Name: Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Poznaj metodę charakterystyki płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji fosfatydyloseryny i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Protokół jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Naukowych Szpitala Uniwersyteckiego w Bordeaux. Próbki krwi pobrano od zdrowych ochotników, którzy wyrazili świadomą zgodę, a próbki te zostały przetworzone zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Dawcy, którzy przyjmowali jakiekolwiek substancje mogące wpływać na czynność płytek krwi, byli wykluczani, jeśli takie substancje zostały przyjęte w ciągu 10 dni poprzedzających eksperymenty. Uzyskano świadomą zgodę od zdrowych ochotników na pobranie krwi i opublikowanie danych. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Pobieranie krwi i przygotowanie umytych płytek krwi
<ol>
	<li>Krew z żył obwodowych należy pobrać do probówek zbiorczych zawierających aktywny antykoagulant cytrynian trójsodowy z kwasem cytrynowym i dekstrozą (ACD) po odrzuceniu pierwszych 3 ml.</li>
	<li>Po pobraniu delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać krew z ACD i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 15 minut przed odwirowaniem.</li>
	<li>Policz płytki krwi za pomocą automatycznego licznika komórek przed odwirowaniem, aby określić prawidłową prędkość wirowania (Tabela 1). Przygotować osocze bogatopłytkowe (PRP) przez odwirowanie przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez stosowania hamulca, aby zoptymalizować regenerację płytek krwi. 
	UWAGA: Ten krok spowoduje wytworzenie trzech warstw w próbce: górna warstwa zawierająca osocze, płytki krwi i niewielką frakcję białych krwinek; środkowa warstwa wzbogacona białymi krwinkami; i dolna warstwa składająca się z czerwonych krwinek. Ostrożnie przenieś PRP z górnej warstwy do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby uniknąć zanieczyszczenia czerwonymi i białymi krwinkami.</li>
	<li>Do PRP dodać 1 ml ACD-A (patrz Tabela 2) i 6,25 μl apyrazy na 9 ml. 
	UWAGA: Apyraza, w stężeniu 0,02 U/ml, rozkłada śladowe ilości ATP lub ADP wydzielane przez płytki krwi, zapobiegając w ten sposób odczuleniu receptorów ADP płytek krwi i utrzymując kształt płytek krwi25. Inhibitor prostacykliny PGI2 (0,5 μM) może być również dołączony do apyrazy, aby zapobiec aktywacji płytek krwi.</li>
	<li>Przygotować osad płytek krwi przez odwirowanie w temperaturze pokojowej przy 1100 x g przez 10 minut. Odessać supernatant zawierający osocze ubogie w płytki krwi (PPP) delikatną metodą, taką jak pipeta Pasteura, i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu płuczącego (patrz Tabela 3 i Tabela 4). Delikatnie homogenizować pipetą, a następnie dodać dodatkowe 3-4 ml buforu do mycia. 
	UWAGA: Poziom wapnia jest obniżony, aby zapobiec krzepnięciu czynnikami skrzepowymi obecnymi w osoczu. Na tym etapie osocze ubogie w płytki krwi zostało całkowicie usunięte, co zapobiega tworzeniu się skrzepów i aktywacji płytek krwi przez produkcję trombiny.</li>
	<li>Ponownie odwirować w temperaturze pokojowej przy 1100 x g przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do mycia. Przenieść 150 μl zawiesiny płytek krwi do probówki o pojemności 1,5 ml w celu zliczenia komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Następnie ponownie zawiesić osad za pomocą 3-4 ml buforu do mycia.</li>
	<li>Przeprowadzić końcowe wirowanie przy 1100 x g przez 10 minut (w temperaturze pokojowej). Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad płytek krwi w objętości buforu reakcyjnego (patrz tabela 5 i tabela 6) do uzyskania końcowego stężenia 5 x 1011 płytek krwi/l.</li>
	<li>Pozwól umytym płytkom krwi odpocząć przez co najmniej 30 minut przed eksperymentami, aby umożliwić zużycie pozostałych inhibitorów i aklimatyzację płytek krwi do buforu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie testu
<ol>
	<li>Przygotować wszystkich agonistów i fluorochromy w buforze reakcyjnym. Dodać 5 μl trombiny do 45 μl buforu (rozcieńczenie 1:10) i 5 μl jonoforu do 495 μl buforu (rozcieńczenie 1:500).
	<ol>
		<li>W przypadku testów wewnętrznych należy porównać nieaktywowane płytki krwi z płytkami krwi leczonymi pojedynczymi i podwójnymi agonistami. Dodać, w różnych podwielokrotnościach, 100 μl przemytych płytek krwi w proporcjach 50 x 109 płytek krwi/l do: (i) 10 μl buforu reakcyjnego, (ii) 3 μl nierozcieńczonego kolagenu (końcowe stężenie 30 μg/ml), (iii) 10 μl wstępnie rozcieńczonej trombiny (0,5 j.m./ml), (iv) 3 μl nierozcieńczonego kolagenu + 10 μl wstępnie rozcieńczonej trombiny, oraz (v) 10 μl wstępnie rozcieńczonego jonoforu (końcowe stężenie 2 μM), o którym wiadomo, że bezpośrednio zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom wapnia, jak wcześniej wspomniano26. 
		UWAGA: Leczenie jonoforem wapnia, takim jak A23187 lub jonomycyna, ma kluczowe znaczenie, ponieważ indukuje rozległe mieszanie błony fosfolipidowej i zwiększoną eksternalizację PS.</li>
		<li>Delikatnie wstrząsnąć ręką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min. 
		UWAGA: Dłuższa inkubacja agonistów (30 min) może pozwolić na lepsze różnicowanie populacji płytek krwi podczas procesu analizy cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 5 μl nierozcieńczonego Annexin-V FITC do każdej mikroprobówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności. 
	UWAGA: W celu lepszej identyfikacji komórek płytkowych można również włączyć przeciwciało monoklonalne przeciwko jednemu z receptorów swoistych dla płytek krwi, GPIX (CD42b) lub integrynie αIIb (CD41, GPIIb).</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu reakcyjnego, aby zatrzymać proces i kontynuować analizę próbki za pomocą cytometru przepływowego.</li>
</ol>
3. Charakterystyka prokoagulacyjnych płytek krwi i mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej (FC)
UWAGA: Do wiarygodnej analizy funkcji płytek krwi użyj przyrządu do cytometrii przepływowej (FC) skonfigurowanego zgodnie z ustalonymi standardami27. Przyrząd musi być zdolny do wykrywania rozproszenia do przodu (FSC) i co najmniej jednego sygnału fluorescencyjnego. Ustaw detektory rozproszenia światła i fluorescencji na wzmocnienie logarytmiczne. Rozcieńczyć próbki odpowiednio do FC, aby upewnić się, że tylko pojedyncze płytki krwi są zliczane ze zmniejszoną prędkością pozyskiwania danych.
<ol>
	<li>Ustaw cytometr przepływowy na "wolne" natężenie przepływu z progiem co najmniej 10 000 zdarzeń płytkowych. Monitoruj emisję fluorescencji za pomocą filtra przepustowego dla FITC.</li>
	<li>Bramka populacji płytek krwi za pomocą rozproszenia do przodu (FSC). Zbadaj płytki krwi i uwolnione mikropęcherzyki zgodnie z ich wielkością. Użyj wykresów gęstości, aby zidentyfikować płytki krwi i uwolnione mikropęcherzyki zarówno dla płytek krwi spoczynkowych, jak i stymulowanych; Analizuj każdą populację bramkowaną niezależnie.</li>
	<li>Rozróżnij płytki krwi prokoagulacyjne zgodnie z osią FL1. Umieścić ujemną granicę odcięcia po prawej stronie populacji płytek krwi w stanie spoczynku (tj. w obecności buforu reakcyjnego). Po aktywacji płytek krwi należy sklasyfikować wszystkie zdarzenia zlokalizowane po prawej stronie tego punktu odcięcia jako płytki krwi eksponujące fosfatydyloserynę.</li>
	<li>Rozróżniaj mikropęcherzyki, które są mniejsze niż płytki krwi, dzięki ich unikalnym właściwościom rozpraszania światła. Ustawić punkt odcięcia na najniższą wartość FSC obserwowaną w spoczynkowej populacji płytek krwi. Po aktywacji należy sklasyfikować wszelkie zdarzenia fosfatydyloseryny dodatnie poniżej tego progu jako mikropęcherzyki. 
	UWAGA: Należy uwzględnić indywidualne różnice w wielkości płytek krwi, dostosowując w razie potrzeby wartość odcięcia. Upewnij się, że mniej niż 1% mikropęcherzyków jest obecnych w stanie spoczynku.</li>
</ol>

