Name: Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę syntezy nanocząstek lipidowych w mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem. Turbulentne mieszanie w ograniczonej geometrii zapewnia reprodukowalną produkcję LNP od skali laboratoryjnej do przemysłowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stypendium NSF dla BKW (DGA1148900), wsparcie od Tessera Therapeutics Inc., Fundacji Billa i Melindy Gatesów (BMGF, numery umów OPP1150755 i INV-041182) oraz FDA w ramach 75F40122C00186.

Synthesizing Lipid Nanoparticles Using CIJ and &#181;MIVM Mixer Technologies

<ol><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li>
<li>Dowdy, S. F., Setten, R. L., Cui, X. -S., Jadhav, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+RNA+therapeutics%3A+The+great+endosomal+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">Delivery of RNA therapeutics: The great endosomal escape.</a> Nucleic Acid Ther. 32 (5), 361-368 (2022).</li>
<li>Eygeris, Y., Patel, S., Jozic, A., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvoluting+lipid+nanoparticle+structure+for+messenger+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Deconvoluting lipid nanoparticle structure for messenger RNA delivery.</a> Nano Lett. 20 (6), 4543-4549 (2020).</li>
<li>Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles%E2%94%80from+liposomes+to+mRNA+vaccine+delivery%2C+a+landscape+of+research+diversity+and+advancement%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles─from liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement.</a> ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).</li>
<li>Buck, J., Grossen, P., Cullis, P. R., Huwyler, J., Witzigmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+DNA+therapeutics%3A+Hallmarks+of+non-viral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Lipid-based DNA therapeutics: Hallmarks of non-viral gene delivery.</a> ACS Nano. 13 (4), 3754-3782 (2019).</li>
<li>Semple, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+cationic+lipids+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of cationic lipids for siRNA delivery.</a> Nat Biotechnol. 28 (2), 172-176 (2010).</li>
<li>Lam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((trialkyl+ionizable+lipids+are+versatile+lipid-nanoparticle+components+for+therapeutic+and+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications.</a> Adv Mater. 35 (15), 2209624(2023).</li>
<li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery%2C+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).</li>
<li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375(2018).</li>
<li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies%3A+From+concepts+to+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Ther. 28 (3), 146-157 (2018).</li>
<li>Jürgens, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-scale+siRNA+and+mRNA+LNP+manufacturing+by+various+microfluidic+mixing+techniques+-+an+evaluation+of+particle+properties+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22OpenNano%22%5BJournal%5D)">Lab-scale siRNA and mRNA LNP manufacturing by various microfluidic mixing techniques - an evaluation of particle properties and efficiency.</a> OpenNano. 12, 100161(2023).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+selective+organ-targeting+%28sort%29+lipid+nanoparticles+%28LNPs%29+using+multiple+technical+methods+for+tissue-specific+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of selective organ-targeting (sort) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery.</a> Nat Protoc. 18 (1), 265-291 (2023).</li>
<li>Yanez Arteta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+reprogramming+of+cellular+protein+production+through+mRNA+delivered+by+functionalized+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (15), E3351-E3360 (2018).</li>
<li>Eygeris, Y., Gupta, M., Kim, J., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+lipid+nanoparticles+for+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery.</a> Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2022).</li>
<li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Lett. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li>
<li>Leung, A. K. K., Tam, Y. Y. C., Chen, S., Hafez, I. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+mixing%3A+A+general+method+for+encapsulating+macromolecules+in+lipid+nanoparticle+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Microfluidic mixing: A general method for encapsulating macromolecules in lipid nanoparticle systems.</a> J Phys Chem B. 119 (28), 8698-8706 (2015).</li>
<li>Prakash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+fabrication+of+lipid+nanoparticles+for+the+delivery+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic fabrication of lipid nanoparticles for the delivery of nucleic acids.</a> Adv Drug Deliv Rev. 184, 114197(2022).</li>
<li>Carvalho, B. G., Ceccato, B. T., Michelon, M., Han, S. W., De La Torre, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+microfluidic+technologies+for+lipid+nano-microsystems+from+synthesis+to+biological+application%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Advanced microfluidic technologies for lipid nano-microsystems from synthesis to biological application.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 141(2022).</li>
<li>Webb, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+for+scalable+manufacturing+of+nanomedicines+from+bench+to+GMP%3A+A+case+study+using+protein-loaded+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes.</a> Int J Pharm. 582, 119266(2020).</li>
<li>Warne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+3+billion+doses+of+comirnaty+in+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Delivering 3 billion doses of comirnaty in 2021.</a> Nat Biotechnol. 41 (2), 183-188 (2023).</li>
<li>Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+nanoprecipitation+of+organic+actives+and+block+copolymers+using+a+confined+impinging+jets+mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+J+Chem%22%5BJournal%5D)">Flash nanoprecipitation of organic actives and block copolymers using a confined impinging jets mixer.</a> Aust J Chem. 56 (10), 1021-1024 (2003).</li>
<li>Hogarth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+impact+of+systematic+hydrophobic+modification+of+model+drugs+on+the+control%2C+stability+and+loading+of+lipid-based+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Evaluating the impact of systematic hydrophobic modification of model drugs on the control, stability and loading of lipid-based nanoparticles.</a> J Mater Chem B. 9 (48), 9874-9884 (2021).</li>
<li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 1, e37(2012).</li>
<li>D'addio, S. M., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+drug+nanoparticle+formation+by+rapid+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (6), 417-426 (2011).</li>
<li>Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+rapid+self-assembly+of+block+copolymer+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles.</a> Phys Rev Lett. 91 (11), 118302(2003).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> J Pharm Sci. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li>
<li>Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+small-scale+multi-inlet+vortex+mixer+for+scalable+nanoparticle+production+and+application+to+the+encapsulation+of+biologics+by+inverse+flash+nanoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Design of a small-scale multi-inlet vortex mixer for scalable nanoparticle production and application to the encapsulation of biologics by inverse flash nanoprecipitation.</a> J Pharm Sci. 107 (9), 2465-2471 (2018).</li>
<li>Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+processing+and+micromixing+in+confined+impinging+jets%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE%22%5BJournal%5D)">Chemical processing and micromixing in confined impinging jets.</a> AIChE. 49, 2264-2282 (2003).</li>
<li>Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+nanoprecipitation+for+the+encapsulation+of+hydrophobic+and+hydrophilic+compounds+in+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles.</a> J Vis Exp. (143), e58757(2019).</li>
<li>Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulating+and+characterizing+lipid+nanoparticles+for+gene+delivery+using+a+microfluidic+mixing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform.</a> J Vis Exp. (168), e62226(2021).</li>
