Name: Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę przygotowania nanokulek kropek kwantowych i ich zastosowanie w fluorescencyjnym immunologicznym teście przepływu bocznego do szybkiej detekcji biomarkerów chorób w ciągu 15 minut.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Projekt Komitetu Nauki i Technologii w Szanghaju (STCSM) (22S31902000) oraz Program Inkubacji Badań Klinicznych Szpitala Chorób Skóry w Szanghaju (NO. lcfy2021-10).

Badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of Shanghai Skin Disease Hospital (nr 2020-15). Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem próbek krwi ludzkiej przeprowadzono w laboratorium o II poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie nanokulek QDs
UWAGA: Do syntezy nanokulek QD, do syntezy nanokulek QD użyto techniki odparowywania emulsji i rozpuszczalnika, o stosunku fazy olejowej do fazy wodnej wynoszącym 1:5. Mini emulsja jest generowana za pomocą ultradźwięków, a nanokulki są zestalane przez odparowanie rozpuszczalnika (chloroformu). Wodorotlenek sodu wykorzystano do katalizowania hydrolizy grup bezwodnika na powierzchni nanokulek, przekształcając je w grupy karboksylowe.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów fazy olejowej i fazy wodnej
	<ol>
		<li>Przygotować 1 ml fazy olejowej: 0,4 ml roztworu poli(bezwodnika styrenowo-kumarowego) (PSMA) (50 mg/ml), 0,1 ml roztworu QDs (100 mg/ml), napełnić dowolną objętość mniejszą niż 1 ml chloroformem.</li>
		<li>Przygotować 5 ml fazy wodnej: roztwór wodny SDS (0,5 % wag.).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie emulsji i krzepnięcie
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml fazy olejowej i 5 ml fazy wodnej do fiolki (15 ml) i umieścić fiolkę na mieszadle magnetycznym. Włącz zasilanie mieszadła magnetycznego.</li>
		<li>Po całkowitym wymieszaniu fazy olejowej i wodnej należy natychmiast przenieść kolbę do zaprogramowanego (60 s, impuls 3 s, po którym następuje 3 s pauza, 50% amplituda) ultradźwięków i włączyć zasilanie.</li>
		<li>Obserwuj roztwór po ultradźwiękach. Początkowo szkarłatny roztwór przeszedł w fazę opalizującą, która nadal zachowuje czerwonawy odcień.</li>
		<li>Umieścić fiolkę z powrotem na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej, ciągle mieszając przez noc. Chloroform był stopniowo odparowywany, a emulsja zastygała w kompozytowe nanokulki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Modyfikacja powierzchni nanokulek
	<ol>
		<li>Dodać 0,1 ml 0,1 mM wodorotlenku sodu do zawiesiny nanokulek na 1 godzinę. Grupy bezwodnikowe na powierzchni nanokulek ulegają hydrolizie do grup karboksylowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie nanogranulek
	<ol>
		<li>Wyłącz mieszadło magnetyczne i przenieś zestalone nanokulki do probówki wirówkowej. Odwirować probówkę o stężeniu 13523 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodaj początkową objętość wody dejonizowanej do osadu, przykryj rurkę pokrywką, zanurz ją w ultradźwiękowej łaźni wodnej i utrzymuj zanurzenie, aż osad zostanie całkowicie zdyspergowany.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.4.1-1.4.2 dwukrotnie, a na koniec przenieś nanogranulki do szklanej butelki. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka nanokulek
	<ol>
		<li>Scharakteryzuj rozmiar i morfologię nanokulek QDs za pomocą obrazowania z transmisyjnej mikroskopii elektronicznej (TEM)22. 
		UWAGA: Różne rozmiary nanokulek można uzyskać, zmieniając proporcje roztworu QDs i roztworu PSMA. Rozmiar nanokulek QDs można również określić za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)27.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie koniugatów QDNB-przeciwciało
<ol>
	<li>Aktywacja grup karboksylowych
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl przygotowanego QDNB (10 mg/ml) do 200 μl buforu fosforanowego (PB, 20 mM, pH 6,0), a następnie dodać 6 μl EDC (20 mg/ml).</li>
		<li>Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej na mieszalniku obrotowym.</li>
		<li>Po inkubacji odwirować mieszaninę o stężeniu 13523 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 100 μl PB (20 mM, pH 6,0) do wytrącenia, przykryć probówkę pokrywką i zanurzyć probówkę w działającej ultradźwiękowej łaźni wodnej, aż osad zostanie całkowicie rozproszony</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Koniugacja przeciwciał i nanokulek
	<ol>
		<li>Rozproszyć 100 μg przeciwciała w 200 μl PB (20 mM, pH 6,0) i dodać aktywowaną zawiesinę QDNB otrzymaną z kroku 2.1 do roztworu przeciwciała.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut z ciągłą rotacją. Usunąć nadmiar przeciwciał przez odwirowanie przy 6010 x g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej), a następnie ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie nanogranulek
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl 1% roztworu kazeiny (w 20 mM buforze PB, pH 7,4) do pozostałości (otrzymanej w kroku 2.2.2), przykryć probówkę pokrywką i zanurzyć ją w działającej ultradźwiękowej łaźni wodnej do momentu całkowitego rozproszenia pozostałości.</li>
		<li>Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z ciągłą rotacją. 
		UWAGA: Celem tego kroku jest zablokowanie wszelkich nieprzereagowanych miejsc na powierzchni QDNB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie koniugatów
