Name: Składanie organoidów siatkówki z mikroglejem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Odkryj metodę współkultury organoidów siatkówki z mikroglejem pochodzącym z ludzkich komórek macierzystych. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów patologicznych zwyrodnienia siatkówki i roli mikrogleji w chorobach neurodegeneracyjnych oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82101145) oraz Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (Z200014).

To badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Szpitala Tongren w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. Linia komórkowa H9 HESC pochodziła z Instytutu Badawczego WiCell. Przed eksperymentem należy wstępnie podgrzać pożywkę do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.
1. Wytwarzanie ludzkiego mikrogleju
<ol>
	<li>Hoduj hESC w pożywce dla komórek macierzystych, aż gęstość komórek osiągnie 80%-90%. Wysiewaj co najmniej 1 x 106 komórek w każdym dołku.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórkami macierzystymi i przepłukać komórki 1x DPBS (1 ml / dołek z płytką 6-dołkową). Następny krok wymaga 2 x 107-1 x 108 komórek. Jeśli to nie wystarczy, połącz komórki z 2-5 dołków, aby wykonać następujące czynności.</li>
	<li>Oddzielić kolonie komórek macierzystych za pomocą 0,5 mM roztworu EDTA przez około 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C (1 ml / dołek na płytce 6-dołkowej).</li>
	<li>Sprawdź morfologię kolonii po 5 minutach. Kiedy krawędzie kolonii są lekko zwinięte z luźnymi przerwami, komórki są gotowe do różnicowania i aspiracji EDTA. Jeśli nie, inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 1-2 minuty. Nie inkubować dłużej niż 8 minut.</li>
	<li>Delikatnie przepłukać komórki w każdym dołku za pomocą 6 ml pożywki A (Tabela 1) z 6 μl 10 mM roztworu inhibitora ROCK Y-27632. Delikatnie postukaj w dno naczynia, aby wypłukać komórki. Ustaw dzień jako dzień 0. 
	UWAGA: Nie pipetuj komórek. Następnego dnia komórki utworzą ciała zarodkowe (EB).</li>
	<li>Po 24 godzinach obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić tworzenie się EB. Zebrać EB do 15 ml probówki odśrodkowej z pipetą o pojemności 10 ml i poczekać, aż EB osiądną na dnie w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić EB za pomocą 6 ml świeżego podłoża A i przenieść je do nowej studzienki 6-dołkowej o niskiej przyczepności. Hodowla w inkubatorze w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Celem przeniesienia studzienki w dniu 1 jest zmniejszenie wpływu dużej liczby martwych komórek podczas procesu tworzenia EB, co może wpływać na stan wzrostu komórek.</li>
	<li>Odświeżaj świeżą pożywkę A codziennie do 4 dnia (6 ml / dołek na płytce 6-dołkowej).</li>
	<li>W dniu 4 należy pokryć 10-centymetrowe naczynie 3 ml 0,1% roztworu żelatyny rybnej przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Jeśli czas powlekania jest krótszy niż 1 godzina, trudno jest wykonać następujące kroki.</li>
	<li>Ostrożnie zebrać EB do 15 ml probówki odśrodkowej z pipetą 10 ml i poczekać, aż EB osiądną w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Usuń 0,1% roztwór żelatyny i opłucz naczynie o średnicy 10 cm 5-6 ml 1x DPBS. Usuń DPBS.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić EBs z 15 ml pożywki B (Tabela 1) w probówce odśrodkowej o pojemności 15 ml i przenieść je do powlekanej 10-centymetrowej szalki. Hodowla w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 tydzień. 
	UWAGA: W ciągu pierwszych 7 dni nie przesuwaj naczynia.</li>
	<li>Odświeżaj świeżą pożywką B raz w tygodniu do 49 dnia (naczynie 15 ml/10 cm) i badaj komórki pod mikroskopem raz w tygodniu. 
	UWAGA: Po 49 dniu w supernatancie w naczyniu hodowlanym można znaleźć kilka komórek wydzielniczych.</li>
	<li>Odwirować komórki sklarowane nad osadem przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki z 2 ml świeżej pożywki B i przenieść do nowej studzienki o niskiej przyczepności na płytce 6-dołkowej. Inkubować w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 i temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: W ciągu najbliższych 7 dni nie przesuwaj płytki. Mikroglej może przylegać do dna studni o niskiej przyczepności.</li>
	<li>W 56 dniu zastąp pożywką C (Tabela 1) (2 ml / dołek płytki 6-dołkowej). Mikroglej przylega do dna studzienki o niskiej przyczepności i pod mikroskopem będzie wyglądał na rozgałęziony. 
	UWAGA: Zmieniając pożywkę C co 3 dni (2 ml / dołek na płytce 6-dołkowej), mikroglej można hodować w podłożu C przez około 15 dni.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie ludzkich RO i współhodowla RO z mikroglejem
<ol>
	<li>Hodowano hESC w pożywce z komórek macierzystych, aż gęstość komórek osiągnie 80%-90%. Wysiewaj co najmniej 1 x 106 komórek w każdym dołku.</li>
	<li>Dodać Dispazę (1 ml / dołek z płytki 6-dołkowej) do komórki hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Odessać roztwór Dispase ze studni.</li>
	<li>Dodaj pożywkę D (Tabela 1) (1 ml / dołek z płytką 6-dołkową) do dołka. Pokrój komórkę na małe kawałki za pomocą pipety o pojemności 10 μl.</li>
	<li>Delikatnie zbierz wszystkie kawałki komórek i pożywkę w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zawieś komórki w 200 μl zimnej matrycy. Przenieś probówkę do mikrowirówki 1,5 do inkubatora na 20 minut. Pracuj szybko, ponieważ matryca zestala się w temperaturze pokojowej (RT). Po 20 minutach w inkubatorze matryca zestala się.</li>
	<li>Przygotuj 10-centymetrowe naczynie z 15 ml pożywki D. Ponownie zawiesić matrycę z pożywką D i delikatnie wstrząsnąć szalką Petriego.</li>
	<li>Następnie umieść naczynie w inkubatorze na 5 dni. Nie przesuwaj płyty. Ustaw dzień jako dzień 0 (RO). Komórki przylegają w ciągu 3 dni.</li>
	<li>W dniu 5 (RO) i dniu 10 (RO) odśwież pożywkę za pomocą Medium D.</li>
	<li>W dniu 12 (RO) usuń pożywkę i dodaj 3 ml Dispase do każdego dania przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać Dyspazę i dodać 15 ml pożywki E (Tabela 1).</li>
	<li>Zbiór mikrogleju: W 56 dniu (MG) delikatnie odessać pożywkę C, dodać Akutazę (1 ml/dołek z płytki 6-dołkowej) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Zebrać komórki mikrogleju do probówki odśrodkowej o pojemności 15 ml z pipetą o pojemności 5 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Delikatnie odessać supernatant i zawiesić mikroglej za pomocą 1 ml pożywki E. Dodać mikroglej do strawionych RO w dniu 12. 
	UWAGA: W dniu 12 (RO) komórki są adhezyjne. W dniu 13 (RO) komórki znajdują się zawieszone w podłożu E. Jeśli podłoże zmieni kolor na żółty od dnia 12 (RO) do dnia 19 (ROs), odśwież podłoże za pomocą Medium E.</li>
	<li>W dniu 19 (RO) agreguj organoidy do środka naczynia, delikatnie obracając płytkę. Delikatnie zassać Medium E i odświeżyć pożywkę za pomocą Medium F.</li>
	<li>Przenieść organoidy z pożywką F do nowego naczynia do zawiesiny.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę raz w tygodniu i wybieraj organoidy do eksperymentów.</li>
</ol>