<li>Bizmark, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribogreen+fluorescent+assay+kinetics+to+measure+ribonucleic+acid+loading+into+lipid+nanoparticle+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Ribogreen fluorescent assay kinetics to measure ribonucleic acid loading into lipid nanoparticle carriers.</a> Adv Mater Interfaces. 11 (17), 2301083(2024).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+lipid-based+nanoparticles%3A+An+efficient+delivery+system+for+nucleic+acid-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Modification of lipid-based nanoparticles: An efficient delivery system for nucleic acid-based immunotherapy.</a> Molecules. 27 (6), 1943(2022).</li>
<li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion-dependent+formation+of+lipid+nanoparticles+containing+macromolecular+payloads%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Fusion-dependent formation of lipid nanoparticles containing macromolecular payloads.</a> Nanoscale. 11 (18), 9023-9031 (2019).</li>
<li>El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+in+vitro+and+in+vivo+efficiency+of+mRNA-lipid+nanoparticles+formulated+by+microfluidic+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Testing the in vitro and in vivo efficiency of mRNA-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing.</a> J Vis Exp. (191), e64810(2023).</li>
<li>Scalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+delivery+of+plasmid+DNA+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Ionizable lipid nanoparticle-mediated delivery of plasmid DNA in cardiomyocytes.</a> Int J Nanomed. 17, 2865-2881 (2022).</li>
<li>Feng, J., Markwalter, C. E., Tian, C., Armstrong, M., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+formulation+of+nanoparticle+therapeutics+from+laboratory+discovery+to+clinical+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Translational formulation of nanoparticle therapeutics from laboratory discovery to clinical scale.</a> J Transl Med. 17 (1), 200(2019).</li>
<li>Kazemian, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-nanoparticle-based+delivery+of+CRISPR%2Fcas9+genome-editing+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lipid-nanoparticle-based delivery of CRISPR/cas9 genome-editing components.</a> Mol Pharm. 19 (6), 1669-1686 (2022).</li>
<li>Pinkerton, N. M. Polymeric drug delivery vehicles and imaging agents. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Princeton+University%22">Princeton University</a>. , PhD thesis, http://arks.princeton.edu/ark:/88435/dsp01h128nd846 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiono syntezę LNP zawierających polimery kwasów nukleinowych przy użyciu dwóch ograniczonych mieszalników turbulentnych z uderzeniem strumieniowym. Mieszalniki turbulentne CIJ, prowadzone z odpowiednimi prędkościami, zapewniają, że skala czasowa mieszania jest krótsza niż czas montażu LNP, wytwarzając jednorodne warunki przesycenia do tworzenia małych LNP o wąskich rozkładach wielkości21. W związku z tym LNP wykonane tą samą chemią przy użyciu różnych geometrii mieszalników turbulentnych (2-strumieniowy CIJ i 4-strumieniowy mieszalnik MIVM) wykazują podobne właściwości fizykochemiczne i wykazują dobrą wydajność transfekcji (Rysunek 5 i Rysunek 6). W przeciwieństwie do tego, LNP wykonane przy użyciu pipetowania, które powoduje gorsze mieszanie, skutkuje większymi i bardziej polidyspersyjnymi LNP (Rysunek 5A) o niższej wydajności transfekcji. Od dawna wiadomo, że kinetyka mieszania i montażu odgrywa znaczącą rolę w przetwarzaniu LNP; Cullis i wsp. zauważyli, że szybkie mieszanie konwwekcyjno-dyfuzyjne etanolu i buforu prowadzi do powstawania małych cząstek o wąskim rozkładzie wielkości, podczas gdy powolne mieszanie dyfuzyjne prowadzi do większych cząstek o szerokim rozkładzie wielkości9. Skala czasowa mieszania w mieszalnikach turbulentnych CIJ zmniejsza się proporcjonalnie do natężeń przepływu strumieni na wlocie do mieszalnika27. Jest to określane ilościowo za pomocą bezwymiarowej liczby Reynoldsa (Re), która mierzy stosunek sił bezwładności i lepkości. Turbulencje wewnątrz komór mieszania CIJ i MIVM występują przy wystarczająco wysokim Re, tak że turbulentne rozciąganie wiru powoduje powstawanie małych skali długości, które powodują szybkie mieszanie rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika przez dyfuzję. Skala długości turbulentnej zależy od Re, a nie od konkretnej geometrii urządzenia mieszającego. Z tego powodu zarówno CIJ, jak i MIVM wytwarzają te same cząstki LNP i dlatego różne rozmiary mieszalników MIVM wytwarzają te same rozmiary NP27. Przy wysokim Re, odpowiadającym wysokim prędkościom wlotowym, LNP mogą być wytwarzane w sposób powtarzalny bez zmian między partiami (rysunek 3B).
Protokół ten umożliwia formułowanie różnych LNP mRNA, DNA lub siRNA o różnych właściwościach fizykochemicznych przy użyciu turbulentnych mieszalników CIJ. Oprócz zapewnienia wszechstronności pod względem składu i stężeń, technika ta zapewnia jasną ścieżkę do szybkiego przesiewania preparatów w sprzedaży laboratoryjnej (kilka miligramów) i skalowania preparatów ołowiu do większych przemysłowych wielkości partii przy szybkości produkcji 5 l/min36. Było to główną przeszkodą dla kilku innych technik, w tym mieszania luzem i mikrofluidyki. Na przykład techniki przetwarzania masowego nie są w stanie konsekwentnie wytwarzać LNP w sposób powtarzalny, nawet w skali kilku mililitrów. Techniki mikroprzepływowe zapewniają znaczną poprawę w porównaniu z technikami mieszania luzem, umożliwiając wytwarzanie jednorodnych i powtarzalnych LNP; Jednak, są one tylko w zakresie miligramów29. Jak szczegółowo opisano we wprowadzeniu, zrównoleglenie urządzeń mikroprzepływowych stanowi próbę skalowania do wag produkcyjnych, ale nie eliminuje problemu zanieczyszczenia i nie może być skalowane tak skutecznie, jak mieszalniki oparte na technologii ograniczonego strumienia uderzeniowego.
Oprócz tych zalet, mieszalniki CIJ odegrają kluczową rolę w produkcji LNP nowej generacji, które wykazują zdolności celowania lub przeprowadzają edycję genów. Obecne preparaty LNP zawierają lipidy i kwasy nukleinowe o podobnej dyfuzyjności, a zatem można je wytwarzać nawet przy nieco słabym mieszaniu na skali laboratoryjnej. Jednak podejścia do edycji genów mogą wymagać enkapsulacji gatunków kwasów nukleinowych o bardzo różnych masach cząsteczkowych, takich jak małe cząsteczki przewodnika RNA i duże transkrypty mRNA, w celu zakodowania białka CAS937. Bardzo różne skale czasu dyfuzji tych różnych gatunków sprawiają, że jednolita enkapsulacja w proporcjach stechiometrycznych jest wyzwaniem. Ten problem jednolitej enkapsulacji staje się coraz bardziej wyraźny wraz ze spadkiem wydajności mieszania. Podobnie, celowanie w komórki niewątrobowe może wymagać włączenia silnie związanych stabilizatorów wolno dyfuzyjnych (takich jak kopolimery blokowe o dużej masie cząsteczkowej z docelowymi ligandami). Ukierunkowane ligandy o wielkości do 14 kDa mogą być sprzężone z kopolimerami blokowymi przed złożeniem nanocząstek, co umożliwia ich równomierne włączenie do nanocząsteczek za pomocą mieszania CIJ38. Mieszalniki turbulentne CIJ są przydatnymi narzędziami do produkcji LNP wykonanych z komponentów o różnych dyfuzyjnościach.
Chociaż mieszalniki turbulentne CIJ wykazują kilka zalet w porównaniu z innymi mieszalnikami w zakresie formułowania LNP, ważne jest, aby zwrócić uwagę na ograniczenia związane z każdą geometrią. Mieszalnik 2-strumieniowy CIJ wymaga, aby oba strumienie wlotowe (etanol i woda) miały równe momenty (w granicach 10%-30%), aby uzyskać równomierne turbulentne mikromieszanie w komorze. Fakt, że strumień wyjściowy składa się w proporcji 50:50 rozpuszczalnik/antyrozpuszczalnik, ogranicza poziom przesycenia w komorze mieszania, w której występuje wytrącanie się29. Ta wada została rozwiązana przez 4-strumieniowy mieszalnik MIVM, ponieważ może on wykorzystywać cztery dysze o nierównym momencie, aby osiągnąć warunki wysokiego przesycenia w komorze mieszania. Ponadto oba mieszalniki muszą być rzędu miligramów masy całkowitej, co czyni je nieidealnym wyborem do wysokoprzepustowych badań przesiewowych wielu różnych preparatów LNP. W przypadku prostych preparatów LNP badania przesiewowe najlepiej przeprowadzić za pomocą mikrofluidyki lub strategii pipetowania w skali mikrogramowej, a następnie przenieść do technologii ograniczonego strumienia uderzeniowego po zidentyfikowaniu kilku preparatów ołowianych. Istotne jest również, aby wziąć pod uwagę martwe objętości w mieszalnikach. W CIJ, dwóch mieszalnikach strumieniowych, objętości podtrzymania wynoszą 50-100 mikrolitrów. Tę ilość materiału należy odjąć od ilości wychwyconej w kąpieli hartowniczej przy obliczaniu odzysku z procesu. Straty te są nieznaczne w przypadku pracy na dużą skalę, ale wynoszą 10% strat, gdy produkowane są całkowite objętości 5 ml, jak pokazano tutaj. Mieszalniki turbulentne z uderzającym strumieniem są cennym narzędziem do produkcji LNP w skali GMP, czego dowodem są dwie szczepionki COVID-19 zatwierdzone przez FDA.

