mm x 5 mm) za pomocą małej końcówki pipety i delikatnie wlej 10% roztwór do zatapiania żelatyny do formy, aż organoid zostanie całkowicie zanurzony (pleśń powinna być wypełniona w przybliżeniu do połowy).
	<ol>
		<li>Umieść formę na szalce Petriego na suchym lodzie zawierającym zimny 100% etanol, aby szybko ją zamrozić (1-2 min). Po całkowitym zamrożeniu, o czym świadczy zmiana koloru na jednolicie biały, wyjmij blok organoidowo-żelatynowy z szalki Petriego, zawiń go w folię aluminiową lub umieść w blaszanym kubku, szczelnie zamkniętym, aby zapobiec zagęszczeniu wody, i przechowuj w temperaturze -80°C do momentu przygotowania do kriosekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu kriosekcji należy umieścić plastikowe bloki zawierające organoidy w komorze kriogenicznej w temperaturze od -20 °C do -25 °C na 10-15 minut, aby zrównoważyć się z temperaturą komory. Pokrój organoidy na sekcje o wielkości 14 μm za pomocą kriotomu i rozmrażaj na szkiełkach szklanych pokrytych tlenkiem indu i cyny (ITO) dla MSI.</li>
	<li>Albo natychmiast zeskanuj strukturalnie jednorodne skrawki w spektrometrze mas, albo zamknij je w pojemniku i przechowuj w temperaturze -80°C do późniejszych badań.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i zastosowanie matrycy dla MALDI-MSI
<ol>
	<li>W przypadku MALDI-MSI spryskaj szkiełka i pokryj skrawki tkanki matrycą, związkiem organicznym, który pomaga jonizować różne metabolity25. Do obrazowania różnych gatunków cząsteczek stosuje się różne matryce; Dlatego najpierw należy wybrać najbardziej odpowiednią matrycę do badania. 
	UWAGA: Badanie to koncentrowało się na lokalizacji i dystrybucji małych metabolitów i aminokwasów związanych z mitochondrialnymi szlakami metabolicznymi, a matryca została odpowiednio dobrana (w celu mapowania lipidów patrz Cappuccio i wsp.)15.</li>
	<li>Po pierwsze, po wyjęciu szkiełek ITO z temperatury -80 °C, należy natychmiast umieścić szkiełko w eksykatorze na 20 minut, aby zminimalizować kondensację wody atmosferycznej na powierzchniach.</li>
	<li>Przygotować dichlorowodorek N-(1-naftylo)etylenodiaminy (NEDC), który jest odpowiednią matrycą dla małych metabolitów, ponieważ daje silny sygnał interesującego analitu bez zakłócania sygnałów tła poniżej m/z 500 Da26. Rozpylić 10 mg/ml roztworu NEDC w 70% metanolu na skrawki organoidów po wysuszeniu szkiełka za pomocą podgrzewanego opryskiwacza pneumatycznego.</li>
	<li>Ustaw parametry opryskiwacza matrycowego w następujący sposób: temperatura dyszy = 75 °C, prędkość dyszy = 1 250 mm/min, natężenie przepływu pompy = 100 μL/min, liczba przejść = 8, rozstaw ścieżek = 2,5 mm, natężenie przepływu gazu 3 l/min, czas suszenia = 10 s i ciśnienie azotu 10 psi.</li>
</ol>
3. Oprzyrządowanie MALDI-MSI
<ol>
	<li>Aby uzyskać platformę MALDI-MSI o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji metabolitów organoidów mózgowych, należy zamontować źródło jonów MALDI z dwujonowym interfejsem lejkowym do spektrometru masowego.</li>
	<li>Użyj podłączonego lasera Nd z przełączaniem Q i potrojonej częstotliwości o długości fali 349 nm, częstotliwości powtarzania 1 kHz i energii impulsu około 1,3-1,4 μJ.</li>
	<li>Aby uniknąć nadmiernego próbkowania, należy skupić laser na plamce o średnicy ~15 μm.</li>
	<li>Podłączyć próbkę do stolika wtryskiwacza MALDI. Eksploatuj i utrzymuj lejek jonów wysokociśnieniowych na poziomie 7.4-7.5 Torr i utrzymuj lejek jonów niskociśnieniowych na poziomie 1.6-1.8 Torr.</li>
	<li>Przyłóż napięcia o częstotliwości radiowej 604 kHz, 80 V0 - szczyt i 780 kHz, 191 V0 - szczyt odpowiednio do lejków jonowych wysokiego i niskiego ciśnienia.</li>
	<li>Aby poprawić czułość dla małych metabolitów w zakresie niskiej masy, należy zmniejszyć amplitudy RF w lejku niskiego i wysokiego ciśnienia źródła MALDI-MSI odpowiednio do około 20% i 15%.</li>
	<li>Ustaw rozdzielczość masową na 70 000. Wybierz obszar i rozmiar piksela (25 μm/piksel) do pomiaru w oprogramowaniu wtryskiwacza MALDI.</li>
</ol>
4. Akwizycja i analiza danych MALDI-MSI
<ol>
	<li>Pozyskiwanie danych w zakresie m/z 80-900 zarówno w trybie jonów ujemnych, jak i dodatnich. Skanuj próbki z rozdzielczością poprzeczną 25 μm na piksel dla przekrojów organoidów 14 μm.</li>
	<li>Ustaw czas wtrysku jonów na spektrometrze mas na 250 ms i uzyskaj widma masowe z transformacją Fouriera (FTMS) w trybie profilu, gdy automatyczna kontrola wzmocnienia (AGC) jest wyłączona26.</li>
	<li>Piki matrycy NEDC można wykorzystać jako wewnętrzną kalibrację masy w trybie online, co pozwala uzyskać dokładność masy lepszą niż ±5 ppm.</li>
	<li>Do przetwarzania danych należy używać kompatybilnego oprogramowania. Zaimportuj dane spektralne MSI bezpośrednio do oprogramowania, a następnie wykonaj korekcję linii bazowej za pomocą algorytmu konwolucji i znormalizuj dane za pomocą całkowitej liczby jonów (TIC).</li>
	<li>Wygeneruj listę cech obrazów jonowych z surowych plików danych, używając szerokości przedziału Δm/z = 0,01 lub ±5 ppm, aby rozróżnić obrazy m/z na podstawie defektu masy i pokrycia pikseli.</li>
	<li>Generuj obrazy w sztucznych kolorach (Jet) lub RGB (czerwono-zielone i niebieskie) z poszczególnych rodzajów jonów metabolitów. Prześlij listę m/z plików danych surowych uzyskanych z MALDI-MSI do bazy danych ludzkiego metabolizmu (HMDB) (tolerancja masy <5 ppm w stosunku do teoretycznej m/z) w celu identyfikacji metabolitów. 
	UWAGA: Dokładna masa oraz przewidywany wzór i struktura metabolitu uzyskane z danych LC-MS/MS są również wykorzystywane do przeszukiwania baz danych metabolomicznych (np. HMDB, Metlin) w celu porównania i identyfikacji metabolitów.</li>
</ol>

