Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

Zakres naszych badań polega na opracowaniu i scharakteryzowaniu modelu in vitro z wykorzystaniem komórek nabłonka dróg oddechowych do badania skutków przewlekłej ekspozycji na CSE. Naszym celem było zrozumienie odpowiedzi komórkowej, która zachodzi w komórkach nabłonka dróg oddechowych i długotrwałej ekspozycji na dym papierosowy, która jest istotna dla patogennej POChP. Rozpoznanie skomplikowanej interakcji komórek odpornościowych nabłonka w POChP jest uważane za kluczowe osiągnięcie w najnowszych badaniach nad POChP.

Opracowaliśmy nowatorski model in vitro, który naśladuje przewlekłą ekspozycję na CSE w komórkach nabłonka dróg oddechowych. Nasze odkrycia otwierają nową drogę do badania długoterminowego wpływu przewlekłej ekspozycji na dym papierosowy na komórki nabłonka dróg oddechowych i rolę w progresji POChP. W przyszłości nasze laboratorium skupi się na badaniu specyficznego szlaku regulującego różnicowanie komórek nabłonka oraz roli każdej heterogenotycznej komórki nabłonka w odpowiedzi na leczenie POChP.

Na początek ułóż świeżo przygotowane podłoże rozprężne, przefiltruj wysterylizowane roztwory proteazy i antybiotyków oraz wysterylizowane narzędzia chirurgiczne na platformie roboczej szafy bezpieczeństwa biologicznego. Dodaj kolagen z ogona szczura do 100-milimetrowych naczyń hodowlanych i 24-milimetrowych transwelli. Pozostaw naczynia otwarte na noc w świetle ultrafioletowym do sterylizacji.

Zanurz uśpioną mysz w 75% etanolu w celu sterylizacji. Nie zanurzaj nosa i ust. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy przeciąć i otworzyć naskórek od dolnej szczęki do jamy brzusznej myszy.

Za pomocą innego zestawu nożyczek chirurgicznych i kleszczy rozerwij tarczycę po obu stronach i usuń połączenia między tchawicą, otaczającą tkanką mięśniową i przełykiem. Następnie ostrożnie wcinaj klatkę piersiową i użyj kleszczy, aby zagłębić się w jamę klatki piersiowej. Usuń całe płuco i znajdź koniec tchawicy.

Wytnij tchawicę od chrząstki tarczycy do gałęzi tchawicy i oskrzeli i umieść ją w pożywce do rozprężania przed zimnem zawierającej cztery antybiotyki. Wstrząśnij probówką, aby spłukać jak najwięcej krwi z powierzchni tchawicy przed umieszczeniem jej na lodzie. Teraz przenieś tchawicę do wstępnie schłodzonego PBS zawierającego cztery antybiotyki.

Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy usuń skrzepy i inne tkanki z powierzchni tchawicy i pokrój je na jeden centymetr kwadratowy. Inkubować tkankę tchawicy w roztworze proteinazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 40 minutach kilkakrotnie rozbujaj probówkę i użyj sitka do komórek o średnicy 40 mikronów, aby usunąć pozostałe tkanki.

Opłucz posiekaną tchawicę na sitku z pięcioma mililitrami podłoża ekspandacyjnego. Odwirować zawiesinę dotchawiczą o stężeniu 400 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I ponownie zawieś granulat w ośmiu mililitrach podłoża rozprężnego.

Policz żywotne komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Zawiesina komórek P0 na 100 milimetrowej szalce wstępnie pokrytej kolagenem z ogona szczura. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Gdy mysie komórki nabłonka tchawicy utworzą nienaruszoną monowarstwę o wyglądzie kostki brukowej, delikatnie spłucz komórki trzema mililitrami wstępnie podgrzanego PBS. Dodaj trzy mililitry enzymatycznego roztworu dysocjacyjnego bez składników zwierzęcych do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Delikatnie odpipetować, aby usunąć komórki i przenieść zawiesinę do trzech mililitrów roztworu hamującego enzymy bez składników zwierzęcych.

