Analiza ilościowa metabolitów witaminy A w diecie metabolitów witaminy A w mysich tkankach ocznych i nieocznych przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej
27 grudnia 2024
Tutaj opisana jest metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej fazy normalnej, mająca na celu wykrywanie i ilościowe określanie krytycznych retinoidów zaangażowanych w ułatwianie funkcji wzrokowych zarówno w tkance ocznej, jak i ogólnoustrojowej, w kontekście ogólnoustrojowego dostarczania witaminy A do wytwarzania niezbędnego światłoczułego chromoforu rodopsyny 11-cis-retinal.
Nasze laboratorium bada dwa kluczowe transportery witaminy A, STRA6 i RBPR2. Te białka błonowe ułatwiają wchłanianie witaminy A z krwi do tkanek, takich jak oko i wątroba. Dzięki HPLC możemy badać fizjologiczne funkcje tych transporterów, tworząc ogólnoustrojowy profil witaminy A u myszy transgenicznych.
Inną techniką stosowaną w naszej dziedzinie jest powierzchniowy rezonans plazmonowy, SPR, który bada powinowactwo i kinetykę wiązania białka z jego ligandem. Zastosowaliśmy SPR do zbadania wiązania między STRA6 lub RBPR2, kompleksem wiążącym retinol RBP4. Jednym z aktualnych wyzwań związanych z tą metodą jest przepustowość próbek.
Etap odparowywania rozpuszczalnika jest głównym wąskim gardłem w tym protokole, a przyszli badacze powinni eksperymentować z metodami suszenia, takimi jak parowanie przedmuchowe azotu, które mają znacznie większą przepustowość w porównaniu z parowaniem próżniowym. Określiliśmy rolę RBPR2 jako ważnego czynnika ułatwiającego utrzymanie homeostazy witaminy A w ustroju poprzez jej funkcję w wątrobie. Zakłócenie ekspresji RBPR2 u myszy transgenicznych doprowadziło do znacznego zakłócenia poziomu witaminy A we wszystkich badanych tkankach ogólnoustrojowych, jak określono ilościowo za pomocą HPLC.
Większość innych protokołów wykrywania witaminy A opartych na HPLC wykorzystuje metody odwrotnej twarzy i zazwyczaj nie pozwala na oddzielne rozdzielanie izomerów retinoidów. Nasz normalny protokół twarzy pozwala na rozwiązanie zarówno izomerów retinaldehydu, jak i retinolu, co pozwala nam stworzyć szczegółowy profil witaminy A, co ma kluczowe znaczenie, biorąc pod uwagę znaczenie fotoizomeryzacji witaminy A w kaskadzie fototransdukcji. Na początek umieść wyekstrahowane tkanki myszy w probówce młynka do tkanek zawierającej 50% lodowatej soli fizjologicznej i 50% metanolu.
Włóż tłuczek do rurki młynka i delikatnie obróć go pięć razy, aby ujednolicić tkankę. Natychmiast przenieś homogenizowaną tkankę do 15-mililitrowej probówki. Do homogenizowanej próbki dodać dwa mililitry metanolu i jeden mililitr 0,1 molowej hydroksyloaminy.
Pozostaw mieszaninę na 15 minut w temperaturze pokojowej. W celu ekstrakcji retinoidów dodaj 10 mililitrów heksanu do homogenatu i wiruj probówkę poziomo przez co najmniej 10 sekund. Odwirować homogenatyczną mieszaninę heksanu przez trzy minuty w temperaturze 1 000 G w celu rozdzielenia faz.
Za pomocą pipety przenieś warstwę heksanu do oddzielnej szklanej rurki o pojemności 15 mililitrów i umieść próbkę w wirówce próżniowej, aby całkowicie odparować heksan z wyekstrahowanej próbki. Ponownie zawiesić wysuszone retinoidy w 15-mililitrowej probówce ze 100 mikrolitrami heksanu i dobrze zawirować, aby upewnić się, że wszystkie retinoidy są rozpuszczone. Odpipetuj całe 100 mikrolitrów heksanu do drugiej szklanej probówki i zwiruj probówkę, aby rozpuścić retinoidy.
Następnie odpipetuj całe 100 mikrolitrów heksanu do pojedynczej szklanej wkładki do analizy HPLC. Skonfiguruj przebieg HPLC przy użyciu odpowiednich warunków. Identyfikuj piki za pomocą czasów retencji i widm UV dla każdego interesującego retinoidu w oparciu o standardy.
Korzystając z systemu danych chromatograficznych, zintegruj zidentyfikowane piki i odnieś się do krzywej wzorca zewnętrznego w celu ilościowego określenia analitu. W przypadku biologicznych chromatogramów tkankowych należy ręcznie zintegrować piki, aby uwzględnić zmienność czasów retencji. W chromatogramie oka myszy kontrolnej zidentyfikowano 13-cis-Retinal, 11-cis-Retinal, All-trans-Retinal, 11-cis-Retinol i All-trans-Retinol.
W chromatogramie oka myszy poddanego działaniu hydroksyloaminy czasy retencji uległy wydłużeniu. Obecny był również syn i anty izomery tych retinaldehydów. W chromatogramie tkanki wątrobowej myszy palmitynian retinylu i All-Trans-Retinol zostały zidentyfikowane jako główne formy witaminy A, a we krwi myszy wykazały pik trans-retinolu.