Microglia-Integrated Retinal Organoids: A Model for Studying Retinal Diseases

<ol><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).</li>
<li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+induction+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (170), e62298(2021).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+pu.1-+and+irf8-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).</li>
<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>O'koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+function+is+distinct+in+different+anatomical+locations+during+retinal+homeostasis+and+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration.</a> Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).</li>
<li>Margeta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+impairs+the+response+of+neurodegenerative+retinal+microglia+and+prevents+neuronal+loss+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma.</a> Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+innate+responses+in+microglia+derived+from+retinoblastoma+patient-specific+IPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs.</a> Glia. 72 (5), 872-884 (2024).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+microglia+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+empower+retinal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ.</a> Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).</li>
<li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruct+human+retinoblastoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstruct human retinoblastoma in vitro.</a> J Vis Exp. (188), e62629(2022).</li>
<li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPS-cell-derived+microglia+promote+brain+organoid+maturation+via+cholesterol+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer.</a> Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).</li>
<li>Usui-Ouchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+human+ipsc-derived+macrophage+progenitors+into+retinal+organoids+to+generate+a+mature+retinal+microglial+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche.</a> Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).</li>
<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+microglia-like+cells+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie są świadomi żadnych powiązań, członkostwa, grantów ani udziałów finansowych, które mogłyby wpłynąć na obiektywność tego badania.