terapia oparta na mRNA ma ogromny potencjał w leczeniu i zapobieganiu szerokiej gamie chorób, w tym chorobom zakaźnym, zaburzeniom genetycznym i nowotworom1. W przeciwieństwie do małocząsteczkowych środków terapeutycznych, które mogą pasywnie dyfundować przez błonę komórkową, kwasy nukleinowe muszą być zamknięte w kapsułkach w celu dostarczania wewnątrzkomórkowego2. Enkapsulacja zapewnia zarówno strukturę, jak i stabilność mRNA, ułatwiając ich wewnątrzkomórkowe dostarczanie przez szlaki endocytarne, a także zapobiegając degradacji przez składniki wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe, takie jak nukleazy3. Opracowano szereg materiałów i nanonośników do enkapsulacji i dostarczania mRNA, w tym nanocząstki nieorganiczne, polimery, lipidy i materiały podobne do lipidów1. Wśród nich LNP stały się najbardziej znaną platformą dostarczania terapii opartych na mRNA4.
LNP składają się z czterech składników lipidowych: lipidów jonizowalnych, cholesterolu, lipidów jonowych i stabilizatora lipidów PEG5. Jonizowalne lipidy nadające się do dostarczania mRNA wykazują staranną równowagę między hydrofobowością lipidów a stałą dysocjacji (pKa) trójskładnikowej grupy aminowej6. Jonizowalny lipid pKa ma zazwyczaj pH między 6,0 a 6,7, takie jak KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) i ALC-03157. To ograniczenie pKa na jonizowalnym lipidie umożliwia zarówno enkapsulację polimerów kwasów nukleinowych jako hydrofobowych soli lipidowych, jak i dostarczanie wewnątrzkomórkowe w procesie "ucieczki endosomu". LNP dostają się do komórki docelowej przez (różne) szlaki endocytozy, z których wszystkie obejmują zakwaszenie endosomu z pH 7,4 do pH ~58. Jonizowalny lipid pKa zapewnia, że LNP mają prawie neutralne powierzchnie w warunkach fizjologicznych, ale stają się kationowe w zakwaszającym endosomie9. Ta reakcja pH umożliwia selektywne rozerwanie tylko błony endosomalnej, uwolnienie zamkniętego w kapsułkach polimeru kwasu nukleinowego i zachowanie żywotności komórek, w przeciwieństwie do trwale kationowych lipidów stosowanych w systemach transfekcji, takich jak lipofekcamina. Cholesterol jest hydrofobową, śródmiąższową cząsteczką w strukturze LNP, która poprawia płynność lipidów. Lipid oobojnojonowy odgrywa rolę strukturalną i tworzy dwuwarstwę na powierzchni LNP. Poli(glikol etylenowy)-lipid (PEG-lipid) jest stabilizatorem koloidalnym, który zwiększa stabilność LNP poprzez nadanie polimerowego stabilizatora sterycznego na powierzchnię LNP, który jest odporny na agregację LNP. To stabilizuje LNP, szczególnie podczas zmian pH, które regenerują wolną formę zasadową jonizowalnego lipidu, który zachowuje się jak olej hydrofobowy. Receptura Onpattro (patisiran) (zwana dalej preparatem LNP) jest często używana jako punkt wyjścia dla formulacji LNP z jonizowalnym lipidem MC3, cholesterolem, distearoilofosfatydylocholiną (DSPC) i PEG2000-DMG rozpuszczonymi w etanolu zmieszanym z wodnym roztworem RNA10.
Do produkcji LNP kapsułkujących polimery kwasów nukleinowych można użyć kilku technik, przy czym większość z nich opiera się na wspólnym motywie szybkiego mieszania strumienia etanolu zawierającego lipidy ze strumieniem wodnym zawierającym interesujący nas kwas nukleinowy (siRNA, mRNA lub DNA)9,11,12,13,14. W związku z tym procesy mieszania masowego, takie jak mieszanie pipetami i mieszanie wirowe, oferują prostą strategię tworzenia LNP, która eliminuje potrzebę stosowania zaawansowanych urządzeń12. Jednak mieszanie zbiorcze nie zapewnia jednorodnego rozkładu składników, co prowadzi do nieoptymalnego rozkładu wielkości LNP wraz ze znaczną zmiennością między partiami15.
Laboratoria rutynowo stosują techniki mieszania mikroprzepływowego, aby uzyskać powtarzalne LNP poprzez bardziej precyzyjną kontrolę nad warunkami mieszania12,13,16. Jednak warunki przepływu laminarnego w urządzeniach mikroprzepływowych, które są nieodłączne ze względu na małe skale długości i niskie prędkości w komorze mikroprzepływowej, skutkują stosunkowo powolnym mieszaniem rozpuszczalnika/antyrozpuszczalnika17. Małe wymiary komory poważnie ograniczają przepustowość i skalowalność potrzebną do produkcji LNP GMP, ale naukowcy przeprowadzili równoległe komory mikroprzepływowe, aby spróbować zwiększyć wielkość produkcji15. Równoległa geometria mikrofluidyki nie eliminuje problemu adsorpcji lipidów na powierzchniach podczas przetwarzania dużych objętości, problemu powszechnie określanego jako "zanieczyszczenie" urządzenia mieszającego, a także występują problemy z jednorodnością i stabilnością przepływów, które sprawiają, że skalowanie mikrofluidyki jest wyzwaniem dla produkcji na skalę przemysłową18,19. Nic dziwnego, że firmy farmaceutyczne używały turbulentnych mieszalników strumieniowych do produkcji mRNA-LNPs20.
