Name: Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj dwukolorową mikroskopię CLEM do wizualizacji interakcji mitochondriów z lizosomami w komórkach HeLa. Ta metoda łączy zalety mikroskopii świetlnej i elektronowej w badaniach nad kontrolą jakości mitochondriów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez podstawowy program badawczy KBRI przez Korea Brain Research Institute finansowany przez Ministerstwo Nauki i ICT (24-BR-01-03). Plazmidy TMEM192-V5-APEX2 zostały dostarczone dzięki uprzejmości Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). Dane TEM uzyskano w Brain Research Core Facilities w KBRI.

Przebieg pracy krok po kroku dla przygotowania próbki jest pokazany w Rysunek 1.
1. Hodowla komórkowa i transfekcja
<ol>
	<li>Hodować komórki HeLa o gęstości 1 × 105 komórek na szklanych szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm z siatką, zawierających DMEM, z 10% płodową surowicą bydlęcą i 100 U/ml penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dzień po wysianiu komórek należy przeprowadzić transfekcję komórek przy 30%-40% konfluencji z plazmidami TMEM192-V5-APEX2 i Mito-mEosEM za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta (po 1 μg plazmidowego DNA TMEM192-V5-APEX2 i Mito-mEosEM z 3 μl odczynnika do transfekcji). Po transfekcji potraktuj komórki DMSO lub U18666A (2 μg/ml) i bafilomycyną A1 (100 nM) przez 18 godzin.</li>
</ol>
2. Konfokalne obrazowanie mikroskopowe
<ol>
	<li>Po potraktowaniu komórek bafilomycyną i U18666A przez 18 godzin, usunąć pożywkę hodowlaną i natychmiast dodać 250 μl ciepłego (30 °C-37 °C) roztworu utrwalającego (2,5% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w 0,1 M roztworze kakodylanu sodu [pH 7,0]) przez delikatne pipetowanie. Natychmiast usunąć utrwalacz, zastąpić go 1,5 ml świeżego utrwalacza i inkubować na lodzie przez 30 minut. Następnie myj komórki przez 3 x 10 minut w 1 ml lodowatego 0,1 M buforu kakodylanu sodu. 
	UWAGA: Opary aldehydu są toksyczne. Wszystkie eksperymenty powinny być przeprowadzane w wentylowanym dygestorium.</li>
	<li>Dodać 1 ml zimnego 20 mM roztworu glicyny w celu ugaszenia aldehydu i inkubować na lodzie przez 10 minut. Przemyć 3 x 10 min w zimnym 0,1 M buforze kakodylanu sodu.</li>
	<li>Przygotować świeży roztwór zawierający 300 μM Amplex-Red, dodając 10 mM H2O2 do 0,1 M roztworu kakodylanu. Dodać 500 μl roztworu Amplex-Red do naczynia na próbkę i inkubować przez 5 minut na lodzie.</li>
	<li>Usunąć roztwór Amplex-Red i przepłukać 3 x 10 minut 0,1 M buforem kakodylanu sodu.</li>
	<li>Po barwieniu Amplex-Red użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować obszar wokół interesujących komórek w trybie skanowania kafelków 3 x 3. Uchwyć zarówno różnicowy kontrast interferencyjny (DIC), jak i sygnał fluorescencyjny, aby zidentyfikować i zarejestrować siatkę i litery na czaszy siatki za pomocą obiektywu 40x (lub 60x). 
	UWAGA: Te obrazy poglądowe służą jako mapa do identyfikacji określonych komórek docelowych w próbkach osadzonych w plastiku.</li>
	<li>Zobrazuj komórki docelowe w dużym powiększeniu za pomocą obiektywu 40x (lub 60x) i uzyskaj obraz Z-stack. 
	UWAGA: Ten obraz w dużym powiększeniu jest nakładany na obraz z mikroskopu elektronowego w celu utworzenia obrazu korelacyjnego.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki do bloku EM
<ol>
	<li>Po obrazowaniu LM dodać 1 ml 1% zredukowanego tetratlenku osmu (przygotowanego przez zawartość 3% żelazocyjanku potasu w 0,3 M buforze kakodylowym o równej objętości 2% wodnego roztworu tetratlenku osmu) w celu końcowego utrwalenia w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, a następnie płukać przez 3 x 10 minut wodą destylowaną o temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Opary tetratlenku osmu są toksyczne. Wszystkie eksperymenty powinny być wykonywane w wentylowanym dygestorium.</li>
	<li>Płukać 3 x 10 minut wodą destylowaną o temperaturze pokojowej, a następnie odwadniać w sortowanym etanolu przez 15 minut za każdym razem (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% i 100%) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wymieszaj etanol z żywicą epoksydową w proporcjach objętościowych 3:1, 1:1 i 1:3, przygotowując łącznie 300 μl każdej mieszanki. Wlej każdą żywicę epoksydową do naczynia, pozwalając jej inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie użyj 100% żywicy epoksydowej do impregnacji przez noc.</li>
	<li>Przygotuj kapsułkę do zatapiania lub probówkę do PCR, wypełniając ją świeżą żywicą epoksydową, umieść probówkę lub kapsułkę do góry nogami w obszarze zainteresowania i umieść w piekarniku w temperaturze 60 °C na 48 godzin w celu polimeryzacji.</li>
</ol>
4. Przekroje i obrazowanie TEM
<ol>
	<li>Po całkowitej polimeryzacji żywicy epoksydowej należy oddzielić dolne szkło od bloku polimerowego, zanurzając je w ciekłym azocie.</li>
	<li>Umieść blok próbki w uchwycie na próbkę ultramikrotomu i umieść go w bloku przycinania. Użyj żyletki, aby przyciąć żywicę do kształtu trapezowego lub prostokątnego wokół interesującego obiektu.</li>
	<li>Umieść przycięty blok próbki w uchwycie na próbkę i wyreguluj tarczę diamentową. Upewnij się, że krawędź przednia bloku próbki jest idealnie równoległa do krawędzi tarczy diamentowej.</li>
	<li>Za pomocą ultramikrotomu wytnij ultracienkie odcinki około 60-70 nm od płasko osadzonych komórek. Zbierz sekcje szeregowe na siatce szczelinowej pokrytej formvarem i wysusz je na płycie grzejnej.</li>
	<li>Zabarwić skrawek barwnikiem kontrastowym przez 2 minuty i cytrynianem ołowiu przez 1 minutę.</li>
	<li>Umieścić siatkę w uchwycie na próbkę TEM w celu obserwacji. Zidentyfikuj komórkę docelową zainteresowania na podstawie obrazu DIC z mikroskopu świetlnego. Zobrazuj cały obszar komórki za pomocą kafelkowych, nakładających się obrazów w powiększeniu 1,700x.</li>
</ol>
5. Łączenie obrazów za pomocą imageJ Fidżi.
<ol>
	<li>Aby rozpocząć zszywanie obrazów, uruchom imageJ Fiji25 i kliknij Plik | Nowość | TrakEM2 (pusty) | Wybierz folder przechowywania, aby utworzyć nowy projekt TrakEM226 (Rysunek 2A1).</li>
	<li>Otwórz zestaw danych obrazu kafelka, przeciągając i upuszczając nieprzetworzone dane obrazu kafelka do obszaru roboczego (Rysunek 2A2).</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Wyrównaj | Montaż wszystkich obrazów w tej warstwie | sprężysty (nieliniowe korespondencje blokowe), a następnie kliknij przycisk OK, aby zaakceptować wartości domyślne pozostałych parametrów (Rysunek 2A3).</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Eksportuj | Utwórz płaski obraz, aby utworzyć zszyty obraz, a następnie kliknij Plik | Zapisz jako, aby zapisać obraz.</li>
</ol>
6. Zmiana rozmiaru obrazu fluorescencji
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do powiększania zdjęć (patrz Spis materiałów). Kliknij Plik | Otwórz i wybierz obraz fluorescencyjny.</li>
	<li>Wprowadź szerokość i wysokość tak, aby miały taki sam rozmiar jak obraz z mikroskopu elektronowego, a następnie wybierz algorytm, który ma zostać zastosowany w metodzie zmiany rozmiaru (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2B1).</li>
	<li>Kliknij Plik | Zapisz jako, aby zapisać obraz o zmienionym rozmiarze.</li>
</ol>
7. Rejestracja obrazu na podstawie punktów orientacyjnych za pomocą wtyczki Big Warp
<ol>
	<li>Otwórz ImageJ Fiji i przeciągnij i upuść mikrofotografię fluorescencyjną o zmienionym rozmiarze (obraz FM) oraz zszytą mikrofotografię elektronową (obraz EM).</li>
	<li>Kliknij Wtyczki | Przeglądarka BigData | Big Wrap, aby rozpocząć rejestrację, a następnie kliknij menu rozwijane, aby wybrać obraz FM jako ruchomy obraz i obraz EM jako obraz docelowy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C1). 
	UWAGA: Każdy obraz FM i EM będzie miał trzy nowe wyskakujące okienka (ruchomy obraz BigWrap, stały obraz BigWrap i punkty orientacyjne) do wyświetlania punktów orientacyjnych.</li>
	<li>Porównaj obrazy FM i EM za pomocą takich funkcji, jak powiększanie (kółko myszy), obracanie obrazu (poruszanie myszą przy przytrzymaniu lewego przycisku) i poruszanie (poruszanie myszą przy przytrzymaniu prawego przycisku), a następnie naciśnij spację na klawiaturze, aby włączyć tryb punktu orientacyjnego, a następnie naciśnij lewy przycisk myszy, aby zaznaczyć co najmniej trzy punkty orientacyjne zidentyfikowane na obrazach FM i EM ( <silna klasa="xfig">Rysunek 2C2, różowe kropki i czerwona strzałka).</li>
	<li>Po zaznaczeniu wszystkich zidentyfikowanych punktów orientacyjnych przejdź do punktu menu Plik | Eksport ruchomego obrazu | OK i pojawi się nowe wyskakujące okienko z przekształconym obrazem FM (Rysunek 2C3). 
	UWAGA: Nowo utworzone wyskakujące okienko to obraz FM przekształcony na podstawie punktu orientacyjnego. Przejrzyj wyrównanie i w razie potrzeby wprowadź poprawki, dodając lub modyfikując punkty orientacyjne i ponownie obliczając transformację.</li>
	<li>Kliknij Plik | Zapisz jako, aby zapisać przekształcony obraz FM.</li>
</ol>
8. Nakładanie obrazów CLEM
<ol>
	<li>W ImageJ przeciągnij i upuść przekształcony obraz FM oraz zszyty obraz EM.</li>
	<li>Kliknij na Obrazek | Rodzaj | Kolor 8-bitowy, aby ustawić ten sam typ obrazu zarówno dla obrazów LM, jak i EM (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D1). 
	UWAGA: Obraz EM musi być konwertowany dwukrotnie w następującej kolejności: 8-bit -> RGB Color -> 8-bit Color.</li>
	<li>Kliknij na Obrazek | Kolor >| Scal kanały, aby połączyć obrazy w obraz kompozytowy, wybierając odpowiednio obrazy FM i EM z menu rozwijanego (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D2).</li>
	<li>Kliknij Plik | Zapisz jako, aby zapisać obraz CLEM.</li>
</ol>

