Laserowa ablacja komórek w nienaruszonych larwach Drosophila ujawnia konkurencję synaptyczną

Próbujemy zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tworzenia obwodów nerwowych podczas rozwoju i używamy prostych układów nerwowych, takich jak Drosophila, do zbadania tego pytania. Jednym z tych mechanizmów jest rola konkurencji synaptycznej w składaniu obwodów, a niniejsza praca koncentruje się na tym zagadnieniu. Jedną z ekscytujących nowych technologii w neuronauce jest optogenetyka.

Wykorzystuje światłoczułe kanały jonowe do włączania i wyłączania neuronów za pomocą impulsów świetlnych. Te nowe metody pozwalają nam kontrolować obwody neuronowe na nowe sposoby i łączyć zmutowane obwody tak, aby zachowywały się. Ablacja pojedynczego neuronu u żywego zwierzęcia pozwoliła nam scharakteryzować rolę konkurencji w tworzeniu prostych obwodów neuronalnych.

Teraz możemy przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem maszynerii molekularnej, która leży u podstaw tego powszechnego zjawiska. Pokazujemy konkurencyjną interakcję między dwoma gigantycznymi neuronami w celu nawiązania kontaktu synaptycznego z docelowymi neuronami ruchowymi. Wynik ten ma podobieństwa w całym królestwie zwierząt, zwłaszcza w układzie wzrokowym kręgów, gdzie został po raz pierwszy odkryty.

Otwiera to drogę do zbadania cząsteczek, które regulują tę konkurencję w genetycznie podatnym organizmie, takim jak Drosophila. Wykorzystamy tę nową metodę optogenetyki, aby lepiej zrozumieć obwód neuronalny leżący u podstaw zachowania ucieczki. Wykorzystamy również naszą wiedzę na temat obwodu neuronalnego, aby lepiej zrozumieć, jak działają te nowe narzędzia optogenetyczne.

Na początek weź szklane naczynie z ciasno dopasowaną pokrywką. Umieść wacik w naczyniu. Pod wyciągiem dodaj od trzech do pięciu mililitrów eteru etylowego do wacika.

Natychmiast przykryj naczynie pokrywką. Użyj pędzla, aby podnieść larwę Drosophila w trzecim stadium rozwojowym z fiolek much. Przenieś jedną larwę do małego otwartego pojemnika.

Umieść pojemnik w szklanym naczyniu z eterem etylowym i natychmiast szczelnie zamknij naczynie. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby sprawdzić ruchliwość larwy co 30 sekund. Przenieś znieczuloną larwę na szklane szkiełko mikroskopowe.

Zanurz larwę w kropli soli fizjologicznej na owady. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń większość soli fizjologicznej za pomocą papierowej chusteczki higienicznej. Ustaw larwę grzbietową do góry w przypadku ablacji gigantycznych włókien lub brzuszną stroną do góry w przypadku ablacji TTMn.

Następnie powoli opuść szklaną pokrywę na larwę. Dodaj sól fizjologiczną z boku szkiełka nakrywkowego, aby wypełnić przestrzeń między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. W przypadku ablacji gigantycznych włókien sprawdź położenie mózgu w dużym powiększeniu pod mikroskopem preparacyjnym.

Upewnij się, że mózg leży poziomo i jest widoczny przez naskórek. Aby przemieścić tkankę tłuszczową pokrywającą mózg, użyj kleszczy, aby lekko docisnąć szkiełko nakrywkowe i przesuwaj szkiełko nakrywkowe z boku na bok. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu wielofotonowego.

Użyj filtra GFP, aby zlokalizować próbkę w trybie epifluorescencji. W przypadku ablacji gigantycznych włókien skup się na interesujących Cię komórkach. Następnie przełącz się na tryb dwóch fotonów.

Ustaw laser na 870 nanometrów i dostosuj wzmocnienie detektora, aby view komórki wyrażające GFP za pomocą skanera galvano. Zdefiniuj obszar do ablacji za pomocą okrągłego obszaru zainteresowania. Następnie przejdź do konfiguracji protokołu ablacji w oprogramowaniu.

Aby to zrobić, sekwencyjnie ustaw jedną klatkę stymulacji akwizycji, a następnie kolejną klatkę akwizycji. Uruchom moc lasera stymulacyjnego na niższą wartość i uruchom protokół stymulacji. Jeśli ablacja się nie powiodła i tylko wybielić komórkę, zwiększ moc lasera o 5% lub liczbę pętli pojedynczo i ponownie uruchom protokół.

Rób to, dopóki nie zobaczysz udanej ablacji komórek. Po pomyślnym przeprowadzeniu ablacji komórki usuń szkiełko nakrywkowe. Za pomocą pędzla delikatnie podnieś larwy ze zjeżdżalni.

Następnie przenieś larwy do fiolki z jedzeniem. W próbkach ablacji gigantycznych włókien ablacja została zweryfikowana przez brak somy znakowanej GFP po stronie mózgu, której poddano ablacji. W przypadku larw po ablacji TTMn brak TTMn po jednej stronie był łatwo rozpoznawalny z powodu braku somy i dendrytów.