Ze względu na ograniczoną dostępność ludzkiej siatkówki, nasze obecne zrozumienie reakcji zapalnych siatkówki pochodzi prawie z modeli zwierzęcych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zróżnicowano organoidy siatkówki. Rozwój modeli organoidów siatkówki jest aktywnym obszarem badań, mających na celu podsumowanie złożoności ludzkiej siatkówki w celu modelowania chorób i rozwoju terapeutycznego. Kilka badań wykazało pomyślne wygenerowanie organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych 1,2,12,13. Jednak większość z tych modeli nie uwzględnia obecności mikrogleju, o którym wiadomo, że odgrywa kluczową rolę w rozwoju siatkówki i patogenezie choroby. Ostatnie badania próbowały zintegrować mikroglej z organoidami siatkówki lub modelami organoidów mózgu 16,17,18, ale szczegółowa metoda jest niejasna. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący kohodowli mikrogleju z organoidami siatkówki we wczesnym stadium, które pochodzą z tej samej linii hESC. Podczas gdy niektóre badania badały rolę mikrogleju w chorobach siatkówki przy użyciu modeli zwierzęcych lub systemów hodowli komórkowych 7,8,9, przedstawiony tutaj model kohodowli oferuje bardziej fizjologicznie istotny system oparty na człowieku do badania interakcji mikrogleju-siatkówki i ich implikacji w patogenezie choroby.
Krytycznymi etapami są stan komórkowy ludzkich komórek macierzystych oraz różnicowanie mikrogleju i organoidów siatkówki. Mikroglej i RO należy rozróżniać krok po kroku, a na różnych etapach należy stosować odpowiednie odczynniki i szalkę (naczynie poddane hodowli tkankowej lub naczynie zawiesinowe). Model ten może pomóc nam zrozumieć proces, w jaki sposób mikroglej przyczynia się do występowania chorób siatkówki. Ma to istotne implikacje dla przyszłych badań przesiewowych leków i badań nad mechanizmami choroby. Jednak metody, które obecnie publikujemy, nadal mają pewne ograniczenia. Ze względu na wydłużony okres różnicowania mikrogleju i brak odpowiednich metod kriokonserwacji, powinniśmy mądrze planować nasz czas na różnicowanie mikrogleju i organoidów siatkówki do kohodowli.
Oprócz organoidów siatkówki uważamy, że integracja komórek odpornościowych z innymi modelami organoidów może również sprzyjać rozwojowi organoidów. Dlatego kluczowe znaczenie ma testowanie innych układów organoidowych. Integracja różnych typów komórek i organoidów w celu utworzenia kompletnych narządów stanowi obiecujący model na przyszłość.

Jako ograniczone źródło ludzkiej siatkówki, różnicowanie ludzkich komórek macierzystych w trójwymiarowe (3D) organoidy siatkówki stanowi obiecujący model in vitro do symulacji siatkówki1. Zawiera różne typy komórek w siatkówce, w tym fotoreceptory, komórki zwojowe siatkówki, komórki dwubiegunowe, komórki Müllera, komórki poziome i astrocyty2. Model ten umożliwia emulację i badanie zarówno mechanizmów rozwoju siatkówki, jak i patogenezy chorób siatkówki. Jednak ze względu na metodę różnicowania kierunkowego, organoidy siatkówki pochodziły z neuroektodermy3, bez wielu innych typów komórek pochodzących z różnych listków rozrodczych, takich jak mikroglej z woreczka żółtkowego i komórki okołonaczyniowe z mezodermy4,5,6.
Obecnie udowodniono, że wiele chorób siatkówki, takich jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki7, jaskra8, oraz retinoblastoma9, są ściśle związane z mikroglejem w siatkówce. Jednak ze względu na brak odpowiednich modeli badawczych konkretne mechanizmy ilustrujące związek między mikroglejem a tymi chorobami nadal pozostają niejasne. Podczas gdy myszy służyły jako korzystny model do badania chorób siatkówki, ostatnie badania wykazały znaczące różnice między mysim a ludzkim mikroglejem pod względem długości życia, tempa proliferacji i braku ludzkich genów homologicznych10,11. Odkrycia te sugerują, że wnioski wyciągnięte z modeli mysich mogą nie być w pełni wiarygodne, co podkreśla znaczenie konstruowania ludzkich organoidów siatkówki zawierających mikroglej.
W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano różne metody różnicowania 3D organoidów siatkówki12,13. Aby ułatwić kohodowlę mikrogleju w organoidach siatkówki, wybraliśmy metodę różnicowania polegającą na przejściu od hodowli przylegającej do zawiesiny. Takie podejście z powodzeniem umożliwia włączenie mikrogleju do organoidów siatkówki, utrzymując je przez co najmniej 60 dni14.