Analyzing Platelet Phosphatidylserine and Microvesicle Release

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Ostatnie badania nad prokoagulacyjnymi płytkami krwi podkreśliły ich zmiany podczas kilku chorób 1,28,29, podkreślając znaczenie ich szczegółowej analizy i charakterystyki 30,31,32. Chociaż obecne testy kliniczne oceniające tworzenie prokoagulantów płytek krwi są ograniczone, w ciągu ostatnich dwóch dekad nastąpił znaczny wzrost zainteresowania klinicznego. Na przykład zależny od wapnia scramblase TMEM16F (ANO6) bierze udział w ekspozycji na prokoagulanta fosfatydyloserynę (PS)33. Warianty TMEM16F są związane z zespołem Scotta 33,34,35, rzadkim zaburzeniem krzepnięcia charakteryzującym się upośledzonym mieszaniem fosfolipidów i zmniejszonym wytwarzaniem trombiny w aktywowanych płytkach krwi 36. Co więcej, podwyższony poziom prokoagulantów płytek krwi jest związany z udarami zakrzepowymi i chorobą wieńcową, co wzbudza zainteresowanie terapiami mającymi na celu ograniczenie aktywności prokoagulantu płytek krwi37. Spośród obecnie dostępnych metod oceny tworzenia się proagulantów płytek krwi, ocena ekspozycji na PS poprzez wiązanie Aneksyny-V i uwalnianie mikropęcherzyków jest jedną z najczęściej stosowanych38,39.
Przedstawiony tutaj protokół umożliwia izolację oczyszczonych przez człowieka płytek krwi i scharakteryzowanie płytek krwi prokoagulantów poprzez pomiar ekspozycji na PS i uwalniania mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej. Bardzo ważne jest, aby zalecić zdrowym ochotnikom, aby powstrzymali się od leków, które mogą wpływać na czynność płytek krwi przez co najmniej 10 dni przed pobraniem krwi. Pobieranie krwi wymaga ostrożności, aby uniknąć urazu żyły lub zbyt powolnego przepływu, ponieważ mogą one indukować wytwarzanie trombiny i aktywację płytek krwi. Krew antykoagulowana cytrynianem sodu nie jest zalecana do przygotowania przemytych płytek krwi, ponieważ resztkowy wapń może umożliwiać wytwarzanie trombiny i aktywację płytek krwi podczas wirowania17. Krew z antykoagulacją ACD ma pH 6,5 i wyższe stężenie cytrynianu 22 mmol/L w porównaniu z pH krwi z antykoagulacją cytrynianową wynoszącą 7,5 i stężenie cytrynianu 13 mmol/l17. Kwaśne pH i obniżone zewnątrzkomórkowe stężenie wapnia we krwi z antykoagulacją ACD zapobiegają agregacji płytek krwi24. Niezbędne jest zminimalizowanie wytwarzania trombiny podczas procesu zbierania. Zaleca się nieurazowe nakłucie żyły przy użyciu igły o wadze co najmniej 21 G, aby zapobiec zastojowi żylnemu lub nadmiernemu ciśnieniu. Dodatkowo pierwsze kilka mililitrów krwi należy wyrzucić, aby uniknąć zanieczyszczenia czynnikami tkankowymi i śladowymi ilościami trombiny17. Niezbędne jest również zminimalizowanie czasu między nakłuciem żyły a przetworzeniem próbki, ponieważ długotrwałe przechowywanie krwi może prowadzić do aktywacji płytek krwi, zwiększając w ten sposób ekspozycję na PS i uwalnianie mikropęcherzyków40. Podczas całej procedury przygotowania płytek krwi należy zwrócić szczególną uwagę, aby zapobiec spontanicznej preaktywacji płytek krwi, która może wystąpić podczas samego procesu przygotowania41,17. Co więcej, wyizolowanie oczyszczonych płytek krwi wymaga ostrożnego unikania zanieczyszczenia innymi komórkami krwi17. Polega to na dokładnym zasysaniu supernatantu po odwirowaniu płytek krwi w celu zapewnienia czystego preparatu. Ponieważ osad jest zazwyczaj widoczny i mocno przylega do ścianki probówki, supernatant można łatwo zassać za pomocą końcówki pipety.
Podczas etapów płukania wirowania płytki krwi są ponownie zawieszane w buforze, który symuluje warunki fizjologiczne. Użycie przemytych płytek krwi w buforze fizjologicznym izoluje je od antykoagulantów i osocza, zapobiegając w ten sposób artefaktom za pośrednictwem trombiny. Podczas gdy osocze bogatopłytkowe (PRP) jest szybką metodą uzyskiwania wysokich stężeń płytek krwi, jej zastosowanie w badaniach funkcjonalnych jest ograniczone przez zmiany pH wywołane antykoagulantami oraz zewnątrzkomórkową zawartość wapnia i białka w osoczu, które mogą wpływać na aktywację płytek krwi17. Co więcej, wysokie poziomy PS generowane podczas aktywacji płytek krwi byłyby wystarczające, aby sprzyjać tworzeniu się kompleksów krzepnięcia osocza, następnemu wybuchowi trombiny i tworzeniu się skrzepów w PRP, co uniemożliwiłoby interpretację wyników eksperymentalnych. Natomiast ponowne zawieszenie w buforze zawierającym apirazę jest zalecane w celu utrzymania funkcjonalności płytek krwi poprzez zapobieganie odczulaniu receptorów purynergicznych poprzez degradację ATP i ADP42,43. Chociaż wielokrotne etapy wirowania i płukania wymagają więcej czasu, zawiesiny przemytych płytek krwi przygotowane tą metodą mają tę zaletę w postaci większej stabilności (5-8 godzin) w porównaniu z preparatami cytrynianowymi PRP, które są stabilne nie dłużej niż 1-3 h23.