Correlative Microscopy Reveals Stress-Induced Mitochondria-Lysosome Interactions

<ol><li>Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+mitochondrial+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of mitochondrial membrane dynamics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).</li>
<li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nat Cell Biol. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Lopez, J., Tait, S. W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+apoptosis%3A+Killing+cancer+using+the+enemy+within%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within.</a> Br J Cancer. 112 (6), 957-962 (2015).</li>
<li>Wang, C., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+apoptosis%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in apoptosis*.</a> Annu Rev Genet. 43, 95-118 (2009).</li>
<li>Rossi, A., Pizzo, P., Filadi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2C+mitochondria+and+cell+metabolism%3A+A+functional+triangle+in+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium, mitochondria and cell metabolism: A functional triangle in bioenergetics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1068-1078 (2019).</li>
<li>Giorgi, C., Marchi, S., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+machineries%2C+regulation+and+cellular+functions+of+mitochondrial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 713-730 (2018).</li>
<li>Talari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-droplet+associated+mitochondria+promote+fatty-acid+oxidation+through+a+distinct+bioenergetic+pattern+in+male+wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid-droplet associated mitochondria promote fatty-acid oxidation through a distinct bioenergetic pattern in male wistar rats.</a> Nat Commun. 14 (1), 766(2023).</li>
<li>Enkler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf1+coordinates+fatty+acid+metabolism+and+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Arf1 coordinates fatty acid metabolism and mitochondrial homeostasis.</a> Nat Cell Biol. 25 (8), 1157-1172 (2023).</li>
<li>Trivedi, P. C., Bartlett, J. J., Pulinilkunnil, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+biology+and+function%3A+Modern+view+of+cellular+debris+bin%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin.</a> Cells. 9 (5), 1131(2020).</li>
<li>Mony, V. K., Benjamin, S., O'Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lysosome-centered+view+of+nutrient+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A lysosome-centered view of nutrient homeostasis.</a> Autophagy. 12 (4), 619-631 (2016).</li>
<li>Thelen, A. M., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+the+lysosome+in+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for the lysosome in lipid metabolism.</a> Trends Cell Biol. 27 (11), 833-850 (2017).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-lysosome-related+organelles+mediate+mitochondrial+clearance+during+cellular+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation.</a> Cell Rep. 42 (10), 113291(2023).</li>
<li>Kim, S., Wong, Y. C., Gao, F., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+mitochondria-lysosome+contacts+by+gba1+dysfunction+in+dopaminergic+neuronal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of mitochondria-lysosome contacts by gba1 dysfunction in dopaminergic neuronal models of Parkinson's disease.</a> Nat Commun. 12 (1), 1807(2021).</li>
<li>Pickrell, A. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+pink1%2C+parkin%2C+and+mitochondrial+fidelity+in+parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The roles of pink1, parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease.</a> Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).</li>
<li>Wong, Y. C., Peng, W., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+regulation+of+inter-mitochondrial+contact+fate+and+motility+in+charcot-marie-tooth+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Lysosomal regulation of inter-mitochondrial contact fate and motility in charcot-marie-tooth type 2.</a> Dev Cell. 50 (3), 339-354.e4 (2019).</li>
<li>Peng, W., Wong, Y. C., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-lysosome+contacts+regulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+dynamics+via+lysosomal+trpml1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial Ca(2+) dynamics via lysosomal trpml1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19266-19275 (2020).</li>
<li>Juhl, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+membrane+contact+sites+for+sterol+transfer+between+endo-lysosomes+and+mitochondria+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of membrane contact sites for sterol transfer between endo-lysosomes and mitochondria in living cells.</a> Sci Rep. 11 (1), 8927(2021).</li>
<li>Khalil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+pathway+for+erythroid+iron+delivery+through+lysosomal+trafficking+of+transferrin+receptor+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2.</a> Blood Adv. 1 (15), 1181-1194 (2017).</li>
<li>Russell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">3d correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> J Cell Sci. 130 (1), 278-291 (2017).</li>
<li>Van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+%28clem%29+combining+live-cell+imaging+and+immunolabeling+of+ultrathin+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy (clem) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections.</a> Nat Methods. 5 (11), 973-980 (2008).</li>
<li>Loginov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+organelle+microscopy%3A+Fluorescence+guided+volume+electron+microscopy+of+intracellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative organelle microscopy: Fluorescence guided volume electron microscopy of intracellular processes.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 829545(2022).</li>
<li>De Beer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biological+tissues%3A+A+multiscale+workflow+from+live+imaging+to+3D+cryo-CLEM%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Visualizing biological tissues: A multiscale workflow from live imaging to 3D cryo-CLEM.</a> Microscopy and Microanalysis. 27 (S2), 11-12 (2021).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meosem+withstands+osmium+staining+and+epon+embedding+for+super-resolution+clem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Meosem withstands osmium staining and epon embedding for super-resolution clem.</a> Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+apex2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of apex2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trakem2+software+for+neural+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trakem2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS One. 7 (6), e38011(2012).</li>
<li>Redmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+autophagy+with+bafilomycin+and+chloroquine+decreases+mitochondrial+quality+and+bioenergetic+function+in+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons.</a> Redox Biol. 11, 73-81 (2017).</li>
<li>Lu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+npc1+as+the+target+of+u18666a%2C+an+inhibitor+of+lysosomal+cholesterol+export+and+ebola+infection%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of npc1 as the target of u18666a, an inhibitor of lysosomal cholesterol export and ebola infection.</a> eLife. 4, e12177(2015).</li>
<li>Jung, M., Choi, H., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+research+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microsc%22%5BJournal%5D)">The autophagy research in electron microscopy.</a> Appl Microsc. 49 (1), 11(2019).</li>
<li>Hao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-reprogramed+megamitochondrion+contacts+and+engulfs+lysosome+to+mediate+mitochondrial+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-reprogramed megamitochondrion contacts and engulfs lysosome to mediate mitochondrial self-digestion.</a> Nat Commun. 14 (1), 4105(2023).</li>