 Advanced MALDI-MSI Mapping of Metabolites in Brain Organoids

<ol><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+Organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: Organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Takebe, T., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids by design.</a> Science. 364 (6444), 956-959 (2019).</li>
<li>Sandoval, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+in+human+brain+organoid+research%3A+Where+we+are+and+where+we+need+to+go%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility in human brain organoid research: Where we are and where we need to go.</a> Stem Cell Rep. 19 (6), 796-816 (2024).</li>
<li>Dei-Ampeh, A. K., Shah, M., Cappuccio, G., Young, D. W., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+models+as+new+tools+for+drug+development+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Phenotyping+of+Human+iPSC-derived+Neurons%22%5BJournal%5D)">Human models as new tools for drug development and precision medicine.</a> Phenotyping of Human iPSC-derived Neurons. , 155-171 (2023).</li>
<li>Choi, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+mammalian+brain+reveals+regional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Sys+Bio%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of mammalian brain reveals regional differences.</a> BMC Sys Bio. 12 (S8), 127(2018).</li>
<li>Kandel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oleic+acid+is+an+endogenous+ligand+of+TLX%2FNR2E1+that+triggers+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Oleic acid is an endogenous ligand of TLX/NR2E1 that triggers hippocampal neurogenesis.</a> PNAS. 119 (13), e2023784119(2022).</li>
<li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+platforms+and+techniques+to+study+stem+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analytical platforms and techniques to study stem cell metabolism.</a> Methods Mol Biol. 1842, 265-281 (2018).</li>
<li>Chen, K., Baluya, D., Tosun, M., Li, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry%3A+A+new+tool+to+assess+molecular+underpinnings+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry: A new tool to assess molecular underpinnings of neurodegeneration.</a> Metabolites. 9 (7), 135(2019).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+for+spatially+resolved+multi-omics+molecular+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Imaging%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging for spatially resolved multi-omics molecular mapping.</a> NPJ Imaging. 2 (1), (2024).</li>
<li>Spruill, M. L., Maletic-Savatic, M., Martin, H., Li, F., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+analysis+of+drug+absorption%2C+distribution%2C+metabolism%2C+and+toxicology+using+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Spatial analysis of drug absorption, distribution, metabolism, and toxicology using mass spectrometry imaging.</a> Biochem Pharmacol. 201, 115080(2022).</li>
<li>Sekera, E. R., Akkaya-Colak, K. B., Lopez, A., Mihaylova, M. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+histology+for+the+analysis+of+budding+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and histology for the analysis of budding intestinal organoids.</a> Anal Chem. 96 (10), 4251-4258 (2024).</li>
<li>Wang, Y., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS+imaging+of+multicellular+tumor+spheroids+and+organoids+as+an+emerging+tool+for+personalized+medicine+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">MS imaging of multicellular tumor spheroids and organoids as an emerging tool for personalized medicine and drug discovery.</a> J Biol Chem. 297 (4), 101139(2021).</li>
<li>Bakker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+ductal+epithelial+organoids+for+high-spatial-resolution+molecular+profiling+using+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparing ductal epithelial organoids for high-spatial-resolution molecular profiling using mass spectrometry imaging.</a> Nat Protoc. 17 (4), 962-979 (2022).</li>
<li>Cappuccio, G., Khalil, S. M., Osenberg, S., Li, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+as+an+emerging+tool+for+studying+metabolism+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Molecular+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging as an emerging tool for studying metabolism in human brain organoids.</a> Front Molecular Biosci. 10, 1181965(2023).</li>
<li>Khalil, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+Imaging+mass+spectrometry+visualizes+the+distribution+of+antidepressant+duloxetine+and+its+major+metabolites+in+mouse+brain%2C+liver%2C+kidney%2C+and+spleen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">MALDI Imaging mass spectrometry visualizes the distribution of antidepressant duloxetine and its major metabolites in mouse brain, liver, kidney, and spleen tissues.</a> Drug Metab Dispos. 52 (7), 673(2024).</li>
<li>Swales, J. G., Hamm, G., Clench, M. R., Goodwin, R. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+and+its+application+in+pharmaceutical+research+and+development%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging and its application in pharmaceutical research and development: A concise review.</a> Int J Mass Spectrom. 437, 99-112 (2019).</li>
<li>Müller, W. H., Verdin, A., De Pauw, E., Malherbe, C., Eppe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+imaging%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging: A review.</a> Mass Spectrom Rev. 41 (3), 373-420 (2022).</li>
<li>Langridge, J. I., Claude, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+and+desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry+coupled+to+ion+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption and desorption electrospray ionization mass spectrometry coupled to ion mobility.</a> Methods Mol Biol. 2084, 245-265 (2020).</li>