Badanie to pokazuje wykonalność i prostotę ilościowego oznaczania mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej. Jednak produkcja mikropęcherzyków może zostać zagubiona w gruzach i hałasie maszyny. Dlatego bardzo ważne jest, aby upewnić się, że cytometr przepływowy został poddany gruntownemu czyszczeniu i że stosowane nie zawierają żadnych cząstek zanieczyszczających, które mogłyby prowadzić do wysokiego tła podczas analizy cytometrii przepływowej. Alternatywnie, do identyfikacji powstawania mikropęcherzyków można użyć specjalistycznych cytometrów przepływowych z możliwością wykrywania małych cząstek. Badano również wiązanie znakowanej fluoresceiną Aneksyny-V w funkcji zawartości PS w błonie, podkreślając krytyczną rolę wystarczających stężeń wapnia w buforze dla wiązania Aneksyny-V i prokoagulacyjnej odpowiedzi płytek krwi44.
Dane potwierdzające stabilność próbek płytek krwi w czasie są obecnie nieliczne. Kilka laboratoriów rozwiązało ten problem, stabilizując próbki poprzez dodanie roztworu utrwalającego, takiego jak bufor zawierający formaldehyd. Dodanie utrwalacza do świeżo pobranych próbek płytek krwi ma tę zaletę, że pozwala zachować próbki do późniejszej analizy. Niemniej jednak wiązanie formaldehydu może powodować sztucznie zwiększone wiązanie Aneksyny-V. Rochat i wsp. wykazali, że wiązanie płytek krwi roztworem formaldehydu o niskim stężeniu, wolnym od wapnia, nie zmienia proporcji dodatnich płytek krwi Aneksyny-V45. Jednak badacze, którzy wymagają fiksacji, powinni zoptymalizować swój specyficzny protokół, aby upewnić się, że nie powoduje on sztucznie zmienionych wyników. W przeciwnym razie próbki należy natychmiast przetworzyć.
Innym szlakiem, który może również prowadzić do ekspozycji na PS, jest apoptoza wewnętrzna, proces, o którym wiadomo, że reguluje żywotność płytek krwi w krążeniu46. Aktywacja proapoptotycznych białek BAK i BAX powoduje aktywację kaspazy, która sprzyja eksternalizacji PS, prowadząc do klirensu płytek krwi in vivo . Ostatnio zasugerowano, że inny marker powierzchni płytek krwi, selektyna P/CD62P, oprócz Aneksyny-V, może być stosowany do odróżniania prokoagulantów od apoptotycznych płytek krwi47. Oczekuje się, że płytki krwi prokoagulantów będą dodatnie zarówno dla markerów PS, jak i selektyny P, podczas gdy płytki apoptozy są dodatnie dla aneksyny-V, ale ujemne dla selektyny P. Jednak czas jest również czynnikiem różnicującym płytki krwi prokoagulacyjne i apoptotyczne47. Wytwarzanie prokoagulacyjnych płytek krwi in vitro jest szybkim procesem, podczas gdy apoptoza wewnętrzna jest procesem wolniejszym itrwa wiele godzin. W tym kontekście stosowanie dodatkowych markerów do oceny prokoagulacyjnych płytek krwi nie jest konieczne, co upraszcza metodę. Utrzymujący się wzrost wewnątrzkomórkowego Ca2+ i prokoagulacyjnego tworzenia płytek krwi następuje w ciągu kilku minut z bardzo silnymi agonistami, takimi jak jonofor lub połączona aktywacja z kolagenem i trombiną, podczas gdy inhibitor BCL-XL (lub mimetyk BH3) wyzwala tworzenie apoptotycznych płytek krwi poprzez aktywację proapoptotycznych BAK i BAX, powodując przepuszczalność błony zewnętrznej mitochondriów, uwalnianie cytochromu C, i aktywacja kaspazy49.
Podsumowując, opisany tutaj protokół ułatwia izolację oczyszczonych płytek krwi i ich późniejszą charakterystykę pod kątem aktywności prokoagulacyjnej przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i cytometrii przepływowej. Procedura ta toruje drogę do przyszłych badań nad prokoagulantami płytek krwi w próbkach krwi pacjentów, z potencjalnymi zastosowaniami w praktyce klinicznej, takimi jak diagnoza rzadkiego zespołu Scotta50.