<li>Hoglinger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Npc1+regulates+ER+contacts+with+endocytic+organelles+to+mediate+cholesterol+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Npc1 regulates ER contacts with endocytic organelles to mediate cholesterol egress.</a> Nat Commun. 10 (1), 4276(2019).</li>
<li>Jung, M., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+imaging+by+correlative+light+and+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy.</a> J Vis Exp. (149), e59750(2019).</li>
<li>Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+organelle+dynamics+between+light+microscopic+live+imaging+and+electron+microscopic+3d+architecture+using+fib-sem%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3d architecture using fib-sem.</a> Microscopy (Oxf). 70 (2), 161-170 (2021).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-targeted+biosensor+for+the+super-resolution+imaging+of+lysosome-mitochondrion+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Lysosome-targeted biosensor for the super-resolution imaging of lysosome-mitochondrion interaction.</a> Front Pharmacol. 13, 865173(2022).</li>
<li>Chen, Q., et al. Quantitative analysis of interactive behavior of mitochondria and lysosomes using structured illumination microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2018).</li>
<li>Wong, Y. C., Ysselstein, D., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-lysosome+contacts+regulate+mitochondrial+fission+via+rab7+gtp+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial fission via rab7 gtp hydrolysis.</a> Nature. 554 (7692), 382-386 (2018).</li>
<li>Perkins, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+neuronal+mitochondria%3A+Three-dimensional+structure+and+organization+of+cristae+and+membrane+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of neuronal mitochondria: Three-dimensional structure and organization of cristae and membrane contacts.</a> J Struc Biol. 119 (3), 260-272 (1997).</li>
<li>Sharma, N., Jung, M., Mishra, P. K., Mun, J. Y., Rhee, H. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flex%3A+Genetically+encodable+enzymatic+fluorescence+signal+amplification+using+engineered+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Flex: Genetically encodable enzymatic fluorescence signal amplification using engineered peroxidase.</a> Cell Chem Biol. 31 (3), 502-513.e506 (2024).</li>
<li>Jung, M., Choi, H., Kim, J., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+transmission+electron+microscopy+showed+details+of+mitophagy+by+mitochondria+quality+control+in+propionic+acid+treated+sh-sy5y+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Correlative light and transmission electron microscopy showed details of mitophagy by mitochondria quality control in propionic acid treated sh-sy5y cell.</a> Materials (Basel). 13 (19), (2020).</li>
<li>Mourik, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMourik%2C+MJ+%22Methods+Cell+Biol%22">Methods Cell Biol</a>. Müller-Reichert, T., Verkade, P. 124, Academic Press. 71-92 (2014).</li>
<li>Hegermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume-clem%3A+A+method+for+correlative+light+and+electron+microscopy+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Volume-clem: A method for correlative light and electron microscopy in three dimensions.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (6), L778-L784 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten opisuje dwukolorowy CLEM do obserwacji interakcji mitochondriów i lizosomów w stałych komórkach za pomocą genetycznie kodowanych znaczników mEosEM i APEX2. W ciągu ostatnich kilku dekad postępy w mikroskopii znacznie poprawiły zdolność do obserwowania zmian w sieciach organelli32,33, a badanie interakcji organelli staje się coraz bardziej interesujące. Mikroskopia superrozdzielcza została wykorzystana do obserwacji zmian w wysoce dynamicznych kontaktach między mitochondriami a lizosomami 34,35,36. Jednak pomimo zastosowania mikroskopii superrozdzielczej trudno jest odróżnić zmiany grubości wewnętrznej i zewnętrznej błony mitochondrialnej (ok. 22 nm) oraz połączeń grzebieniowych (ok. 28 nm)37. Transmisyjna mikroskopia elektronowa ma tę zaletę, że umożliwia obserwację struktury próbek biologicznych w bardzo wysokiej rozdzielczości, ale ma tę wadę, że obrazy można oglądać tylko w czerni i bieli, co utrudnia rozróżnienie organelli na złożonych obrazach. W naszym protokole zastosowaliśmy metodę CLEM, która łączy zalety mikroskopii świetlnej i elektronowej do monitorowania interakcji dwóch różnych organelli poprzez barwienie ich różnymi kolorami. W szczególności dwukolorowy CLEM jest nieocenionym narzędziem do obserwacji i analizy mitofagii, procesu degradacji mitochondriów w lizosomach, jak pokazano na rysunku 3.
Obrazowanie żywych komórek jest zwykle wykonywane w warunkach fizjologicznych, co umożliwia naukowcom obserwację dynamicznych procesów komórkowych w czasie rzeczywistym. Jednak techniki mikroskopii elektronowej często wymagają czasochłonnych procedur przygotowania próbki, w tym utrwalania i barwienia. Opóźnienie czasowe między obrazowaniem żywych komórek a przygotowaniem próbki za pomocą mikroskopii elektronowej ogranicza rozdzielczość czasową techniki i może skutkować potencjalnie pominiętymi dynamicznymi zdarzeniami komórkowymi. Aby przezwyciężyć ograniczenia CLEM z żywymi komórkami, opracowaliśmy dwukolorową metodę CLEM, w której sonda mEosEM23 i barwnik chemiczny (Amplex-Red) są barwione enzymem znakowania zbliżeniowego APEX238 bez utraty sygnału fluorescencji nawet w trudnych warunkach utrwalających. W poprzednim badaniu CLEM na żywych komórkach39 stwierdzono rozbieżności między sygnałami fluorescencji a obrazami EM ze względu na problemy z rozdzielczością czasową w próbkowaniu TEM po obrazowaniu żywych komórek i ograniczenia techniczne w przygotowaniu próbki. Jednak uzyskując obrazy fluorescencyjne nieruchomych komórek przez wystarczająco długi czas (obrazowanie z-stack całych komórek w dużym powiększeniu), możemy rozwiązać problem rozdzielczości czasowej i poprawić korelację między obrazami LM i EM (ryc. 3 i ryc. 4).
Innym kluczowym czynnikiem wpływającym na pomyślne wyniki CLEM jest to, jak dokładnie zarejestrować obraz LM z obrazem EM. Aby to zrobić, najpierw zastosowaliśmy kombinację trybów obrazowania DIC i fluorescencji podczas obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej, aby stworzyć mapę nawigacyjną wokół komórek docelowych. Korzystając z tej mapy nawigacyjnej, mogliśmy łatwo zidentyfikować interesujące nas komórki na ultramikrotomie i TEM. Po drugie, pozyskując obrazy całych komórek na kafelkach TEM w dużym powiększeniu, byliśmy w stanie uzyskać wiele punktów orientacyjnych, które można było wykorzystać do rejestracji obrazu. Z naszego doświadczenia wynika, że im większa liczba punktów orientacyjnych, tym lepsza dokładność wyrównania obrazów LM i EM we wtyczce Big Warp.
W tym badaniu pokazaliśmy domeny interakcji lizosomów i mitochondriów z wynikami CLEM o wysokiej rozdzielczości. Ponadto dwukolorowa sonda pozwoliła na precyzyjne rozróżnienie mitochondriów i lizosomów. Ta metoda ma jednak pewne ograniczenia. Po pierwsze, jeśli czas reakcji podczas proksymalnego znakowania Amplex-Red przez enzym APEX2 jest zbyt długi, Amplex-Red będzie dyfundować i barwić się szerzej niż docelowe położenie białka38. Po drugie, grubość (objętość w osi z) obszaru, w którym lizosom jest pochłonięty w mitochondriach, jest dość mała, więc nie można określić fuzji dwóch błon organelli w odcinku szeregowym o grubości 50 nm. Ponadto poważnym wyzwaniem jest dokładne ustawienie osi Z przekroju optycznego za pomocą mikroskopu świetlnego i przekroju mechanicznego za pomocą ultramikrotomu. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, dwukolorowy CLEM może być stosowany w połączeniu z konwencjonalną tomografią elektronową40 lub objętością sekcji szeregowej CLEM41.