<li>Khalil, S. M., Römpp, A., Pretzel, J., Becker, K., Spengler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+topography+of+whole-body+sections+of+the+Anopheles+stephensi+mosquito%2C+characterized+by+high-resolution+atmospheric-pressure+scanning+microprobe+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid topography of whole-body sections of the Anopheles stephensi mosquito, characterized by high-resolution atmospheric-pressure scanning microprobe matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging.</a> Anal Chem. 87 (22), 11309-11316 (2015).</li>
<li>Khalil, S. M., Sprenger, R. R., Hermansson, M., Ejsing, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDA-imaging+with+structural+identification+of+lipid+molecules+on+an+Orbitrap+Velos+Pro+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">DDA-imaging with structural identification of lipid molecules on an Orbitrap Velos Pro mass spectrometer.</a> J Mass Spectrom. 57 (9), e4882(2022).</li>
<li>Bender, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+method+for+MALDI+mass+spectrometry+imaging+of+fresh-frozen+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Sample preparation method for MALDI mass spectrometry imaging of fresh-frozen spines.</a> Anal Chem. 95 (47), 17337-17346 (2023).</li>
<li>Paşca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Qian, X., Song, H., Ming, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids%3A+Advances%2C+applications+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain organoids: Advances, applications and challenges.</a> Development. 146 (8), dev166074(2019).</li>
<li>Ferguson, C. N., Fowler, J. W. M., Waxer, J. F., Gatti, R. A., Loo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+tissue+imaging+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mass+Spectrom+Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based tissue imaging of small molecules.</a> Adv Mass Spectrom Biomed Res. 806, 283-299 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+imaging+of+metabolites+with+a+N+-%281-Naphthyl%29+Ethylenediamine+Dihydrochloride+matrix+and+its+application+to+colorectal+cancer+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS imaging of metabolites with a N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride matrix and its application to colorectal cancer liver metastasis.</a> Anal Chem. 87 (1), 422-430 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Udoskonalony protokół MALDI-MSI o wysokiej rozdzielczości organoidów ludzkiego mózgu skrupulatnie uwzględnia kluczowe kroki w celu zapewnienia wiarygodności wyników. Konserwacja próbki staje się najważniejsza, a aby uniknąć pękania i uszkodzenia tkanek, proponuje się alternatywną metodę zamrażania, obejmującą podgrzany roztwór do zatapiania i etanol chłodzony suchym lodem. Protokół ten działa najlepiej w przypadku tkanek o niewielkich rozmiarach, takich jak organoidy ludzkiego mózgu15. Materiały do zatapiania, takie jak związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zatapianie parafiny utrwalanej w formalinie (FFPE), są ostrzegane ze względu na ich zakłócenia w osadzaniu i jonizacji matrycy. Zamiast tego, 10% żelatyna z zimnej skóry ryb jest podkreślana jako optymalne rozwiązanie do zatapiania, pokazując jej skuteczność w zachowaniu integralności tkanek podczas kriosekcji15. Ponadto wybór matrycy i technik jej osadzania, takich jak natryskiwanie na sucho, jest niezbędny, aby zminimalizować delokalizację małych metabolitów o niskiej m/z i zwiększyć rozdzielczość obrazu.
Solidność i niezawodność protokołu potwierdza udane wykrycie i wizualizacja szerokiego spektrum cząsteczek w organoidach ludzkiego mózgu15, co dostarczyło bezcennych informacji na temat ich rozmieszczenia przestrzennego i potencjalnego znaczenia biologicznego. Odkrycia te znacznie poszerzają wiedzę na temat skomplikowanego krajobrazu molekularnego w organoidach mózgowych, wyjaśniając kluczowe szlaki sygnałowe i procesy metaboliczne leżące u podstaw rozwoju i funkcjonowania mózgu.
Podczas gdy obecne dane dostarczają nowych informacji na temat lokalizacji różnych gatunków, źródło obrazowania Spectroglyph MALDI użyte w tym badaniu nie osiągnęło jeszcze rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki (obecnie na poziomie ~10-20 μm). Inne platformy, takie jak timsTOF firmy Bruker i MRT firmy Water, mogą zapewnić rozdzielczość pojedynczej komórki na poziomie 5 μm, dlatego ważne jest, aby pamiętać o instrumencie, który ma być używany do eksperymentów.
Pomimo tych ograniczeń, HR-MALDI-MSI organoidów mózgowych o wysokiej rozdzielczości jest bardzo obiecujący. Możliwość mapowania rozkładu metabolitów i lipidów w organoidach stanowi unikalny punkt na temat trajektorii losu komórek metabolicznych, szlaków i odrębnych sygnatur kluczowych dla rozwoju i dojrzewania organoidów. Metodologia ta służy jako pomost między konwencjonalną histologią a analizą molekularną, ułatwiając głębsze zrozumienie wzajemnych powiązań między genomem, fenomem i reakcjami środowiskowymi.
Podsumowując, zoptymalizowany protokół HR-MALDI-MSI organoidów ludzkiego mózgu stanowi cenny atut dla naukowców badających modele organoidów. Metoda ta kładzie podwaliny pod dalsze wyjaśnienie zawiłości molekularnych leżących u podstaw rozwoju i funkcjonowania mózgu poprzez skrupulatne zajmowanie się krytycznymi krokami, rozwiązywanie problemów i uznawanie ograniczeń. Wraz z ewolucją i coraz większą dostępnością technologii MSI, jest ona gotowa do pogłębienia naszej wiedzy na temat wczesnego rozwoju człowieka, modelowania chorób i odkrywania leków.

