Identyfikacja komórek w stanie spoczynku w modelu ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej limfocytów T danio pręgowanego za pomocą barwienia proliferacji komórek
19 lipca 2024
Użyliśmy barwienia proliferacji komórek, aby zidentyfikować komórki w stanie spoczynku w modelu T-ostrej białaczki limfoblastycznej u danio pręgowanego. Barwnik jest zatrzymywany w komórkach niedzielących się i redukowany podczas proliferacji komórek, co umożliwia selekcję uśpionych komórek do dalszego badania. Protokół ten zapewnia funkcjonalne narzędzie do badania samoodnowy w kontekście spoczynku komórkowego.
Komórki macierzyste białaczki są rzadką subpopulacją komórek w białaczce, które są odpowiedzialne za długotrwałą chorobę, utrzymanie i nawrót. Naszym celem jest lepsze scharakteryzowanie tych komórek, aby znaleźć sposoby na ich celowanie i eliminowanie oraz poprawę wyników leczenia pacjentów. Nowotworowe komórki macierzyste, w tym komórki macierzyste białaczki, istnieją w stanie spoczynku lub powolnego wzrostu, co może umożliwić im uniknięcie antyproliferacyjnego leczenia raka.
Zrozumienie spoczynku komórkowego pomoże zidentyfikować potencjalne słabości komórek macierzystych białaczki i nowe sposoby ich zwalczania. Korzystając z tego protokołu, możemy zidentyfikować i wyizolować komórki białaczki w stanie spoczynku z modelu ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek T u ryb zebry. Komórki te mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak badania przesiewowe leków in vivo, profilowanie transkryptomiczne i analiza proteomiczna.
Aby rozpocząć, rozmrozić fiolkę zawierającą jeden mililitr zamrożonych komórek TALL ryby pręgowanej znakowanej GFP w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Powoli odpipetować zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, zawierającej cztery mililitry pożywki rybnej na lodzie. Wirować komórki w temperaturze 2 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 0,5 mililitra pożywki rybnej.
Dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówki zawierającej 10 mikrolitrów niebieskiego barwnika tripanowego. Dobrze wymieszaj i przenieś 10 mikrolitrów na hemocytometr i policz komórki pod mikroskopem. Następnie przytrzymaj znieczuloną dorosłą rybę zebry CG1 brzuszną stroną do góry.
Za pomocą mikrostrzykawki Hamiltona wstrzyknąć od pięciu do sześciu mikrolitrów zawiesiny komórkowej do przestrzeni dootrzewnowej. Około 21 do 28 dni po przeszczepie oceń procent komórek białaczkowych znakowanych GFP od znieczulonych ryb danio pręgowanego. Aby zebrać komórki białaczkowe, przenieś uśpioną rybę danio pręgowanego na nową szalkę Petriego i dodaj jeden mililitr pożywki rybnej, która posłuży jako bufor dla komórek.
Za pomocą żyletki najpierw odetnij głowę jerepowi, a następnie zmaceruj tkankę. Pipetuj w górę i w dół, aby usunąć duże grudki komórek. Przełóż zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 40 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby zdysocjować na zawiesinę pojedynczej komórki.
Na początek zbierz raz 10 do potęgi sześciu fluorescencyjnie znakowanych komórek TALL zebry w 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych. Odwirować komórki w temperaturze 2 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 0,9 XPBS. Umieść 250 mikrolitrów zawiesiny komórkowej w probówce do mikrowirówki.
Następnie dodaj 250 mikrolitrów 0,9 XPBS, aby zwiększyć objętość do 500 mikrolitrów. Dodać wymaganą objętość roztworu podstawowego barwnika CTFR i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Odwirować komórki w temperaturze 2 500 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Dodaj 500 mikrolitrów pożywki rybnej, aby usunąć nadmiar barwnika, i ponownie odwiruj przed ponownym zawieszeniem osadu w 25 mikrolitrach pożywki rybnej. Zabarwić komórki trypskanym błękitem i zbadać je pod mikroskopem pod kątem żywotności. Korzystając ze zoptymalizowanego stężenia CTFR, wybarwić komórki zebry i pozostawić niektóre komórki nowotworowe niezabarwione.
Za pomocą mikrostrzykawki Hamiltona wstrzyknij pięć mikrolitrów barwionej i niebarwionej zawiesiny komórkowej do jamy dootrzewnowej znieczulonej zespołobionej ryby pręgowanej. W celu przygotowania płytki dawcy przenieś 500 000 komórek zebry zebry typu dzikiego CG1 do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj pięć mililitrów pożywki rybnej, aby rozcieńczyć zapas komórek do 100 komórek na mikrolitr.
Dozować 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej i umieścić płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu sortowania. Przygotuj kontrolki bez plam i pojedynczych kolorów do konfiguracji eksperymentu sortowania. Przepuścić zawiesinę komórek kontrolnych i próbki przez nasadkę filtra o średnicy 35 mikronów do rurki faksowej na lodzie.
Odwirować 96-dołkową płytkę w temperaturze 2 500 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ostrożnie usuń 45 mikrolitrów supernatyny z każdej studzienki, pozostawiając pięć mikrolitrów cieczy. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów i za pomocą mikrostrzykawki Hamilton wstrzyknąć zawiesiny komórek do żądanej liczby ryb zebry CG1
.Po przesadzeniu zebry CG1 z posortowanymi komórkami w celu analizy rozcieńczenia ograniczającego, wysokie komórki CT-FR miały czterokrotnie wyższą częstość występowania białaczkowych komórek macierzystych w porównaniu z niskimi komórkami CT-FR. Reprezentatywne zdjęcia danio pręgowanego po 28 dniach od przeszczepu wykazały, że u 89% ryb danio pręgowanego o wysokim CTFR rozwinęła się białaczka w porównaniu z 20% w grupie nisko zachorowanej na CT-FR. Danio pręgowany CT-FR miał znacznie krótsze opóźnienie do białaczki.
