Name: Zmodyfikowany model preparatu do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Poznaj uproszczony model przygotowania do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną wspólną. Ta metoda ułatwia badaczom opanowanie techniki i odkrywanie potencjalnych leków neuroprotekcyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82173781 i 82373835), projekt badawczy podoktorancki (BKS212055), Projekt Innowacji Naukowych i Technologicznych Biura Nauki i Technologii Foshan (2320001007331), Fundację Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych Guangdong (2019A1515010806), Kluczowe Projekty Terenowe (Inteligentna Produkcja) Ogólnych Uniwersytetów w Prowincji Guangdong (2020ZDZX2057) oraz Projekty Naukowo-Badawcze (Charakterystyczna innowacja) uniwersytetów ogólnych w prowincji Guangdong (2019KTSCX195).

Protokół eksperymentalny został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (Numer rejestracyjny: 2019-DL-002). Wszystkie dane z badań nad zwierzętami zostały udokumentowane zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). W badaniu wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley (SD) o masie 250 g ± 20 g i wieku 6-8 tygodni. Szczegóły dotyczące wykorzystanych zwierząt, odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Wprowadzić i utrzymać głęboką anestezję u szczurów, stosując Zoletil 50 (50mg/kg, IM) oraz chlorowodorek ksylazyny (40mg/kg, IP). Przez cały czas trwania procedury chirurgicznej zapewnić utrzymanie temperatury ciała na poziomie 37 ± 0.5 °C przy użyciu sondy rektalnej podłączonej do mata grzewczego. Nałożyć maść weterynaryjną na oczy szczura, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
	<li>Ogolić sierść z głowy i szyi szczurów. Użyć kremu do depilacji w celu usunięcia futra z głowy i szyi, a następnie zmyć krem solą fizjologiczną. Zdezynfekować skórę w miejscu operacyjnym, aplikując trzykrotnie etanol oraz povidone-jod za pomocą sterylnych haczyków bawełnianych.</li>
	<li>Za pomocą skalpela wykonać nacięcie o długości 2 cm na środku głowy szczura wzdłuż szwu strzałkowego, a następnie ostrożnie usunąć mięśnie pokrywające czaszkę.</li>
	<li>Wycienić czaszkę po stronie niedokrwiennej u szczura za pomocą wiertarki do czaszki. Podczas procesu szlifowania stosować sól fizjologiczną w celu chłodzenia i usuwania pozostałości. Zarejestrować bazowy przepływ krwi u szczurów za pomocą obrazowania kontrastowego laserowego speckle (LSCI).</li>
	<li>Aplikować trzykrotnie etanol oraz povidone-jod na skórę szyi za pomocą sterylnych haczyków bawełnianych. Wykonać nacięcie o długości 2 cm wzdłuż linii środkowej szyi za pomocą ostrza chirurgicznego. Użyć rozwieraczy, aby odsunąć skórę i gruczoły ślinowe na boki, eksponując mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy oraz mięśnie szyjne.</li>
	<li>Rozdzielić mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy i mięśnie szyjne, aby odsłonić obszar tętnicy szyjnej. Zidentyfikować anatomię naczyniową tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) i tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA). Na podstawie anatomii naczyniowej odseparować CCA, a także pochodzące od niej ECA i ICA15. 
	UWAGA: Budowa anatomiczna szczura wskazuje, że obszar CCA jest głównie pokryty mięśniem mostkowo-obojczykowo-sutkowym i mięśniami szyjnymi, a ICA i ECA wywodzą się z CCA. Po odsłonięciu CCA wzdłuż niej widoczna jest rozwidlenie w kształcie litery Y, reprezentujące ICA i ECA. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić nerwu błędnego, który biegnie równolegle do CCA.</li>
</ol>
2. Zamknięcie tętnicy środkowej mózgu (MCA)
<ol>
	<li>Zwiąż łatwo rozwiązujący się węzeł na zewnętrznej tętnicy szyjnej (ECA) i wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), używając nici jedwabnej 3-0, aby tymczasowo zablokować przepływ krwi. Umieść zacisk naczyniowy na CCA w odległości około 0,5 cm od pierwszego węzła.
	<ol>
		<li>Zafarbuj na czarno igłę strzykawki 5 mL. Wykonaj niewielkie nakłucie w CCA za pomocą zafarbowanej igły i zaznacz otwory na czarno.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadź monofilamentową sznurkę nylonową do CCA przez czarny znacznik. Otwórz zacisk naczyniowy i poprowadź drut nylonowy do wewnętrznej tętnicy szyjnej (ICA), aż napotka on lekki opór. Mocno zaciśnij drugi węzeł, aby utrzymać monofilamentową sznurkę nylonową wewnątrz tętnicy, zapobiegając jej przesunięciu z pozycji blokującej.</li>
	<li>Zanotuj czas wystąpienia niedokrwienia w tym punkcie i zmierz wartość przepływu krwi po stronie niedokrwiennej za pomocą LSCI. Podaj krople bupiwakainy do rany na szyi w celu znieczulenia i zamknięcia rany. Zdejmij maskę anestezjologiczną i pozwól szczurowi dojść do siebie. 
	UWAGA: Jeśli wprowadzenie monofilamentowej sznurki nylonowej do ICA sprawia trudność, wycofaj ją nieco i spróbuj ponownie.</li>
</ol>
3. Reperfuzja po MCAO
<ol>
	<li>Po 90 min niedokrwienia ponownie podaj szczurom izofluran w celu znieczulenia. Zmierz przepływ krwi mózgowej po stronie niedokrwionej za pomocą LSCI i upewnij się, że monofilamentowa szpå nylonowa nie przesunęła się.</li>
	<li>Rozwiąż węzły na zewnętrznej tętnicy szyjnej (ECA), aby umożliwić reperfuzję krwi. Rozwiąż węzeł na wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), zabezpiecz szpå monofilamentową, a następnie ją wyjmij. Załóż zacisk naczyniowy przed utrwaloną szpą monofilamentową, aby zapobiec krwawieniu.</li>
	<li>Zastąp pierwszy węzeł na CCA zaciskiem naczyniowym. Za pomocą pęsety odsunij nacięcie naczynia w bok (Rysunek 1). Zaciśnij miejsce nacięcia pęsetą i podwiąż je nicią 6-0, aby zamknąć nacięcie. Usuń zacisk naczyniowy, sprawdź, czy nie ma wycieków i potwierdź pełną reperfuzję (Wideo 1). 
	UWAGA: Wykonaj podwiązanie w celu zamknięcia nacięcia, aby uniknąć nadmiernego zaciskania naczynia, co mogłoby doprowadzić do zwężenia CCA.</li>
	<li>Po podwiązaniu nacięcia zarejestruj wartości przepływu krwi w korze mózgowej za pomocą LSCI, aby potwierdzić pomyślną reperfuzję. Zamknij nacięcie szyi szwami, a następnie podaj 1 00 000 jednostek penicyliny i 2 mL soli fizjologicznej, aby zapobiec infekcji i odwodnieniu.</li>
	<li>Zapewnij ciepło do momentu odzyskania przytomności przez szczury. Po operacji podaj miękką karmę i monitoruj funkcje życiowe zwierząt.</li>
</ol>
4. Ocena funkcji nerwów i niedokrwiennego uszkodzenia mózgu
<ol>
	<li>Po pełnym wybudzeniu szczurów badacze nieznający przydziału zwierząt do grup ocenią ich funkcje neuronalne. Do oceny funkcji neurologicznej wszystkich szczurów należy wykorzystać skalę Longa (Tabela 1) oraz zmodyfikowaną skalę stopnia ciężkości neurologicznej (mNSS) (Tabela 2).</li>
	<li>24 h po operacji przeprowadź eutanazję szczurów w znieczuleniu izofluranem (4% izofluranu przy przepływie tlenu 4 L/min) poprzez zwichnięcie szyi16 (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi). Przepłucz mózg lodowatą wodą, aby usunąć pozostałości krwi.</li>
	<li>Podziel tkankę mózgową na 5 sekcji i zabarw je TTC. Wykonaj zdjęcia obu stron przekrojów tkanki mózgowej, zmierz obszar niedokrwienny stron przedniej i tylnej przy użyciu oprogramowania Image J i oblicz stopień zawału, stosując następujący wzór: 
	<img alt="Wzór na objętość: V=1/3 h(S₁+√(S₁×S₂+S₂)) w obliczeniach geometrycznych." src="/files/ftp_upload/67060/67060eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	UWAGA: S1 i S2 reprezentują odpowiednio obszar zawału proksymalnej części przedmózgowia i proksymalnej części pnia mózgu w przekrojach mózgu. Obszar zawału każdego przekroju mózgu jest korygowany zgodnie z wzorem Swansona, gdzie h oznacza grubość przekroju mózgu. Wzór ten, opisany wcześniej przez autora w poprzednich badaniach17, pozwala na dokładniejsze obliczenie wielkości zmiany zawałowej.</li>
	<li>Przeanalizuj dane przy użyciu oprogramowania statystycznego i graficznego, aby ocenić skuteczność i stabilność modelu.</li>
	<li>Zastosuj metodę immunofluorescencji do znakowania neuronów korowych u szczurów, aby dodatkowo potwierdzić uszkodzenia neuronalne wywołane tą metodą. Po 24 h niedokrwienia i reperfuzji u szczurów wykonano perfuzję sercową przy użyciu schłodzonego PBS w celu pobrania tkanki mózgowej.</li>
	<li>Zatop i zamroź tkankę mózgową, a następnie wykonaj przekroje. Użyj przeciwciał neuronalnych, takich jak marker niedojrzałych neuronów Doublecortin (DCX)18, marker jąder neuronalnych Neuronal Nuclei (NeuN)18 oraz marker dendrytyczny neuronów Microtubule-associated protein-2 (MAP-2)19. Obserwuj ekspresję neuronów niedokrwiennych przy użyciu konfokalnej mikroskopii laserowej.</li>
</ol>