Widma absorbentów UV potwierdziły obecność izoform retinoidów w pikach chromatogramu.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje rolę transporterów witaminy A, STRA6 i RBPR2, w pobieraniu witaminy A przez tkanki oczne i systemowe. Z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) zbadano funkcje fizjologiczne tych transporterów u myszy transgenicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Witamina A jest kluczowa dla funkcji wzrokowych.
- Transportery STRA6 i RBPR2 ułatwiają pobieranie witaminy A.
- Metoda HPLC jest wykorzystywana do profilowania witaminy A w tkankach.
- Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) służy do oceny oddziaływań białko-ligand.
Cel badania
- Ilościowe oznaczenie retinoidów zaangażowanych w funkcję widzenia.
- Zrozumienie systemowego zaopatrzenia w witaminę A.
- Zbadanie powinowactwa wiązania transporterów witaminy A.
Zastosowane metody
- Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC).
- Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR).
- Transgeniczne modele mysie do systematycznego profilowania witaminy A.
- Analiza kinetyki wiązania między transporterami a białkami wiążącymi retinol.
Główne wyniki
- Skuteczna kwantyfikacja kluczowych retinoidów.
- Wnioski dotyczące ról fizjologicznych STRA6 i RBPR2.
- Charakterystyka powinowactw wiązania transporterów do białek wiążących retinol.
- Zidentyfikowanie problemów z przepustowością próbek w metodzie SPR.
Wnioski
- Badanie pogłębia zrozumienie mechanizmów transportu witaminy A.
- Wyniki mogą stanowić podstawę dla przyszłych badań nad funkcją wzrokową.
- Postępy metodologiczne mogą zwiększyć wydajność w badaniach nad białkami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe profilowanie metabolitów witaminy A w tkankach mysich z wykorzystaniem HPLC umożliwia precyzyjną ocenę systemicznej i okularystycznej podaży witaminy A, co bezpośrednio dostarcza danych do walidacji celów dla ścieżek wzrokowych zależnych od GPCR. Ta zdolność analityczna wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego na etapie odkrywania, szczególnie w odniesieniu do biologii transporterów i strumienia metabolicznego w modelach przedklinicznych. Niezawodna kwantyfikacja metabolitów stanowi podstawę pewności predykcyjnej w badaniach translacyjnych nad zaburzeniami wzroku i metabolicznymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji transporterów witaminy A oraz przepływu w szlakach metabolicznych in vivo.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez kwantyfikację rozkładu metabolitów w tkankach.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla STRA6 i RBPR2 w modelach przedklinicznych.
- Dostarcza danych ilościowych zwiększających pewność prognostyczną w programach ukierunkowanych na transportery.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe odczyty izomerów retinoidów w złożonych macierzach tkankowych.
- Standaryzuje detekcję metabolitów w celu zapewnienia powtarzalności między seriami eksperymentalnymi.
- Umożliwia skalowalność testu oraz ponowne wykorzystanie platformy w badaniach nad transporterami i metabolizmem.
- Wspiera wiarygodną ocenę wpływu perturbacji związkowych lub genetycznych na metabolizm witaminy A.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie profilowania metabolitów do modeli niedoboru witaminy A w obrębie narządu wzroku i systemowo, istotnych w kontekście danej choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację funkcji transportera.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju terapii celowanych w transportery, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy homeostazy systemowej oraz tkankowo specyficznego dostarczania witaminy A.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda oparta na technice HPLC integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania przedkliniczne, wspierając identyfikację związków wiodących oraz badania mechanistyczne transporterów witaminy A.
- Biologia odkryć: Ilościowe profilowanie metabolitów wyjaśnia funkcję transporterów i wąskie gardła szlaków metabolicznych.
- Przesiewanie: Powtarzalność testu i dane ilościowe umożliwiają rzetelne porównanie interwencji genetycznych lub farmakologicznych.
- Analityka: Wysokorozdzielcze dane chromatograficzne wspierają analizę statystyczną poziomów metabolitów w różnych tkankach i warunkach.
- Badania translacyjne: Metoda jest zgodna z modelami przedklinicznymi dla systemowej i okulistycznej homeostazy witaminy A.
- Zastosowania komercyjne: Protokół można dostosować do różnorodnych badań profilowania transporterów, metabolizmu oraz tkanek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w biologii transporterów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje oznaczanie ilościowe metabolitów i poprawia powtarzalność między badaniami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i zmniejsza biologiczne ryzyko w późnych etapach programów ukierunkowanych na transportery.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w fazie odkrywania i badań przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obsłudze HPLC oraz analizie danych chromatograficznych.
- Wymagany jest dostęp do wysokiej jakości aparatury oraz walidowanych wzorców analitycznych.
- Standaryzacja międzyzespołowa jest niezbędna dla zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Protokół można dostosować do różnych tkanek mysich, jednak w przypadku innych gatunków lub matryc może być wymagana optymalizacja.
- Przepustowość próbek może być ograniczona przez etapy odparowywania rozpuszczalnika, co sugeruje potrzebę optymalizacji procesu pracy.