<table><tbody><tr><td>Acctuase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07920</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr>Przeciwciało<td>anty-CRX(M02)</td><td>abnova</td><td>H00001406-M02</td><td>; rozcieńczenie zgodnie z zaleceniami producenta</td></tr><tr>Przeciwciało<td>anty-IBA1</td><td>Abcam</td><td>ab5076</td><td>; rozcieńczenie zgodnie z instrukcjami producenta</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologie</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Dypaza (1U/ml)</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>07923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G7041-100G</td><td>Solid</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>H9 linia komórkowa</td><td>WiCell Research Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>RD Systems&nbsp;</td><td>203-IL-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-34</td><td>PeproTech</td><td>200-34-50UG</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>RD Systems&nbsp;</td><td>216-MC-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nieistotny roztwór aminokwasów</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pióro/paciorkowiec</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka dla komórek macierzystych&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5990</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>X-ViVO</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr></tbody></table>

składanie organoidów siatkówki z mikroglejem

Assembling Retinal Organoids with Microglia

Ze względu na ograniczony dostęp do ludzkiej siatkówki, organoidy siatkówki (RO) są najlepszym modelem do badania chorób siatkówki u ludzi, co może ujawnić mechanizm rozwoju siatkówki i występowanie chorób siatkówki. Mikroglej (MG) to unikalne makrofagi rezydujące w siatkówce i ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), pełniące kluczowe funkcje odpornościowe. Jednak organoidy siatkówki nie mają mikrogleju, ponieważ ich źródłem różnicowania jest woreczek żółtkowy. Specyficzna patogeneza mikrogleju w tych chorobach siatkówki pozostaje niejasna; Dlatego konieczne okazuje się stworzenie modelu organoidu siatkówki z udziałem mikrogleju. W tym przypadku udało nam się skonstruować model współhodowlany organoidów siatkówki z mikroglejem pochodzącym z ludzkich komórek macierzystych. W tym artykule rozróżniliśmy mikroglej, a następnie wspólnie wyhodowaliśmy go z organoidami siatkówki we wczesnym stadium. Jako inkorporacja komórek odpornościowych, model ten zapewnia zoptymalizowaną platformę do modelowania chorób siatkówki i badań przesiewowych leków, aby ułatwić dogłębne badania nad patogenezą i leczeniem chorób siatkówki i chorób związanych z OUN.