Modified MCAO/R Model with Preserved ECA for Enhanced Reperfusion and Stability

<ol><li>Paul, S., Candelario-Jalil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+neuroprotective+strategies+for+the+treatment+of+ischemic+stroke%3A+An+overview+of+clinical+and+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Emerging neuroprotective strategies for the treatment of ischemic stroke: An overview of clinical and preclinical studies.</a> Exp Neurol. 335, 113518(2021).</li>
<li>Feigin, V. L., Owolabi, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pragmatic+solutions+to+reduce+the+global+burden+of+stroke%3A+a+World+Stroke+Organization-Lancet+Neurology+Commission%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pragmatic solutions to reduce the global burden of stroke: a World Stroke Organization-Lancet Neurology Commission.</a> Lancet Neurol. 22 (12), 1160-1206 (2023).</li>
<li>Putaala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+Stroke+in+Young+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Continuum+%28Minneapolis%2C+Minn%29%22%5BJournal%5D)">Ischemic Stroke in Young Adults.</a> Continuum (Minneapolis, Minn). 26 (2), 386-414 (2020).</li>
<li>Girotra, T., Lekoubou, A., Bishu, K. G., Ovbiagele, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contemporary+and+comprehensive+analysis+of+the+costs+of+stroke+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">A contemporary and comprehensive analysis of the costs of stroke in the United States.</a> J Neurol Sci. 410, 116643(2020).</li>
<li>Howells, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+strokes+for+different+folks%3A+The+rich+diversity+of+animal+models+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22JCBFM%22%5BJournal%5D)">Different strokes for different folks: The rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia.</a> JCBFM. 30 (8), 1412-1431 (2010).</li>
<li>Matur, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+animal+models+of+ischemic+stroke+to+the+human+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Translating animal models of ischemic stroke to the human condition.</a> Transl Stroke Res. 14 (6), 842-853 (2023).</li>
<li>O'Collins, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C026+experimental+treatments+in+acute+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">1,026 experimental treatments in acute stroke.</a> Ann Neurol. 59 (3), 467-477 (2006).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema+1.+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Nosotchu%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema 1. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Nosotchu. , 1-7 (1986).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Faber, J. E., Moore, S. M., Lucitti, J. L., Aghajanian, A., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+the+cerebral+collateral+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Sex differences in the cerebral collateral circulation.</a> Transl Stroke Res. 8 (3), 273-283 (2017).</li>
<li>Justić, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+Koizumi+model+of+mouse+cerebral+ischemia%3A+A+comparative+longitudinal+study+of+cerebral+and+retinal+ischemia+in+the+Koizumi+and+Longa+middle+cerebral+artery+occlusion+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cerebral+microcirculation+perfusion+in+rat+models+of+middle+cerebral+artery+occlusion+prepared+through+common+carotid+artery+insertion+and+external+carotid+artery+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22CJTER%22%5BJournal%5D)">Comparison of cerebral microcirculation perfusion in rat models of middle cerebral artery occlusion prepared through common carotid artery insertion and external carotid artery insertion.</a> CJTER. 27 (11), 1683-1691 (2023).</li>
<li>Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).</li>
<li>Trueman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-examination+of+the+intraluminal+filament+MCAO+model%3A+impact+of+external+carotid+artery+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: impact of external carotid artery transection.</a> Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).</li>
<li>Ziegler, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+sympathetic+denervation+attenuates+myocardial+inflammation+and+improves+cardiac+function+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Local sympathetic denervation attenuates myocardial inflammation and improves cardiac function after myocardial infarction in mice.</a> Cardiovasc Res. 114 (2), 291-299 (2018).</li>
<li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovasc Res. 118 (3), 814-827 (2022).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cerebral+ischemia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Animal models of cerebral ischemia: A review.</a> Biomed Pharmacother. 131, 110686(2020).</li>
<li>Belayev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docosanoids+promote+neurogenesis+and+angiogenesis%2C+blood-brain+barrier+integrity%2C+penumbra+protection%2C+and+neurobehavioral+recovery+after+experimental+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Docosanoids promote neurogenesis and angiogenesis, blood-brain barrier integrity, penumbra protection, and neurobehavioral recovery after experimental ischemic stroke.</a> Mol Neurobiol. 55 (8), 7090-7106 (2018).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carthamin+yellow+improves+cerebral+ischemia-reperfusion+injury+by+attenuating+inflammation+and+ferroptosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Carthamin yellow improves cerebral ischemia-reperfusion injury by attenuating inflammation and ferroptosis in rats.</a> Int J Mol Med. 47 (4), 52(2021).</li>
<li>Chia, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+number+of+ischemic+strokes+potentially+eligible+for+endovascular+thrombectomy%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Determining the number of ischemic strokes potentially eligible for endovascular thrombectomy: a population-based study.</a> Stroke. 47 (5), 1377-1380 (2016).</li>
<li>Henninger, N., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+time+window+for+endovascular+and+pharmacological+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Extending the time window for endovascular and pharmacological reperfusion.</a> Transl Stroke Res. 7 (4), 284-293 (2016).</li>
<li>Zhang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Intravenous+thrombolytic+therapy+in+acute+ischemic+stroke+patients%3A+evaluation+of+clinical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Use of Intravenous thrombolytic therapy in acute ischemic stroke patients: evaluation of clinical outcomes.</a> Cell Biochem Biophys. 72 (1), 11-17 (2015).</li>
<li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+variables+influencing+ischemic+injury+in+the+Longa+and+Koizumi+methods+of+intraluminal+filament+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of variables influencing ischemic injury in the Longa and Koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice.</a> PLOS One. 11 (2), e0148503(2016).</li>
<li>Smith, H. K., Russell, J. M., Granger, D. N., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+differences+between+two+classical+surgical+approaches+for+middle+cerebral+artery+occlusion-induced+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Critical differences between two classical surgical approaches for middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice.</a> J Neurosci Methods. 249, 99-105 (2015).</li>
<li>Dittmar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ECA+transection+in+the+development+of+masticatory+lesions+in+the+MCAO+filament+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of ECA transection in the development of masticatory lesions in the MCAO filament model.</a> Exp Neurol. 195 (2), 372-378 (2005).</li>
<li>Lourbopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inadequate+food+and+water+intake+determine+mortality+following+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (6), 2084-2097 (2017).</li>
<li>Ogishima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+the+pterygopalatine+and+external+carotid+arteries+induces+ischemic+damage+in+the+murine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophth+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ligation of the pterygopalatine and external carotid arteries induces ischemic damage in the murine retina.</a> Invest Ophth Vis Sci. 52 (13), 9710-9720 (2011).</li>
<li>Irvine, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion+after+ischemic+stroke+is+associated+with+reduced+brain+edema%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Reperfusion after ischemic stroke is associated with reduced brain edema.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1807-1817 (2018).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+Size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: Size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).</li>
<li>Dirnagl, U., Dirnagl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bench+to+bedside%3A+The+quest+for+quality+in+experimental+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bench to bedside: The quest for quality in experimental stroke research.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).</li>
<li>Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+parameters%27+impact+on+mortality+and+variability+in+mouse+stroke+experiments%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: A meta-analysis.</a> Sci Rep. 6, 21086(2016).</li>
<li>McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+cerebral+hypoperfusion+and+ischaemic+pathology+beyond+MCA+territory+after+intraluminal+filament+occlusion+in+C57Bl%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice.</a> Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).</li>
<li>Kitagawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+ischemia+after+bilateral+carotid+artery+occlusion+and+intraluminal+suture+occlusion+in+mice%3A+Evaluation+of+the+patency+of+the+posterior+communicating+artery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 18 (5), 570-579 (1998).</li>
<li>Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+surgical+approach+reduces+variability+following+filament+induction+of+experimental+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice.</a> Dis Model Mech. 10 (7), 931-938 (2017).</li>
</ol>

Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) indukowany szwem nylonowym z monofilamentu jest najpowszechniejszą metodą stosowaną do przygotowania modeli MCAO. Podejście to jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych i zyskało uznanie wielu praktyków ze względu na swoją prostotę, brak potrzeby kraniotomii, minimalny uraz chirurgiczny i zdolność do uzyskania reperfuzji.
Istnieją dwie klasyczne techniki chirurgiczne dla włókna śródświetlnego MCAO: metoda Koizumi8 i metoda Longa9. Główna różnica między tymi metodami polega na tym, w jaki sposób szew jest wprowadzany w celu zamknięcia MCA. W metodzie Koizumi szew wprowadzany jest przez nacięcie tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA). Przedni koniec szwu jest pokryty silikonem, aby zablokować punkt początkowy MCA. I odwrotnie, w metodzie Longa, szew jest wprowadzany do ICA przez przeciętą tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA). Przedni koniec szwu jest rozszerzony do kulistego kształtu, aby zablokować punkt początkowy MCA (ryc. 5). Podczas reperfuzji szew jest delikatnie wycofywany, aby przywrócić przepływ krwi.
Metoda Longa polega na wprowadzeniu szwu do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) przez przeciętą tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA). Proces ten wymaga oddzielenia i odłączenia ECA, a także oddzielenia i usunięcia małych gałęzi, które są następnie odcinane za pomocą wstrzykiwacza do elektrokoagulacji, aby zapobiec krwawieniu. W związku z tym metoda ta wymaga starannego i precyzyjnego działania. Co więcej, krótki pozostały/a koniec odciętego ECA może ułatwić zsuwanie się szwu podczas wprowadzania, co jeszcze bardziej zwiększa złożoność procedury. Wyzwanie to jest szczególnie widoczne podczas przygotowywania mysiego modelu niedokrwienia mózgu, ponieważ często wymaga użycia mikroskopu w celu zapewnienia dokładności, co zwiększa ogólną złożoność operacji.
Główny problem związany z metodą Koizumi polega na podwiązaniu tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), co powoduje kompensacyjną reperfuzję tkanki mózgowej po stronie niedokrwiennej wyłącznie przez koło Willisa. CCA jest kluczową gałęzią łuku aorty od serca i służy jako główna tętnica zapewniająca perfuzję przepływu krwi w mózgu. W związku z tym model niedokrwienno-reperfuzyjny mózgu stworzony metodą Koizumi często doświadcza stanu hipoperfuzji. Ta hipoperfuzja nie jest ograniczona do obszaru tętnicy środkowej mózgu, ale rozciąga się na całą półkulę niedokrwienną po tej samej stronie. Nawet po 35 dniach modelowania wartość przepływu krwi nie wraca do wartości wyjściowej, co sugeruje, że metoda Koizumi powinna być traktowana jako model niedokrwienny z przewlekłą hipoperfuzją, a nie model niedokrwienno-reperfuzyjny10.
Natomiast metoda Longa może osiągnąć wartość przepływu krwi na poziomie 100% u zwierząt z MCAO/R. Należy jednak zauważyć, że osiągnięcie całkowitej rekanalizacji nie musi oznaczać, że należy zrezygnować z metody Koizumi. Rozważając translację kliniczną, metoda Koizumi może być bardziej odpowiednia dla pacjentów ze spontaniczną powolną rekanalizacją po niedrożności tętnicy. Zjawisko to jest jednak stosunkowo rzadkie w praktyce klinicznej. Tylko niewielki odsetek pacjentów z udarem niedokrwiennym mózgu spełnia kryteria trombolizy i otrzymuje skuteczne leczenie w okresie leczenia20,21. Ponadto niektórzy pacjenci nie osiągają całkowitej rewaskularyzacji nawet po leczeniu trombolitycznym22. W związku z tym metoda Koizumi może być wykorzystana do symulacji stanu takich pacjentów.
Z drugiej strony, metoda Longa pozwala na szybką reanalizę naczyń po okluzji, dzięki czemu jest bardziej odpowiednia do symulacji pacjentów, którzy otrzymują skuteczną terapię trombolityczną lub trombektomię w praktyce klinicznej. W celu symulacji pacjentów, którzy nie przeszli terapii trombolitycznej, model trwałego niedokrwienia mózgu przygotowany metodą Koizumi może zaoferować pełniejszą okluzję i prostszy zabieg chirurgiczny.
Metoda Longa do indukowania okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) może prowadzić do bardziej znaczącego uszkodzenia reperfuzyjnego poprzez zachowanie rekanalizacji naczyniowej pochodzącej z tętnicy szyjnej wspólnej (CCA)23,24. Należy jednak pamiętać, że tętnica szyjna zewnętrzna (ECA) musi zostać odcięta i trwale podwiązana podczas metody Longa, co zaburza całą strukturę przepływu krwi w mózgu i nie jest zgodne z pacjentami klinicznymi. Ponadto tętnice językowe, szczękowe i potyliczne są gałęziami ECA13. W związku z tym przecięcie lub trwałe podwiązanie ECA może powodować zaburzenia odżywiania i picia, co skutkuje utratą masy ciała25. Wcześniejsze badania wykazały, że zgony myszy po modelowaniu MCAO są głównie spowodowane nieodpowiednim spożyciem pokarmu lub wody, a nie uszkodzeniem niedokrwiennym mózgu14,26. Dodatkowo podwiązanie ECA może zmniejszyć przepływ krwi w siatkówce i wywołać uszkodzenie siatkówki w postaci śmierci komórki27.
Ponadto najważniejszym wskaźnikiem w badaniach nad udarem mózgu jest objętość zawału; Udowodniono jednak, że objętość zawałów wywołanych metodą szwów ma znaczne odchylenie standardowe, nawet przy zachowaniu ścisłych protokołów chirurgicznych i gromadzenia danych. We wcześniejszych doniesieniach objętość zawału była związana ze stopniem reperfuzji28, a reperfuzja modelu udaru przygotowanego metodą Koizumiego zależy od krążenia Willisa 29,30,31. Udowodniono jednak, że cykl Willisa ma wysoką zmienność anatomiczną, szczególnie u myszy C57Bl / 6, gdzie 90% zwierząt może nie mieć jednej lub dwóch tylnych tętnic komunikacyjnych32, co jest kluczowym wyznacznikiem wysokiej zmienności w urazie niedokrwiennym33. Dlatego zachowanie perfuzji CCA może zmniejszyć zmienność objętości zawału34. Podano, że średni współczynnik zmienności wielkości zawału w badaniach z udarem mózgu wynosił 29,5%31, co przyczyniło się do niskiej mocy statystycznej badań dotyczących udaru. Stanowi to również ogromne wyzwanie dla potencjalnych odkryć leków. Niewątpliwie zwiększa to koszty rozwoju i tłumaczenia klinicznego i może prowadzić do tego, że naukowcy tracą dostęp do potencjalnie skutecznych leków. Zwiększa również liczbę zwierząt, które mają być uwzględnione w analizie statystycznej eksperymentu, co jeszcze bardziej narusza zasadę etyki zwierząt 3R.
Dlatego w tym badaniu metody modelowania zostały zmodyfikowane, aby zapewnić integralność struktury przepływu krwi w tkance mózgowej i wystarczającą reperfuzję po niedokrwieniu mózgu. Główne modyfikacje obejmują dwa etapy: (1) wprowadzenie szwu do CCA za pomocą igły strzykawkowej o pojemności 5 ml zamiast wykonywania małego nacięcia; ten krok zmniejsza nacięcie CCA i bardziej sprzyja podwiązaniu nacięcia; (2) wycofanie szwu i użycie cieńszych nici jedwabnych do podwiązania otworu igły CCA, bez wpływu na perfuzję przepływu krwi w CCA. Oczywiście wymaga to również starannej operacji chirurgicznej, ale różni się od wprowadzenia szwu przez ECA; metoda ta zachowuje integralność struktury przepływu krwi w mózgu, umożliwiając jednocześnie pełne reperperowanie przepływu krwi przez CCA, upraszczając procedurę operacyjną i zmniejszając zmienność objętości zawału. Niektórzy badacze stosowali podobne metody badawcze do naprawy nacięć za pomocą kleju tkankowego, ale ma to potencjał do zakrzepicy, która przyniesie niekontrolowane skutki. A ustabilizowanie nacięcia trwa dłużej25.
Podsumowując, badanie to zapewnia zmodyfikowane podejście do przygotowania modelu niedokrwienia i reperfuzji mózgu, który pozwala na odpowiednią perfuzję krwi po odłączeniu włókien i może skutkować znacznie powtarzalnymi objętościami zawału i uszkodzeniami neurologicznymi. Wszystkie powyższe wyniki pokazują, że zmodyfikowana metoda jest wykonalna i odtwarzalna oraz może stanowić punkt odniesienia dla praktyków w przygotowaniu modeli ułatwiających skuteczne kliniczne tłumaczenie leków na niedokrwienie mózgu.