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl roztworu konserwującego (20 mM buforu PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trehalozy, 6% sacharozy, 0,1% S9, pH 7,4) do mieszaniny i przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie pasków do testów immunologicznych z przepływem bocznym
UWAGA: Pasek immunochromatograficzny składa się z membrany nitrocelulozowej (NC), podkładki na próbkę, podkładki sprzężonej, wkładki chłonnej i płyty z polichlorku winylu (PVC) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Wszystkie roztwory należy natychmiast przygotować i zużyć. Zaleca się, aby paski do testów immunologicznych z przepływem bocznym były przygotowywane w czystym pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.
<ol>
	<li>Przygotowanie membrany NC
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór powlekający linii testowej (linia T) i linii kontrolnej (linia C): rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące CRP i kozie przeciwciało anty-królicze IgG PB do końcowego stężenia 1 mg/ml.</li>
		<li>Umieść prawidłowo płytę PCV i usuń papier ochronny znajdujący się 25 mm od krawędzi płyty PCV. Wyrównaj i przyklej membranę NC wzdłuż dolnej krawędzi pozostałego papieru ochronnego do płyty PCV.</li>
		<li>Dozować roztwory powłokowe T-line i C-line na membranę NC z szybkością natryskiwania 1 μl/cm, upewniając się, że jest ona umieszczona w odległości 20 mm od górnej krawędzi, tworząc linię testową (o szerokości 1 mm).</li>
		<li>Umieść membranę NC w warunkach o wilgotności mniejszej niż 30% i zakresie temperatur 18-26 °C do suszenia. Czas schnięcia powinien wynosić co najmniej 24 h. 
		UWAGA: Upewnij się, że górna i dolna krawędź membrany NC są zlicowane z odpowiednimi krawędziami sąsiednich obszarów. Membran NC nie należy dotykać rękami. Wilgotność na tym etapie powinna być kontrolowana w zakresie od 45% do 65%. Przed kontynuowaniem roztwór powłoki T-line, roztwór do powlekania C-line i membranę NC należy wyrównać do tej samej temperatury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie padu sprzężonego
	<ol>
		<li>Zanurzyć podkładkę sprzężoną w roztworze do obróbki podkładki sprzężonej (bufor 20 mM PB, pH 7,4, 1% BSA).</li>
		<li>Umieść namoczoną podkładkę sprzężoną w piecu do suszenia w celu wysuszenia (temperatura pokojowa) przez noc.</li>
		<li>Delikatnie przyklej zmodyfikowaną podkładkę sprzężoną do płyty PCV.</li>
		<li>Przygotowany roztwór sprzężony z przeciwciałem QDNB rozcieńczyć roztworem konserwującym (20 mM bufor PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trehalozy, 6% sacharozy, 0,1% S9, pH 7,4).</li>
		<li>Dozować roztwór koniugatu przeciwciała QDNB na podkładkę koniugatu z szybkością natryskiwania 1 μl/cm i wysuszyć podkładkę sprzężoną przez 24 godziny 
		UWAGA: Określony współczynnik rozcieńczenia należy dostosować do celu wykrywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie podkładki na próbki
	<ol>
		<li>Zanurzyć podkładkę na próbkę w roztworze do traktowania podkładki pod próbkę (20 mM buforu PB, pH 7,4, 1% BSA, 5% trehalozy, 6% sacharozy, 0,1% S9, pH 7,4).</li>
		<li>Umieścić namoczoną podkładkę na próbkę w suszarce (45 °C) i suszyć przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Składanie karty i cięcie jej na paski
	<ol>
		<li>Jak pokazano na Rysunek 1, kolejno umieść papier chłonny (podkładkę chłonną), podkładkę sprzężoną i podkładkę próbki na płytce PCV z membraną NC.</li>
		<li>Pokrój kartę na paski o szerokości 3,8 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pakowanie pasków
	<ol>
		<li>Zamknij paski testowe w plastikowej kasecie i zamknij torebkę z folii aluminiowej zawierającą środek osuszający.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Operacja testowa i ocena jakościowa
UWAGA: Zaleca się, aby operacje z wykorzystaniem próbek krwi ludzkiej były przeprowadzane w laboratorium o II poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Próbki ludzkiego osocza uzyskano z laboratorium klinicznego (od osób pozbawionych tożsamości ludzkiej). Zazwyczaj ludzką krew pobierano za pomocą lampy próżniowej EDTA, a osocze izolowano zgodnie ze standardowym protokołem34. Wirować przy 3 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu separacji plazmy. Zebrać górną warstwę żółtego osocza za pomocą pipety i przechowywać osocze w probówce o pojemności 1,5 ml w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
<ol>
	<li>Odpipetować 10 μl próbki osocza lub roztworu kalibratora do 1 ml buforu PBS zawierającego 0,1% Tween 20. Następnie przenieść 100 μl przygotowanej rozcieńczonej próbki na podkładkę na próbkę paska testowego.</li>
	<li>Po 15-minutowym biegu obserwuj sygnały fluorescencyjne linii T i linii C pod wpływem światła ultrafioletowego, aby uzyskać wyniki jakościowe.</li>
	<li>Włóż kartę paskową do czytnika fluorescencyjnego testu przepływu bocznego, aby uzyskać intensywność fluorescencji do analizy ilościowej. 
	UWAGA: W tym przykładzie zastosowano metodę testu immunologicznego typu sandwich35,36; Jedna czerwona linia (linia kontrolna) oznacza wynik negatywny, podczas gdy dwie czerwone linie (linia testowa i kontrolna) wskazują wynik pozytywny. Brak przewodu kontrolnego wskazuje, że przeprowadzony test jest nieważny.</li>
</ol>