Proces produkcji LNP załadowanych RNA polega na mieszaniu wodnego strumienia buforowego zawierającego ładunek RNA ze strumieniem etanolu zawierającym cztery odrębne składniki lipidowe. Preparaty te wykorzystują kwaśny bufor o pH 4,0 lub niższym, który ładuje jonizowalny lipid podczas mieszania strumieni wodnych i etanolowych. Dodatnio naładowane lipidy jonizowalne oddziałują elektrostatycznie z ujemnie naładowanymi RNA, tworząc hydrofobową sól lipidową RNA. Hydrofobowe formy lipidów, w tym sól RNA-lipid, wytrącają się w zmieszanych rozpuszczalnikach i tworzą jądra hydrofobowe. Jądra te rosną poprzez wytrącanie się obojgotliwych lipidów i cholesterolu, aż do osiągnięcia punktu krytycznego, w którym wystarczająca ilość pegylowanego lipidu adsorbuje się na powierzchni LNPs, zatrzymując dalszy wzrost -zarodkowanie i mechanizm wzrostu21,22,23. Dodanie buforu wodnego do roztworu lipidowego, w zakresie, w jakim lipidy wytrącają się i tworzą LNP, zależy od dwóch odrębnych skal czasowych: okresu mieszania rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika,mieszaniny τ i okresu wzrostu jąder, τagg. Bezwymiarowa liczba Damköhlera, zdefiniowana jako Da = τmix/τagg, oddaje wzajemne oddziaływanie między tymi skalami czasu24. W przypadku powolnego mieszania (Da > 1) ostateczna wielkość LNP jest kontrolowana przez transport i zmienia się w zależności od czasu mieszania. I odwrotnie, podczas szybkiego mieszania (Da < 1), płyn jest rozdrobniony na prążki lub warstwy o długości Kołmogrowa, przy czym tworzenie LNP jest regulowane wyłącznie przez dyfuzję molekularną każdego składnika, co skutkuje jednorodną kinetyką tworzenia LNP. Osiągnięcie tego drugiego scenariusza wymaga, aby stężenie lipidów przekroczyło próg krytyczny, ustanawiając stan przesycenia sprzyjający równomiernemu jednorodnemu zarodkowaniu.
Szacuje się, że τagg waha się od kilkudziesięciu do kilkuset milisekund25. W najbardziej podstawowej konfiguracji dwa strumienie, jeden zawierający etanol z lipidami, a drugi zawierający wodny bufor z ładunkiem RNA, są wstrzykiwane do komory znanej jako "zamknięty mieszalnik uderzający" (CIJ). Wiry turbulentne wytwarzają skale długości prążków rozpuszczalnika/antyrozpuszczalnika wynoszące 1 μm w ciągu 1,5 m, gdy działają z odpowiednimi prędkościami. Prędkości strumienia i geometria mieszania określają przekształcenie pędu liniowego w wiry turbulentne, które mieszają strumienie. Jest to parametryzowane przez liczbę bezwymiarową, liczbę Reynoldsa (Re), która jest liniowo proporcjonalna do prędkości przepływu. Re oblicza się ze wzoru Re = Σ (ViDi/vi), gdzie Vi jest prędkością przepływu każdej pary, vi jest lepkością kinematyczną każdego strumienia, a Di jest średnicą wlotu strumienia w 2-strumieniowych urządzeniach CIJ26 lub średnicą komory w 4-strumieniowych MIVMs27. Uwaga: Niektóre odniesienia do CIJ używają tylko jednej średnicy i prędkości strumienia do zdefiniowania Re28. Re mieści się w zakresie 1-100 w urządzeniu mikrofluidycznym, podczas gdy w urządzeniach CIJ można osiągnąć Re na poziomie 125 000. W mieszalniku CIJ strumienie o równym pędzie zderzają się, rozpraszając swój pęd po uderzeniu jako mieszanie turbulentne, co prowadzi do wydajnego mikromieszania dzięki małym mikroskalom Kołmogorowa i małej liczbie Damköhlera. Innym typem mieszalnika jest "mieszalnik wirowy z wieloma wlotami" (MIVM), w którym cztery strumienie są kierowane do centralnej komory. W tej konfiguracji ciągłe przepływy do zamkniętej komory mieszania zapewniają dobrze zdefiniowaną skalę czasu mieszania. Wszystkie elementy płynne przechodzą przez wysokoenergetyczną strefę mieszania w obu typach mieszalników. W przeciwieństwie do tego, proste urządzenia mieszające, takie jak skrzyżowania T, nie zawierają komory, która zapewnia strefę mieszania, co skutkuje mniejszym mieszaniem dwóch strumieni ze względu na to, że pęd strumienia przychodzącego jest w dużej mierze odchylany w kierunku wylotu, a nie w kierunku turbulentnego generowania wirów. Zarówno mieszalniki CIJ, jak i MIVM mogą pracować w trybie wsadowym lub ciągłym, co zapewnia elastyczność w produkcji LNP na różnych skalach.
Ten protokół opisuje, jak optymalne formuły LNP są tworzone dzięki zastosowaniu dwóch technologii ograniczonego strumienia uderzeniowego: 2-strumieniowych CIJ i 4-strumieniowych mieszalników MIVM. Działanie mieszalników CIJ i MIVM zostało już wcześniej zademonstrowane w celu przygotowania nanocząsteczek z hydrofobowymi materiałami rdzeniowymi29. Ten artykuł i film powinny być konsultowane jako dodatkowe źródło informacji na temat tworzenia się nanocząsteczek w tych mieszalnikach. Ta aktualizacja koncentruje się na tworzeniu NP na podstawie lipidów. Zademonstrowano możliwość dostrojenia wielkości LNP poprzez zmianę warunków mikromieszania. Ponadto wykazano przydatność technologii CIJ w tworzeniu stabilnych, monodyspersyjnych LNP o ulepszonej wydajności transfekcji in vitro w komórkach HeLa w porównaniu z LNP wytwarzanymi przy użyciu słabego mieszania pipetowego. Ponadto omówiono zalety i wady każdej geometrii mieszania CIJ, wraz z odpowiednimi warunkami potrzebnymi do skalowania tych mieszalników.