Według Światowej Organizacji Zdrowia, udar mózgu pozostał drugą najczęstszą przyczyną zgonów na świecie przez ostatnią dekadę, z wysokim wskaźnikiem zachorowalności, wysoką śmiertelnością i wysokim wskaźnikiem niepełnosprawności1,2. Oczekuje się, że wraz ze starzeniem się światowej populacji częstość występowania udaru mózgu w krajach rozwijających się wzrośnie, stając się potencjalnie główną przyczyną przedwczesnych zgonów i niepełnosprawności u dorosłych. Ponadto istnieje tendencja do występowania udarów w młodszym wieku3. Utrata siły roboczej po udarze stanowi również duże obciążenie dla rodzin i społeczeństwa4. Dlatego opracowanie bezpiecznych i skutecznych metod leczenia stanowi poważne wyzwanie w badaniach nad udarem.
Modele zwierzęce służą jako kluczowe narzędzia do badania zapobiegania i leczenia chorób ludzkich. Skuteczna translacja strategii leczenia udaru zależy od odtwarzalności i wiarygodności modeli zwierzęcych po udarze5,6. Tętnica środkowa mózgu (MCA) jest częstym miejscem klinicznego udaru mózgu, co sprawia, że model MCAO jest najbardziej zbliżony do udaru niedokrwiennego u ludzi. Model MCAO, przygotowany metodą szwów, został doceniony przez badaczy ze względu na takie zalety, jak brak kraniotomii i łatwa kontrola czasu niedokrwiennego. Został wykorzystany w ponad 40% eksperymentów neuroprotekcyjnych7. Jednak pomimo licznych zalet, szczegóły operacyjne tego modelu pozostają kontrowersyjnym tematem dla wielu badaczy.
Dla modelu MCAO (ang. cuclesion of midcebral artery ocluzji) wywołanego szwem, reperfuzja następuje poprzez wycofanie szwu. Obecnie do zakładania szwów stosuje się dwie główne metody: metodę Koizumiego8 oraz metodę Longa9. W metodzie Koizumiego szew wchodzi do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) głównie przez nacięcie tętnicy szyjnej wspólnej (CCA), podczas gdy w metodzie Longa przechodzi przez przeciętą tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) do ICA. Podczas reperfuzji metoda Koizumi wymaga trwałego podwiązania nacięcia CCA i opiera się na okręgu Willisa do reperfuzji10. Jednak niektóre badania sugerują, że skuteczna reperfuzja nie może być osiągnięta wyłącznie poprzez kompensacyjną podaż koła Willisa po utracie podaży CCA. Co więcej, krąg Willisa wykazuje wysoką zmienność anatomiczną, szczególnie u myszy C57Bl/6, zwiększając zmienność zawału i zmniejszając wiarygodność danych eksperymentalnych. W związku z tym metoda ta jest coraz częściej kwestionowana przez badaczy11.
Metoda Longa polega na wprowadzeniu szwu przez przerwane ECA, a następnie trwałym podwiązaniu wewnętrznej tętnicy szyjnej (ICA) po wycofaniu szwu. Pozwala to zachować drożność CCA, umożliwiając perfuzję krwi do 100% wartości wyjściowych. Jednak ta metoda wymaga oddzielenia zewnętrznej tętnicy szyjnej i małych odgałęzień tętnic, odcięcia ich lub elektrokoagulacji, co sprawia, że procedura jest trudna. Zaburza również pełną strukturę przepływu krwi w mózgu, która różni się od stanu klinicznego pacjenta12. Co ważne, badania wskazują, że przecięcie lub podwiązanie ECA może powodować zmiany niedokrwienne w mięśniach kontrolujących żucie i połykanie, wpływając na dietę zwierząt i prowadząc do pooperacyjnej śmierci zwierząt oraz poważnych uszkodzeń czuciowych i motorycznych u szczurów13,14.
Dlatego pilnie potrzebna jest zmodyfikowana metoda przygotowania modelu, aby rozwiązać te problemy. W badaniu tym przedstawiono zmodyfikowaną metodę modelowania MCAO, która naprawia nacięcie przyczepu CCA i osiąga skuteczną reperfuzję. Procedura jest prosta, praktyczna i wykonalna, wywołując znaczne uszkodzenia neurologiczne i powtarzalne zmiany zawałowe oraz dostarczając cennych wskazówek dla badaczy udaru.