Quantum Dot Nanobeads for Enhanced Sensitivity in Biomarker Detection

<ol><li>de Puig, H., Bosch, I., Gehrke, L., Hamad-Schifferli, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+the+nano-bio+interface+in+lateral+flow+and+dipstick+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Challenges of the nano-bio interface in lateral flow and dipstick immunoassays.</a> Trends Biotechnol. 35 (12), 1169-1180 (2017).</li>
<li>Miller, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin-enhanced+nanodiamond+biosensing+for+ultrasensitive+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spin-enhanced nanodiamond biosensing for ultrasensitive diagnostics.</a> Nature. 587 (7835), 588-593 (2020).</li>
<li>Gao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platinum-decorated+gold+nanoparticles+with+dual+functionalities+for+ultrasensitive+colorimetric+in+vitro+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Platinum-decorated gold nanoparticles with dual functionalities for ultrasensitive colorimetric in vitro diagnostics.</a> Nano Lett. 17 (9), 5572-5579 (2017).</li>
<li>Fan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deeply-dyed+nanobead+system+for+rapid+lateral+flow+assay+testing+of+drugs+at+point-of-care%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Deeply-dyed nanobead system for rapid lateral flow assay testing of drugs at point-of-care.</a> Sensors Actuators B Chem. 362, 131829(2022).</li>
<li>Garcia, V. S., Guerrero, S. A., Gugliotta, L. M., Gonzalez, V. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lateral+flow+immunoassay+based+on+colored+latex+particles+for+detection+of+canine+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">A lateral flow immunoassay based on colored latex particles for detection of canine visceral leishmaniasis.</a> Acta Trop. 212, 105643(2020).</li>
<li>You, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Household+fluorescent+lateral+flow+strip+platform+for+sensitive+and+quantitative+prognosis+of+heart+failure+using+dual-color+upconversion+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Household fluorescent lateral flow strip platform for sensitive and quantitative prognosis of heart failure using dual-color upconversion nanoparticles.</a> ACS Nano. 11 (6), 6261-6270 (2017).</li>
<li>Ye, Z., Tan, M., Wang, G., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fluorescent+europium+chelate-doped+silica+nanoparticles%3A+preparation%2C+characterization+and+time-resolved+fluorometric+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel fluorescent europium chelate-doped silica nanoparticles: preparation, characterization and time-resolved fluorometric application.</a> J Mater Chem. 14 (5), 851(2004).</li>
<li>Xu, Y., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+fluorescent+labeling+of+silica+nanoparticles+with+lanthanide+chelates+for+highly+sensitive+time-resolved+immunofluorometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple fluorescent labeling of silica nanoparticles with lanthanide chelates for highly sensitive time-resolved immunofluorometric assays.</a> Clin Chem. 53 (8), 1503-1510 (2007).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+detection+sensitivity+by+oriented+bioconjugation+of+antibodies+to+quantum+dots+with+a+flexible+spacer+arm+for+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Improving detection sensitivity by oriented bioconjugation of antibodies to quantum dots with a flexible spacer arm for immunoassay.</a> RSC Adv. 6 (55), 50119-50127 (2016).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+protein+biomarker+using+a+portable+fluorescence+biosensor+based+on+quantum+dots+and+a+lateral+flow+test+strip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of protein biomarker using a portable fluorescence biosensor based on quantum dots and a lateral flow test strip.</a> Anal Chem. 82 (16), 7008-7014 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+strip+sensor+for+rapid+determination+of+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">Fluorescent strip sensor for rapid determination of toxins.</a> Chem Commun. 47 (5), 1574-1576 (2011).</li>
<li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging%2C+labeling+and+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for imaging, labeling and sensing.</a> Nat Mater. 4 (6), 435-446 (2005).</li>
<li>Smith, A. M., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+quantum+dots+for+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Compact quantum dots for single-molecule imaging.</a> J Vis Exp. (68), e4236(2012).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+assembly+of+magnetic-core+dual+quantum+dot-shell+nanocomposites+for+fluorescence+lateral+flow+detection+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer assembly of magnetic-core dual quantum dot-shell nanocomposites for fluorescence lateral flow detection of bacteria.</a> Nanoscale. 12 (2), 795-807 (2020).</li>
<li>Hu, J., Tang, F., Jiang, Y. Z., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+and+quantitative+detection+of+Salmonella+using+a+quantum+dot+nanobead-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Rapid screening and quantitative detection of Salmonella using a quantum dot nanobead-based biosensor.</a> Analyst. 145 (6), 2184-2190 (2020).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+graphene+oxide-supported+multilayer-quantum+dots+nanofilm+into+multiplex+lateral+flow+immunoassay%3A+A+rapid+and+ultrasensitive+point-of-care+testing+technique+for+multiple+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Introduction of graphene oxide-supported multilayer-quantum dots nanofilm into multiplex lateral flow immunoassay: A rapid and ultrasensitive point-of-care testing technique for multiple respiratory viruses.</a> Nano Res. 16 (2), 3063-3073 (2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric-fluorescent+dual-signal+enhancement+immunochromatographic+assay+based+on+molybdenum+disulfide-supported+quantum+dot+nanosheets+for+the+point-of-care+testing+of+monkeypox+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Colorimetric-fluorescent dual-signal enhancement immunochromatographic assay based on molybdenum disulfide-supported quantum dot nanosheets for the point-of-care testing of monkeypox virus.</a> Chem Eng J. 472, 144889(2023).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+MoS2%40QD+nanosheets+mediated+dual-mode+lateral+flow+immunoassay+for+flexible+and+ultrasensitive+detection+of+multiple+drug+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual-color MoS2@QD nanosheets mediated dual-mode lateral flow immunoassay for flexible and ultrasensitive detection of multiple drug residues.</a> Sensors Actuators B Chem. 403, 135142(2024).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+incorporation+of+quantum+dots+into+porous+microspheres+through+a+solvent-evaporation+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Efficient incorporation of quantum dots into porous microspheres through a solvent-evaporation approach.</a> Langmuir. 28 (14), 6141-6150 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+lateral+flow+immunoassay+for+highly+sensitive+detection+of+eight+anticoagulant+rodenticides+based+on+cadmium-free+quantum+dot-encapsulated+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent lateral flow immunoassay for highly sensitive detection of eight anticoagulant rodenticides based on cadmium-free quantum dot-encapsulated nanospheres.</a> Sensors Actuators B Chem. 324, 128771(2020).</li>
