Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Nasze zainteresowania badawcze koncentrują się obecnie na konstruowaniu wysokiej jakości wielofunkcyjnych nanomateriałów i ich zastosowaniu w rozwoju ultraczułej diagnostyki przyłóżkowej. Paski do testów immunologicznych z przepływem bocznym służą jako krytyczne narzędzia szybkiego wykrywania w miejscu opieki nad pacjentem, szczególnie w badaniach przesiewowych chorób podczas epidemii. Aby zwiększyć czułość wykrywania testów immunologicznych przepływu bocznego, pojawiły się różne nowe nanocząstki, w tym kolorowy lateks, nanocząstki fluorescencyjne z konwersją w górę, mikrosfery fluorescencyjne z wynikiem czasowym i kropki kwantowe.

Zaprezentowaliśmy jednoetapową metodę odparowywania emulsji do otrzymywania nanokulek z kropek kwantowych i innych zastosowań w czułości, na przykład w bocznych testach fluoroimmunologicznych. W porównaniu z innymi metodami przygotowania nanokulek z kropek kwantowych, protokół ten ma tę zaletę, że jest uproszczony w obsłudze i ma wysoką wydajność. Dodatkowo nanokulki z kompozytu polimerowego są biokompatybilne, w przeciwieństwie do nanokulek krzemionkowych, które zazwyczaj wymagają dodatkowej modyfikacji powierzchni za pomocą polimerów.

Czułe fluorescencyjne paski do testów immunologicznych z przepływem bocznym zostały opracowane przy użyciu przygotowanych nanokulek z kropek kwantowych. Paski te mogą być używane do jakościowego i ilościowego wykrywania biomarkerów choroby w miejscu opieki nad pacjentem. Ten nowy test może pomóc lekarzom w szybkim i dokładnym diagnozowaniu chorób.

Na początek wymieszaj 0,4 mililitra roztworu bezwodnika polistyrenowo-ko-maleinowego i 0,1 mililitra roztworu QD, aby przygotować jeden mililitr fazy olejowej. Następnie wypełnij resztę chloroformem, aż objętość osiągnie jeden mililitr. Następnie przygotuj fazę wodną za pomocą roztworu dodecylosiarczanu sodu.

Połączyć jeden mililitr fazy olejowej i pięć mililitrów fazy wodnej w fiolce. Umieścić fiolkę na mieszadle magnetycznym i włączyć ją. Po dokładnym wymieszaniu oleju i fazy wodnej należy natychmiast przenieść fiolkę do zaprogramowanego urządzenia ultradźwiękowego i włączyć zasilanie.

Następnie umieścić fiolkę z powrotem na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej i mieszać w sposób ciągły przez noc. Po odparowaniu rozpuszczalnika dodaj 0,1 mililitra 0,1 milimolowego wodorotlenku sodu do zawiesiny nano kulek i pozwól mu reagować przez godzinę. Na początek dodaj 100 mikrolitrów przygotowanych nano kulek QD do 200 mikrolitrów buforu fosforanowego.

Następnie dodaj sześć mikrolitrów EDC. Następnie inkubuj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej na mieszalniku obrotowym. Odwirować mieszaninę w temperaturze 13,523G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu fosforanowego do osadu. Przykryj rurkę pokrywką i zanurz ją w działającej ultradźwiękowej łaźni wodnej, aż osad zostanie całkowicie rozproszony. Rozproszyć 100 mikrogramów przeciwciała w 200 mikrolitrach buforu fosforanowego i dodać aktywowaną zawiesinę nano kulek QD do roztworu przeciwciała.

Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut z ciągłą rotacją. Następnie usunąć nadmiar przeciwciał przez odwirowanie w stężeniu 6,010G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucić supernatant. Aby zablokować nano kulki, dodaj 200 mikrolitrów 1% roztworu kazeiny do pozostałości.

Przykryj probówkę pokrywką i zanurz ją w działającej ultradźwiękowej łaźni wodnej, aż pozostałość zostanie całkowicie zdyspergowana. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny z ciągłą rotacją. Do mieszaniny dodaj 100 mikrolitrów roztworu konserwującego i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego użycia.

Aby rozpocząć, przygotuj roztwór do powlekania linii testowej i linii kontrolnej. Rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące białko C-reaktywne i kozią immunoglobulinę przeciw królikowi G buforem fosforanowym. Następnie należy odpowiednio ułożyć płytę z polichlorku winylu i usunąć papier ochronny znajdujący się 25 milimetrów od krawędzi deski.

Wyrównaj i przyklej membranę nitrocelulozową wzdłuż dolnej krawędzi pozostałego papieru ochronnego do płyty z polichlorku winylu. Dozuj roztwory powłok linii testowej i linii kontrolnej na membranę nitrocelulozową, upewniając się, że jest ona umieszczona w odległości 20 milimetrów od górnej krawędzi, tworząc linię testową. Do suszenia membranę nitrocelulozową należy umieścić w warunkach o wilgotności mniejszej niż 30% i zakresie temperatur od 18 do 26 stopni Celsjusza.

Aby przygotować pad sprzężony, zanurz pad sprzężony w roztworze do leczenia padu sprzężonego. Następnie umieść namoczoną podkładkę sprzężoną w piecu do suszenia w celu wysuszenia przez noc. Przygotowany roztwór koniugatu przeciwciała QD nano bead rozcieńczyć roztworem konserwującym i dozować go na podkładkę koniugatu.

W celu przygotowania podkładki do pobierania próbek zanurzyć podkładkę do pobierania próbek w roztworze do obróbki podkładki pod próbkę. Następnie umieść namoczoną podkładkę na próbkę w suszarce ustawionej na 45 stopni Celsjusza i susz przez 24 godziny. Kolejno umieść papier chłonny, podkładkę sprzężoną i podkładkę na próbkę na płycie z polichlorku winylu z membraną nitrocelulozową.

Odpipetować 10 mikrolitrów próbki osocza lub roztworu kalibratora do jednego mililitra buforu PBS zawierającego 0,1%Tween 20. Następnie przenieś 100 mikrolitrów przygotowanej rozcieńczonej próbki na podkładkę na próbkę paska testowego. Po 15 minutach pracy obserwuj sygnały fluorescencyjne linii testowej i linii kontrolnej pod wpływem światła ultrafioletowego, aby uzyskać wyniki jakościowe.

Włóż kartę paskową do czytnika fluorescencyjnego testu przepływu bocznego, aby uzyskać intensywności fluorescencji do analizy ilościowej.