Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem
23 sierpnia 2024
Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.
Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu powstawania nanocząstek poprzez turbulentne mieszanie strumieni rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika w ograniczonych geometriach. Ograniczone mieszanie turbulentne umożliwia powtarzalną produkcję nanocząstek lipidowych w warunkach ciągłego przepływu, od skali laboratoryjnej (setki mikrolitrów) do skali przemysłowej z prędkością kilkudziesięciu litrów na minutę. Nanocząstki lipidowe są zwykle przygotowywane za pomocą urządzeń mikroprzepływowych lub przez mieszanie pipetami.
Te urządzenia mikroprzepływowe mieszają rozpuszczalnik etanolowy i wodne strumienie antyrozpuszczalnika w tych kanałach przypominających naczynia włosowate. Jednak te małe kanały i niskie natężenia przepływu dają niską liczbę Reynoldsa, co prowadzi do mieszania laminarnego. Mieszanie pipetami wytwarza LNP poprzez wstrzyknięcie strumienia rozpuszczalnika bezpośrednio do kąpieli antyrozpuszczalnikowej.
Obecne metody wytwarzania nanocząstek lipidowych mają słabą skalowalność i odtwarzalność. Na przykład mieszanie pipetami jest z natury zmienne ze względu na nieograniczone mieszanie ręczne. Chociaż urządzenia mikroprzepływowe rozwiązują niektóre z tych problemów, działają przy bardzo niskich natężeniach przepływu i zanieczyszczają się z powodu odkładania się lipidowego RNA na ściankach kanału.
Kwestie te uwypuklają potrzebę dysponowania powtarzalnymi technikami o wysokiej przepustowości w skali laboratoryjnej i klinicznej. Protokół ten demonstruje powtarzalną i skalowalną produkcję nanocząstek lipidowych poprzez turbulentne mieszanie w różnych wielkościach partii. Naukowcy mogą bez obaw przeprowadzać badania przesiewowe lub optymalizację preparatów LNP na małą skalę przed wyprodukowaniem większych partii materiałów do rozszerzonych prób.
Turbulentne mieszanie zapewnia spójne nanocząstki, niezależnie od wielkości partii. Mieszalniki turbulentne o ograniczonej geometrii rozwiązują główne problemy związane z istniejącymi technikami produkcji nanocząstek lipidowych. Wykorzystanie warunków turbulentnych powoduje szybsze mieszanie na skalę molekularną, co umożliwia włączenie oligonukleotydów o różnej wielkości do rdzenia LNP.
Mieszalnik CIJ eliminuje również zanieczyszczenia spowodowane osadzaniem się lipidów na ściankach mieszalnika. Przepływy turbulentne o tej samej liczbie Reynoldsa mają podobne turbulentne wiry w skali Kołmogorowa dla spójnego mieszania. Zamknięty mieszalnik strumieniowy z uderzeniem kieruje na siebie dwa strumienie o wysokiej liczbie Reynoldsa wewnątrz większej komory mieszania.
Liniowy pęd każdego strumienia jest rozpraszany w tworzeniu wirów turbulentnych w skali mikronów, które powodują szybkie i równomierne mieszanie strumieni rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika. Aby rozpocząć formułowanie nanocząstek lipidowych, napełnij dwie pięciomililitrowe strzykawki etanolem i zablokuj każdą z nich w porcie wlotowym zamkniętego mieszalnika CIJ (Impinging Jet). Szybko wcisnąć strzykawki i zebrać ścieki z mieszalnika jako odpady.
Wyjąć strzykawki z płukaniem etanolem z CIJ. Wdmuchnij suchy strumień azotu przez adaptery wlotowe, aby wysuszyć wewnętrzne kanały CIJ. Wymieszaj podstawowe roztwory lipidów i rozcieńcz je etanolem w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.
Rozcieńczyć 100 milimolowy zapas buforowy octanu pH 4 do 10 milimoli w całkowitej objętości czterech mililitrów. Aby przygotować strumień antyrozpuszczalnika, wymieszaj RNA z buforem octanowym w 1,5-mililitrowej probówce. Przygotuj 500 mikrolitrów roztworu w strzykawce o pojemności jednego mililitra.
Odwrócić strzykawkę i usunąć powietrze z wodnego strumienia rozpuszczalnika. Podobnie zbierz 500 mikrolitrów roztworu lipidów w jednomililitrowej strzykawce. Następnie odwróć strzykawkę, aby usunąć powietrze ze strumienia rozpuszczalnika etanolowego.
Umieścić czysty mieszalnik CIJ nad fiolką z kąpielą hartowniczą. Połączyć obie strzykawki z portami wlotowymi mieszalnika CIJ. Szybko wcisnąć obie strzykawki, aby wymieszać strumienie rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika i zebrać nanocząstki lipidowe w kąpieli hartującej.