Tworzenie prokoagulantu płytek krwi jest kluczowe dla utrzymania hemostazy1,2,3. Proces ten obejmuje indukowaną przez agonistów ekspresję fosfolipidów na błonie płytek krwi, która jest niezbędna do składania kompleksów tenazy i protrombinazy1,3,4. Po aktywacji płytek krwi, mikropęcherzyki płytkowe są również w sposób ciągły uwalniane5,6. Mikropęcherzyki (o średnicy od 50 nm do ponad 1 μm) otaczają zarówno strukturę błony, jak i składniki cytoplazmatyczne komórek źródłowych7,8. Mikropęcherzyki są ważnymi mediatorami sygnalizacji międzykomórkowej9,10, a także repozytoria czynników wzrostu, które wspomagają gojenie się ran i modulację stanu zapalnego11,12. Sugeruje się również, że mikropęcherzyki są od 50 do 100 razy bardziej prokoagulacyjne niż aktywowane płytki krwi13. Warto zauważyć, że najnowsze dowody sugerują, że zmagazynowane płytki krwi ulegają aktywacji, co prowadzi do produkcji mikropęcherzyków - ma to potencjalne konsekwencje dla praktyki terapii transfuzji płytek krwi. Wydłużony czas przechowywania mikropęcherzyków i zwiększona aktywność prokoagulantu sprawiają, że są one obiecującym substytutem płytek krwi w zastosowaniach transfuzjologicznych14.
Wprowadzono innowacje metodologiczne, aby bezpośrednio i pośrednio ocenić powstawanie prokoagulantów płytek krwi zarówno w warunkach zdrowotnych, jak i chorobowych4,14,15. Oceny ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków przy użyciu oczyszczonych płytek krwi dostarczyły nowych danych na temat tego, jak zaburzone są reakcje prokoagulantów płytek krwi w różnych chorobach człowieka1,4. Ta rozwijająca się dziedzina badań otwiera również możliwości interwencji terapeutycznych1,4. Jednak izolacja i analiza oczyszczonych płytek krwi z krwi jest czasochłonna, wymaga specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, a zatem nie można ich obecnie dostosować do rutynowej diagnostyki klinicznej16,17. Analiza ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków jest również trudna ze względu na ich mały rozmiar i liczbę pozytywnych zdarzeń dla markerów będących przedmiotem zainteresowania18,19.
Cytometria przepływowa, wykorzystująca fluorescencyjne wiązanie Aneksyny-V, była kamieniem węgielnym w ocenie ekspresji PS na płytkach krwi i mikropęcherzykach od momentu jej powstania dwie dekady temu20. Zyskał powszechną akceptację w badaniu prokoagulacyjnych płytek krwi i mikropęcherzyków21,22. W związku z tym przedstawiono tutaj zoptymalizowany protokół, który można wykorzystać do izolacji oczyszczonych płytek krwi z próbek krwi przy użyciu techniki opracowanej przez grupę Cazenave'a23, a następnie charakterystyki ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej po aktywacji płytek krwi24. Protokół ten ułatwi dalsze badania i dogłębną charakterystykę prokoagulacyjnych płytek krwi w populacjach klinicznych będących przedmiotem zainteresowania.

