Dwukolorowa korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami
27 września 2024
Ten protokół opisuje mechanizm użycia światła korelacyjnego i mikroskopii elektronowej do wizualizacji interakcji mitochondriów i lizosomów znakowanych odpowiednio mEosEM i APEX2.
Dysfunkcja mitochondriów jest związana z wieloma chorobami, w szczególności zaburzeniami neurodegeneracyjnymi i metabolicznymi. Dlatego, jeśli możemy zrozumieć, w jaki sposób mitochondria są regulowane przez lizosomy, pomaga to w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych. W tym protokole zademonstrowaliśmy dwukolorową metodę CLEM do wizualizacji kontaktu lizosomów mitochondrialnych.
Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa to technika obrazowania, która łączy w sobie zalety mikroskopii świetlnej i mikroskopii elektronowej. W tym protokole maksymalizujemy przewagę CLEM za pomocą dwukolorowych sond do wizualizacji kontaktu lizosomów mitochondrialnych. Wyraźne rozróżnienie mitochondriów ulegających degradacji w lizosomach przy użyciu tradycyjnych metod pobierania próbek za pomocą mikroskopii elektronowej jest trudne.
W pracy przedstawiono wynik CLEM o wysokiej rozdzielczości, który wyraźnie pokazał domenę efektorową lizosomów i mitochondriów. Metoda dwukolorowego pobierania została wykorzystana do dokładnego rozróżnienia efektorów mitochondriów w lizosomach. Nasze badania wykazały, że mitochondria oddziałują z lizosomami.
Nasze badania wykazały, że mitochondria oddziaływały z lizosomami na różne sposoby w odpowiedzi na różne stresy zewnętrzne. Badając przyczyny i regulatory tych zjawisk, uzyskamy wgląd w zrozumienie wewnątrzkomórkowej kontroli jakości mitochondriów. Na początek hoduj komórki HeLa o gęstości od jednego razy 10 do potęgi pięciu w 35-milimetrowych szklanych naczyniach hodowlanych z siatką.
Następnego dnia należy współtransfekować komórki przy 30% do 40% zbiegu z plazmidami za pomocą odczynnika do transfekcji. Po transfekcji potraktuj komórki dimetylosulfotlenkiem lub U18666A i bafilomycyną A1 przez 18 godzin. W przypadku obrazowania konfokalnego usuń pożywkę hodowlaną i natychmiast dodaj 250 mikrolitrów ciepłego roztworu utrwalającego w temperaturze od 30 do 37 stopni Celsjusza.
Natychmiast usuń utrwalacz. Zastąp go 1,5 mililitra świeżego utrwalacza i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Następnie umyj komórki trzy razy przez 10 minut, każda jednym mililitrem lodowatego 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu.
Następnie dodaj jeden mililitr zimnego 20-milimolowego roztworu glicyny, aby ugasić aldehyd. Po inkubacji komórek na lodzie przez 10 minut, umyć je trzykrotnie po 10 minut w zimnym 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu. Następnie dodać 500 mikrolitrów czerwonego roztworu Amplex do naczynia na próbkę i inkubować przez pięć minut na lodzie.
Następnie usuń czerwony roztwór Amplex i przepłucz komórki trzy razy po 10 minut za pomocą 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu. Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować obszar wokół interesujących komórek w trybie skanowania płytek trzy na trzy. Uchwyć zarówno różnicowe sygnały interferencyjne, kontrastowe, jak i fluorescencyjne, aby zidentyfikować i zarejestrować siatkę i litery na czaszy siatki za pomocą 40-krotnego obiektywu.
Zobrazuj komórki docelowe w dużym powiększeniu za pomocą 40-krotnego obiektywu i uzyskaj obraz Z-stack. Po zobrazowaniu zabarwionych na czerwono komórek Amplex za pomocą mikroskopu konfokalnego, dodaj jeden mililitr 1% zredukowanego tetratlenku osmu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i inkubuj przez godzinę. Następnie przepłukać próbkę trzy razy przez 10 minut wodą destylowaną o temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Odwadniać w serii stopniowanych etanoli przez 15 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej. Teraz wymieszaj etanol z żywicą epoksydową w proporcjach objętościowych trzy do jednego, jeden do jednego i jeden do trzech, przygotowując łącznie 300 mikrolitrów każdej mieszanki. Wlej każdą mieszaninę żywicy epoksydowej do naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę.
Następnie przygotuj kapsułkę do zatapiania, wypełniając ją świeżą żywicą epoksydową. Odwróć rurkę lub kapsułkę do góry nogami w obszarze zainteresowania i umieść ją w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza na 48 godzin w celu polimeryzacji. Następnie zanurz dolną szybę i blok polimerowy w ciekłym azocie, aby je rozdzielić.