Modele organoidowe, pochodzące z pierwotnych komórek macierzystych tkanki, embrionalnych komórek macierzystych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)1,2,3 prowadzą zaawansowane badania w dziedzinie biologii człowieka, oferując trójwymiarowe modele, które ściśle naśladują funkcje specyficzne dla narządów, pomagając w badaniu rozwoju człowieka, mechanizmów chorobowych i odkrywania leków4,5. W tym kontekście, odkrycie zawiłości organoidów mózgowych jest kluczowe dla zrozumienia zarówno fizjologicznego, jak i patologicznego rozwoju mózgu6,7, wymagające technologii, takich jak obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI)8,9. MSI, w odróżnieniu od tradycyjnej spektrometrii mas, umożliwia bezpośrednie, bezznacznikowe mapowanie setek do tysięcy biomolekuł w jednym przekroju tkanki, zapewniając szczegółowy wgląd w przestrzenny rozkład cząsteczek - takich jak lipidy, peptydy, aminokwasy, leki i ich metabolity - bez potrzeby stosowania specjalnych sond molekularnych10,11. Co więcej, obrazy molekularne MSI mogą być rejestrowane na odcinkach histologicznych i barwionych immunologicznie, zapewniając kompleksowy wgląd w morfologię tkanki, specyficzność komórek i zawartość molekularną.
MSI jest bardzo obiecujące dla badań nad organoidami, oferując wgląd w molekularne podstawy chorób, zależności genetyczno-fenotypowe i reakcje na bodźce środowiskowe12,13,14,15. W przemyśle farmaceutycznym MSI ułatwia analizy wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i eliminacji leków w modelach przedklinicznych11,16. Ponadto pomaga w rozwiązywaniu ich biotransformowanych metabolitów, które mogą być farmakologicznie aktywne17.
Wśród metod MSI przeważają desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI), jonizacja elektrorozpylaniem desorpcji (DESI) oraz spektrometria mas jonów wtórnych (SIMS)9,18,19,20,21. Spośród nich MALDI-MSI wyróżnia się wszechstronnością, szerokim zakresem masy, możliwościami bezpośredniej analizy i kompatybilnością z różnymi związkami chemicznymi specyficznymi dla tkanki22. Jednak pomimo swojego potencjału, zastosowanie MALDI-MSI w badaniach nad organoidami mózgowymi pozostaje niedostatecznie zbadane. Aby wypełnić tę lukę, wprowadzono dostosowany protokół do analizy organoidów mózgowych w wysokiej rozdzielczości MALDI-MSI (HR-MALDI-MSI) w celu optymalizacji zachowania tkanek, selekcji matryc i warunków obrazowania, zapewniając niezawodne pozyskiwanie danych wysokiej jakości15. Ten szczegółowy protokół prezentuje możliwości HR-MALDI-MSI w zakresie zapewnienia naukowcom dodatkowego arsenału do wykorzystania mocy tej technologii do badania metabolicznego krajobrazu organoidów w niespotykanych dotąd szczegółach.