Mitochondria i lizosomy to główne organelle związane z błoną, które są niezbędne do utrzymania homeostazy komórkowej. Mitochondria to wysoce dynamiczne organelle komórkowe modulowane przez zdarzenia rozszczepienia i fuzji1. Ogólnie rzecz biorąc, mitochondria są określane jako elektrownia komórki i są znane ze swojej ważnej roli w fosforylacji oksydacyjnej, produkcji ATP i magazynowaniu metabolitów, takich jak calcium2. Oprócz swojej roli w metabolizmie energetycznym, mitochondria biorą udział w wielu innych procesach sygnalizacji komórkowej, w tym w apoptozie3,4, sygnalizacji wapniowej5,6 i metabolizmie lipidów7,8. Podobnie, lizosomy są wysoce dynamicznymi organellami komórkowymi, które odgrywają wiele ról jako centra recyklingu komórkowego w celu utrzymania czystości komórkowej poprzez degradację białek, autofagię, endocytozę i fagocytozę9. Oprócz roli w degradacji, lizosomy odgrywają również role w fizjologii komórkowej, takie jak wykrywanie składników odżywczych, homeostaza10, metabolizm lipidów11 i dedyferencjacja komórkowa12.
Pomimo istnienia licznych badań nad funkcjami poszczególnych organelli komórkowych, nasze ostatnie badania skupiły się na mniej zrozumiałym wzajemnym oddziaływaniu między mitochondriami a lizosomami, co jak wykazano, wpływa zarówno na fizjologię komórkową, jak i patologię. Kontakty między mitochondriami a lizosomami zaobserwowano w różnych typach komórek, w tym w komórkach rakowych, neuronach i komórkach pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)13, i są one głównie obserwowane pod wpływem stresu komórkowego lub w chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona13,14 i choroba Charcota-Marie-Tootha15. Kontakt między mitochondriami a lizosomami odgrywa ważną rolę w utrzymaniu homeostazy metabolicznej poprzez wymianę jonów (np. Ca2+)16, cholesterol17, a iron18 między dwoma organellami. Ponadto kontakt między mitochondriami a lizosomami odgrywa kluczową rolę w kontroli jakości organelli komórkowych. Na przykład uszkodzone mitochondria mogą być ukierunkowane na degradację w procesie mitofagii, w którym są pochłaniane przez autofagosomy i dostarczane do lizosomów w celu degradacji. W związku z tym usunięcie dysfunkcyjnych mitochondriów może być ułatwione, zanim spowodują one dalsze uszkodzenia komórki lub normalnych mitochondriów. Ta interakcja między mitochondriami a lizosomami ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy komórkowej i zapobiegania gromadzeniu się dysfunkcyjnych organelli. W ten sposób tylko uszkodzone mitochondria są selektywnie usuwane, umożliwiając zdrowemu mitochondriom optymalne funkcjonowanie w komórce.
Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) to technika obrazowania, która ostatnio zyskała uwagę jako metoda badawcza, łącząc zalety mikroskopii świetlnej (LM) i mikroskopii elektronowej (EM) w celu dostarczenia szczegółowych informacji strukturalnych w różnych skalach. W CLEM próbka jest najpierw obrazowana za pomocą LM w celu zidentyfikowania określonych obszarów zainteresowania, a następnie następuje etapy przygotowania próbki EM, takie jak utrwalanie, odwadnianie i osadzanie. Ta sama próbka jest następnie obserwowana pod mikroskopem elektronowym. Chociaż ostatnio opisano metody CLEM z żywymi komórkami19,20,21,22, dokładne połączenie obrazów optycznych wysoce dynamicznych próbek biologicznych z obrazami mikroskopii elektronowej nieruchomych komórek w jednej płaszczyźnie pozostaje wyzwaniem. W przypadku wysoce dynamicznych organelli, takich jak mitochondria i lizosomy, ich dokładna lokalizacja może się zmieniać, gdy są obserwowane na żywo pod mikroskopem świetlnym i nadal się poruszają nawet podczas krótkiego czasu opóźnienia wymaganego do utrwalenia.
Dlatego w tym protokole, dwa różne znaczniki molekularne, które pozostają aktywne nawet w roztworach utrwalających, zostały użyte do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami, które odgrywają ważną rolę w utrzymaniu homeostazy metabolicznej poprzez wymianę jonów (np. Ca2+)16, cholesterol17, oraz iron18 między tymi organellami. Konstrukty TMEM192-V5-APEX2 i Mito-mEosEM wykorzystano do obserwacji interakcji mitochondriów i lizosomów w hodowanych komórkach zarówno na poziomie EM, jak i LM. W przypadku mitochondriów znacznik mEosEM został wybrany ze względu na jego zdolność do zachowania sygnału fluorescencji podczas przygotowywania próbki EM w roztworze utrwalającym i OsO423. W przypadku lizosomów znacznik APEX2, białko o masie około 28 kDa, wykorzystano do zbadania lokalizacji określonego białka zarówno na poziomie EM, jak i LM24. W obecności nadtlenku wodoru, substrat APEX2, Amplex-Red, tworzy nierozpuszczalny polimer, który można zaobserwować za pomocą mikroskopii konfokalnej w miejscu docelowym znacznika. W tym protokole dwukolorowy CLEM został wykorzystany do wizualizacji struktury interakcji między lizosomami a mitochondriami w stałych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Chemikalia i odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25% Aldehyd glutarowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16200</td><td>Opary aldehydu są niezwykle toksyczne. Stosować tylko w dygestorium.</td></tr><tr><td>30% roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Merck</td><td>107210</td><td></td></tr><tr><td>4% roztwór paraformaldehydu</td> Opary ldehydu <td>Biosesang</td><td>PC2031-100-00</td><td>są niezwykle toksyczne. Stosować tylko w dygestorium.</td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>ThermoFisher</td><td>A12222</td><td></td></tr><tr><td>Epon 812</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>Transfekcja plazmidu</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>SIGMA</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu 3%</td> <td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>22410</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu 4 % roztwór wodny</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>16320</td><td>Bardzo toksyczny. Stosować tylko w dygestorium.</td></tr><tr><td>Heksacyjanożelazian(II) potasu trójwodny&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu trójwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250-500G</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie EM UranyLess</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>22409</td><td></td></tr><tr><td>Budowa plazmidu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mito-mEosEM</td><td>addgene</td><td>132706</td><td>DOI:&nbsp; 10.1016/j.chembiol.2024.02.007</td></tr><tr><td>TMEM192-V5-APEX2</td><td>Sharma N.&nbsp; i wsp.</td><td>Nie dotyczy</td><td>DOI:&nbsp; 10.1016/j.chembiol.2024.02.007</td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 um Filtr strzykawkowy</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynie nakrywkowe z kratką</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD BEEM</td><td></td></tr><tr><td>Kapsułki do zatapiania</td><td>Ted Pella</td><td>130</td><td></td></tr><tr><td>Obsługiwane formvar Siatka miedziana z pojedynczym gniazdem</td><td>Ted Pella</td><td>01705</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy</td><td>DiATOME</td><td>DU4530</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>ARTOS 3D</td><td></td></tr><tr><td>mikroskopy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócona mikroskopia konfokalna</td><td>Nikon</td><td>A1 Rsi/Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>Software i Algorytmy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/Image J</td><td>NIH / open source</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Pakiet oprogramowania ImageJ BigWarp</td><td>NIH / open source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://imagej.net/plugins/bigwarp Photozoom Pro 8&nbsp;</td><td>BenVista</td><td></td><td>https://www.benvista.com/photozoompro Alternatywne oprogramowanie Image Resizer : https://imageresizer.com/ Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel ON1 zmień rozmiar : https://www.on1.com/products/resize-ai/</td></tr></tbody></table>

dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Dual-color Correlative Light and Electron Microscopy for the Visualization of Interactions between Mitochondria and Lysosomes

Organelle komórkowe, takie jak mitochondria i lizosomy, wykazują dynamiczne struktury. Pomimo wyższej rozdzielczości transmisyjnej mikroskopii elektronowej do analizy strukturalnej, mikroskopia świetlna jest niezbędna do wizualizacji dynamicznych organelli poprzez znakowanie specyficzne dla celu. Poniższy protokół opisuje metodę, która łączy dwukolorową korelacyjną mikroskopię świetlną i mikroskopię elektronową (CLEM) w celu obserwacji interakcji między mitochondriami a lizosomami. W tym badaniu mitochondria oznaczono mEosEM (Mito-mEosEM), a lizosomy TMEM192-V5-APEX2. Wyniki uzyskane z obrazów CLEM pozwalają na obserwację zmian w oddziaływaniach między mitochondriami a lizosomami w warunkach stresu zewnętrznego. Leczenie bafilomycyną (BFA), która hamuje funkcję lizosomów, spowodowało zwiększenie kontaktu między mitochondriami a lizosomami, co doprowadziło do powstania rozdrobnionych mitochondriów uwięzionych w lizosomach. I odwrotnie, leczenie U18666A, które hamuje eksport cholesterolu z lizosomów, spowodowało, że lizosomy zostały otoczone mitochondriami, co wskazuje na odrębną formę interakcji. W pracy przedstawiono skuteczną metodę obserwacji interakcji między mitochondriami a lizosomami w komórkach stałych. Co więcej, obrazowanie CLEM za pomocą dwukolorowych sond stanowi potężne narzędzie do przyszłych badań dynamiki organelli i ich implikacji dla funkcji komórek i patologii.