Umieść blok próbki w uchwycie na próbkę ultramikrotomu i umieść go w bloku przycinania. Użyj żyletki, aby przyciąć żywicę do prostokątnego lub trapezoidalnego kształtu wokół interesującego obiektu. Umieść przycięty blok próbki w uchwycie na próbkę i wyreguluj tarczę diamentową.
Za pomocą ultramikrotomu wytnij ultracienkie odcinki około 60 do 70 nanometrów od płaskich osadzonych komórek. Zbierz sekcje szeregowe na siatce szczelinowej pokrytej formvarem przed wysuszeniem ich na płycie grzejnej. Następnie zabarwiaj skrawki barwnikiem kontrastowym przez dwie minuty i cytrynianem ołowiu przez jedną minutę.
Następnie umieść siatkę w transmisyjnym mikroskopie elektronowym lub TEM w uchwycie na próbkę w celu obserwacji. Na podstawie obrazu kontrastu interferencji różnicowej z mikroskopu świetlnego zidentyfikuj komórkę docelową zainteresowania i zobrazuj cały obszar komórki za pomocą kafelkowych, nakładających się obrazów w powiększeniu 1,700 razy Aby uzyskać korelacyjne obrazy mikroskopii świetlnej i elektronowej komórek HeLa za pomocą ImageJ Fiji, uruchom ImageJ Fiji i kliknij plik, nowy, pusty TrakEM2, i wybierz folder pamięci, aby utworzyć nowy projekt TrakEM2. Przeciągnij i upuść nieprzetworzone dane obrazu kafelka do obszaru roboczego, aby otworzyć zestaw danych obrazu kafelka.
Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz linię, zmontuj wszystkie obrazy w tej warstwie i elastyczne nieliniowe korespondencje blokowe. Następnie kliknij przycisk OK, aby zaakceptować wartości domyślne dla pozostałych parametrów. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz eksport, a następnie utwórz płaski obraz, aby utworzyć zszyty obraz.
Następnie kliknij plik i zapisz jako, aby zapisać obraz. Aby zmienić rozmiar obrazu fluorescencyjnego, otwórz oprogramowanie do powiększania zdjęć. Kliknij plik, otwórz i wybierz obraz.
Wprowadź szerokość i wysokość. Aby dopasować rozmiar obrazu z mikroskopu elektronowego. Wybierz algorytm, który ma zostać zastosowany w metodzie zmiany rozmiaru.
Kliknij plik i zapisz jako, aby zapisać obraz o zmienionym rozmiarze. Otwórz aplikację ImageJ Fiji, a następnie przeciągnij i upuść fluorescencję o zmienionym rozmiarze oraz zszyty mikrograf elektronowy do obszaru roboczego. Kliknij na plugins big data viewer i big warp, aby rozpocząć rejestrację.
Następnie kliknij menu rozwijane, aby wybrać obraz z mikrofotografii fluorescencyjnej jako ruchomy obraz i obraz z mikrografu elektronowego jako obraz docelowy. Korzystając z funkcji, takich jak powiększanie, obracanie obrazu i przesuwanie, porównaj obrazy z mikrofotografii fluorescencyjnej i elektronowej. Naciśnij spację na klawiaturze, aby przełączyć się w tryb punktu orientacyjnego, a następnie naciśnij lewy przycisk myszy, aby zaznaczyć co najmniej trzy punkty orientacyjne zidentyfikowane na obu obrazach.
Po zaznaczeniu wszystkich zidentyfikowanych punktów orientacyjnych przejdź do pliku, wyeksportuj ruchomy obraz i kliknij OK. Pojawi się nowe wyskakujące okienko z przekształconym obrazem mikrofotografii fluorescencyjnej. Kliknij plik i zapisz jako, aby zapisać przekształcony obraz z mikrofotografii fluorescencyjnej.
Aby nałożyć obrazy CLEM, przeciągnij i upuść przekształcony obraz mikrografu fluorescencyjnego oraz zszyty obraz mikrografu elektronowego do przestrzeni roboczej ImageJ. Kliknij obraz, typ i ośmiobitowy kolor. Aby ustawić ten sam typ obrazu zarówno dla obrazów fluorescencji, jak i mikrofotografii elektronowej.
Kliknij obraz, kolor i scal kanały. Aby połączyć obrazy. Kliknij plik i zapisz jako, aby zapisać obraz CLEM.
Mitochondria uwięzione w lizosomach zaobserwowano w komórkach traktowanych bafilomycyną A1, co wskazuje na zahamowanie autofagii i obniżenie jakości mitochondriów, podczas gdy komórki kontrolne wykazywały mitochondria oddziałujące z lizosomami, ale nie pochłonięte przez nie, zakłócenie mitochondriów obserwowane w komórkach kontrolnych wykazało, że mitochondria otaczały lizosomy, a nie były przez nie pochłaniane. Komórki poddane działaniu U18666A wykazały zwiększone interakcje między mitochondriami a lizosomami, przy czym niektóre lizosomy zostały pochłonięte przez mitochondria.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę wykorzystania korelacjonowanej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM) do wizualizacji interakcji między mitochondriami a lizosomami za pomocą dwukolorowych sond. Zrozumienie, w jaki sposób mitochondria są regulowane przez lizosomy, może dać wgląd w opracowywanie strategii terapeutycznych dla chorób związanych z dysfunkcją mitochondriami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
Tło
- Dysfunkcja mitochondria łączy się z wieloma chorobami, szczególnie zaburzeniami neurodegeneracyjnymi.
- Zrozumienie regulacji mitochondriów przez lizosomy może postępować strategiami terapeutycznymi.
- Tradycyjne metody obrazowania tych interakcji mogą zasłaniać ważne szczegóły.
- Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa oferuje sposób łączenia technik obrazowania.
Cel badania
- Wizualizacja interakcji mitochondriów i lizosomu za pomocą wysokiej rozdzielczości obrazowania.
- Rozróżnienie interakcji w różnych warunkach stresu zewnętrznego.
- Zwiększenie zrozumienia kontroli jakości mitochondriów w komórkach.
Stosowane metody
- Hodowla komórek HeLa była prowadzona w szklanych naczyniach z siateczką o średnicy 35 mm.
- Komórki były ko-transfekowane za pomocą plazmidów i później traktowane środkami farmakologicznymi.
- Do obrazowania komórek wykorzystano zarówno mikroskopi konfokalną, jak i transmisyjną elektronową.
- CLEM było wykonywane za pomocą dwukolorowych sond, aby ułatwić wizualizacje mitochondriów w lizosomach.
- Przeprowadzano określone etapy inkubacji i płukania, aby przygotować próbki do obrazowania.
Główne wyniki
- Badanie ujawnia wyraźne interakcje między mitochondriami i lizosomami w różnych warunkach.
- Wysokiej rozdzielczości obrazowanie podkreśliło struktury komórkowe i ich reakcje na stres zewnętrzny.
- Uzyskano mechanoryczne wglądy w regulację mitochondriów przez lizosomy.
- Wyniki walidacji wskazały na niezawodne metody obrazowania do badania interakcji organelli.
Wnioski
- To badanie pokazuje skuteczność dwukolorowej CLEM w badaniu interakcji organelli.
- Ulepszenia w technikach obrazowania zapewniają nowe szlaki badawcze w zakresie kontroli jakości mitochondriów.
- Wnioski wyciągnięte z tego badania mogą mieć konsekwencje dla zrozumienia i leczenia chorób związanych z dysfunkcją mitochondriami.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Dual-color correlative light and electron microscopy (CLEM) enables high-resolution visualization of mitochondria-lysosome interactions, addressing a critical gap in understanding organelle dynamics relevant to disease mechanisms. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in early discovery, particularly for programs focused on mitochondrial quality control and cellular stress responses. Integrating CLEM into discovery pipelines enhances predictive confidence for portfolio decisions involving organelle-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of organelle contact sites, supporting functional target validation.
- Clarifies mechanistic pathways of mitochondrial regulation by lysosomes under stress conditions.
- Facilitates biological de-risking by distinguishing distinct interaction phenotypes in response to pharmacological perturbation.
- Supports predictive confidence for advancing mitochondrial quality control targets.
Screening & Assay Development
- Provides validated imaging outputs for downstream assay development and compound screening.
- Enables reproducible quantification of organelle interactions using dual-color labeling.
- Supports standardization of imaging-based readouts for screening platforms targeting organelle dynamics.
- Improves reliability of phenotypic screening for compounds modulating mitochondria-lysosome crosstalk.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular stress models for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies in fixed cells.
- Provides risk-adjusted data for advancing organelle-targeted interventions in preclinical models.
- Enhances predictive de-risking for mitochondrial dysfunction programs.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-color CLEM method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation, enabling robust hypothesis testing and pathway clarification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of organelle interactions and quality control mechanisms.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides high-resolution, dual-modality data for comparative analysis of cellular responses to stressors.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by modeling disease-relevant organelle dynamics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse organelle-targeted research initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in organelle-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across research teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial and lysosomal targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced microscopy and dual-color probe labeling.
- Demands access to confocal and electron microscopy infrastructure with image registration capabilities.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- Adaptation to other cell types or disease models may require probe optimization.
- Potential artifacts from fixation and sectioning must be carefully controlled and interpreted.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:49
Cell Transfection and Confocal Imaging for Observing the Interactions Between Mitochondria and Lysosomes in Fixed Cells
4:05
Sample Preparation for Electron Microscopy Block, Sectioning and Transmission Electron Microscopy (TEM) Imaging
6:34
Image Processing and Generation of the CLEM Image using ImageJ Fiji
8:00
Landmark-Based Image Registration with the Big Warp Plugin
9:43
Representative Results