<table><tbody><tr><td>(1S, 2S)-1,2-di-1-naftylo-etylenodiamina dichlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)</td><td>1052707-27-3</td><td>Substancja matrycowa do MALDI-MS, &ge; 99,0% (HPLC)</td></tr> <tr><td>1 i razy; Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Life Technologies, USA</td><td>14190-144</td><td>Bez CaCl2 i MgCl2</td></tr><tr><td>ART Końcówki do pipet z filtrem o szerokim otworze</td><td>Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA</td><td>2069G</td><td>Zmniejsz potencjalne zanieczyszczenie</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Tissue-Tek</td><td>25608-916</td><td>Standardowa forma o płaskiej powierzchni&nbsp;</td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Fisher Scientific</td><td>M1079610500</td><td>Szkiełka nakrywkowe</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>E511-25</td><td>Certyfikowana biologiczna plama</td></tr> rybna <tr><td>żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)</td><td>G7041</td><td>Postać proszku ze skóry ryb zimnowodnych</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>517-28-2</td><td>Certyfikowana plama biologiczna Podwyższone ciśnienie źródło obrazowania z</td></tr><tr><td>opryskiwaczem HTX M5+</td><td>HTX Technologies LLC, Carrboro, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Opryskiwacz matrycowy</td></tr><tr><td>Cyna indu</td><td>Hudson Surface Technology,</td> <td>PL-IF-000010-P25</td><td>Zapewnij powierzchnię przewodzącą do obrazowania MALDI</td></tr><tr><td>Źródło jonów MALDI</td><td>Spectroglyph LLC, USA</td><td></td><td>interfejs podwójnego lejka jonowego</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td> <td>67-56-1</td><td>HPLC klasa</td></tr><tr><td>przewodząca tlenek (ITO)&ndash; Prowadnice powlekane&nbsp; &nbsp;</td><td>Nowy Jork, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td> wieprzowa <td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MIA)</td><td>G1890</td><td>Postać proszku ze skóry świni</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Q-Exactive</td><td>Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA</td><td></td><td>Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SCiLS Lab</td><td>&nbsp; wersja 2024a Pro&nbsp;</td><td></td><td>do przetwarzania danych&nbsp;</td></tr><tr><td>Water</td><td>Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td> <td>Klasa</td><td></td></tr><tr><td></td> HPLC W6500 <td>(Waltham, MA, USA)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie molekularne organoidów ludzkiego mózgu z wykorzystaniem spektrometrii mas

Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry

Modele organoidów mózgu służą jako potężne narzędzie do badania rozwoju i funkcji ludzkiego mózgu. Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI), najnowocześniejsza technologia, pozwala nam mapować przestrzenny rozkład różnych cząsteczek, takich jak lipidy, cukry, aminokwasy, leki i ich metabolity w tych organoidach, a wszystko to bez potrzeby stosowania specjalnych sond molekularnych. Wysokiej jakości dane MSI zależą od skrupulatnego przygotowania próbki. Utrwalacze odgrywają kluczową rolę, ale konwencjonalne opcje, takie jak aldehyd glutarowy, paraformaldehyd i kriokonserwacja, takie jak sacharoza, mogą nieumyślnie wpływać na metabolity tkankowe. Optymalne utrwalenie pociąga za sobą błyskawiczne zamrażanie w ciekłym azocie. Jednak w przypadku małych organoidów bardziej odpowiednim podejściem jest przeniesienie organoidów bezpośrednio z inkubatora do ogrzanego roztworu do zatapiania, a następnie zamrożenie w etanolu chłodzonym suchym lodem. Kolejnym krytycznym krokiem jest osadzanie przed kriosekcją, która również wymaga materiałów kompatybilnych z MSI, ponieważ tradycyjne opcje mogą zakłócać osadzanie i jonizację matrycy. W tym miejscu przedstawiono zoptymalizowany protokół dla organoidów ludzkiego mózgu o wysokiej rozdzielczości MALDI-MSI, obejmujący przygotowanie próbki, sekcję i obrazowanie przy użyciu spektrometrii mas. Metoda ta pokazuje rozkład molekularny małych metabolitów, takich jak aminokwasy, z dużą dokładnością masy i czułością. W związku z tym, w połączeniu z uzupełniającymi badaniami organoidów mózgowych, może pomóc w wyjaśnieniu złożonych procesów rządzących wczesnym rozwojem mózgu, trajektoriami losu komórek metabolicznych i charakterystycznymi sygnaturami metabolitów. Co więcej, zapewnia wgląd w dokładne lokalizacje cząsteczek w organoidzie, wzbogacając naszą wiedzę na temat organizacji przestrzennej trójwymiarowych modeli organoidów mózgu. Wraz z postępem w tej dziedzinie przewiduje się rosnącą liczbę badań wykorzystujących MSI do zagłębiania się w organoidy mózgowe i złożone systemy biologiczne, pogłębiając w ten sposób zrozumienie metabolicznych aspektów funkcjonowania i rozwoju ludzkiego mózgu.

Poniżej przedstawiono protokół optymalizujący obrazowanie molekularne (metaboliczne) z wykorzystaniem MSI (Rysunek 1, patrz również Cappuccio et al.)15. Najbardziej wiarygodne dane oraz najlepsze zachowanie morfologii tkanek uzyskano przy zastosowaniu 10% żelatyny z zimnej skóry ryb, co potwierdzono barwieniem histologicznym seryjnych skrawków. Wykorzystując zatopienie 60-dniowych ludzkich organoidów mózgu w żelatynie rybie, zmapowano metabolity związane z cyklem Krebsa za pomocą MSI, wykazując ich rozkład przestrzenny (Rysunek 2).
Ogólnie zoptymalizowany protokół konsekwentnie dostarczał wiarygodnych wyników, przy czym 10% żelatyna z zimnych skór ryb okazała się preferowanym materiałem do zatapiania, a ustawienia natrysku matrycy NEDC zostały precyzyjnie dostrojone w celu poprawy rozdzielczości obrazu. Wykryte małe metabolity w organoidach mózgu dostarczają cennych informacji na temat złożoności molekularnej tej tkanki.
<img alt="Równowaga statyczna w organoidach mózgu pochodzących z iPSC; schemat obrazowania masowego LC-MS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66997/66997fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ogólny schemat badania metabolomu ludzkich organoidów mózgu. Organoidy pochodzące z fibroblastów pacjenta via indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są wykorzystywane w LC-MS i MSI w celu wykazania przestrzennego rozkładu metabolitów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66997/66997fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat cyklu Krebsa z szlakami NADH, NAD⁺, obrazy mikroskopowe struktur komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66997/66997fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Mapowanie metabolitów związanych z cyklem Krebsa. Identyfikacja i rozmieszczenie metabolitów związanych z cyklem Krebsa w 60-dniowych organoidach pochodzących od zdrowych kontroli z wykorzystaniem MSI. Przedstawiono barwienie hematoksyliną i eozyną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66997/66997fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opracowano zaawansowaną metodę obrazowania organoidów mózgowych za pomocą spektrometrii mas (MSI), która pozwala na mapowanie rozkładów metabolitów w tych modelach. Technologia ta oferuje wgląd w szlaki metaboliczne mózgu i sygnatury metabolitów we wczesnym okresie rozwoju i choroby, obiecując głębsze zrozumienie funkcji ludzkiego mózgu.