<table><tbody><tr><td>(CD42b, GPIX) APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13980</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi ACD-A</td><td>BD Vacutainer</td><td>366645</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-V FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>560931</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase Grade VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej 30%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 0,25M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat kwasu cytrynowego</td><td>Merck</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen&nbsp;</td><td>Stago</td><td>86924</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>jonofor Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Calbiochem/VWR</td><td>100105</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Trombina&nbsp;</td><td>Łącznik Biomed</td><td>EZ 006 A</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy dwuwodny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Na3C6H5O7*2H2O</td></tr><tr><td>&alpha; Integryna IIb (CD41, GPIIb) PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607115</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Procoagulant Platelet Characterization by Measuring Phosphatidylserine Exposure and Microvesicle Release from Human Purified Platelets

Aktywowane płytki krwi sprzyjają krzepnięciu głównie poprzez eksponowanie proagulantu fosfolipidowego fosfatydyloseryny (PS) na ich zewnętrznej powierzchni błony i uwalnianie mikropęcherzyków wyrażających PS, które zachowują oryginalną architekturę błony i cytoplazmatyczne składniki ich macierzystych komórek. Dostępność fosfatydyloseryny ułatwia wiązanie głównych czynników krzepnięcia, znacznie zwiększając skuteczność katalityczną enzymów krzepnięcia, podczas gdy uwalnianie mikropęcherzyków działa jako kluczowy mediator sygnalizacji międzykomórkowej. Prokoagulanty odgrywają kluczową rolę w stabilizacji skrzepów podczas hemostazy, a ich zwiększony udział w krwiobiegu koreluje ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Wykazano również, że mikropęcherzyki płytkowe są bogate w czynniki wzrostu, które wspomagają gojenie się ran i modulację stanu zapalnego. Analiza ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków za pomocą cytometrii przepływowej stanowi poważne wyzwanie ze względu na ich niewielki rozmiar i ograniczoną liczbę pozytywnych zdarzeń dla markerów będących przedmiotem zainteresowania. Pomimo znacznych postępów poczynionych w ciągu ostatniej dekady, metody oceny ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków pozostają w toku. Niestety, nie istnieje jeden powszechnie stosowany protokół i należy ocenić kilka czynników, aby określić najbardziej odpowiednią metodologię dla każdego konkretnego zastosowania. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół izolowania przemytych płytek krwi od ludzkiej krwi, a następnie aktywacji kolagenu i / lub trombiny, w celu zmierzenia ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które charakteryzują płytki krwi prokoagulantu. Protokół ten ma na celu ułatwienie wstępnego przygotowania osocza bogatopłytkowego i izolacji przemytych płytek krwi. Wreszcie, ekspozycja na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków są określane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej, co umożliwia identyfikację płytek krwi prokoagulantów.