<table><tbody><tr><td>18:0 PC (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365P</td><td>Pomocniczy lipid</td></tr><tr><td>21 G x 1-1/2 cala. Igła BD PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa ścianka płyta dolna</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-135</td><td></td></tr><tr><td>96 Well biała/przezroczysta płyta dolna, powierzchnia TC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>ALC-0315</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890900</td><td>Jonizowalny lipid</td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 100 kDa MWCO, 15 ml</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 100 kDa MWCO, 4 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Lucyferazy System testowy</td><td>Promega</td><td>E2620</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Millipore Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap FLuc mRNA (5 miesięcy)</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7202</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik z ograniczonymi strumieniami uderzeniowymi</td><td>Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)</td>N<td>/A Skontaktuj</td><td>się z Holland lub DTD w sprawie niestandardowych zamówień, a system Helix Biotech to Nova BT. Zapoznaj się z tekstem do walidacji nowego miksera</td></tr><tr><td>D-Lin-MC3-DMA </td><td>MedChemExpress</td><td>HY-112251 </td><td>Jonizowalny lipid</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>DMG-PEG 2000</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880151P</td><td>PEG-lipid</td></tr><tr><td>DODMA</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890899P</td><td>Jonizowalny etanol lipidowy</td></tr><tr><td>200 Proof</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml o wysokiej czystości</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca, certyfikowana, Stany Zjednoczone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, wolny kwas</td><td>IBI Scientific</td><td>IB01130</td><td></td></tr><tr><td>HSW HENKE-JECT dwuczęściowy 1 ml Luer</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>HSW HENKE-JECT dwuskładnikowy 5 ml (6 mL) Luer Lock</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4050.X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Idex 1648 ETFE rurka <img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/67047/67047eq02.jpg" style="margines: auto; ">” OD 0,093" ID</td><td>Idex Zdrowie &amp; Nauka</td><td>1648</td><td></td></tr><tr><td>Idex P-678 ¼ "-28 do Luer dopasowanie</td><td>Idex Health &amp; Tuleja Science</td><td>P-678</td><td></td></tr><tr><td>Idex P-940 do przewodów ETFE</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>Złączka Luer</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-604</td><td>Zamontuj na wlocie mieszalnika CIJ lub MIVM z odpowiednimi gwintami. Części Idex są również dostępne za pośrednictwem VWR i wielu innych dostawców</td></tr><tr><td>Stoisko mikserów</td><td>Holland Applied Technologies</td><td>N/A</td><td>Zobacz Markwalter &amp;   Prud'homme for design.26 Skontaktuj się z Hollandią, aby kupić</td></tr><tr><td>mieszalnik wirowy z wieloma wlotami</td><td>Holland Applied Technologies i Diamond Tool and Die (DTD)</td>N<td>/A</td><td>Skontaktuj się z Holland lub DTD w sprawie niestandardowych zamówień. Zapoznaj się z tekstem nowego o-ringu walidacyjnego mieszalnika</td></tr><tr><td>(MIVM)</td><td>C.E. Conover</td><td>MM1.5 35.50 V75</td><td>Zamów luzem - część eksploatacyjna. Upewnij się, że rozpuszczalnik jest kompatybilny, jeśli używasz alternatywnego źródła.</td></tr><tr><td>Tuleja odpływowa - CIJ</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-200</td><td>Montaż ze złączką wylotową (duży koniec zlicowany z rurką)</td></tr><tr><td>Złączka wylotowa - CIJ</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-205</td><td>Montaż z tuleją i rurką na wylocie komory CIJ</td></tr><tr><td>Złączka wylotowa - MIVM</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-942</td><td>Połączenie z tuleją</td></tr><tr><td>Rurka wylotowa - CIJ</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>1517</td><td>Użyj obcinaka do rurek do czystych końcówek. Upewnij się, że dodatkowe rurki nie wystają do komory mieszania</td></tr><tr><td>Rurka wylotowa - MIVM</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Pasuje do identyfikatora tulejki.</td></tr><tr><td>PBS - sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x) pH 7,4, bez RNaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PHD 2000 Programowalna pompa strzykawkowa</td> Harvard <td>Apparatus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa dwuczęściowa strzykawka 1 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Złączka</td> <td>wtykowaIdex Zdrowie &amp; Science</td><td>P-309</td><td>Montaż po bokach mieszalnika CIJ (punkt dostępu do uszczelki po wierceniu)</td></tr> <tr><td>Quant-it Zestaw do oznaczania RNA RiboGreen i odczynnik RiboGreen RNA, RediPlate 96 Zestaw do oznaczania ilościowego RNA RiboGreen</td><td>Invitrogen firmy Thermo Fisher Scientific</td><td>R11491</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin, sól sodowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R12204</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Odkażacz powierzchniowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka scyntylacyjna</td><td>DWK Lifesciences</td><td>74504-20</td><td></td></tr><tr><td>SGE Gazoszczelne strzykawki, Luer Lock, 100 ml</td><td>SGE</td><td>100MR-LL-GT</td><td></td></tr><tr><td>SGE Gazoszczelne strzykawki, Luer Lock, 50 ml</td> Kasety dializacyjne <td>SGE</td><td>50MR-LL-GT</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer, 20 K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66012</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Millipore Sigma</td><td>32319-500G-R</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td>Milipore sacharozy</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe, sterylne</td><td>Genesse Scientific</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Woda, jakość wolna od endotoksyn</td><td>Biologiczne</td><td>RNA 118-325-131</td> Drożdżowe <td>RNA wolne od RNAzy i DNAz</td></tr><tr><td>(10 mg / ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7118</td><td></td></tr></tbody></table>

synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers

Nanocząsteczki lipidowe (LNP) wykazały swój ogromny potencjał jako środki terapeutyczne, czego dowodem jest zatwierdzenie i globalne zastosowanie dwóch szczepionek COVID-19 z informacyjnym RNA (mRNA). Na małą skalę LNP są często wytwarzane przy użyciu mikrofluidyki; Jednak ograniczenia tych urządzeń wykluczają ich wykorzystanie na dużą skalę. Szczepionki przeciwko COVID-19 są produkowane w dużych ilościach przy użyciu mieszalników turbulentnych z ograniczonym strumieniem uderzeniowym (CIJ). Technologia CIJ umożliwia produkcję na skalę laboratoryjną z pewnością, że można ją skalować do wielkości produkcji. Kluczowymi koncepcjami w mieszaniu CIJ są to, że długość i skala czasu mieszania są określane przez intensywność turbulencji w komorze mieszania oraz że tworzenie się nanocząstek odbywa się z dala od ścian, co eliminuje problem osadzania się na powierzchniach i zanieczyszczenia. Praca ta przedstawia proces wytwarzania LNP przy użyciu technologii mieszalnika z ograniczonym strumieniem uderzeniowym o dwóch geometriach: dwustrumieniowym CIJ i czterostrumieniowym mieszalniku wirowym z wieloma wlotami (MIVM). Omówiono zalety i wady każdej geometrii mieszania. W tych geometriach LNP powstają w wyniku szybkiego mieszania strumienia rozpuszczalnika organicznego (zwykle etanolu zawierającego jonizowalne lipidy, kolipidy i stabilizujące lipidy PEG) z wodnym strumieniem antyrozpuszczalnikowym (wodny bufor zawierający RNA lub DNA). Przedstawiono parametry pracy mieszalników CIJ i MIVM w celu przygotowania powtarzalnych LNP o kontrolowanej wielkości, potencjale zeta, stabilności i skuteczności transfekcji. Przedstawiono również różnice między LNP wytwarzanymi przy niewłaściwym mieszaniu (roztwory pipetujące) w porównaniu z mieszaniem CIJ.

Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Lipid nanoparticles (LNPs) have demonstrated their enormous potential as therapeutic delivery vehicles, as evidenced by the approval and global usage of ...

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu powstawania nanocząstek poprzez turbulentne mieszanie strumieni rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika w ograniczonych geometriach. Ograniczone mieszanie turbulentne umożliwia powtarzalną produkcję nanocząstek lipidowych w warunkach ciągłego przepływu, od skali laboratoryjnej (setki mikrolitrów) do skali przemysłowej z prędkością kilkudziesięciu litrów na minutę. Nanocząstki lipidowe są zwykle przygotowywane za pomocą urządzeń mikroprzepływowych lub przez mieszanie pipetami.Te urządzenia mikroprzepływowe mieszają rozpuszczalnik etanolowy i wodne strumienie antyrozpuszczalnika w tych kanałach przypominających naczynia włosowate. Jednak te małe kanały i niskie natężenia przepływu dają niską liczbę Reynoldsa, co prowadzi do mieszania laminarnego. Mieszanie pipetami wytwarza LNP poprzez wstrzyknięcie strumienia rozpuszczalnika bezpośrednio do kąpieli antyrozpuszczalnikowej.Obecne metody wytwarzania nanocząstek lipidowych mają słabą skalowalność i odtwarzalność. Na przykład mieszanie pipetami jest z natury zmienne ze względu na nieograniczone mieszanie ręczne. Chociaż urządzenia mikroprzepływowe rozwiązują niektóre z tych problemów, działają przy bardzo niskich natężeniach przepływu i zanieczyszczają się z powodu odkładania się lipidowego RNA na ściankach kanału.Kwestie te uwypuklają potrzebę dysponowania powtarzalnymi technikami o wysokiej przepustowości w skali laboratoryjnej i klinicznej. Protokół ten demonstruje powtarzalną i skalowalną produkcję nanocząstek lipidowych poprzez turbulentne mieszanie w różnych wielkościach partii. Naukowcy mogą bez obaw przeprowadzać badania przesiewowe lub optymalizację preparatów LNP na małą skalę przed wyprodukowaniem większych partii materiałów do rozszerzonych prób.Turbulentne mieszanie zapewnia spójne nanocząstki, niezależnie od wielkości partii. Mieszalniki turbulentne o ograniczonej geometrii rozwiązują główne problemy związane z istniejącymi technikami produkcji nanocząstek lipidowych. Wykorzystanie warunków turbulentnych powoduje szybsze mieszanie na skalę molekularną, co umożliwia włączenie oligonukleotydów o różnej wielkości do rdzenia LNP.Mieszalnik CIJ eliminuje również zanieczyszczenia spowodowane osadzaniem się lipidów na ściankach mieszalnika. Przepływy turbulentne o tej samej liczbie Reynoldsa mają podobne turbulentne wiry w skali Kołmogorowa dla spójnego mieszania. Zamknięty mieszalnik strumieniowy z uderzeniem kieruje na siebie dwa strumienie o wysokiej liczbie Reynoldsa wewnątrz większej komory mieszania.Liniowy pęd każdego strumienia jest rozpraszany w tworzeniu wirów turbulentnych w skali mikronów, które powodują szybkie i równomierne mieszanie strumieni rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika. Aby rozpocząć formułowanie nanocząstek lipidowych, napełnij dwie pięciomililitrowe strzykawki etanolem i zablokuj każdą z nich w porcie wlotowym zamkniętego mieszalnika CIJ (Impinging Jet). Szybko wcisnąć strzykawki i zebrać ścieki z mieszalnika jako odpady.Wyjąć strzykawki z płukaniem etanolem z CIJ. Wdmuchnij suchy strumień azotu przez adaptery wlotowe, aby wysuszyć wewnętrzne kanały CIJ. Wymieszaj podstawowe roztwory lipidów i rozcieńcz je etanolem w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.Rozcieńczyć 100 milimolowy zapas buforowy octanu pH 4 do 10 milimoli w całkowitej objętości czterech mililitrów. Aby przygotować strumień antyrozpuszczalnika, wymieszaj RNA z buforem octanowym w 1,5-mililitrowej probówce. Przygotuj 500 mikrolitrów roztworu w strzykawce o pojemności jednego mililitra.Odwrócić strzykawkę i usunąć powietrze z wodnego strumienia rozpuszczalnika. Podobnie zbierz 500 mikrolitrów roztworu lipidów w jednomililitrowej strzykawce. Następnie odwróć strzykawkę, aby usunąć powietrze ze strumienia rozpuszczalnika etanolowego.Umieścić czysty mieszalnik CIJ nad fiolką z kąpielą hartowniczą. Połączyć obie strzykawki z portami wlotowymi mieszalnika CIJ. Szybko wcisnąć obie strzykawki, aby wymieszać strumienie rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika i zebrać nanocząstki lipidowe w kąpieli hartującej.Wyjąć mieszalnik CIJ z kąpieli hartowniczej z nadal podłączonymi strzykawkami. Trzymać CIJ nad pojemnikiem na odpady i wyjąć strzykawki, pozwalając pozostałej objętości zapłynięcia do pojemnika na odpady. Teraz zakryj kąpiel hartowniczą zawierającą dyspersję nanocząsteczek lipidowych i delikatnie zakręć fiolką.Mieszalnik wirowy z wieloma wlotami ma stycznie wstrzykiwane strumienie do komory mieszania, które tworzą blaszki w wirze obrotowym. Wysoka liczba Reynoldsa w komorze mieszania zapewnia wytwarzanie wirów turbulentnych w skali mikronów, które szybko mieszają blaszki, podobnie jak wiry turbulentne w mieszalniku CIJ. Aby rozpocząć montaż mieszalnika wirowego o rozmiarze mikro z wieloma wlotami lub MIVM, zbierz wymagany dolny odbiornik, tarczę geometrii mieszania, górną tarczę, O-ring i klucz płaski na platformie roboczej.Umieść O-ring w rowku w tarczy mieszającej. Dopasuj otwory tarczy mieszającej do kołków na górnej tarczy i dociśnij je do siebie, nie odrywając O-ringu. Przykręć luźno dopasowany O-ring tarczy mieszającej i zespół górnej tarczy do dolnego odbiornika.Następnie dokręć górną tarczę do dolnego odbiornika za pomocą klucza płaskiego. Włóż i dokręć złączkę rurki wylotowej do dolnego odbiornika, aby zakończyć MIVM. Zamontuj zmontowany MIVM w stojaku miksera tak, aby rurka wylotowa wychodziła przez płytę nośną.Następnie przygotuj roztwory rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika w pożądanej kompozycji. Załaduj 30 mililitrów roztworów do gazoszczelnych strzykawek. Odwróć strzykawkę i rurkę i usuń z nich powietrze.Przymocuj rurkę PTFE za pomocą adaptera Luer zamontowanego na końcu. Zamontuj strzykawki w pompie strzykawkowej i podłącz je do wlotów mieszalnika w MIVM. Rozcieńczyć 100 milimolowy zapas buforowy octanu pH 4 do 10 milimolów w całkowitej objętości 320 mililitrów.Na pompie strzykawkowej ustaw objętościowe natężenie przepływu na 20 mililitrów na minutę. Uruchomić pompę strzykawkową i pozwolić, aby pierwsze 10 sekund ścieków spłynęło do zlewki na odpady. Po 10 sekundach zebrać ścieki MIVM w kąpieli hartowniczej.Teraz usuń i zakryj kąpiel hartowniczą zawierającą dyspersję nanocząstek lipidowych. Wyczyść MIVM między każdym eksperymentem, przepłukując co najmniej dwukrotność objętości rurki wylotowej. Po odłączeniu miksera od podstawy, trzymając zamocowane strzykawki, należy przytrzymać go nad pojemnikiem na odpady.Wyjąć strzykawki, pozwalając, aby zator spłynął do pojemnika. Następnie przytrzymaj zespół miksera do góry nogami i użyj klucza płaskiego, aby zdemontować mikser. Przepłukać rurkę wylotową i geometrię mieszania etanolem i wysuszyć elementy strumieniem powietrza lub azotu.Następnie opłucz O-ring wodą dejonizowaną i osusz go. Dokładnie opłucz górną tarczę i strzykawkę etanolem przed użyciem strumienia powietrza lub azotu do wysuszenia powierzchni.