Procedura generowania organoidów siatkówki została opisana w naszej poprzedniej pracy15. Poniżej przedstawiamy reprezentatywne wyniki dla mikrogleju oraz kokultury mikrogleju z organoidami siatkówki.
W niniejszej pracy przedstawiamy każdy etap różnicowania mikrogleju (Rysunek 1A). Dzień 0 reprezentuje etap hodowli komórek macierzystych. Następnie komórki macierzyste poddano trawieniu i hodowli w celu formowania ciał embroidalnych (EB). W ciągu pierwszych 4 dni procesu komórki formują EB (Rysunek 1B). Następnie zawiesinę EB przenosimy na adherentne szalki 10 cm. Po około 7 dniach komórki przypominają te przedstawione na Rysunku 1C. W miarę postępu hodowli komórki adherentne wydzielają progenitorów hematopoetycznych do nadsączu (Rysunek 1D). Proces ten trwa około 45 dni. Na tym etapie komórki można zebrać z nadsączu i przenieść na płytki 6-dołkowe. W ciągu kolejnych 7 dni mikroglej dojrzeje (Rysunek 1E) i będzie gotowy do dalszych doświadczeń.
W 12. dniu różnicowania organoidów siatkówki komórki adherentne poddaje się trawieniu w celu uzyskania hodowli zawiesinowej, a następnie do organoidów siatkówki dodaje się Medium E zawierające mikroglej. Mikroglej migruje do wnętrza organoidów siatkówki. Aby wyraźnie zaobserwować morfologię mikrogleju, przeprowadzono transfekcję hESC lentiwirusem EGFP, dzięki czemu zróżnicowany mikroglej wykazuje ekspresję GFP i autofluorescencję (zieloną) (Rysunek 2A-C). Zbadzano również strukturę tkankową organoidów siatkówki współhodowanych z mikroglejem, wykorzystując marker fotoreceptorów CRX oraz marker mikrogleju IBA1 w analizie immunofluorescencyjnej organoidów siatkówki z mikroglejem po 50 dniach różnicowania (Rysunek 2D).
<img alt="Schemat procesu różnicowania komórek macierzystych; hESC do mikrogleju z wymianą pośrodków w ciągu 63 dni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67016/67016fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat i oś czasu powstawania komórek mikrogleju pochodzących z hESC. (A) Protokół rozpoczyna się od rozmrożenia i pasażowania hESC w płytce 6-dołkowej. (B) Tworzenie jednorodnych ciał embrioidalnych (EB) w obecności Medium A. (C) EB są przenoszone do powlekanej płytki, a w dniach 4–56 tworzą się progenitorzy hematopoetyczne. (D, E) W 56. dniu pobiera się supernatant z komórkami (D) i przenosi go do 6-dołkowej płytki o niskiej adhezji, aby w 63. dniu uzyskać mikroglej (E). Pasek skali: 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/67016fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment różnicowania komórek; mikroskopia fluorescencyjna EGFP; analiza organoidów, porównanie wyników." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67016/67016fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy w czasie trwania współhodowli mikrogleju i organoidów siatkówki. (A) Reprezentatywne obrazy komórek mikrogleju pochodzących z EGFP-hESC. (B) Współhodowla mikrogleju EGFP+ z organoidami siatkówki po 18 dniach różnicowania. (C) Współhodowla mikrogleju EGFP+ z organoidami siatkówki po 30 dniach różnicowania. Pasek skali: 300 µm. (D) Do wykrycia struktury tkankowej organoidów siatkówki współhodowanych z mikroglejem po 50 dniach różnicowania zastosowano CRX (marker komórek fotoreceptorowych; czerwony) i IBA1 (marker mikrogleju; zielony). DAPI (niebieski) barwi jądra komórkowe. Pasek skali: 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/67016fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Skład pożywek użytych w niniejszym badaniu.W tabeli wymieniono składniki niezbędne do przygotowania 500 mL każdej z pożywek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/Table%201-67016R1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Mikroglej to unikalne komórki odpornościowe rezydentne w siatkówce, odgrywające kluczową rolę w różnych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. Stworzenie modelu kohodowli organoidów siatkówki z mikroglejem może ułatwić lepsze zrozumienie patogenezy i postępów w rozwoju chorób siatkówki.

Składanie organoidów siatkówki z mikroglejem

Due to the limited accessibility of the human retina, retinal organoids (ROs) are the best model for studying human retinal disease, which could reveal ...