<li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+dendritic+mesoporous+silica+nanoparticles%27+surface+chemistry+for+quantum+dot+enrichment+and+an+ultrasensitive+lateral+flow+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Rational design of dendritic mesoporous silica nanoparticles' surface chemistry for quantum dot enrichment and an ultrasensitive lateral flow immunoassay.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 13 (18), 21507-21515 (2021).</li>
<li>Xu, L. D., Zhu, J., Ding, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoassay+of+SARS-CoV-2+nucleocapsid+proteins+using+novel+red+emission-enhanced+carbon+dot-based+silica+spheres%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Immunoassay of SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins using novel red emission-enhanced carbon dot-based silica spheres.</a> Analyst. 146 (16), 5055-5060 (2021).</li>
<li>Tao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-Cov-2+Spike-S1+antigen+test+strip+with+high+sensitivity+endowed+by+high-affinity+antibodies+and+brightly+fluorescent+QDs%2Fsilica+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">SARS-Cov-2 Spike-S1 antigen test strip with high sensitivity endowed by high-affinity antibodies and brightly fluorescent QDs/silica nanospheres.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 15 (23), 27612-27623 (2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ultrasensitive+fluorescent+immunochromatographic+assay+based+on+multilayer+quantum+dot+nanobead+for+simultaneous+detection+of+SARS-CoV-2+antigen+and+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of an ultrasensitive fluorescent immunochromatographic assay based on multilayer quantum dot nanobead for simultaneous detection of SARS-CoV-2 antigen and influenza A virus.</a> Sensors Actuators B Chem. 345, 130372(2021).</li>
<li>Chen, L., Chen, C., Li, R., Li, Y., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CdTe+quantum+dot+functionalized+silica+nanosphere+labels+for+ultrasensitive+detection+of+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">CdTe quantum dot functionalized silica nanosphere labels for ultrasensitive detection of biomarker.</a> Chem Commun. 19, 2670-2672 (2009).</li>
<li>Chu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+preparing+quantum+dot+nanospheres+with+narrow+size+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">A novel method for preparing quantum dot nanospheres with narrow size distribution.</a> Nanoscale. 2 (4), 542-547 (2010).</li>
<li>Zhang, P., Lu, H., Chen, J., Han, H., Ma, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+sensitive+detection+of+HBsAg+by+using+a+quantum+dots+nanobeads+based+dot-blot+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Simple and sensitive detection of HBsAg by using a quantum dots nanobeads based dot-blot immunoassay.</a> Theranostics. 4 (3), 307-315 (2014).</li>
<li>Ouyang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+on-site%2C+ultra-sensitive%2C+quantitative+sensing+method+for+the+determination+of+total+aflatoxin+in+peanut+and+rice+based+on+quantum+dot+nanobeads+strip%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">An on-site, ultra-sensitive, quantitative sensing method for the determination of total aflatoxin in peanut and rice based on quantum dot nanobeads strip.</a> Toxins. 9 (4), 137(2017).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+ciprofloxacin+on-site+rapid+detections+using+quantum+dot+microsphere+based+immunochromatographic+test+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative ciprofloxacin on-site rapid detections using quantum dot microsphere based immunochromatographic test strips.</a> Food Chem. 335, 127596(2021).</li>
<li>Chen, Y., Fu, Q., Xie, J., Wang, H., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high+sensitivity+quantum+dot-based+fluorescent+quenching+lateral+flow+assay+for+the+detection+of+zearalenone%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a high sensitivity quantum dot-based fluorescent quenching lateral flow assay for the detection of zearalenone.</a> Anal Bioanal Chem. 411 (10), 2169-2175 (2019).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+detection+using+quantum+dot+fluorescence+immunochromatography+combined+with+isothermal+amplification+and+CRISPR%2FCas13a%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a.</a> Biosens Bioelectron. 202, 113978(2022).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+quantum+dot+nanobead+lateral+flow+assay+for+facile+detection+of+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based quantum dot nanobead lateral flow assay for facile detection of varicella-zoster virus.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 107 (10), 3319-3328 (2023).</li>
<li>Liu, Y., Xiao, M., Xu, N., Yang, M., Yi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-need+quantitation+of+2%2C4-dichlorophenoxyacetic+acid+using+a+ratiometric+fluorescent+nanoprobe+and+a+smartphone-based+sensing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Point-of-need quantitation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a ratiometric fluorescent nanoprobe and a smartphone-based sensing system.</a> Sensors Actuators B Chem. 367, 132083(2022).</li>
<li>McCafferty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+collection+processing+and+handling+for+plasma+and+serum+proteomics+BT+-+Serum%2Fplasma+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood collection processing and handling for plasma and serum proteomics BT - Serum/plasma proteomics.</a> Methods Mol Biol. 2628, 33-40 (2023).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+quantitative+detection+of+C-reactive+protein+based+on+quantum+dots+and+immunofiltration+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Rapid and quantitative detection of C-reactive protein based on quantum dots and immunofiltration assay.</a> Int J Nanomedicine. 10, 6161-6173 (2015).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+quantitative+detection+of+C-reaction+protein+based+on+immunofluorescent+nanospheres+coupled+with+lateral+flow+test+strip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive and quantitative detection of C-reaction protein based on immunofluorescent nanospheres coupled with lateral flow test strip.</a> Anal Chem. 88 (12), 6577-6584 (2016).</li>
<li>Fan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-component+dual-readout+aggregation-induced+emission+nanobeads+for+qualitative+and+quantitative+detection+of+c-reactive+protein+at+the+point+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">One-component dual-readout aggregation-induced emission nanobeads for qualitative and quantitative detection of c-reactive protein at the point of care.</a> Anal Chem. 96 (1), 401-408 (2024).</li>
<li>Gui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+and+reverse+fluorescence+dual-signal+readout+immunochromatographic+assay+for+the+sensitive+determination+of+sibutramine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Colorimetric and reverse fluorescence dual-signal readout immunochromatographic assay for the sensitive determination of sibutramine.</a> ACS Omega. 9 (6), 7075-7084 (2024).</li>
</ol>