Odwirować zawiesinę komórkową o masie 400 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. I ponownie zawieś granulat w jednym mililitrze podłoża rozprężnego. Policz żywotne komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.

Zawiesina komórek P1 na 100 milimetrowej szalce wstępnie pokrytej kolagenem z ogona szczura. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Gdy pierwotne komórki nabłonka mysich dróg oddechowych osiągną 80% zbieżności, komórki nasienne na szkiełku pokrytym kolagenem z ogona szczura.

Następnie dodaj paraformaldehyd, aby utrwalić komórki na 12 godzin. Przemyć szkiełko trzykrotnie PBS przez pięć minut każdy i inkubować z 3% albuminą surowicy bydlęcej i 0,1% Tritonem X-100 w PBS przez jedną godzinę. Dodać przeciwciało anty-pancytokeratyny w rozcieńczeniu od 1 do 500 na szkiełko i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia przemyć to szkiełko trzy razy roztworem PBS przez pięć minut każdy, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym w rozcieńczeniu od 1 do 1 000 przez dwie godziny w ciemności. Po umyciu szkiełka PBS dodać DPI w rozcieńczeniu od 1 do 1 000 i inkubować przez 15 minut. Umyj szkiełko raz za pomocą PBS przez pięć minut.

Obserwuj szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby porównać wzorce ekspresji z kontrolą pozytywną i kontrolą ujemną. Po odłączeniu i odwirowaniu ponownie zawiesić komórki fazy P2 w odpowiedniej objętości podłoża ekspandacyjnego. Odpipetować jeden mililitr zawiesiny komórek na komorę wierzchołkową wkładu membrany poliwęglanowej transwell.

Dodaj 1,5 mililitra pożywki proliferacyjnej do podstawowej komory transwella. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia konfluencji. Przygotować 50 mililitrów pożywki do całkowitego różnicowania, używając następujących składników.

Przetrzyj jednego papierosa przez 12,5 mililitra pożywki różnicującej. A następnie przefiltruj go przez filtr porowy o wielkości 0,22 mikrona, aby przygotować ekstrakt z dymu papierosowego lub CSE. Aby zapewnić standaryzację między eksperymentami i partiami CSE, zmierz absorbancję przy 320 nanometrach na spektrofotometrze.

Następnie usuń podłoże rozprężne z komory wierzchołkowej i podstawowej transwells. Dodać pożywkę różnicującą zawierającą CSE o odpowiednim stężeniu, aby stymulować pierwotne komórki nabłonka mysich dróg oddechowych przez 28 dni. Podczas inkubacji przemyć komorę wierzchołkową dwa razy w tygodniu PBS i zastąpić pożywkę w komorze podstawowej świeżo przygotowanym podłożem różnicującym zawierającym mysie komórki nabłonka dróg oddechowych CSE, które pomyślnie różnicują się na granicy faz powietrze-ciecz w ciągu 28 dni.

Obecność komórek rzęskowych i kubkowych wykazano za pomocą testu immunofluorescencyjnego odpowiednio markera rzęsek, acetylowanej alfa-tubuliny i markera komórek kubkowych, mucyny 5AC. Żywotność komórek po 24 godzinach przy różnych stężeniach CSE wykazała, że komórki nabłonkowe zmniejszyły się, gdy stężenie było wyższe niż 6%Aktywność komórek pod wpływem długotrwałej stymulacji nie wykazała znaczącej śmierci komórek przy stężeniach 2%4% i 6%CSE. Zauważono jednak zmiany w oporności transbłonowej i złuszczonych komórkach.

Ponadto zaobserwowano ogólne zmniejszenie liczby komórek zróżnicowanych i komórek rzęskowych, gdy hodowle komórek nabłonka mysich dróg oddechowych były przewlekle narażone na CSE.