Ilościowe oznaczenie płytek prokoagulacyjnych i mikropęcherzyków przeprowadzono z wykorzystaniem barwienia aneksyną V, rejestrując co najmniej 50 000 zdarzeń na próbkę. Zgodnie z opisem w kroku 2.2, pomiary płytek wyjściowych wykonano na próbkach inkubowanych z buforem reakcyjnym, co przedstawiono na Rysunku 1A. Wielkość płytek oceniano na podstawie mediany wartości rozproszenia w przód (FSC). Choć FSC zależy od wielu czynników, pozostaje ono powszechnie stosowanym wskaźnikiem szacowania wielkości komórek, w tym płytek krwi. Wykresy gęstości obszaru (Rysunek 1A) wykorzystano do identyfikacji i bramkowania płytek spoczynkowych oraz uwolnionych mikropęcherzyków.
W przypadku nieaktywowanych płytek krwi mniej niż 2,9% wykazywało obecność fosfatydyloseryny (PS), co określono za pomocą barwienia Annexin-V. Po aktywacji przemytych płytek samym kolagenem lub w połączeniu z trombiną bądź jonoforem wapnia, zaobserwowano wzrost ekspozycji PS. Sam kolagen spowodował wzrost odsetka płytek dodatnich pod kątem PS do 26,7%. Trombina miała minimalny wpływ na ekspozycję PS (9,1%), jednak w połączeniu z kolagenem zwiększyła odsetek płytek eksponujących PS do 36,2%. Dla odniesienia, traktowanie 2 µM jonoforem spowodowało, że 49,6% płytek stało się prokoagulacyjnymi.
Rysunek 1 ilustruje, że bazowa proporcja mikrojesykul pochodzących z przemytych płytek krwi u zdrowej osoby była minimalna (0.3%). Podczas gdy trombina i kolagen minimalnie zwiększyły powstawanie mikrojesykul, dopiero w połączeniu kolagenu i trombiny odnotowano istotny wzrost ich tworzenia (Rysunek 1D; 11.4%). Dodanie 2 µM jonoforu spowodowało, że 44.0% mikrojesykul utworzonych przez płytki kontrolne wykazywało ekspozycję PS.
Rysunek 2 przedstawia informacje dotyczące zmienności, powtarzalności i odtwarzalności, jakich należy oczekiwać w tym procesie.
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej płytek krwi, FS Log vs. Aneksyna-V. Wykresy pokazują rozkłady płytek PSneg i PSpos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ekspozycja PS i tworzenie mikropęcherzyków w spoczynkowych i aktywowanych płytkach kontrolnych. Płytki były albo nieaktywowane (spoczynkowe) (A), albo aktywowane za pomocą 30 µg/mL kolagenu (B), 0,5 U/mL trombiny (C), kombinacji kolagenu i trombiny (D) oraz 2 µM jonoforu. Reprezentatywne wykresy kropkowe przedstawiają wielkość płytek (rozproszenie przednie (FSC log)) w stosunku do wiązania Aneksyny-V. Linie poziome i pionowe (E) wyznaczają populację negatywną pod względem płytek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy pudełkowe ekspozycji fosfatydyloseryny i tworzenia mikropęcherzyków; % komórek dodatnich w zależności od stężenia jonoforu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Powtarzalność i odtwarzalność ekspozycji PS oraz tworzenia mikropęcherzyków po inkubacji z jonoforem. Analiza ekspozycji PS i tworzenia mikropęcherzyków po inkubacji z jonoforem w stężeniu 2 µM lub 5 µM w wypłukanych płytkach krwi, traktowanych lub nietraktowanych cytratem (chelatorem wapnia): (A) od 4 różnych zdrowych kontroli; (B) od jednej zdrowej kontroli, powtórzone 5 razy; oraz (C) od dwóch zdrowych kontroli przygotowanych przez dwóch różnych techników. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Liczba płytek krwi w krwi pełnej (109 na mL)</td>
			<td >Względna siła odśrodkowa (g)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >&lt;30</td>
			<td >70</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >30-50</td>
			<td >100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >51-100</td>
			<td >130</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >101-150</td>
			<td >200</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >151-300</td>
			<td >250</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >301-600</td>
			<td >290</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >&gt;600</td>
			<td >340</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Względne siły odśrodkowe dla przygotowania osocza bogatopłytkowego w zależności od liczby płytek krwi w krwi pełnej.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas cytrynowy monohydrat (C6H8O7.H2O, 38 mM)</td>
			<td>8 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytrynian trisodowy dwuwodny (Na3C6H5O7.2 H2O, 61 mM)</td>
			<td>180 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza (C6H12O6, 136 mM)</td>
			<td>24,6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Nie należy korygować pH roztworu. Przechowywać roztwór w 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Przygotowanie 1 L wodnego roztworu kwasu cytrynowo-dekstrozowego (ACD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas cytrynowy monohydrat (C6H8O7.H2O, 36 mM)</td>
			<td>7,56 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (103 mM)</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> MgCl22.6H2O (1 mM) </td>
			<td>0,203 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dostosować pH do wartości 6,5. Przechowywać roztwór w 4 °C. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Przygotowanie roztworu zapasowego buforu do płukania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td>
			<td>583 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl₂2, 0,25 M</td>
			<td>400 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apiraza</td>
			<td>31.5 µL </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Przygotowanie 50 mL doraźnego roztworu buforu płuczącego z roztworu zapasowego.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (137 mM)</td>
			<td>8 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2,7 mM)</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl₂2.6H2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (5 mM) </td>
			<td>1,19 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO33 (12 mM) </td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H2O; 0,3 mM</td>
			<td>0,05 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dostosuj pH do wartości 7,4. Przechowuj roztwór w 4 °C. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Przygotowanie roztworu zapasowego buforu reakcyjnego.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td>
			<td>167 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl22, 0,25 M</td>
			<td>400 µL </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukoza</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 6: Przygotowanie 50 mL doraźnego roztworu buforu reakcyjnego z roztworu stokowego.