Obrazowanie molekularne organoidów ludzkiego mózgu z wykorzystaniem spektrometrii mas

Brain organoid models serve as a powerful tool for studying human brain development and function. Mass spectrometry imaging (MSI), a cutting-edge ...

Badaliśmy metabolomikę rozwijającego się ludzkiego mózgu. Wyzwanie do zbadania in vivo. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystujemy modele organoidów mózgowych in vitro oraz zaawansowane specjalne techniki metabolomiczne.W ostatnich latach szybko zastosowano zaawansowane technologie oparte na technologii mistrzowskiej do charakteryzacji organoidów, a oczekuje się, że trend ten będzie się utrzymywał. Ostatnie badania metabolomiczne z wykorzystaniem obrazowania spektrometrii mas lub MSI pokazują zalety modeli organoidowych w zrozumieniu molekularnych mechanizmów rozwoju i chorób człowieka, w tym rzadkich schorzeń, oraz zastosowań w medycynie spersonalizowanej. Utrzymanie integralności molekularnej i morfologii organoidów podczas obrazowania molekularnego jest wyzwaniem, wymaga precyzyjnego obchodzenia się z próbkami i ich przygotowania. Aby rozwiązać ten problem, opracowano specjalistyczną technikę analizy organoidów mózgowych za pomocą wielu wskaźników MALDI MSI. Optymalizuje spektrum masowe między warunkami obrazowania, immatrykulacją i konserwacją tkanek, aby zapewnić wiarygodne dane wysokiej jakości. Ten kompleksowy protokół demonstruje potencjał MSI o wysokiej rozdzielczości i daje naukowcom zasoby potrzebne do pełnego wykorzystania tej technologii do szczegółowego zbadania topografii metabolomicznej organoidów.Nasze badania ogłoszą nasze zrozumienie neurogenezy, metabolitu związanego z określonymi typami komórek w organoidach mózgowych. To szczegółowe profilowanie metaboliczne nie tylko rzuci światło na regułę tych metabolitów w rozwoju mózgu, ale także zidentyfikuje potencjalny cel interwencji terapeutycznych imitujących zaburzenia neurorozwojowe.[Narrator] Na początek wyjmij z inkubatora kolbę zawierającą organoidy mózgowe pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Używając końcówek o szerokim otworze, przenieś organoidy z kolby do szalki. Umyj organoidy trzykrotnie DPBS bez chlorku wapnia i chlorkiem magnezu w celu przepłukania pożywki. Następnie szybko spłucz wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie sole z DPBS. Dodać 10 miligramów żelatyny otrzymanej z zimnej skóry rybnej do kolby zawierającej 100 mililitrów DPBS. Podgrzej i mieszaj mieszaninę w temperaturze od 70 do 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie przenieś roztwór do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby usunąć pęcherzyki. Za pomocą małej końcówki do pipety przypnij organoid w środku plastikowej formy. Delikatnie wlej 10% roztwór do zatapiania żelatyny do formy, aż organoid zostanie całkowicie zanurzony. Umieść formę na szalce Petriego zawierającej zimny 100% etanol na suchym lodzie. Po całkowitym zamrożeniu, o czym świadczy zmiana koloru na jednolity biały, usuń organoidowy blok żelatyny z szalki Petriego. Zawiń blok w folię aluminiową lub umieść go w blaszanym kubku. Uszczelnij i przechowuj blok w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do sekcji kriogenicznej. W celu przeprowadzenia kriosekcji należy umieścić plastikowe klocki zawierające organoidy w komorze kriogenicznej ustawionej na minus 20 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut. Następnie na kriotomie podziel organoidy na 14 mikrometrowych sekcji i zamontuj na szkiełkach pokrytych tlenkiem indu i cyny do obrazowania spektrometrii mas lub MSI. Przechowuj szkiełka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu obrazowania. Na początek usuń szkiełko pokryte tlenkiem indu i cyny zamontowane z sekcjami organoidów mózgowych z minus 80 stopni Celsjusza. Umieść szkiełko w osuszaczu na 20 minut, aby zminimalizować kondensację wody atmosferycznej na powierzchni. Po wysuszeniu, za pomocą podgrzewanego opryskiwacza pneumatycznego, rozpylić 10 miligramów na mililitr NEDC w 70% metanolu na skrawki organoidów. Aby uzyskać platformę MALDI MSI o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji metabolitów organoidów mózgowych, zamontuj źródło jonów z interfejsem podwójnego lejka jonowego na spektrometrze masowym. Użyj podłączonego lasera ND o potrójnej częstotliwości przełącznika Q o długości fali 349 nanometrów, częstotliwości powtarzania jednego kiloherca i energii impulsu około 1,3 do 1,4 mikrodżuli. Aby uniknąć nadmiernego próbkowania, należy skupić laser na plamce o średnicy około 15 mikrometrów. Podłączyć próbkę do stolika wtryskiwacza MALDI. Eksploatuj i utrzymuj lejek jonów wysokiego ciśnienia na poziomie od 7.4 do 7.5 Torr, a lejek jonów niskociśnieniowych przy 1.6 do 1.8 Torr. Zastosuj napięcia o częstotliwości radiowej 780 kiloherców przy 191 woltach od szczytu do szczytu do dołka i 604 kiloherców przy 80 woltach od szczytu do szczytu do lejków jonowych wysokiego ciśnienia. Aby poprawić czułość dla małych metabolitów w zakresie niskiej masy, należy zmniejszyć amplitudy fal radiowych w lejku niskiego i wysokiego ciśnienia źródła MALDIDMSI odpowiednio do około 20 i 15%. Ustaw rozdzielczość masową na 70 000. Następnie wybierz obszar i rozmiar piksela 25 mikrometrów na piksel. Ustaw zakres ładunku głównego od 80 do 900 zarówno w trybie jonów ujemnych, jak i dodatnich. Pozostaw wyłączoną automatyczną kontrolę wzmocnienia, a następnie ustaw czas wtrysku na 250 milisekund i uzyskaj widma masowe transformacji Furiera w trybie profilu. Zaimportuj dane spektralne spektrometrii mas bezpośrednio do kompatybilnego oprogramowania. Wykonaj korekcję linii bazowej przy użyciu algorytmu konwolucji i znormalizuj dane przy użyciu całkowitej liczby jonów. Wygeneruj listę cech obrazów jonów z plików danych raw, używając szerokości przedziału ładunku głównego delta równej 0,01 lub 5:00 PPM, aby rozróżnić obrazy współczynnika ładunku głównego na podstawie defektu masy i pokrycia pikseli. Generuj obrazy w fałszywych kolorach lub RGB z poszczególnych rodzajów jonów metabolitów. Prześlij listę współczynnika ładunku głównego plików danych surowych uzyskanych z MALDI MSI do bazy danych ludzkiego metabolomu w celu identyfikacji metabolitów. Metabolity związane z cyklem Krebsa w 60-dniowych organoidach ludzkiego mózgu zmapowano przestrzennie przy użyciu MSI z zatopieniem żelatyny rybnej.