Na początek uzyskaj ludzkie embrionalne komórki macierzyste w pożywce z komórkami macierzystymi o gęstości komórek od 80 do 90%Po usunięciu zużytego podłoża przepłucz komórki w każdej studzience jednym mililitrem 1X DPBS. Inkubować kolonie komórek macierzystych w każdym dołku z jednym mililitrem 0,5 milimolowego EDTA przez około pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Sprawdź morfologię kolonii, aby upewnić się, że krawędzie są lekko zawinięte z luźnymi przerwami.Odessać EDTA i, jeśli to konieczne, inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejną jedną do dwóch minut, ale nie dłużej niż osiem minut. Delikatnie przepłucz komórki w każdej studzience sześcioma mililitrami pożywki A zawierającej sześć mikrolitrów 10-milimolowego roztworu inhibitora skał Y27632. Delikatnie postukaj w dno naczynia, aby wypłukać komórki.Po 24 godzinach obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić formowanie się ciała zarodka. Za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów zbierz ciała zarodków do 15-mililitrowej rurki odśrodkowej i poczekaj, aż ciała zarodków osiądą na dnie przez pięć minut. Następnie ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić ciała zarodków w sześciu mililitrach świeżej pożywki A. Przenieść je do nowej studzienki o niskiej przyczepności na płytce sześciodołkowej i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Czwartego dnia pokryj 10-centymetrowe naczynie trzema mililitrami 0,1% roztworu żelatyny rybnej i inkubuj przez co najmniej godzinę w inkubatorze o temperaturze 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie usuń roztwór żelatyny i opłucz naczynie raz pięcioma do sześciu mililitrami 1X DPBS. Ostrożnie zbierz ciała zarodków do 15-mililitrowej rurki odśrodkowej i poczekaj, aż ciała zarodków osiądą na dnie w ciągu pięciu minut.Delikatnie ponownie zawiesić ciała zarodków za pomocą 15 mililitrów pożywki B i przenieść je do powlekanej 10-centymetrowej szalki. Hodowla w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez tydzień. Po 49 dniach odwirować komórki w temperaturze 200G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą dwóch mililitrów świeżej pożywki C. Przenieść do nowego dołka o niskiej przyczepności na płytce sześciodołkowej. Inkubuj płytkę w inkubatorze o temperaturze 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza. W 56 dniu zastąp zużytą pożywkę dwoma mililitrami pożywki C na dołek.Zbadaj płytkę pod mikroskopem, aby zidentyfikować rozgałęziony mikroglej przylegający do dna studzienki o niskiej przyczepności. Aby zebrać mikroglej do wspólnej hodowli, delikatnie zastąp podłoże C w każdym dołku jednym mililitrem Accutazy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Za pomocą pięciomililitrowej pipety zbierz komórki mikrogleju do 15-mililitrowej probówki i odwiruj komórki w temperaturze 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po odrzuceniu supernatantu zawiesić mikroglej za pomocą jednego mililitra pożywki E.To rozpocząć, uzyskać ludzki mikroglej z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i zebrać je w 56 dniu. W celu uzyskania organoidów siatkówki hoduj ludzkie embrionalne komórki macierzyste w pożywce z komórek macierzystych, aż gęstość komórek osiągnie 80 do 90% Dodaj jeden mililitr wyświetlaczy na studzienkę do komórek hodowlanych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po wyjęciu wyświetlaczy dodaj jeden mililitr pożywki D do każdej studzienki.Pokrój komórki na małe kawałki za pomocą pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Delikatnie zbierz wszystkie kawałki komórek i pożywkę do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Odwirować probówkę o sile 200 G przez pięć minut.Po usunięciu supernatantu delikatnie ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach zimnej matrycy. Przenieś 1,5-mililitrową mikrorurkę wirówkową do inkubatora na 20 minut. Po 20 minutach w inkubatorze matryca zestala się.Przygotuj 10-centymetrowe naczynie z 15 mililitrami pożywki D. Ponownie zawieś matrycę z podłożem D i delikatnie potrząśnij szalką Petriego. Umieść naczynie w inkubatorze na pięć dni. W dniu 12 zastąp pożywkę trzema mililitrami choroby.Po pięciu minutach odessać Dispase i dodać 15 mililitrów pożywki E. Wprowadzić zebrany mikroglej do strawionych organoidów siatkówki w 12 dniu. W dniu 19 delikatnie zakręć płytką, aby zebrać organoidy do środka szalki i zastąp pożywkę E pożywką F. Na koniec przenieś organoidy z pożywką F do nowej płytki zawiesinowej. Do 30 dnia organoidy siatkówki współhodowane z mikroglejem wykazywały znaczną autofluorescencję GFP wskazującą na obecność mikrogleju.Hodowane wspólnie organoidy siatkówki wykazywały wyraźne sygnały immunofluorescencyjne dla markera fotoreceptora CRX i markera mikrogleju IBA1.

assembling-retinal-organoids-with-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu z rezydującym mikroglejem poprzez włączenie do rozwoju organoidów komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do rozwoju organoidów.

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Niniejszy film prezentuje trzy rodzaje analiz morfometrycznych siatkówki, obejmujące pomiar grubości wewnętrznej warstwy jądrowej, określenie liczby komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz pomiar wielkości RGCs. Technika ta może stanowić prostą, a zarazem naukową platformę do przeprowadzania analiz morfometrycznych.

Analizy morfometryczne przekrojów siatkówki

Ten artykuł wideo ilustruje przygotowanie, procedury łatania ciał komórkowych oraz sposób implementacji dynamicznych zapisów zaciskowych z komórek zwojowych w całych siatkówkach myszy. Technika ta pozwala na zbadanie dokładnego udziału pobudzających i hamujących wejść synaptycznych oraz ich względnej wielkości i czasu na impulsy neuronalne.

Implementacja dynamicznego zacisku z przewodnictwem synaptycznym i sztucznym w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Odkryj metodę współkultury organoidów siatkówki z mikroglejem pochodzącym z ludzkich komórek macierzystych. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów patologicznych zwyrodnienia siatkówki i roli mikrogleji w chorobach neurodegeneracyjnych oka.

Składanie organoidów siatkówki z mikroglejem

Przeglądaj więcej filmów