Wyjąć mieszalnik CIJ z kąpieli hartowniczej z nadal podłączonymi strzykawkami. Trzymać CIJ nad pojemnikiem na odpady i wyjąć strzykawki, pozwalając pozostałej objętości zapłynięcia do pojemnika na odpady. Teraz zakryj kąpiel hartowniczą zawierającą dyspersję nanocząsteczek lipidowych i delikatnie zakręć fiolką.
Mieszalnik wirowy z wieloma wlotami ma stycznie wstrzykiwane strumienie do komory mieszania, które tworzą blaszki w wirze obrotowym. Wysoka liczba Reynoldsa w komorze mieszania zapewnia wytwarzanie wirów turbulentnych w skali mikronów, które szybko mieszają blaszki, podobnie jak wiry turbulentne w mieszalniku CIJ. Aby rozpocząć montaż mieszalnika wirowego o rozmiarze mikro z wieloma wlotami lub MIVM, zbierz wymagany dolny odbiornik, tarczę geometrii mieszania, górną tarczę, O-ring i klucz płaski na platformie roboczej.
Umieść O-ring w rowku w tarczy mieszającej. Dopasuj otwory tarczy mieszającej do kołków na górnej tarczy i dociśnij je do siebie, nie odrywając O-ringu. Przykręć luźno dopasowany O-ring tarczy mieszającej i zespół górnej tarczy do dolnego odbiornika.
Następnie dokręć górną tarczę do dolnego odbiornika za pomocą klucza płaskiego. Włóż i dokręć złączkę rurki wylotowej do dolnego odbiornika, aby zakończyć MIVM. Zamontuj zmontowany MIVM w stojaku miksera tak, aby rurka wylotowa wychodziła przez płytę nośną.
Następnie przygotuj roztwory rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika w pożądanej kompozycji. Załaduj 30 mililitrów roztworów do gazoszczelnych strzykawek. Odwróć strzykawkę i rurkę i usuń z nich powietrze.
Przymocuj rurkę PTFE za pomocą adaptera Luer zamontowanego na końcu. Zamontuj strzykawki w pompie strzykawkowej i podłącz je do wlotów mieszalnika w MIVM. Rozcieńczyć 100 milimolowy zapas buforowy octanu pH 4 do 10 milimolów w całkowitej objętości 320 mililitrów.
Na pompie strzykawkowej ustaw objętościowe natężenie przepływu na 20 mililitrów na minutę. Uruchomić pompę strzykawkową i pozwolić, aby pierwsze 10 sekund ścieków spłynęło do zlewki na odpady. Po 10 sekundach zebrać ścieki MIVM w kąpieli hartowniczej.
Teraz usuń i zakryj kąpiel hartowniczą zawierającą dyspersję nanocząstek lipidowych. Wyczyść MIVM między każdym eksperymentem, przepłukując co najmniej dwukrotność objętości rurki wylotowej. Po odłączeniu miksera od podstawy, trzymając zamocowane strzykawki, należy przytrzymać go nad pojemnikiem na odpady.
Wyjąć strzykawki, pozwalając, aby zator spłynął do pojemnika. Następnie przytrzymaj zespół miksera do góry nogami i użyj klucza płaskiego, aby zdemontować mikser. Przepłukać rurkę wylotową i geometrię mieszania etanolem i wysuszyć elementy strumieniem powietrza lub azotu.
Następnie opłucz O-ring wodą dejonizowaną i osusz go. Dokładnie opłucz górną tarczę i strzykawkę etanolem przed użyciem strumienia powietrza lub azotu do wysuszenia powierzchni.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNPs) z wykorzystaniem technologii mikserów z ograniczonym strumieniem zderzającym (CIJ). Miksery CIJ umożliwiają stworzenie powtarzalnych, turbulentnych środowisk mikromieszania, co prowadzi do otrzymania monodyspersyjnych LNPs.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Synteza nanocząstek
- Techniki mieszania turbulentnego
- Zastosowania biotechnologiczne
Wstęp
- Nanocząsteczki lipidowe są niezbędne w systemach dostarczania leków.
- Obecne metody produkcji LNP borykają się z problemami dotyczącymi skalowalności i powtarzalności.
- Urządzenia mikrofluidyczne często prowadzą do mieszania laminarnego, które jest mniej efektywne.
- Ograniczone mieszanie turbulentne stanowi rozwiązanie tych problemów.
Cel badania
- Wykazanie powtarzalnej i skalowalnej metody produkcji LNP.
- Rozwiązanie ograniczeń istniejących technik syntezy LNP.