<table><tbody><tr><td>System znieczulenia dla zwierząt</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IE</td><td></td></tr><tr><td>Utrzymywanie temperatury zwierząt</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>69020</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne Cy3</td><td>Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd</td><td>GB21303</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało DAP1</td><td>Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd</td><td>Przeciwciało</td> G1012 <td></td></tr><tr><td>DCX</td><td>Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd</td><td>GB13434</td><td></td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Beyotime Biotechnology Co., LTD</td><td>C0265</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad</td><td>Prism Oprogramowanie GraphPad GraphPad</td><td>Prism 8.0</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia</td><td>Oprogramowanie</td><td></td>ImageJ</tr><tr><td>Isofluran</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>Laserowa krew plamkowa system obrazowania przepływu</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>Przeciwciało PeriCam PSI NR</td><td></td></tr><tr><td>MAP-2</td><td>Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd</td><td>GB11128</td><td></td></tr><tr><td>Miniaturowa ręczna wiertarka do czaszki</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>87001</td><td></td></tr><tr><td>szew monofilamentowy</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>250-280g</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało NeuN</td><td>Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd</td><td>GB11138</td><td></td></tr><tr><td>OCT środek do zatapiania</td><td>BIOSHARP</td><td>BL557A</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina sodowa</td><td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.</td><td>17121709-2</td><td></td></tr><tr><td>Szybki roztwór do odzyskiwania antygenu do zamrożonych sekcji</td><td>Beyotime Biotechnology Co., LTD</td><td>P0090</td><td></td></tr><tr><td>SD szczury</td><td>SPF (Pekin) Biotechnology Co., Ltd.</td><td>250-280g</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Beyotime Biotechnology Co., LTD</td><td>ST795</td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>2019030101</tr></tbody></table>

zmodyfikowany model preparatu do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu

A Modified Model Preparation for Middle Cerebral Artery Occlusion Reperfusion

Model reperfuzji okluzji tętnicy środkowej mózgu (MCAO/R) jest kluczowy dla zrozumienia patologicznych mechanizmów udaru mózgu i dla rozwoju leków. Jednak wśród powszechnie stosowanych metod modelowania, metoda Koizumi często spotyka się z analizą ze względu na podwiązanie tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) i niemożność uzyskania odpowiedniej reperfuzji. Podobnie metoda Longa była krytykowana za odłączenie i podwiązanie tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA). Badanie to ma na celu wprowadzenie zmodyfikowanej metody przygotowania modelu, która zachowuje integralność ECA, polega na wprowadzeniu monofilamentowego szwu nylonowego przez CCA, naprawie podwiązanego nacięcia CCA i utrzymaniu reperfuzji z CCA. Reperfuzję przepływu krwi potwierdzono za pomocą laserowego obrazowania przepływu plamkowego. Metody oceny, takie jak skala Longa, zmodyfikowana ocena nasilenia neurologicznego, barwienie chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC) i znakowanie immunofluorescencyjne neuronów wykazały, że podejście to może wywołać stabilne uszkodzenie nerwów niedokrwiennych. Ten zmodyfikowany protokół modelowy MCAO/R jest prosty i stabilny, dostarczając cennych wskazówek dla praktyków w dziedzinie niedokrwienia mózgu.