molecular-imaging-of-human-brain-organoids-using-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie molekularne organoidów ludzkiego mózgu za pomocą spektrometrii mas 

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przygotowania próbki podczas planowania eksperymentów z użyciem MALDI MSI, aby zmaksymalizować wykrywanie metaboliczne i molekularne w próbkach biologicznych.

Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Tutaj wprowadzamy kompleksowy protokół do generowania i dalszej analizy organoidów ludzkiego mózgu za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra.

Generowanie i dalsza analiza transkryptomów pojedynczych komórek i jąder w organoidach mózgowych

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu z rezydującym mikroglejem poprzez włączenie do rozwoju organoidów komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do rozwoju organoidów.

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Protokół ten opisuje kluczowe kroki umożliwiające rygorystyczne i powtarzalne pomiary zarówno glikogenu, jak i glikanów powiązanych z N za pomocą spektrometrii masowej.

Przestrzenne obrazowanie molekularne glikomu za pomocą spektrometrii mas

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Poznaj obrazowanie masowe organoidów mózgu w celu szczegółowej analizy metabolitów. Ta metoda umożliwia badanie neurogenezy i identyfikację potencjalnych celów terapeutycznych w zaburzeniach rozwoju nerwowego.

Obrazowanie molekularne organoidów ludzkiego mózgu z wykorzystaniem spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów