Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi
29 listopada 2024
Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.
Tworzenie prokoagulantów płytek krwi ma kluczowe znaczenie dla utrzymania hemostazy. Proces ten obejmuje ekspresję fosfolipidów i uwalnianie mikropęcherzyków na powierzchni płytek krwi, co jest niezbędne dla etapów krzepnięcia. Oceny tego procesu dostarczyły nowych danych na temat odpowiedzi prokoagulacji płytek krwi w różnych chorobach ludzkich.
Cytometria przepływowa stała się kamieniem węgielnym i zyskała powszechną akceptację w ocenie ekspresji fosfatydyloseryny na płytkach krwi i uwalnianiu mikropęcherzyków. Izolacja i analiza oczyszczonych płytek krwi z krwi jest czasochłonna i wymaga specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, a zatem nie jest obecnie dostępna do rutynowej diagnostyki klinicznej. Analiza ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków jest również trudna ze względu na ich mały rozmiar i małą liczbę pozytywnych zdarzeń dla markerów będących przedmiotem zainteresowania.
Na początek należy pobrać krew z żył obwodowych do probówek zbiorczych zawierających aktywny antykoagulant cytrynian trisodowy z kwasem cytrynowym i dekstrozą. Delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać krew z antykoagulantem i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 15 minut. Policz płytki krwi za pomocą automatycznego licznika komórek, aby określić prawidłową prędkość wirowania.
Aby przygotować osocze bogatopłytkowe, należy odwirować krew o stężeniu 250 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez robienia przerwy. Następnie dodaj 1 mililitr ACDA i 6,25 mikrolitra apirazy do 9 mililitrów osocza bogatopłytkowego. Odwirować mieszaninę przy 1,100 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Za pomocą pipety pastwiskowej usunąć supernatant zawierający osocze ubogie w płytki krwi i delikatnie zawiesić osad płytek krwi w 1 mililitrze buforu do mycia. Następnie dodaj 3 do 4 mililitrów buforu myjącego do probówki i ponownie odwiruj. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze buforu do mycia.
Przenieść 150 mikrolitrów zawiesiny płytek krwi do probówki o pojemności 1,5 mililitra w celu zliczenia komórek w automatycznym liczniku komórek. Dodać 3 do 4 mililitrów buforu do pozostałej zawiesiny, aby wykonać dodatkowe płukanie, jak pokazano wcześniej. Następnie ponownie zawiesić osad płytek krwi w buforze reakcyjnym, aby osiągnąć końcowe stężenie 5 x 10 do mocy 11 płytek krwi na litr.
Na początek należy uzyskać umyte płytki krwi w pożądanym buforze do cytometrii przepływowej. Przygotować wszystkich agonistów i fluorochromy w buforze reakcyjnym. W przypadku testów wewnętrznych dodać 100 mikrolitrów przemytych płytek krwi o stężeniu 50 x 10 do mocy 9 płytek krwi na litr do różnych probówek.
Delikatnie wstrząśnij każdą porcją i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut. Następnie dodać 5 mikrolitrów nierozcieńczonego Aneksyny V-FITC do każdej mikroprobówki i inkubować. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu reakcyjnego do każdej probówki, aby zatrzymać proces.
Bramkowanie populacji płytek krwi za pomocą rozproszenia do przodu lub FSC i użycie wykresów gęstości do identyfikacji każdej populacji niezależnie. Ustaw ujemną wartość odcięcia po prawej stronie populacji płytek krwi w stanie spoczynku. Po aktywacji należy sklasyfikować zdarzenia po prawej stronie tego punktu odcięcia jako płytki krwi eksponujące fosfatydyloserynę.
W celu różnicowania mikropęcherzyków należy ustawić punkt odcięcia na najniższą wartość FSC obserwowaną w populacji spoczynkowych płytek krwi. Po aktywacji zdarzenia dodatnie fosfatydyloseryny poniżej tego progu należy sklasyfikować jako mikropęcherzyki. Pomiary wyjściowe wykazały, że mniej niż 2,9% nieaktywowanych płytek krwi wykazywało ekspozycję na fosfatydyloserynę.
Po aktywacji 26,7% płytek krwi stało się fosfatydyloseryną dodatnią z kolagenem, 9,1% z trombiną i 36,2% zarówno z kolagenem, jak i trombiną. Leczenie jonoforem spowodowało uzyskanie 49,6% płytek fosfatydyloseryny. Wyjściowy odsetek mikropęcherzyków wynosił 0,3%Znaczący wzrost zaobserwowano tylko w przypadku kolagenu i trombiny razem (około 11,4%), a bardziej w przypadku jonoforów (44%)".
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje powstawanie płytek prokoagulacyjnych, które odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu hemostazy. Opracowany protokół umożliwia izolację przemytych płytek krwi z krwi ludzkiej w celu ilościowego oznaczenia ekspozycji fosfatydyloseryny oraz uwalniania mikropęcherzyków, będących kluczowymi wskaźnikami obecności płytek prokoagulacyjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia płytek krwi
- Mechanizmy hemostazy
- Reakcje prokoagulacyjne w chorobach
Wstęp
- Płytki krwi odgrywają istotną rolę w hemostazie.
- Nieprawidłowa aktywność prokoagulacyjna jest powiązana z różnymi chorobami ludzi.
- Cytometria przepływowa jest kluczowa dla oceny aktywacji płytek krwi oraz uwalniania mikro-pęcherzyków.
Zastosowane metody
- Izolacja opłukanych płytek krwi z krwi ludzkiej za pomocą wirowania.
- Cytometria przepływowa w celu ilościowego oznaczenia ekspozycji fosfatydyloseryny i uwalniania mikropęcherzyków.
- Zastosowanie specjalistycznych odczynników i buforów dla zapewnienia dokładnych pomiarów.
Główne wyniki
- Stwierdzono, że bazowe poziomy ekspozycji fosfatydyloseryny w nieaktywowanych płytkach krwi wynosiły poniżej 2,9%.
- Aktywacja doprowadziła do znaczącego wzrostu liczby płytek pozytywnych pod kątem obecności fosfatydyloseryny, osiągając maksimum na poziomie 49,6% po zastosowaniu jonoforu.
- Tworzenie mikro-pęcherzyków wzrosło do 44% w określonych warunkach aktywacji.
Wnioski
- Badanie ustanawia niezawodny protokół izolacji i analizy płytek krwi.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia funkcji płytek krwi w stanie zdrowia i choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa charakterystyka płytek krwi o działaniu prokoagulacyjnym, przeprowadzana poprzez analizę ekspozycji fosfatydyloseryny i uwalniania mikropęcherzyków, ma kluczowe znaczenie dla minimalizacji ryzyka zakrzepowego oraz zrozumienia mechanizmów hemostatycznych we wczesnych etapach poszukiwania nowych leków. Niniejszy protokół umożliwia precyzyjny pomiar stanów aktywacji płytek krwi, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych oraz w badaniach translacyjnych. Niezawodna ocena tych biomarkerów dostarcza istotnych informacji przy podejmowaniu decyzji dotyczących portfolio na styku biologii odkrywczej i rozwoju przedklinicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie zależnych od płytek krwi szlaków krzepnięcia w celu mechanistycznej oceny ryzyka.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów wpływających na aktywację płytek krwi i odpowiedzi prokoagulacyjne.
- Zapewnia ilościowe punkty końcowe do testowania hipotez w badaniach nad zakrzepicą i hemostazą.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych układów płytkowych do późniejszego screeningu związków.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne odczyty oparte na cytometrii przepływowej do celów opracowywania testów.
- Umożliwia wiarygodną kwantyfikację ekspozycji fosfatydyloseryny oraz uwalniania mikropęcherzyków jako wyników screeningu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje profile aktywacji płytek krwi in vitro z modelami ryzyka zakrzepowego istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną czynników przeciwzakrzepowych lub prokoagulacyjnych.
- Dostarcza translacyjnych biomarkerów dla decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o ocenę ryzyka.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Niniejszy protokół integruje etapy wczesnego odkrywania i badań przedklinicznych, umożliwiając prowadzenie studiów mechanistycznych, walidację celów oraz opracowywanie testów w ramach programów badawczych nad zakrzepicą i hemostazą.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków krzepnięcia zależnego od płytek krwi.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki cytometrii przepływowej do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia precyzyjny pomiar liczby płytek krwi wykazujących obecność fosfatydyloseryny oraz liczby mikropęcherzyków do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy dane dotyczące aktywacji płytek krwi in vitro z przedkliniczną oceną ryzyka zakrzepowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do analizy funkcji płytek krwi w wielu programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad krzepnięciem krwi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje aktywację płytek krwi i ilościowe oznaczanie mikro-pęcherzyków w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów celujących w szlaki zależne od płytek krwi z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie biologii płytek krwi oraz analizy cytometrii przepływowej.
- Wymaga specjalistycznego instrumentarium laboratoryjnego i infrastruktury analitycznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów bramkowania i kwantyfikacji pomiędzy zespołami.
- Możliwa jest konieczność adaptacji metody dla różnych źródeł płytek krwi lub modeli chorobowych.
- Wyzwania obejmują niską liczbę zdarzeń oraz złożoność techniczną detekcji mikropęcherzyków.