Pengfei Zhang jest założycielem Shanghai Kundao Biotech i ma potencjalne interesy finansowe w tej firmie.

W tym miejscu opisujemy protokół przygotowania nanokulek kropek kwantowych (QDNB)27 oraz zastosowania QDNB do przygotowania fluorescencyjnych testów immunologicznych z przepływem bocznym (LFIA). Przedstawiono jakościowy i ilościowy pomiar CRP w próbkach. Ten LFIA oparty na QDNB może być również stosowany do innych biomarkerów chorób 25,32, toksyn pokarmowych29,30, wirusów16,27 i innych.
Krytycznymi etapami tego protokołu jest przygotowanie koniugatów QDNB i QDNB-przeciwciało. Wielkość cząstek QDNB i zawartość QD w nanokulkach powinny być zoptymalizowane w celu uzyskania wysoce fluorescencyjnego QDNB z niskimi sygnałami tła w LFIA. Wychwytywanie i wykrywanie par przeciwciał ma kluczowe znaczenie dla testu immunologicznego i powinno być badane pod kątem najlepszych dopasowań od różnych dostawców. Koniugacja przeciwciała z QDNB powinna być zoptymalizowana, w tym stosunek przeciwciał do QDNB, pH buforu i odczynniki blokujące. W szczególności należy unikać agregacji QDNB i przeciwciał poprzez optymalizację pH buforu, stężenia soli i czasu reakcji w procedurach koniugacji.
W porównaniu z innymi metodami przygotowania nanokulek z kropek kwantowych, protokół ten ma zalety prostoty, łatwej obsługi i wysokiej wydajności. Co więcej, nanokulki z kompozytu polimerowego są biokompatybilne, w przeciwieństwie do nanokulek krzemionkowych, które zwykle wymagają dodatkowej modyfikacji powierzchni za pomocą polimerów. Jednak QDNB przygotowane przy użyciu tego protokołu nie są tak monodyspersyjne, jak te przygotowane przy użyciu nanokulek matrycowych polimeru19 lub krzemionki21 . Wielkość cząstek QDNB zwykle waha się od 70 nm do 200 nm.
Paski do testów immunologicznych z przepływem bocznym (LFIA) oparte na QDNB są przygotowywane podobnie jak inne fluorescencyjne LFIA. Ze względu na wysoką wydajność kwantową QDNB i wzmocnienie sygnału QDNB, LFIA oparta na QDNB wykorzystująca ten protokół jest bardziej czuła niż inne LFIA oparte na mikrosferach fluorescencyjnych, takie jak mikrosfery fluorescencyjne o rozdzielczości czasowej i mikrosfery fluoresceinowe. Ponadto stabilność QDNB jest lepsza niż w przypadku tradycyjnej fluoresceiny, dzięki czemu LFIA na bazie QDNB mają dłuższy czas przechowywania.
Jednak kadm na powierzchni kropek kwantowych jest podatny na chelatację grupami sulfhydrylowymi w białkach, zwłaszcza w środowisku wodnym. Unikanie stosowania wysokich stężeń białka ma kluczowe znaczenie dla stabilności LFIA opartych na QDNB. Kadm jest toksyczny, a jego zastosowanie jest w niektórych sytuacjach ograniczone, co wymaga przygotowania bezkadmowych kropek kwantowych o wysokiej wydajności kwantowej i stabilności.
Podsumowując, zapewniona jest wszechstronna metoda przygotowania nanokulek z kropek kwantowych w jednym kroku, która jest skalowalna do produkcji przemysłowej. Korzystając z przygotowanych QDNB, stworzono fluorescencyjne paski do testów immunologicznych z przepływem bocznym do jakościowego i ilościowego wykrywania biomarkerów choroby. Idealnym QDNB dla LFIA jest mały nanokulek otoczony licznymi QD bez wygaszania fluorescencji.

Paski do testów immunologicznych z przepływem bocznym (LFIA) służą jako kluczowe narzędzia do szybkiego wykrywania w miejscu opieki nad pacjentem1,2, szczególnie w badaniach przesiewowych chorób podczas epidemii. Jednak tradycyjne paski testowe LFIA na bazie złota koloidalnego wykazują niską czułość wykrywania i dostarczają tylko wyników jakościowych3. Aby zwiększyć czułość wykrywania LFIA, pojawiły się różne nowe nanocząstki, w tym kolorowe lateks4,5, nanocząstki fluorescencyjne 6, czasowo rozdzielcze mikrosfery fluorescencyjne7,8 oraz quantum dots9,10,11. Kropki kwantowe (QDs)12,13, znane również jako nanokryształy półprzewodnikowe, oferują regulowane długości fal emisji, szeroki zakres wzbudzenia i wysoką wydajność luminescencji, co czyni je idealnymi etykietami do obrazowania biologicznego.
Jednak sygnał fluorescencyjny emitowany przez poszczególne kropki kwantowe pozostaje słaby, co skutkuje stosunkowo niską czułością wykrywania w testach immunologicznych. Enkapsulacja wielu kropek kwantowych w mikrosferach może wzmacniać sygnały i poprawiać czułość testów immunologicznych opartych na kropkach kwantowych. Różne metody, takie jak samodzielny montaż warstwa po warstwie14,15,16,17,18, metoda pęcznienia19,20 oraz mikrosfera krzemionkowa21,22,23,24 enkapsulacji, zostały wykorzystane do hermetyzacji kropek kwantowych wewnątrz mikrosfer. Na przykład, funkcjonalizowane kropkami kwantowymi etykiety nanosfery krzemionki można osiągnąć poprzez zwiększenie obciążenia QD na immunoreakcję kanapkową25. Suszarka rozpyłowa wyposażona w rozpylacz ultradźwiękowy została również wykorzystana do przygotowania nanosfer QD-BSA w skali nanosup26. Jednak wyżej wymienione metody cierpią ze względu na złożoną wieloetapowość, wygaszanie fluorescencji i niską wydajność.
W naszej poprzedniej pracy27, opisano metodę odparowywania emulsji i rozpuszczalnika do hermetyzacji kropek kwantowych wewnątrz nanokulek polimerowych. Ta technika przygotowania jest prosta, utrzymuje wydajność fluorescencyjną QD, zapewnia wysoką wydajność enkapsulacji i pozwala na łatwą skalowalną produkcję. Kilka grup badawczych z powodzeniem opracowało paski LFIA przy użyciu QDNB przygotowanych tą metodą do zastosowań, w tym wykrywania toksyn pokarmowych28,29,30, wykrywanie biomarkerów chorób zakaźnych31,32 oraz monitorowanie środowiska33.
Ten protokół przedstawia konkretne kroki przygotowawcze dla nanokulek z kropkami kwantowymi (QDNB), QDNB i koniugacji przeciwciał, przygotowania LFIA na bazie QDNB oraz pomiaru białka C-reaktywnego (CRP) w próbkach ludzkiego osocza.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek (dimetyloamino)propylo)-N'-etylokarbodimidu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td></td></tr><tr><td>Papier absorpcyjny&nbsp;</td><td>Kinbio Biotech</td><td>CH37K</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>Kazeina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8654</td><td></td></tr><tr><td>CdSe/ZnS kropka kwantowa</td><td>Suzhou Mesolight Inc.</td><td>CdSe/ZnS-625</td><td></td></tr><tr><td>Choloroform</td><td>Sino Pharm</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CRP</td><td>Hytest Biotech</td><td>4C28</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny czytnik testów przepływu bocznego</td><td>Suzhou Helmence Precision Instrument</td><td>FIC-H1</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka z włókna szklanego</td><td>Kinbio Biotech</td><td>SB06</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik IgG</td><td>Sangon Biotech D111018</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa&nbsp;</td><td>Satorious</td><td>CN140</td><td></td></tr><tr><td>Kopolimer poli(bezwodnika styrenowo-maleinowego)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S458066</td><td></td></tr><tr><td>IgG Rabbit</td><td>Sangon Biotech D110502</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Sino Pharm</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek</td><td>sodu Sino Pharm</td><td>10019718</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Fluorescent Lateral Flow Immunoassay Based on Quantum Dots Nanobeads