Danio pręgowany o wysokiej CT-FR miał znacznie niższą przeżywalność całkowitą w porównaniu z danio pręgowanym CT-FR o niskiej populacji.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na identyfikacji spoczynkowych komórek macierzystych białaczki w modelu ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek T u ryb zebrafish. Dzięki zastosowaniu barwienia proliferacji komórkowej badacze mogą izolować komórki uśpione do dalszych analiz, co pozwala na lepsze zrozumienie spoczynku komórkowego i jego wpływu na leczenie nowotworów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia komórki
- badania nad rakiem
Wstęp
- Macierzyste komórki białaczki przyczyniają się do podtrzymywania choroby i nawrotów.
- Komórki te często znajdują się w stanie spoczynku, co pozwala im unikać działania terapii.
- Zrozumienie stanu spoczynku może ujawnić słabe punkty macierzystych komórek białaczki.
- Model rybki danio (zebrafish) stanowi unikalną platformę do badania tych komórek.
Cel badania
- Charakterystyka spoczynkowych macierzystych komórek białaczwiczych.
- Badanie metod celowania w te komórki i ich eliminacji.
- Poprawa wyników leczenia pacjentów dzięki lepszemu zrozumieniu zachowania komórkowego.
Zastosowane metody
- Barwienie proliferacji komórek w celu zidentyfikowania komórek spoczynkowych.
- Izolacja komórek uśpionych do dalszych analiz.
- Zastosowanie wyników w badaniach przesiewowych leków in vivo.
- Wykorzystanie profilowania transkrypcyjnego i analizy proteomicznej.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja spoczywających komórek białaczki u rybek zebrafish.
- Wnioski dotyczące roli spoczynku w przeżywalności macierzystych komórek białaczki.
- Potencjał opracowania terapii celowanych w oparciu o zachowanie komórkowe.
- Ustanowienie funkcjonalnego narzędzia do badania samoodnowy.
Wnioski
- Barwienie proliferacji komórek jest skuteczną metodą izolowania komórek w stanie spoczynku.
- Zrozumienie stanu spoczynku jest kluczowe dla celowania w białkolemiczne komórki macierzyste.
- Niniejsze badanie stanowi podstawę dla przyszłych strategii terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spoczywające leukemiczne komórki macierzyste (LSCs) stanowią główne wyzwanie w ostrej białaczkowej białaczkowstrojowej leukemii limfoblastycznej z komórek T (T-ALL) ze względu na ich rolę w utrzymywaniu się choroby i nawrotach. Zdolność do funkcjonalnej identyfikacji i izolacji tych uśpionych komórek w modelu rybiego zebrafisha umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka i zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć. Niniejszy schemat postępowania zapewnia skalowalną platformę do badania podatności LSC oraz dostarczania informacji niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych skorygowanych o ryzyko.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną identyfikację spoczynkowych LSC w celu walidacji celów terapeutycznych w oparciu o postawione hipotezy.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie proliferujących od dormantnych populacji komórek.
- Ułatwia priorytetyzację celów powiązanych z opornością na leczenie i nawrotami choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany schemat postępowania w celu izolacji i śledzenia podziałów komórkowych w systemach istotnych dla badanych chorób.
- Umożliwia powtarzalną kwantyfikację retencji barwnika jako wskaźnika stanu proliferacji.
- Przygotowuje populacje komórek spoczywających i proliferujących do dalszego screeningu związków oraz testów funkcjonalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami poszukiwania biomarkerów translacyjnych, umożliwiając badanie właściwości LSC in vivo.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki skalowalnym modelom transplantacji u ryb danio pręgowanych.
- Ułatwia dostosowanie rozwoju badań do poziomu ryzyka poprzez powiązanie stanu spoczynku z odpowiedzią na lek oraz cechami macierzystości.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z ciągiem od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając funkcjonalną izolację spoczynkowych LSC do dalszych analiz i przesiewów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów spoczynku i samoodnowy LSC.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty proliferacji komórek na potrzeby opracowywania testów.
- Analityka: Umożliwia pomiary oparte na cytometrii przepływowej w celu porównania retencji barwnika i tempa podziałów komórkowych.
- Badania translacyjne: Łączy zachowanie LSC in vivo z przedkliniczną odpowiedzią na leki i opracowywaniem biomarkerów.
- Wykorzystanie w organizacji: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do funkcjonalnej analizy LSC w różnych modelach T-ALL.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w celowaniu w LSC i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w biologii nawrotów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje identyfikację komórek spoczywających i umożliwia skalowalne, powtarzalne przepływy pracy.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie stanu spoczynku z opornością na leczenie i macierzystością.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację strategii terapeutycznych celujących w LSC w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w pracy z danio przebrzanym, barwieniu komórek oraz cytometrii przepływowej.
- Wymaga dostępu do zoptymalizowanych barwników proliferacyjnych oraz infrastruktury do sortowania żywych komórek.
- Wymaga standaryzacji stężeń barwników i strategii bramkowania pomiędzy zespołami.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla innych modeli białaczki lub gatunków.
- Zależne od skutecznych protokołów transplantacji in vivo i engraftmentu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:57
In Vivo Propagation and Harvesting of GFP‐Labeled Zebrafish T‐ALL Cells
2:50
Optimization and In Vivo Propagation of CellTrace Far Red (CT‐FR) Stained Zebrafish T‐ALL Cells
4:32
Preparation and Sorting of CT‐FR‐Stained Zebrafish T‐ALL Cells for Transplantation and Tumor Tracking