Obrazowanie przepływu metodą laserowego obrazowania plamkowania (laser speckle flow imaging) wykazało, że przed zamknięciem naczynia za pomocą monofilamentowej szwy nylonowej w obszarze tętnicy środkowej mózgu (MCA) występował obfity przepływ krwi, a następnie zarejestrowano bazowe wartości przepływu krwi u szczurów. Po zamknięciu MCA wartość przepływu krwi po stronie niedokrwiennej mózgu gwałtownie spadła. Przed usunięciem szwy ponownie sprawdzono wartości przepływu po stronie niedokrwiennej, aby potwierdzić, czy szwa skutecznie zamyka MCA. Wyniki wskazały jedynie niewielką zmianę w przepływie krwi. Po usunięciu szwy perfuzja krwi szybko powróciła (Rysunek 2). Wideo 1 pokazuje również wyraźny puls wypełnienia tętnicy szyjnej wspólnej, co sugeruje, że metoda ta pozwala na uzyskanie wystarczającej perfuzji krwi po niedokrwieniu mózgu.
Wyniki oceny funkcji neurologicznych (Rysunek 3) wykazały, że w porównaniu z grupą pozorowanej operacji, skala Longa w grupie modelowej wynosiła 1,80 ± 0,27 (p &lt; 0,05), a wynik mNSS wyniósł 7,4 ± 0,89 (p &lt; 0,05). Wyniki te wskazują, że model zatoru i reperfuzji środkowej tętnicy mózgowej (MCAO/R) przygotowany tą metodą doprowadził do istotnych uszkodzeń neurologicznych. Wideo 2 demonstruje charakterystyczne zachowanie szczurów z grupy modelowej, polegające na rotowaniu podczas pełzania, co jest typowym objawem uszkodzenia wywołanego udarem i dodatkowo potwierdza poprawność tej metody.
Barwienie TTC wykazało, że stopień zawału w grupie modelowej szczurów wynosił 5,58 ± 1,79 (p &lt; 0,05), przy czym obszar zawału obejmował przede wszystkim prążkowie i korę, a wielkość zawału pozostała względnie stabilna. Barwienie immunofluorescencyjne ukazało utratę neuronów korowych po niedokrwieniu i reperfuzji (Rysunek 4). Wyniki te łącznie wskazują, że metoda ta pozwala na stworzenie stabilnego modelu MCAO/R, odpowiedniego do oceny przedklinicznej skuteczności leków.
<img alt="Etapy procedury chirurgicznej techniki szycia; sekwencja zbliżeń na schemacie operacji medycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67060/67060fig01v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie podwiązania konektora CCA. Żółte koło oznacza punkt wprowadzenia i miejsce podwiązania korka drutowego, natomiast pozycja podwiązania (żółta strzałka) wskazuje miejsce, w którym tętnica szyjna wspólna (CCA) została podwiązana drutem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/67060fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie kontrastowe plamek laserowych, analiza przed/po okluzji/reperfuzji, układ robotyczny, wyniki na wykresach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67060/67060fig02v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obrazy przepływu krwi wykonane metodą kontrastowych plamek laserowych u szczurów po stronie niedokrwiennej przed i po okluzji oraz przed i po reperfuzji. (A) Obrazy przepływu krwi w mózgu szczurów, gdzie obszary niebieskie wskazują niskie wartości przepływu krwi, a obszary czerwone wysokie wartości przepływu krwi. Paski skali: 200 mm. (B) Zmiany w niedokrwieniu i reperfuzji mózgu u szczurów, przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe, przy wielkości próby n = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/67060fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy modelu mózgu szczura porównujące grupę pozorowaną i grupę leczoną; wykresy słupkowe wyników Longa oraz mNSS." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67060/67060fig03v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wyniki obszaru zawału i oceny funkcji neurologicznych w grupie pozorowanej i grupie modelowej. (A) Barwienie TTC przedstawia obszary zawału tkanki mózgowej zarówno w grupie pozorowanej, jak i w grupie modelowej, gdzie obszary białe wskazują tkankę zawałową, a obszary czerwone tkankę prawidłową. (B) Przedstawiono ilościowe wyniki w skalach Longa i mNSS, a także stopień zawału. Istotność statystyczną w porównaniu z grupą pozorowaną oznaczono jako *p &lt; 0.05, przy liczności próby n = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/67060fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna, NeuN, DCX, MAP-2, DAPI, grupa pozorowana vs. grupa modelowa, porównanie markerów neuronalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67060/67060fig04v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wyniki uszkodzenia neuronów korowych w grupie pozorowanej i grupie modelowej. Ekspresja NeuN (A), DCX (B) i MAP-2 (C) w neuronach korowych. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/67060fig04large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat metod zatoru i reperfuzji mózgowej: Koizumi, Longa, podejście zmodyfikowane." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67060/67060fig05v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Schemat zatoru i reperfuzji MCA według metod Koizumi, Longi oraz metody zmodyfikowanej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/67060fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Testy motoryczne&gt;</td>
			<td>Punkty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podnoszenie szczura za ogon</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Zgięcie kończyny przedniej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Zgięcie kończyny tylnej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Przesunięcie głowicy &gt; 10° do osi pionowej w ciągu 30 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Umieszczenie szczura na podłodze</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0 Prawidłowy chód</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Niezdolność do chodzenia w linii prostej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2 Krążenie w stronę strony niedowładnej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3 Upadek na stronę niedowładną</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testy sensoryczne</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Test rozmieszczenia (test wizualny i dotykowy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2 Test propriocepcji (czucie głębokie, opieranie łapy o krawędź stołu w celu </td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">stymulować mięśnie kończyn)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testy równowagi wiązki</td>