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and ...

Tworzenie prokoagulantów płytek krwi ma kluczowe znaczenie dla utrzymania hemostazy. Proces ten obejmuje ekspresję fosfolipidów i uwalnianie mikropęcherzyków na powierzchni płytek krwi, co jest niezbędne dla etapów krzepnięcia. Oceny tego procesu dostarczyły nowych danych na temat odpowiedzi prokoagulacji płytek krwi w różnych chorobach ludzkich.Cytometria przepływowa stała się kamieniem węgielnym i zyskała powszechną akceptację w ocenie ekspresji fosfatydyloseryny na płytkach krwi i uwalnianiu mikropęcherzyków. Izolacja i analiza oczyszczonych płytek krwi z krwi jest czasochłonna i wymaga specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, a zatem nie jest obecnie dostępna do rutynowej diagnostyki klinicznej. Analiza ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków jest również trudna ze względu na ich mały rozmiar i małą liczbę pozytywnych zdarzeń dla markerów będących przedmiotem zainteresowania.Na początek należy pobrać krew z żył obwodowych do probówek zbiorczych zawierających aktywny antykoagulant cytrynian trisodowy z kwasem cytrynowym i dekstrozą. Delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać krew z antykoagulantem i pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na 15 minut. Policz płytki krwi za pomocą automatycznego licznika komórek, aby określić prawidłową prędkość wirowania.Aby przygotować osocze bogatopłytkowe, należy odwirować krew o stężeniu 250 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej bez robienia przerwy. Następnie dodaj 1 mililitr ACDA i 6,25 mikrolitra apirazy do 9 mililitrów osocza bogatopłytkowego. Odwirować mieszaninę przy 1,100 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Za pomocą pipety pastwiskowej usunąć supernatant zawierający osocze ubogie w płytki krwi i delikatnie zawiesić osad płytek krwi w 1 mililitrze buforu do mycia. Następnie dodaj 3 do 4 mililitrów buforu myjącego do probówki i ponownie odwiruj. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad w 1 mililitrze buforu do mycia.Przenieść 150 mikrolitrów zawiesiny płytek krwi do probówki o pojemności 1,5 mililitra w celu zliczenia komórek w automatycznym liczniku komórek. Dodać 3 do 4 mililitrów buforu do pozostałej zawiesiny, aby wykonać dodatkowe płukanie, jak pokazano wcześniej. Następnie ponownie zawiesić osad płytek krwi w buforze reakcyjnym, aby osiągnąć końcowe stężenie 5 x 10 do mocy 11 płytek krwi na litr.Na początek należy uzyskać umyte płytki krwi w pożądanym buforze do cytometrii przepływowej. Przygotować wszystkich agonistów i fluorochromy w buforze reakcyjnym. W przypadku testów wewnętrznych dodać 100 mikrolitrów przemytych płytek krwi o stężeniu 50 x 10 do mocy 9 płytek krwi na litr do różnych probówek.Delikatnie wstrząśnij każdą porcją i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut. Następnie dodać 5 mikrolitrów nierozcieńczonego Aneksyny V-FITC do każdej mikroprobówki i inkubować. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu reakcyjnego do każdej probówki, aby zatrzymać proces.Bramkowanie populacji płytek krwi za pomocą rozproszenia do przodu lub FSC i użycie wykresów gęstości do identyfikacji każdej populacji niezależnie. Ustaw ujemną wartość odcięcia po prawej stronie populacji płytek krwi w stanie spoczynku. Po aktywacji należy sklasyfikować zdarzenia po prawej stronie tego punktu odcięcia jako płytki krwi eksponujące fosfatydyloserynę.W celu różnicowania mikropęcherzyków należy ustawić punkt odcięcia na najniższą wartość FSC obserwowaną w populacji spoczynkowych płytek krwi. Po aktywacji zdarzenia dodatnie fosfatydyloseryny poniżej tego progu należy sklasyfikować jako mikropęcherzyki. Pomiary wyjściowe wykazały, że mniej niż 2,9% nieaktywowanych płytek krwi wykazywało ekspozycję na fosfatydyloserynę.Po aktywacji 26,7% płytek krwi stało się fosfatydyloseryną dodatnią z kolagenem, 9,1% z trombiną i 36,2% zarówno z kolagenem, jak i trombiną. Leczenie jonoforem spowodowało uzyskanie 49,6% płytek fosfatydyloseryny. Wyjściowy odsetek mikropęcherzyków wynosił 0,3%Znaczący wzrost zaobserwowano tylko w przypadku kolagenu i trombiny razem (około 11,4%), a bardziej w przypadku jonoforów (44%)".