- Umożliwienie efektywnego screeningu i optymalizacji formulacji.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie mieszalników z ograniczonymi strumieniami zderzającymi (CIJ) do mieszania turbulentnego.
- Przygotowanie strumieni rozpuszczalnika i antyrozpuszczalnika w sposób kontrolowany.
- Wdrożenie wielowlotowego mieszalnika wirowego (MIVM) do produkcji na większą skalę.
- Zbiór i analiza dyspersji nanocząsteczek lipidowych.
Główne wyniki
- Skuteczna produkcja monodyspersyjnych nanocząsteczek lipidowych.
- Wykazana skalowalność z poziomu laboratoryjnego do skali przemysłowej.
- Spójne mieszanie osiągnięte dzięki przepływom turbulentnym.
- Eliminacja problemów z foulingiem związanych z osadzaniem się lipidów.
Wnioski
- Ograniczone mieszanie turbulentne jest skuteczną metodą syntezy LNP.
- Podejście to zwiększa powtarzalność i skalowalność procesu.
- Badacze mogą z pewnością optymalizować formulacje LNP dla różnych zastosowań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Turbulentne mieszanie w strumieniu uderzającym w ograniczonej przestrzeni (CIJ) umożliwia skalowalną i powtarzalną syntezę nanocząstek lipidowych (LNP) do dostarczania terapeutycznego, bezpośrednio rozwiązując ograniczenia metod mikrofluidycznych oraz ręcznego mieszania. Technologia ta wspiera pewne przejście z etapu przesiewania formulacji w skali laboratoryjnej do produkcji w skali przemysłowej, zapewniając spójną jakość nanocząstek i niezawodność procesu. Podejście to jest niezwykle istotne dla linii biopharmaceutycznych wymagających wydajnego, wysokoprzepustowego wytwarzania LNP dla terapii kwasami nukleinowymi oraz platform szczepionkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szybki screening formulacji i optymalizację składów LNP do dostarczania kwasów nukleinowych.
- Wspiera walidację funkcjonalną nośników poprzez wytwarzanie LNP o kontrolowanym rozmiarze i stabilności.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie powtarzalnych charakterystyk nanocząsteczek w poszczególnych partiach.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne preparaty LNP do dalszych analiz biologicznych.
- Umożliwia ilościową kontrolę wielkości nanocząsteczek, potencjału zeta oraz wydajności enkapsulacji.
- Umożliwia przygotowanie do przesiewania wysokoprzepustowego oraz skalowalność platformy dla różnych ładunków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez utrzymanie jakości LNP przy zwiększaniu skali produkcji.
- Jest zgodne z translacyjnymi strategiami biomarkerów dzięki wspieraniu spójnej wydajności systemu dostarczania.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnym etapie z powodu zmienności procesu lub niespójności związanych z foulingiem.
Integracja potoków i przepływów pracy
Mieszalniki CIJ oraz wirówkowe z wieloma wlotami pozycjonują syntezę LNP jako pomost od wczesnej fazy odkrywania, poprzez optymalizację wiodących kandydatów, aż po dostawy materiałów przedklinicznych, wspierając w ten sposób stabilny transfer procesu i skalowanie.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących skuteczności dostarczania i kompatybilności ładunku w systemach kontrolowanych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe serie LNP do porównawczej oceny formulacji.
- Analityka: Wspiera pomiary rozmiaru, potencjału zeta i stabilności w celu podejmowania decyzji w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Utrzymuje ciągłość procesu i jakość produktu od skali laboratoryjnej po produkcję materiałów do badań klinicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, zestandaryzowaną platformę możliwą do adaptacji dla różnych kwasów nukleinowych i ładunków terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w zakresie wydajności LNP i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w produkcji nanocząsteczek.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez minimalizację ryzyka związanego z procesem.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację i rozwój terapeutycznych kandydatów opartych na LNP z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy z zakresu formulacji nanocząstek oraz zasad mieszania w przepływie turbulentnym.
- Wymagany jest dostęp do mikserów CIJ lub wirowirówek wielowlotowych oraz narzędzi analitycznych do charakteryzacji nanocząstek.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja parametrów mieszania i wskaźników kontroli jakości.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych ładunków kwasów nukleinowych i składów lipidowych poprzez modyfikacje protokołu.
- W rozważaniach należy uwzględnić protokoły czyszczenia i zapobieganie zanieczyszczeniom, zgodnie z konstrukcją miksera.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:28
Optimized Formulation of Lipid Nanoparticles Using a Two‐Jet Continuous Impinging Jet (CIJ) Mixer
4:49
Advanced Formulation and Production of Lipid Nanoparticles Using a Four‐Jet Micro‐Size Multiple Inlet Vortex Mixer (µMIVM)