			<td>6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">0 Wagi o stabilnym ustawieniu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Chwyta bok belki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2 przytulają się do belki, a jedna kończyna opada z belki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3 Przytula się do belki i dwie kończyny opadają z belki lub kręci się na belce (&gt;60 s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">4 Próby utrzymania równowagi na belce, ale następuje upadek (&gt;40 s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">5 Prób utrzymania równowagi na belce, zakończonych upadkiem (&gt;20 s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">6 Spada: brak próby utrzymania równowagi lub chwycenia się belki (&lt;20 s)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brak odruchów i ruchy nieprawidłowe</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Odruch małżowinowy (potrząsanie głową po dotknięciu przewodu słuchowego zewnętrznego)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Odruch rogówkowy (mrugnięcie okiem po lekkim dotknięciu rogówki watą)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Odruch przestrachu (odpowiedź motoryczna na krótki hałas wywołany pstryknięciem papieru w podkładce z klipsem)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">1 Drgawki, mioklonie, myodystonia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maksymalna liczba punktów</td>
			<td>18</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Zmodyfikowana skala nasilenia deficytów neurologicznych.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">skale Zea-Longa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wynik</td>
			<td>Objaw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 punktów</td>
			<td>Brak deficytów neurologicznych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 punkt</td>
			<td>Lekki: brak możliwości pełnego wyprostu prawej przedniej łapy podczas uniesienia ogona</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 punkty</td>
			<td>Umiarkowane: krążenie w prawo/lewo podczas chodzenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 punkty</td>
			<td>Ciężki: upadki w prawą/lewą stronę podczas chodzenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 punkty</td>
			<td>Brak zdolności do samodzielnego chodzenia z utratą przytomności</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Wyniki w skali Zea-Longa.
Film 1: Kluczowe etapy naprawy podwiązką nacięcia CCA podczas reperfuzji u szczurów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/video%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Wideo 2: Nagrania behawioralne szczurów poddanych procedurze MCAO/R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67060/video%202.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>

Ten protokół opisuje proces przygotowania do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną wspólną.

Zmodyfikowany model preparatu do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu

The middle cerebral artery occlusion reperfusion (MCAO/R) model is crucial for understanding the pathological mechanisms of stroke and for drug ...

Zakres naszych badań to modernizacja w zakresie niedokrwienia mózgu. Podjęliśmy próbę wprowadzenia nici jedwabnej z tętnicy szyjnej wspólnej i nacięcia pięcioma nićmi jedwabnymi z tętnicy szyjnej wspólnej i tętnicy szyjnej zewnętrznej. Uważa się, że metoda jest niewystarczająca, ale uważa się, że wpływa ona na dopływ krwi do mięśni.Operacja jest złożona i dla początkujących. Nasz protokół odnosi się do powyższego, następuje i zapewnia alternatywne podejście. Nasz protokół ułatwia większej liczbie lekarzy opanowanie nowoczesności niedokrwiennej mózgu i szybkie odkrycie potencjalnych leków neuroprotekcyjnych.Po znieczuleniu szczura i zdezynfekowaniu obszaru operacyjnego wykonaj dwucentymetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej szyi za pomocą ostrza chirurgicznego. Zastosuj retraktory, aby bocznie odciągnąć skórę i gruczoły ślinowe, odsłaniając mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe i szyjne. Następnie oddziel mięśnie mostkowo-obojczykowo-sutkowe i szyjne, aby odsłonić obszar szyjny.Oddziel wspólną tętnicę szyjną i zidentyfikuj anatomię naczyniową wspólnej tętnicy szyjnej wewnętrznej i zewnętrznej. Następnie oddziel pochodzącą z tętnicy szyjnej wspólnej, tętnicę szyjną zewnętrzną i tętnicę szyjną wewnętrzną. Za pomocą jedwabnej nici 3/O zawiąż łatwo rozplątujący się węzeł nad tętnicą szyjną zewnętrzną i tętnicą szyjną wspólną, aby tymczasowo zablokować przepływ krwi.Umieść klips naczyniowy na wspólnej tętnicy szyjnej około 0,5 centymetra od pierwszego węzła i umieść luźny węzeł między pierwszym klipsem naczyniowym a węzłem nici jedwabnej. Teraz ufarbuj igłę pięciomililitrowej strzykawki na czarno. Następnie za pomocą barwionej na czarno igły wykonaj małe nakłucie w tętnicy szyjnej wspólnej i zaznacz otwory na szpilki na czarno.Włóż nylonowy szew monofilamentowy do wspólnej tętnicy szyjnej przez znak. Otwórz zacisk naczyniowy i poprowadź nylonowy drut do tętnicy szyjnej wewnętrznej, aż zatrzyma się z lekkim oporem. Następnie mocno zaciśnij drugi węzeł, aby utrzymać nylonowy szew monofilamentowy na miejscu wewnątrz tętnicy, zapobiegając przemieszczeniu się z pozycji blokującej.Rozwiąż węzły na tętnicy szyjnej zewnętrznej, aby umożliwić reperfuzję krwi. Po zabezpieczeniu szwu monofilamentowego i jego wyjęciu należy rozwiązać węzeł na tętnicy szyjnej wspólnej. Założyć klips naczyniowy przed zamocowanym szwem monofilamentowym, aby zapobiec krwawieniu.Następnie zastąp pierwszy wspólny węzeł tętnicy szyjnej klipsem naczyniowym. Użyj pęsety, aby obrócić nacięcie naczynia na boki. Zacisnąć nacięcie pęsetą i podwiązać je za pomocą nici 6/O, aby naprawić nacięcie.Zdejmij klips naczyniowy, sprawdź, czy nie ma wycieków i potwierdź całkowitą reperfuzję. Laserowe obrazowanie przepływu plamkowego wykazało, że przed zamknięciem tętnicy środkowej mózgu lub MCA występował obfity przepływ krwi w obszarze MCA. Po zamknięciu MCA wartość przepływu krwi po niedokrwiennej stronie mózgu gwałtownie spadła.Przepływ krwi po stronie niedokrwiennej został ponownie sprawdzony przed zdjęciem szwu, potwierdzając okluzję MCA z niewielką zmianą przepływu krwi. Po wycofaniu szwu perfuzja krwi szybko się przywróciła.