procoagulant-platelet-characterization-measuring-phosphatidylserine

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje technikę różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi. Hematopoetyczne komórki progenitorowe macierzyste — wyizolowane z ludzkiej krwi pępowinowej — różnicują się w dojrzałe megakariocyty w obecności trombopoetyny. Dojrzałe megakariocyty wytwarzają cytoplazmatyczne rozszerzenia zwane propłytkami, które dają początek pojedynczym płytkom krwi.

Metoda in vitro do różnicowania megakariocytów i tworzenia płytek krwi

Ten film pokazuje metodę oceny wpływu naprężeń ścinających na płytki krwi. Leczenie przeciwciałami indukuje dysocjację i zmiany konformacyjne w kompleksach mechanoreceptorowych, aktywując płytki krwi i wyrażając markery na powierzchni. Markery te obserwuje się za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Wpływ naprężenia ścinającego na płytki krwi leczone przeciwciałami przeciwko receptorom mechanosensorycznym

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Opisujemy prostą metodę izolacji umytych płytek krwi od ludzkiej krwi, a następnie pomiary agregacji płytek krwi wywołanej przez agonistę za pomocą mętności. Jako przykład stosujemy tę metodę do badania odpowiedzi agregacyjnej ludzkich płytek krwi na kolagen po wstępnej inkubacji z inhibitorem kanału Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Zmętnienie na ludzkich płukanych płytkach krwi: wpływ inhibitora pannexin1 Brilliant Blue FCF na agregację indukowaną kolagenem

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Zarządzanie inwentaryzacją płytek krwi oparte na badaniu zawartości mikrocząsteczek w koncentratach płytek krwi to nowa inicjatywa poprawy jakości w szpitalnych bankach krwi. Celem jest odróżnienie płytek krwi aktywowanych od nieaktywowanych, aby zoptymalizować wykorzystanie płytek krwi. Dostarczanie nieaktywowanych płytek krwi pacjentom hematologicznym i onkologicznym może zmniejszyć ich wysokie ryzyko wystąpienia oporności na krwiożerczość.

Rutynowa metoda badań przesiewowych na obecność mikrocząstek w transfuzjach płytek krwi

Opisujemy metodę w roztworze, polegającą na zastosowaniu równomiernego ścinania do receptorów powierzchni płytek krwi za pomocą wiskozymetrii stożko-płytkowej. Metoda ta może być również stosowana w szerszym zakresie do stosowania ścinania do innych typów komórek i fragmentów komórek i nie musi być ukierunkowana na określoną parę ligand-receptor.

Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Wielokolorowa cytometria przepływowa dla płytek krwi może zidentyfikować nowe podtypy płytek krwi w klasycznych subpopulacjach płytek krwi, takie jak płytki spoczynku, agregacyjne, prokoagulacyjne i apoptotyczne. Pozwala to na porównanie różnych wzorców subpopulacji indukowanych przez różnych agonistów płytek krwi. Tutaj szczegółowo opisano procedurę tworzenia wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza subpopulacji płytek krwi za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

Obecny protokół dostarcza obszerny zestaw procedur niezbędnych do analizy prokoagulacyjnych płytek krwi, które wykazują nakładające się cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi.

Kompleksowa analiza płytek krwi prokoagulantów wykazujących cechy martwicy, apoptozy i aktywacji płytek krwi

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Poznaj metodę charakterystyki płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji fosfatydyloseryny i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi (Wideo) | JoVE Journal

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Przeglądaj więcej filmów