Obrazowanie molekularne organoidów ludzkiego mózgu za pomocą spektrometrii mas

Badaliśmy metabolomikę rozwijającego się ludzkiego mózgu. Wyzwanie do zbadania in vivo. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystujemy modele organoidów mózgowych in vitro oraz zaawansowane specjalne techniki metabolomiczne.

W ostatnich latach szybko zastosowano zaawansowane technologie oparte na technologii mistrzowskiej do charakteryzacji organoidów, a oczekuje się, że trend ten będzie się utrzymywał. Ostatnie badania metabolomiczne z wykorzystaniem obrazowania spektrometrii mas lub MSI pokazują zalety modeli organoidowych w zrozumieniu molekularnych mechanizmów rozwoju i chorób człowieka, w tym rzadkich schorzeń, oraz zastosowań w medycynie spersonalizowanej. Utrzymanie integralności molekularnej i morfologii organoidów podczas obrazowania molekularnego jest wyzwaniem, wymaga precyzyjnego obchodzenia się z próbkami i ich przygotowania. Aby rozwiązać ten problem, opracowano specjalistyczną technikę analizy organoidów mózgowych za pomocą wielu wskaźników MALDI MSI. Optymalizuje spektrum masowe między warunkami obrazowania, immatrykulacją i konserwacją tkanek, aby zapewnić wiarygodne dane wysokiej jakości. Ten kompleksowy protokół demonstruje potencjał MSI o wysokiej rozdzielczości i daje naukowcom zasoby potrzebne do pełnego wykorzystania tej technologii do szczegółowego zbadania topografii metabolomicznej organoidów.

Nasze badania ogłoszą nasze zrozumienie neurogenezy, metabolitu związanego z określonymi typami komórek w organoidach mózgowych. To szczegółowe profilowanie metaboliczne nie tylko rzuci światło na regułę tych metabolitów w rozwoju mózgu, ale także zidentyfikuje potencjalny cel interwencji terapeutycznych imitujących zaburzenia neurorozwojowe.

[Narrator] Na początek wyjmij z inkubatora kolbę zawierającą organoidy mózgowe pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Używając końcówek o szerokim otworze, przenieś organoidy z kolby do szalki. Umyj organoidy trzykrotnie DPBS bez chlorku wapnia i chlorkiem magnezu w celu przepłukania pożywki. Następnie szybko spłucz wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie sole z DPBS. Dodać 10 miligramów żelatyny otrzymanej z zimnej skóry rybnej do kolby zawierającej 100 mililitrów DPBS. Podgrzej i mieszaj mieszaninę w temperaturze od 70 do 80 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie przenieś roztwór do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby usunąć pęcherzyki. Za pomocą małej końcówki do pipety przypnij organoid w środku plastikowej formy. Delikatnie wlej 10% roztwór do zatapiania żelatyny do formy, aż organoid zostanie całkowicie zanurzony. Umieść formę na szalce Petriego zawierającej zimny 100% etanol na suchym lodzie. Po całkowitym zamrożeniu, o czym świadczy zmiana koloru na jednolity biały, usuń organoidowy blok żelatyny z szalki Petriego. Zawiń blok w folię aluminiową lub umieść go w blaszanym kubku. Uszczelnij i przechowuj blok w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do sekcji kriogenicznej. W celu przeprowadzenia kriosekcji należy umieścić plastikowe klocki zawierające organoidy w komorze kriogenicznej ustawionej na minus 20 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut. Następnie na kriotomie podziel organoidy na 14 mikrometrowych sekcji i zamontuj na szkiełkach pokrytych tlenkiem indu i cyny do obrazowania spektrometrii mas lub MSI. Przechowuj szkiełka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu obrazowania. Na początek usuń szkiełko pokryte tlenkiem indu i cyny zamontowane z sekcjami organoidów mózgowych z minus 80 stopni Celsjusza. Umieść szkiełko w osuszaczu na 20 minut, aby zminimalizować kondensację wody atmosferycznej na powierzchni. Po wysuszeniu, za pomocą podgrzewanego opryskiwacza pneumatycznego, rozpylić 10 miligramów na mililitr NEDC w 70% metanolu na skrawki organoidów. Aby uzyskać platformę MALDI MSI o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji metabolitów organoidów mózgowych, zamontuj źródło jonów z interfejsem podwójnego lejka jonowego na spektrometrze masowym. Użyj podłączonego lasera ND o potrójnej częstotliwości przełącznika Q o długości fali 349 nanometrów, częstotliwości powtarzania jednego kiloherca i energii impulsu około 1,3 do 1,4 mikrodżuli. Aby uniknąć nadmiernego próbkowania, należy skupić laser na plamce o średnicy około 15 mikrometrów. Podłączyć próbkę do stolika wtryskiwacza MALDI. Eksploatuj i utrzymuj lejek jonów wysokiego ciśnienia na poziomie od 7.4 do 7.5 Torr, a lejek jonów niskociśnieniowych przy 1.6 do 1.8 Torr. Zastosuj napięcia o częstotliwości radiowej 780 kiloherców przy 191 woltach od szczytu do szczytu do dołka i 604 kiloherców przy 80 woltach od szczytu do szczytu do lejków jonowych wysokiego ciśnienia. Aby poprawić czułość dla małych metabolitów w zakresie niskiej masy, należy zmniejszyć amplitudy fal radiowych w lejku niskiego i wysokiego ciśnienia źródła MALDIDMSI odpowiednio do około 20 i 15%. Ustaw rozdzielczość masową na 70 000. Następnie wybierz obszar i rozmiar piksela 25 mikrometrów na piksel. Ustaw zakres ładunku głównego od 80 do 900 zarówno w trybie jonów ujemnych, jak i dodatnich. Pozostaw wyłączoną automatyczną kontrolę wzmocnienia, a następnie ustaw czas wtrysku na 250 milisekund i uzyskaj widma masowe transformacji Furiera w trybie profilu. Zaimportuj dane spektralne spektrometrii mas bezpośrednio do kompatybilnego oprogramowania. Wykonaj korekcję linii bazowej przy użyciu algorytmu konwolucji i znormalizuj dane przy użyciu całkowitej liczby jonów. Wygeneruj listę cech obrazów jonów z plików danych raw, używając szerokości przedziału ładunku głównego delta równej 0,01 lub 5:00 PPM, aby rozróżnić obrazy współczynnika ładunku głównego na podstawie defektu masy i pokrycia pikseli. Generuj obrazy w fałszywych kolorach lub RGB z poszczególnych rodzajów jonów metabolitów. Prześlij listę współczynnika ładunku głównego plików danych surowych uzyskanych z MALDI MSI do bazy danych ludzkiego metabolomu w celu identyfikacji metabolitów. Metabolity związane z cyklem Krebsa w 60-dniowych organoidach ludzkiego mózgu zmapowano przestrzennie przy użyciu MSI z zatopieniem żelatyny rybnej.