Aby zwizualizować oddziaływania między mitochondriami a lizosomami przy użyciu tego dwukolorowego protokołu CLEM, zastosowaliśmy Mito-mEosEM oraz TMEM192-V5-APEX2. Utrwalone komórki obrazowano najpierw za pomocą mikroskopu świetlnego, a następnie pobrano próbki do obrazowania EM. Wyniki skorelowanych obrazów przedstawiono na Rysunku 3A,B oraz Rysunku 4A. Postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem, sprawdziliśmy, czy jesteśmy w stanie zaobserwować zmiany w oddziaływaniach między mitochondriami a lizosomami pod wpływem stresu zewnętrznego.
Traktowanie komórek BFA, inhibitorem lizosomalnej V-ATPazy, hamuje autofagię, co prowadzi do obniżenia jakości mitochondriów i zwiększenia interakcji między mitochondriami a lizosomami27. W komórkach traktowanych BFA zaobserwowaliśmy mitochondria uwięzione wewnątrz lizosomów (Rysunek 3B), w porównaniu do komórek kontrolnych traktowanych DMSO (Rysunek 3A). Choć na samych mikrografiach elektronowych trudno jest odróżnić pofragmentowane, gęste elektronowo mitochondria od przedziałów komórkowych wewnątrz lizosomów, można je łatwo rozróżnić na obrazach skorelowanych (Rysunek 3B1,B2). Struktura zaburzenia mitochondrialnego (Rysunek 3A1,A2; niebieska strzałka) zaobserwowana w mitochondriach komórek traktowanych DMSO nie jest powiązana z lizosomami, a struktura na obrazie fluorescencyjnym, która wygląda jak lizosom uwięziony wewnątrz dużego mitochondrium, jest strukturą, w której mitochondrium otacza lizosom (Rysunek 3A2; czerwona strzałka).
Następnie przetestowaliśmy działanie U18666A (2 µg/mL przez 18 h), znanego inhibitora NPC1, który blokuje transport cholesterolu z lizosomów28. Komórki traktowane U18666A wykazały zwiększoną bezpośrednią interakcję między mitochondriami a lizosomami (Rysunek 4). Ponadto kontakty między mitochondriami a lizosomami w próbkach traktowanych U18666A różniły się od tych w próbkach traktowanych BFA. W komórkach HeLa traktowanych BFA pofragmentowane mitochondrium jest całkowicie uwięzione w lizosomie, co stanowi wcześniej opisaną morfologię mitofagii12,29. Jednak w grupie traktowanej U18666A niektóre lizosomy wykazujące ekspresję TMEM192 wydają się być otoczone przez mitochondrium (Rysunek 4D,E)30,31.
<img alt="Schemat przygotowania komórek i obrazowania: transfekcja, znakowanie APEX2, konfiguracja mikroskopii konfokalnej i TEM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd metody CLEM opartej na TEM z wykorzystaniem genetycznie znakowanej sondy fluorescencyjnej. (A) Komórki HeLa hodowano w szklanych naczyniach hodowlanych o średnicy 35 mm z dnem w formie siatki. (B) Utrwalone komórki znakowano Amplex-Red za pomocą białka APEX2. (C) Obrazy fluorescencyjne pozyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Do przechwycenia szerokiego obrazu przeglądowego oraz obrazu docelowej komórki w wysokiej rozdzielczości wykorzystano zmotoryzowany stolik i funkcję skanowania mozaikowego (tile-scan). Duży obraz służy jako mapa nawigacyjna do identyfikacji położenia komórki docelowej w preparatach zatopionych w plastiku. (D) Następnie przeprowadzono potransfukcyjną utrwalanie oraz odwadnianie i zatapianie. (E) Zatapianie wykonano przy użyciu probówki PCR lub kapsułki BEEM wypełnionej żywicą nad komórką docelową na szkiełku podstawowym. (F) Po polimeryzacji żywicy usunięcie szkiełka pozostawiło odciśnięty wzór siatki na dolnej powierzchni bloku. (G) Komórkę docelową zidentyfikowano na podstawie odciśniętego wzoru na powierzchni żywicy, a następnie wykonano skrawki komórki o grubości około 60 nm przy użyciu ultramikrotomu. (H) Skrawki seryjne zebrano na miedzianej siatce z otworami powleczonej formvarem. (I) Siatki obrazowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; CLEM = korelatywna mikroskopia świetlna i elektronowa; ROI = obszar zainteresowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat przetwarzania obrazu: zszywanie obrazów, zmiana rozmiaru fluorescencji, rejestracja punktów charakterystycznych, nakładanie CLEM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przetwarzanie obrazu i generowanie obrazu CLEM przy użyciu ImageJ Fiji. (A1) Główny interfejs użytkownika Fiji i TrakEM2. (A2) Import zestawu obrazów kafelkowych uzyskanych za pomocą TEM przy powiększeniu 1,700x. (A3) Dopasowanie i przykład obrazu zszytego przy użyciu metody dopasowania obrazu w TrakEM2. (B1-B3) Konwersja małej mikrografii świetlnej na duże obrazy wysokiej jakości przy użyciu oprogramowania do powiększania zdjęć. (C1-C3) Przepływ pracy dla rejestracji między obrazami z mikroskopii świetlnej a obrazami z mikroskopii elektronowej przy użyciu wtyczki Big Wrap. (D1-D3) Proces nakładania przekształconego obrazu FM na obraz EM w celu syntezy skorelowanego obrazu mikroskopowego. Skróty: TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa; CLEM = korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa; FM = mikroskopia fluorescencyjna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat confocal, TEM i CLEM; lokalizacja mitochondriów i lizosomów; analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Obrazy CLEM miejsc kontaktu mitochondriów i lizosomów traktowanych lub nietraktowanych bafilomycyną A1. Komórki HeLa poddano kotransfekcji Mito-mEosEM (mitochondria; zielony) oraz TMEM192-APEX2 (lizosomy; czerwony), a następnie zabarwiono barwnikiem Amplex-Red. (A) Nietraktowane komórki HeLa. Informacje molekularne z sygnału fluorescencyjnego (panel lewy) oraz informacje ultrastrukturalne uzyskane za pomocą TEM (panel środkowy) nałożono na siebie (panel prawy) na podstawie sygnału i morfologii mitochondriów. (A1,A2) W nietraktowanych komórkach HeLa wewnętrzna błona mitochondrialna jest uszkodzona (niebieska strzałka) lub mitochondria i lizosomy znajdują się bardzo blisko siebie (czerwona strzałka). (B1,B2) W komórkach HeLa traktowanych bafilomycyną A1 przez 18 h zaobserwowano mitofagię, charakteryzującą się uwięzieniem nie zdegradowanych mitochondriów w lizosomach (zielona strzałka). Paski skali = 1 µm (A1,A2,B1,B2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe konfokalne, TEM i CLEM mitochondriów (zielone) i lizosomów (czerwone) w komórkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67020/67020fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obrazy CLEM miejsc kontaktu mitochondrialno-lizosomalnego po traktowaniu U18666A (A) Dwukolorowe obrazy CLEM komórek HeLa wykazujących ekspresję Mito-mEosEM i TMEM192-V5-APEX2 (oznaczonych Amplex-Red) pod wpływem U18666A (2 µg/mL przez 18 h). (A1,A2) Czerwone strzałki wskazują miejsca kontaktu między mitochondriami a lizosomami. Paski skali = 1 µm. (B1-B3,C1-C3) Czerwona strzałka wskazuje pojawienie się fuzji międzyorganellowej między mitochondriami a lizosomami na obrazach seryjnych. Paski skali = 500 nm (B1-B3). Paski skali = 1 µm (C1-C3). (D,E) Obrazy TEM z dużym powiększeniem miejsc fuzji między mitochondriami a lizosomami. Kolory pseudobarwne zostały użyte w celu odróżnienia mitochondrium (zielone) od lizosomu (czerwone). Paski skali = 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67020/67020fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Cellular organelles, such as mitochondria and lysosomes, display dynamic structures. Despite the higher resolution of transmission electron microscopy for ...