a-modified-model-preparation-for-middle-cerebral-artery-occlusion

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Włóknista okluzja tętnicy środkowej mózgu jest powszechnie stosowanym modelem badania udaru niedokrwiennego u myszy.

Modelowanie udaru u myszy – zator tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem modelu filamentowego

Tutaj prezentujemy protokół do trwałego zamknięcia dystalnej tętnicy środkowej mózgu u starszych samic szczurów z jednoczesnym zamknięciem tętnic szyjnych w celu wygenerowania dużych zawałów korowych i utrzymujących się deficytów. Pokazujemy potwierdzenie wielkości zmiany za pomocą strukturalnego rezonansu magnetycznego po 24 godzinach i 8 tygodniach po udarze.

Wykonywanie stałej dystalnej środkowej części mózgu z niedrożnością tętnicy szyjnej wspólnej u starszych szczurów w celu zbadania niedokrwienia kory mózgowej z trwałą niepełnosprawnością

Aby zrozumieć patofizjologię udaru, ważne jest korzystanie z wiarygodnych modeli. W artykule opisano jeden z najczęściej stosowanych modeli udaru u myszy, określany jako model niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAo) (określany również jako model włókna śródświetlnego lub szewu) z reperfuzją.

Podejście chirurgiczne do niedrożności tętnicy środkowej mózgu i udaru wywołanego reperfuzją u myszy

Opisujemy mysi model udaru wywołanego przez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej za pomocą szwu pokrytego silikonem. Protokół może być stosowany w celu wywołania trwałej okluzji lub tymczasowego niedokrwienia, a następnie reperfuzji.

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Udar noworodkowy jest istotną przyczyną wczesnego uszkodzenia mózgu, wymagającym modelu translacyjnego ze spójnymi wzorcami urazów ogniskowych i wysoką odtwarzalnością, aby umożliwić badanie. W pracy opisano szczegółową procedurę chirurgiczną mającą na celu stworzenie niekrwotocznego, jednostronnego ogniskowego uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego u gryzoni o długości równoważnej.

Przemijający model niedrożności tętnicy środkowej mózgu udaru noworodka u szczurów P10

Wewnątrzświateł okluzja włókien środkowej tętnicy mózgowej jest najczęściej używanym modelem in vivo eksperymentalnego udaru mózgu u gryzoni. Wykonuje się tutaj alternatywne podejście chirurgiczne umożliwiające naprawę tętnicy szyjnej wspólnej, które umożliwia reperfuzję tętnicy szyjnej wspólnej i pełną reperfuzję do obszaru tętnicy środkowej mózgu.

Niedrożność tętnicy środkowej mózgu umożliwiająca reperfuzję poprzez wspólną naprawę tętnicy szyjnej u myszy

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Ten protokół demonstruje unikalny model udaru myszy ze średniej wielkości zawałem i doskonałym wskaźnikiem przeżycia. Model ten pozwala przedklinicznym badaczom zajmującym się udarem mózgu wydłużyć czas trwania niedokrwienia, wykorzystać starzejące się myszy i ocenić długoterminowe wyniki funkcjonalne.

Zmodyfikowany przezczaszkowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu do badania wyników udaru u starszych myszy

Ten protokół opisuje model przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy poprzez śródświetlne zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej. Dodatkowo przedstawiono przykłady oceny wyników z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego i testów behawioralnych.

Przejściowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Obecny protokół opisuje szczurzy model okluzji/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu, który zachowuje anatomiczną strukturę naczyń mózgowych bez powodowania uszkodzeń.

Szczurzy model niedrożności/reperfuzji tętnicy środkowej mózgu bez uszkadzania struktury anatomicznej naczyń mózgowych

Ten protokół przedstawia przewodnik krok po kroku dla badaczy, jak przeprowadzić procedurę zamknięcia tętnicy środkowej mózgu na myszach przy użyciu zmodyfikowanej metody Longa tętnicy szyjnej zewnętrznej. Modyfikacje przedstawione w artykule mają na celu zwiększenie dokładności niedrożności tętnicy środkowej mózgu i zapewnienie pełnej reperfuzji.

Optymalizacja metody zamykania tętnic środkowych Longa w celu uzyskania pełnej reperfuzji

Poznaj uproszczony model przygotowania do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną wspólną. Ta metoda ułatwia badaczom opanowanie techniki i odkrywanie potencjalnych leków neuroprotekcyjnych.

Zmodyfikowany model preparatu do reperfuzji niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Przeglądaj więcej filmów