Kropki kwantowe, znane również jako nanokryształy półprzewodnikowe, są nowatorskimi etykietami fluorescencyjnymi do obrazowania i wykrywania biologicznego. Jednak koniugaty kropka kwantowa-przeciwciało o małych wymiarach (~10 nm), przygotowane za pomocą pracochłonnych procedur oczyszczania, wykazują ograniczoną czułość w wykrywaniu niektórych śladowych markerów choroby za pomocą pasków do testów immunologicznych z przepływem bocznym. W niniejszej pracy przedstawiono metodę otrzymywania nanokulek z kropek kwantowych (QDNB) metodą jednoetapowego odparowywania emulsji. Korzystając z tak przygotowanego QDNB, stworzono fluorescencyjny test immunologiczny z przepływem bocznym w celu wykrycia biomarkerów choroby na przykładzie białka C-reaktywnego (CRP). W przeciwieństwie do nanocząstek z pojedynczą kropką kwantową, koniugaty nanokulek i przeciwciał w kropkach kwantowych są bardziej czułe jako znaczniki testów immunologicznych ze względu na wzmocnienie sygnału poprzez zamknięcie setek kropek kwantowych w jednym nanokulkach z kompozytu polimerowego. Co więcej, większy rozmiar QDNB ułatwia separację wirowania podczas koniugacji QDNB z przeciwciałami. Wyprodukowano fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na QDNBs, a stężenie CRP w próbce zmierzono w ciągu 15 minut. Wyniki testu można ocenić jakościowo przy oświetleniu światłem UV i zmierzyć ilościowo za pomocą czytnika fluorescencyjnego w ciągu 15 minut.

Procedury przygotowania QDNB przedstawiono schematycznie na Rysunku 1A. Fazę olejową zawierającą QD i polimer w chloroformie zmieszano z fazą wodną, a następnie za pomocą sonikacji uzyskano miniemulsję. Emulsję zestalono poprzez stopniowe odparowanie chloroformu. Mikrografia transmisyjna (TEM) QDNB przedstawiona jest na Rysunku 2A. QDNB mają morfologię sferyczną o średnich średnicach wynoszących 96 nm, wyznaczonych na podstawie 50 QDNB na obrazach TEM. Wewnątrz nanikulek wyraźnie obserwuje się nanocząstki QD, co wskazuje na skuteczną enkapsulację. Rysunek 2B i Rysunek 2D przedstawiają odpowiednio widma fluorescencji i absorpcji QDNB.
QDNB i przeciwciała zostały sprzężone z wykorzystaniem chemii karbodiimidowej, co przedstawiono na Ryc. 1B. Konjugat QDNB-przeciwciało został użyty do przygotowania LFIA opartego na QDNB. Budowa LFIA została zilustrowana na Ryc. 1C. Jeśli w próbce znajduje się antygen CRP, konjugaty QDNB-anty-CRP gromadzą się na linii testowej.
Jak pokazano na Rysunku 3, pomiar przeprowadza się poprzez dodanie 100 µL rozcieńczonej próbki do otworu na próbkę. Po 15 min czasie reakcji wyniki testu można odczytać jakościowo pod wpływem promieniowania UV. Wyniki ilościowe można uzyskać za pomocą czytnika pasków fluorescencyjnych, a stężenie próbki można obliczyć przy użyciu równania kalibracyjnego zawartego w oprogramowaniu czytnika pasków37,38.
<img alt="Synteza i zastosowanie kropek kwantowych: schematy sonikacji, koniugacji chemicznej PSMA, testu przepływu bocznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67000/67000fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ilustracja fluorescencyjnego immunoanalizy przepływu bocznego opartej na nanikulkach z kropek kwantowych. (A) Procedury przygotowania QDNB. (B) Zasada działania koniugatów QDNB-przeciwciało. (C) Zasada działania LFIA opartej na QDNB do wykrywania CRP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67000/67000fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz TEM nanocząstek; wykres widma; wykres absorbancji w funkcji długości fali; analiza optyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67000/67000fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Charakterystyka QDNBs. (A) Obraz TEM QDNBs. Pasek skali: 100 nm. (B) Widma emisji fluorescencyjnej QDNB. (C) Widma absorpcyjne QDNB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67000/67000fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykrywanie CRP za pomocą testu przepływu bocznego; obejmuje pasek testowy, wykres stężeń, spektrometr, wyniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67000/67000fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Procedury immunoanalizy przepływu bocznego dla CRP. (A) Schemat wykrywania. (B) Zdjęcia pasków LFIA opartych na QDNB wykrywających próbki CRP w zakresie 0-30 mg/L pod światłem UV. (C) Czytnik fluorescencyjny do ilościowego oznaczenia wyników. (D) Zdjęcie wyników ilościowych. (E) Wykrywanie białka C-reaktywnego (CRP) z zastosowaniem transformacji logistycznej, a następnie regresji liniowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67000/67000fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy protokół przygotowania nanokulek kropek kwantowych (QDNB) i wykrywania biomarkerów choroby za pomocą pasków do testów immunologicznych opartych na przepływie bocznym opartych na QDNB. Wyniki testu można ocenić jakościowo przy oświetleniu światłem UV i zmierzyć ilościowo za pomocą fluorescencyjnego czytnika pasków w ciągu 15 minut.

Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Quantum dots, also known as semiconductor nanocrystals, are novel fluorescent labels for biological imaging and sensing. However, quantum dot-antibody ...

Nasze zainteresowania badawcze koncentrują się obecnie na konstruowaniu wysokiej jakości wielofunkcyjnych nanomateriałów i ich zastosowaniu w rozwoju ultraczułej diagnostyki przyłóżkowej. Paski do testów immunologicznych z przepływem bocznym służą jako krytyczne narzędzia szybkiego wykrywania w miejscu opieki nad pacjentem, szczególnie w badaniach przesiewowych chorób podczas epidemii. Aby zwiększyć czułość wykrywania testów immunologicznych przepływu bocznego, pojawiły się różne nowe nanocząstki, w tym kolorowy lateks, nanocząstki fluorescencyjne z konwersją w górę, mikrosfery fluorescencyjne z wynikiem czasowym i kropki kwantowe.Zaprezentowaliśmy jednoetapową metodę odparowywania emulsji do otrzymywania nanokulek z kropek kwantowych i innych zastosowań w czułości, na przykład w bocznych testach fluoroimmunologicznych. W porównaniu z innymi metodami przygotowania nanokulek z kropek kwantowych, protokół ten ma tę zaletę, że jest uproszczony w obsłudze i ma wysoką wydajność. Dodatkowo nanokulki z kompozytu polimerowego są biokompatybilne, w przeciwieństwie do nanokulek krzemionkowych, które zazwyczaj wymagają dodatkowej modyfikacji powierzchni za pomocą polimerów.Czułe fluorescencyjne paski do testów immunologicznych z przepływem bocznym zostały opracowane przy użyciu przygotowanych nanokulek z kropek kwantowych. Paski te mogą być używane do jakościowego i ilościowego wykrywania biomarkerów choroby w miejscu opieki nad pacjentem. Ten nowy test może pomóc lekarzom w szybkim i dokładnym diagnozowaniu chorób.Na początek wymieszaj 0,4 mililitra roztworu bezwodnika polistyrenowo-ko-maleinowego i 0,1 mililitra roztworu QD, aby przygotować jeden mililitr fazy olejowej. Następnie wypełnij resztę chloroformem, aż objętość osiągnie jeden mililitr. Następnie przygotuj fazę wodną za pomocą roztworu dodecylosiarczanu sodu.Połączyć jeden mililitr fazy olejowej i pięć mililitrów fazy wodnej w fiolce. Umieścić fiolkę na mieszadle magnetycznym i włączyć ją. Po dokładnym wymieszaniu oleju i fazy wodnej należy natychmiast przenieść fiolkę do zaprogramowanego urządzenia ultradźwiękowego i włączyć zasilanie.Następnie umieścić fiolkę z powrotem na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej i mieszać w sposób ciągły przez noc. Po odparowaniu rozpuszczalnika dodaj 0,1 mililitra 0,1 milimolowego wodorotlenku sodu do zawiesiny nano kulek i pozwól mu reagować przez godzinę. Na początek dodaj 100 mikrolitrów przygotowanych nano kulek QD do 200 mikrolitrów buforu fosforanowego.Następnie dodaj sześć mikrolitrów EDC. Następnie inkubuj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej na mieszalniku obrotowym. Odwirować mieszaninę w temperaturze 13,523G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu fosforanowego do osadu. Przykryj rurkę pokrywką i zanurz ją w działającej ultradźwiękowej łaźni wodnej, aż osad zostanie całkowicie rozproszony. Rozproszyć 100 mikrogramów przeciwciała w 200 mikrolitrach buforu fosforanowego i dodać aktywowaną zawiesinę nano kulek QD do roztworu przeciwciała.Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut z ciągłą rotacją. Następnie usunąć nadmiar przeciwciał przez odwirowanie w stężeniu 6,010G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie wyrzucić supernatant. Aby zablokować nano kulki, dodaj 200 mikrolitrów 1% roztworu kazeiny do pozostałości.Przykryj probówkę pokrywką i zanurz ją w działającej ultradźwiękowej łaźni wodnej, aż pozostałość zostanie całkowicie zdyspergowana. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny z ciągłą rotacją. Do mieszaniny dodaj 100 mikrolitrów roztworu konserwującego i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego użycia.Aby rozpocząć, przygotuj roztwór do powlekania linii testowej i linii kontrolnej. Rozcieńczyć przeciwciało wychwytujące białko C-reaktywne i kozią immunoglobulinę przeciw królikowi G buforem fosforanowym. Następnie należy odpowiednio ułożyć płytę z polichlorku winylu i usunąć papier ochronny znajdujący się 25 milimetrów od krawędzi deski.Wyrównaj i przyklej membranę nitrocelulozową wzdłuż dolnej krawędzi pozostałego papieru ochronnego do płyty z polichlorku winylu. Dozuj roztwory powłok linii testowej i linii kontrolnej na membranę nitrocelulozową, upewniając się, że jest ona umieszczona w odległości 20 milimetrów od górnej krawędzi, tworząc linię testową. Do suszenia membranę nitrocelulozową należy umieścić w warunkach o wilgotności mniejszej niż 30% i zakresie temperatur od 18 do 26 stopni Celsjusza.Aby przygotować pad sprzężony, zanurz pad sprzężony w roztworze do leczenia padu sprzężonego. Następnie umieść namoczoną podkładkę sprzężoną w piecu do suszenia w celu wysuszenia przez noc. Przygotowany roztwór koniugatu przeciwciała QD nano bead rozcieńczyć roztworem konserwującym i dozować go na podkładkę koniugatu.W celu przygotowania podkładki do pobierania próbek zanurzyć podkładkę do pobierania próbek w roztworze do obróbki podkładki pod próbkę. Następnie umieść namoczoną podkładkę na próbkę w suszarce ustawionej na 45 stopni Celsjusza i susz przez 24 godziny. Kolejno umieść papier chłonny, podkładkę sprzężoną i podkładkę na próbkę na płycie z polichlorku winylu z membraną nitrocelulozową.Odpipetować 10 mikrolitrów próbki osocza lub roztworu kalibratora do jednego mililitra buforu PBS zawierającego 0,1%Tween 20. Następnie przenieś 100 mikrolitrów przygotowanej rozcieńczonej próbki na podkładkę na próbkę paska testowego. Po 15 minutach pracy obserwuj sygnały fluorescencyjne linii testowej i linii kontrolnej pod wpływem światła ultrafioletowego, aby uzyskać wyniki jakościowe.Włóż kartę paskową do czytnika fluorescencyjnego testu przepływu bocznego, aby uzyskać intensywności fluorescencji do analizy ilościowej.