Dysfunkcja mitochondriów jest związana z wieloma chorobami, w szczególności zaburzeniami neurodegeneracyjnymi i metabolicznymi. Dlatego, jeśli możemy zrozumieć, w jaki sposób mitochondria są regulowane przez lizosomy, pomaga to w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych. W tym protokole zademonstrowaliśmy dwukolorową metodę CLEM do wizualizacji kontaktu lizosomów mitochondrialnych.Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa to technika obrazowania, która łączy w sobie zalety mikroskopii świetlnej i mikroskopii elektronowej. W tym protokole maksymalizujemy przewagę CLEM za pomocą dwukolorowych sond do wizualizacji kontaktu lizosomów mitochondrialnych. Wyraźne rozróżnienie mitochondriów ulegających degradacji w lizosomach przy użyciu tradycyjnych metod pobierania próbek za pomocą mikroskopii elektronowej jest trudne.W pracy przedstawiono wynik CLEM o wysokiej rozdzielczości, który wyraźnie pokazał domenę efektorową lizosomów i mitochondriów. Metoda dwukolorowego pobierania została wykorzystana do dokładnego rozróżnienia efektorów mitochondriów w lizosomach. Nasze badania wykazały, że mitochondria oddziałują z lizosomami.Nasze badania wykazały, że mitochondria oddziaływały z lizosomami na różne sposoby w odpowiedzi na różne stresy zewnętrzne. Badając przyczyny i regulatory tych zjawisk, uzyskamy wgląd w zrozumienie wewnątrzkomórkowej kontroli jakości mitochondriów. Na początek hoduj komórki HeLa o gęstości od jednego razy 10 do potęgi pięciu w 35-milimetrowych szklanych naczyniach hodowlanych z siatką.Następnego dnia należy współtransfekować komórki przy 30% do 40% zbiegu z plazmidami za pomocą odczynnika do transfekcji. Po transfekcji potraktuj komórki dimetylosulfotlenkiem lub U18666A i bafilomycyną A1 przez 18 godzin. W przypadku obrazowania konfokalnego usuń pożywkę hodowlaną i natychmiast dodaj 250 mikrolitrów ciepłego roztworu utrwalającego w temperaturze od 30 do 37 stopni Celsjusza.Natychmiast usuń utrwalacz. Zastąp go 1,5 mililitra świeżego utrwalacza i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Następnie umyj komórki trzy razy przez 10 minut, każda jednym mililitrem lodowatego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu.Następnie dodaj jeden mililitr zimnego 20-milimolowego roztworu glicyny, aby ugasić aldehyd. Po inkubacji komórek na lodzie przez 10 minut, umyć je trzykrotnie po 10 minut w zimnym 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu. Następnie dodać 500 mikrolitrów czerwonego roztworu Amplex do naczynia na próbkę i inkubować przez pięć minut na lodzie.Następnie usuń czerwony roztwór Amplex i przepłucz komórki trzy razy po 10 minut za pomocą 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować obszar wokół interesujących komórek w trybie skanowania płytek trzy na trzy. Uchwyć zarówno różnicowe sygnały interferencyjne, kontrastowe, jak i fluorescencyjne, aby zidentyfikować i zarejestrować siatkę i litery na czaszy siatki za pomocą 40-krotnego obiektywu.Zobrazuj komórki docelowe w dużym powiększeniu za pomocą 40-krotnego obiektywu i uzyskaj obraz Z-stack. Po zobrazowaniu zabarwionych na czerwono komórek Amplex za pomocą mikroskopu konfokalnego, dodaj jeden mililitr 1% zredukowanego tetratlenku osmu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i inkubuj przez godzinę. Następnie przepłukać próbkę trzy razy przez 10 minut wodą destylowaną o temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odwadniać w serii stopniowanych etanoli przez 15 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej. Teraz wymieszaj etanol z żywicą epoksydową w proporcjach objętościowych trzy do jednego, jeden do jednego i jeden do trzech, przygotowując łącznie 300 mikrolitrów każdej mieszanki. Wlej każdą mieszaninę żywicy epoksydowej do naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę.Następnie przygotuj kapsułkę do zatapiania, wypełniając ją świeżą żywicą epoksydową. Odwróć rurkę lub kapsułkę do góry nogami w obszarze zainteresowania i umieść ją w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza na 48 godzin w celu polimeryzacji. Następnie zanurz dolną szybę i blok polimerowy w ciekłym azocie, aby je rozdzielić.Umieść blok próbki w uchwycie na próbkę ultramikrotomu i umieść go w bloku przycinania. Użyj żyletki, aby przyciąć żywicę do prostokątnego lub trapezoidalnego kształtu wokół interesującego obiektu. Umieść przycięty blok próbki w uchwycie na próbkę i wyreguluj tarczę diamentową.Za pomocą ultramikrotomu wytnij ultracienkie odcinki około 60 do 70 nanometrów od płaskich osadzonych komórek. Zbierz sekcje szeregowe na siatce szczelinowej pokrytej formvarem przed wysuszeniem ich na płycie grzejnej. Następnie zabarwiaj skrawki barwnikiem kontrastowym przez dwie minuty i cytrynianem ołowiu przez jedną minutę.Następnie umieść siatkę w transmisyjnym mikroskopie elektronowym lub TEM w uchwycie na próbkę w celu obserwacji. Na podstawie obrazu kontrastu interferencji różnicowej z mikroskopu świetlnego zidentyfikuj komórkę docelową zainteresowania i zobrazuj cały obszar komórki za pomocą kafelkowych, nakładających się obrazów w powiększeniu 1,700 razy Aby uzyskać korelacyjne obrazy mikroskopii świetlnej i elektronowej komórek HeLa za pomocą ImageJ Fiji, uruchom ImageJ Fiji i kliknij plik, nowy, pusty TrakEM2, i wybierz folder pamięci, aby utworzyć nowy projekt TrakEM2. Przeciągnij i upuść nieprzetworzone dane obrazu kafelka do obszaru roboczego, aby otworzyć zestaw danych obrazu kafelka.Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz linię, zmontuj wszystkie obrazy w tej warstwie i elastyczne nieliniowe korespondencje blokowe. Następnie kliknij przycisk OK, aby zaakceptować wartości domyślne dla pozostałych parametrów. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz eksport, a następnie utwórz płaski obraz, aby utworzyć zszyty obraz.Następnie kliknij plik i zapisz jako, aby zapisać obraz. Aby zmienić rozmiar obrazu fluorescencyjnego, otwórz oprogramowanie do powiększania zdjęć. Kliknij plik, otwórz i wybierz obraz.Wprowadź szerokość i wysokość. Aby dopasować rozmiar obrazu z mikroskopu elektronowego. Wybierz algorytm, który ma zostać zastosowany w metodzie zmiany rozmiaru.Kliknij plik i zapisz jako, aby zapisać obraz o zmienionym rozmiarze. Otwórz aplikację ImageJ Fiji, a następnie przeciągnij i upuść fluorescencję o zmienionym rozmiarze oraz zszyty mikrograf elektronowy do obszaru roboczego. Kliknij na plugins big data viewer i big warp, aby rozpocząć rejestrację.Następnie kliknij menu rozwijane, aby wybrać obraz z mikrofotografii fluorescencyjnej jako ruchomy obraz i obraz z mikrografu elektronowego jako obraz docelowy. Korzystając z funkcji, takich jak powiększanie, obracanie obrazu i przesuwanie, porównaj obrazy z mikrofotografii fluorescencyjnej i elektronowej. Naciśnij spację na klawiaturze, aby przełączyć się w tryb punktu orientacyjnego, a następnie naciśnij lewy przycisk myszy, aby zaznaczyć co najmniej trzy punkty orientacyjne zidentyfikowane na obu obrazach.Po zaznaczeniu wszystkich zidentyfikowanych punktów orientacyjnych przejdź do pliku, wyeksportuj ruchomy obraz i kliknij OK. Pojawi się nowe wyskakujące okienko z przekształconym obrazem mikrofotografii fluorescencyjnej. Kliknij plik i zapisz jako, aby zapisać przekształcony obraz z mikrofotografii fluorescencyjnej.Aby nałożyć obrazy CLEM, przeciągnij i upuść przekształcony obraz mikrografu fluorescencyjnego oraz zszyty obraz mikrografu elektronowego do przestrzeni roboczej ImageJ. Kliknij obraz, typ i ośmiobitowy kolor. Aby ustawić ten sam typ obrazu zarówno dla obrazów fluorescencji, jak i mikrofotografii elektronowej.Kliknij obraz, kolor i scal kanały. Aby połączyć obrazy. Kliknij plik i zapisz jako, aby zapisać obraz CLEM.Mitochondria uwięzione w lizosomach zaobserwowano w komórkach traktowanych bafilomycyną A1, co wskazuje na zahamowanie autofagii i obniżenie jakości mitochondriów, podczas gdy komórki kontrolne wykazywały mitochondria oddziałujące z lizosomami, ale nie pochłonięte przez nie, zakłócenie mitochondriów obserwowane w komórkach kontrolnych wykazało, że mitochondria otaczały lizosomy, a nie były przez nie pochłaniane. Komórki poddane działaniu U18666A wykazały zwiększone interakcje między mitochondriami a lizosomami, przy czym niektóre lizosomy zostały pochłonięte przez mitochondria.