synthesizing-lipid-nanoparticles-turbulent-flow-confined-impinging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Nanomateriały zapewniają wszechstronne mechanizmy kontrolowanego dostarczania terapeutycznego zarówno dla nauk podstawowych, jak i zastosowań translacyjnych, ale ich wytwarzanie często wymaga specjalistycznej wiedzy, która jest niedostępna w większości laboratoriów biomedycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skalowalnego wytwarzania i ładowania terapeutycznego różnorodnych, samoorganizujących się nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej.

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Flash NanoPrecipitation (FNP) to skalowalne podejście do produkcji polimerowych nanocząstek typu rdzeń-powłoka. Opisano preparaty na skalę laboratoryjną do kapsułkowania terapii hydrofobowych lub hydrofilowych.

Nanoprecypitacja błyskawiczna do enkapsulacji związków hydrofobowych i hydrofilowych w nanocząstkach polimerowych

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia nanocząsteczek lipidowych (LNP), które zawierają mRNA kodujące lucyferazy świetlika. Te LNP zostały przetestowane pod kątem ich siły działania in vitro w komórkach HepG2 i in vivo u myszy C57BL / 6.

Testowanie skuteczności in vitro i in vivo nanocząstek mRNA-lipidów powstałych metodą mieszania mikroprzepływowego

Ten protokół zapewnia podejście do optymalizacji receptur w stosunku do czynników badania mieszanego, ciągłego i kategorycznego, które minimalizuje subiektywne wybory w konstrukcji eksperymentalnego projektu. W fazie analizy stosowana jest skuteczna i łatwa w użyciu procedura modelowania dopasowania.

Przepływ pracy w celu optymalizacji formułowania nanocząstek lipidowych (LNP) przy użyciu zaprojektowanych eksperymentów z procesem mieszaniny i samozwalidowanych modeli zespołowych (SVEM)

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

W niniejszej pracy wyjaśniamy sposób wykonania i zastosowania mikropłynnego mieszalnika zdolnego do mieszania dwóch roztworów w czasie ~8 μs. Demonstrujemy również wykorzystanie tych mieszalników w detekcji spektroskopowej z użyciem fluorescencji UV oraz fluorescencyjnego transferu energii w rezonansie (FRET).

Miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Poznaj metodę syntezy nanocząstek lipidowych w mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem. Turbulentne mieszanie w ograniczonej geometrii zapewnia reprodukowalną produkcję LNP od skali laboratoryjnej do przemysłowej.

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Przeglądaj więcej filmów