fluorescent-lateral-flow-immunoassay-based-on-quantum-dots-nanobeads

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Wykorzystując technologię mikrosfer xMAP firmy Luminex Corporation, opracowaliśmy wielowiązkowy fluorometryczny test immunoenzymatyczny (MFIA) do nadzoru serologicznego różnych gatunków zwierząt laboratoryjnych. MFIA to zawiesinowa macierz mikrosfer, w której antygen, kontrola tkankowa lub immunoglobuliny są kowalencyjnie powiązane z kolorowo kodowanymi mikrosferami polistyrenowymi. Omówiono metodę testową MFIA oraz różne zagadnienia związane z rozwiązywaniem problemów.

Metodyka przeprowadzania i rozwiązywanie problemów w multipleksowym fluorometrycznym immunoprzebiegu

Ten film opisuje technikę testu immunologicznego wykorzystującą fluorescencyjne kulki magnetyczne lub mikrosfery w połączeniu z różnymi antygenami do jednoczesnego wykrywania różnych izotypów przeciwciał w próbce surowicy. Test jest pomocny w zrozumieniu serokonwersji podczas infekcji lub po szczepieniu.

Multianalitowy test immunobealikowy: Technika testu immunologicznego oparta na przepływie do jednoczesnego wykrywania wielu podtypów przeciwciał w próbce ludzkiej surowicy

Ten film demonstruje system mikroprzepływowy do testu immunologicznego opartego na magnetycznych nanocząsteczkach. System detekcji wykorzystuje urządzenie mikroprzepływowe zawierające pułapkę magnetyczną w swoich kanałach. Do kanałów wprowadzane są wstępnie uformowane immunokompleksy, składające się z pokrytych antygenem nanocząstek magnetycznych związanych z przeciwciałami pierwszorzędowymi i przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą. Immunokompleksy zostają wychwycone w...

Test immunologiczny oparty na nanocząstkach magnetycznych przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

Ten film demonstruje multipleksowane ilościowe wykrywanie bakterii za pomocą karboksylowanych magnetycznych mikrosfer polistyrenowych barwionych w różne zestawy. Procedura obejmuje tworzenie kompleksów perełkowo-bakteryjnych, separację magnetyczną i analizę opartą na przepływie, umożliwiając precyzyjne i jednoczesne oznaczanie ilościowe wielu bakterii w tym samym dołku reakcyjnym.

Multipleksowa ilościowa detekcja bakterii przy użyciu mikrosfer magnetycznych znakowanych barwnikiem

Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.

Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Opracowanie pasa immunochromatograficznego z przepływem bocznym do szybkiego i ilościowego wykrywania związków drobnocząsteczkowych

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Wychodząc naprzeciw pilnym potrzebom diagnostycznym dengi, przedstawiamy zintegrowane z aplikacją na smartfony papierowe urządzenie analityczne Dengue NS1 (DEN-NS1-PAD) do ilościowego określania stężenia antygenu dengi NS1 w próbkach klinicznych surowicy/krwi. Ta innowacja usprawnia zarządzanie dengą, wspomagając podejmowanie decyzji klinicznych w różnych placówkach opieki zdrowotnej, nawet tych o ograniczonych zasobach.

Przenośny papierowy test immunologiczny w połączeniu z aplikacją na smartfony do kolorymetrycznego i ilościowego wykrywania antygenu dengi NS1

Poznaj metodę przygotowania nanokulek kropek kwantowych i ich zastosowanie w fluorescencyjnym immunologicznym teście przepływu bocznego do szybkiej detekcji biomarkerów chorób w ciągu 15 minut.

Fluorescencyjny test immunologiczny przepływu bocznego oparty na nanokulkach kropek kwantowych

Przeglądaj więcej filmów