dual-color-correlative-light-electron-microscopy-for-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Technikę CLEM dostosowano do analizy morfologii ultrastrukturalnej błon, organelli i struktur wewnątrzkomórkowych pod wpływem cząsteczek wstrzykniętych metodą mikroiniekcji. Metoda ta łączy zaawansowane techniki mikromanipulacji/mikroiniekcji, konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikroskopii elektronowej, co pozwala na uzyskanie rozdzielczości od milimetrów do wielu nanometrów. Technika ta znajduje zastosowanie w szerokim spektrum badań.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM) jako narzędzie do wizualizacji cząsteczek wprowadzonych metodą mikroiniekcji oraz ich eukariotycznych celów wewnątrzkomórkowych

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Opisano metodę, dzięki której nanocząstki kropek kwantowych (QD) mogą być używane do korelacyjnych badań immunocytochemicznych osadzonych w żywicy epoksydowej ludzkiej tkance patologicznej. Stosujemy komercyjne QD sprzężone z fragmentami przeciwciał, które są wizualizowane za pomocą szerokokątnej fluorescencyjnej mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa z wykorzystaniem nanocząstek kropek kwantowych

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Ten artykuł ilustruje potężną metodę ilościowego oznaczania mitochondriów lub lizosomów w żywych komórkach. Połączenie barwników specyficznych dla lizosomów lub mitochondriów z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym umożliwia ilościowe określenie tych organelli w mieszanych populacjach komórek, takich jak komórki pierwotne pobrane z próbek tkanek, przy użyciu wielobarwnej cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja mitochondriów i lizosomów w limfocytach T oparta na wielobarwnej cytometrii przepływowej

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Mitofagia jest głównym mechanizmem kontroli jakości mitochondriów. Jednak ocena mitofagii in vivo jest utrudniona ze względu na brak wiarygodnych testów ilościowych. Przedstawiono protokół obserwacji mitofagii w żywych komórkach przy użyciu barwnika mitochondriów o barwie zielonej fluorescencji i barwnika lizosomowego o czerwonej fluorescencji.

Wizualizacja mitofagii za pomocą barwników fluorescencyjnych dla mitochondriów i lizosomów

Tutaj prezentujemy protokół do zoptymalizowanej korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej opartej na endogennym, fluorescencyjnym znakowaniu jako narzędzie do badania lokalizacji rzadkich białek w odniesieniu do ultrastruktury komórkowej. O sile tego podejścia świadczy ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 w wygłodzonych komórkach bez leczenia bafilomycyną.

Ultrastrukturalna lokalizacja endogennego LC3 za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej na przekroju

Badanie mitofagii za pomocą mikroskopii elektronowej, czujników genetycznych i immunofluorescencji wymaga kosztownego sprzętu, wykwalifikowanego personelu i znacznej inwestycji czasu. Tutaj pokazujemy skuteczność komercyjnego zestawu barwników fluorescencyjnych w ilościowym określaniu procesu mitofagii zarówno w Caenorhabditis elegans, jak i w linii komórkowej raka wątroby.

Wykrywanie mitofagii w Caenorhabditis elegans i komórkach ssaków przy użyciu barwników specyficznych dla organelli

Ten protokół przedstawia proces propagacji, różnicowania i barwienia hodowanych komórek SH-SY5Y oraz pierwotnych neuronów hipokampa szczura do wizualizacji i analizy ultrastruktury mitochondriów za pomocą mikroskopii stymulowanego zubożenia emisji (STED).

Wykorzystanie obrazowania STED na żywych komórkach do wizualizacji ultrastruktury wewnętrznej błony mitochondrialnej w modelach komórek neuronalnych

Poznaj dwukolorową mikroskopię CLEM do wizualizacji interakcji mitochondriów z lizosomami w komórkach HeLa. Ta metoda łączy zalety mikroskopii świetlnej i elektronowej w badaniach nad kontrolą jakości mitochondriów.

Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami

Przeglądaj więcej filmów